Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

عالية الإنتاجية الحمض النووي بلازميد تعدد الإرسال والتحويل باستخدام تكنولوجيا نانوالاستغناء الصوتية

Published: August 8, 2019 doi: 10.3791/59570
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Institut Pasteur de Lille, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (Inserm) U1177, Drugs and Molecules for Living Systems, Université de Lille, 2L'atelier du Développeur, Marquette lez Lille

Summary

يصف هذا البروتوكول نقل الخلايا البلازمية عالي الإنتاجية في لوحة تبلغ 384 بئرًا باستخدام تقنية طرد قطرات القطرة الصوتية. وتستغرق وقتا طويلا، وعرضة للخطأ صرف الحمض النووي ومتعددة، ولكن أيضا الاستغناء عن الكاشف transfection، هي البرمجيات التي يحركها جهاز nanodispenser. ثم يتم زرع الخلايا في هذه الآبار المملوءة مسبقا.

Abstract

نقل الخلايا، لا غنى عنه للعديد من الدراسات البيولوجية، يتطلب السيطرة على العديد من المعلمات لتحقيق إنجاز دقيق وناجح. في معظم الأحيان يؤديها في الإنتاجية المنخفضة، وعلاوة على ذلك تستغرق وقتا طويلا وعرضة للخطأ، حتى أكثر من ذلك عند تعدد البلازميدات. قمنا بتطوير طريقة سهلة وسريعة ودقيقة لتنفيذ نقل الخلايا في تخطيط لوحة 384-well باستخدام تقنية طرد قطرات الصوتية (ADE). ويستند جهاز nanodispenser المستخدمة في هذه الدراسة على هذه التكنولوجيا ويسمح تسليم نانوحجم دقيق بسرعة عالية من لوحة مصدر جيدا إلى وجهة واحدة. فإنه يمكن الاستغناء ومتعددة الحمض النووي وكاشف الانف وفقا لجدول بيانات مصممة مسبقا. هنا نقدم بروتوكول الأمثل لإجراء ADE القائم على عالية الإنتاجية البلازمية التغوط الذي يجعل من الممكن للوصول إلى كفاءة تصل إلى 90٪ وcotransfection ما يقرب من 100٪ في تجارب cotransfection. نقوم بتوسيع نطاق العمل الأولي من خلال اقتراح ماكرو يستند إلى جداول البيانات سهلالاستخدام، وقادر على إدارة ما يصل إلى أربعة بلازميدات/آبار من مكتبة تحتوي على ما يصل إلى 1536 بلازميدات مختلفة، وتطبيق دليل الأنابيب المستندة إلى الكمبيوتر اللوحي. يقوم الماكرو بتصميم القالب (القوالب) الضرورية للوحة (لوحات) المصدر ويقوم بإنشاء الملفات الجاهزة للاستخدام للتطبيق المستند إلى nanodispenser والكمبيوتر اللوحي. بروتوكول الانتقطاع أربع خطوات ينطوي على ط) الاستغناء عن مخفف مع معالج السائل الكلاسيكية، '2' توزيع بلازميد ومتعددة، '3' كاشف الانعتراب الاستغناء عن موزع النانو، و 4) طلاء الخلايا على الآبار المملوءة مسبقا. تسمح السيطرة الموصوفة المستندة إلى البرامج من تعدد الإرسال والتغوط بلازميد ADE حتى غير المتخصصين في الميدان بإجراء عملية نقل خلايا موثوق بها بطريقة سريعة وآمنة. تتيح هذه الطريقة التعرف السريع على الإعدادات المثلى لنوع خلية معين ويمكن نقلها إلى نهج أعلى مقياسوية ويدوية. ويخفف البروتوكول من التطبيقات، مثل بروتين ORFeome البشري (مجموعة من إطارات القراءة المفتوحة في الجينوم) أو التحقق من صحة وظيفة الجينات المستندة إلى CRISPR-Cas9، في استراتيجيات الفحص غير المجمعة.

Introduction

تصف الطريقة المعروضة هنا بالتفصيل كيفية إجراء تعدد الإرسال والتركيب الحمض النووي في خلايا الثدييات ذات الإنتاجية العالية باستخدام موزع نانوي سائل صوتي في لوحة تبلغ مساحتها 384 بئرًا، حتى لغير المتخصصين في هذا المجال. يسمح هذا الأسلوب1 نشرت مؤخرا أداء ما يصل إلى 384 حالة متعددة الحمض النووي بلازميد مستقلة وأجهزة التغوط في تجربة واحدة، في أقل من 1 ح. كانت التجارب واحدة أو cotransfection ناجحة، لتصل إلى ما يقرب من 100٪ التكفين داخل السكان الخلايا المنقولة. يجعل هذا البروتوكول التغوط أسهل لأن معظم الخطوات المملة والمستهلكة للوقت والمعرضة للأخطاء هي الآن مدفوعة بالبرامج (راجع الشكل 1 للحصول على نظرة عامة). وقد بُذلت جهود أخرى لوضع أدوات مكرسة لتعزيز سهولة الاستخدام مع تجنب الأخطاء البشرية خلال العملية ككل وتشجيع التغوط الناجح حتى لغير المتخصصين في الميدان. يتضمن البروتوكول الموصوف جدول بيانات ماكرو "سهل الاستخدام" قمنا بتطويره من أجل إدارة 384 حالة تحويل مستقلة مع إمكانيات تعدد المضاعفات تصل إلى أربعة بلازميدات في كل بئر. يقوم الماكرو تلقائياً بإنشاء قوالب لوحة (لوحات) المصدر لتحميل وحدة تخزين بلازميد الحمض النووي المتوقعة من بدء حلول المخزون والملفات المطلوبة لدفع برنامج nanodispenser على التصميم التجريبي الذي تم إدخاله. كما الاستغناء اليدوي للحمض النووي في لوحة مصدر 384 جيدا مملة وعرضة للخطأ، كما قمنا بتطوير تطبيق مخصص المستندة إلى قرص لتوجيه المستخدم في حين الاستغناء عن محلول الحمض النووي وفقا للقالب.

Figure 1
الشكل 1: سير العمل التجريبي. التمثيل التخطيطي لبروتوكول الانعطاف العكسي الآلي الأمثل (من التصميم التجريبي إلى الاستخدام البيولوجي المخصص). تتم الإشارة إلى الخطوات اليدوية بواسطة رمز اليد ويتم كتابة الوقت التقريبي لكل خطوة في مربع أحمر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

العديد من التجارب القائمة على الخلايا تبدأ مع نقل الحمض النووي بلازميد، وحتى لو كان العديد من الكواشف المخصصة ولا تزال قيد التطوير لتعزيز كفاءة التغوط و / أو تخفيف الإجراء، لا يزال هناك الكثير الذي يتعين القيام به2،3 , 4.الحمض النووي بلازميد خلية التغوط ينطوي على عدة خطوات للوصول إلى كفاءة عالية، مثل التناول الأولي المعقد، والهروب الانزودوم، ونقل السيتوبلازمية إلى النواة 5،6. بالإضافة إلى هطول الكالسيوم أو التقنيات الفيزيائية مثلالكهربائي أو الحقن الدقيق باستخدام أجهزة مخصصة 7، ركزت الأساليب الكيميائية الحديثة على تعزيز تسليم خلايا الحمض النووي مع خفض السمية الخلوية الخلية8، 9. استخدام الدهون أو البوليمرات الموجبة تشكيل المجمعات مثل liposome، ومؤخرا، نظم الكيمياء البوليمرية nonliposomal جعلت التغوط أسهل وأكثر كفاءة10. وعلى الرغم من هذه التطورات، لا يزال نقل الخلايا يتطلب مهارات محددة ليتم تنفيذها بدقة لأن معظم هذه البروتوكولات الفيزيائية الفيزيائية أو الكيميائية تتطلب من العلماء إعداد كل حالة تفاعل عبر الحمض النووي يدوياً، وبالتالي إضعاف الإنتاجية. وللتحايل على هذه المشكلة، تم تطوير بروتوكولات التغوط العكسي باستخدام كواشف الانفال الكيميائي11و12و13، مما يمكّن المستخدم من اختبار أو الجمع بين العديد من البلازميدات بطريقة أسرع. في هذه البروتوكولات ، يتم تشكيل مجمعات الأحماض النووية مع الكواشف عبر التغوط قبل بذر الخلايا على المجمعات. ومع ذلك، لا تزال هذه البروتوكولات العكسية محدودة بالمعالجة اليدوية لحلول الحمض النووي والجمع بين كل من الشروط المستقلة. على الرغم من أنه من الممكن تنفيذها في شكل لوحة 96 جيدا، وإعداد الحمض النووي والاستغناء ستكون مملة، ومن المرجح أن تكون هناك أخطاء. عندما تكون هناك حاجة إلى كميات مختلفة من بلازميدات الحمض النووي عدة وتعدد مع بعضها البعض، وتبديل الخلايا يصبح أكثر صعوبة لتحقيق وأكثر استهلاكا للوقت، والأخطاء البشرية تصبح حتمية جدا. يصبح الارتقاء إلى شكل لوحة 384 بئر في نهج التغوط العكسي، على الرغم من عدد قليل من ظروف الانف من الحمض النووي المتعدد، تحديا مستحيلا بسبب الأسباب التالية. '1' كميات الحمض النووي، أو كاشف التغوط، أو أحجام خليط التفاعل التي يجب إدارتها أقل من 1 ميكرولتر لكل بئر. '2' يصبح تعدد الإرسالات لـ 384 حالة مستقلة معقداً للغاية. التسليم في كل من الآبار 384 هو أيضا 3) تستغرق وقتا طويلا للغاية و '4' عرضة للخطأ. والواقع أن الاستغناء عن الحل الصحيح في الآبار المتوقعة من الصعب إدارته لأن الأحجام المنخفضة التي تم صرفها بالفعل لا تسمح بالمراقبة البصرية بين الآبار الفارغة والمملوءة بالفعل. v) وأخيرا، هناك خطر كبير من تجفيف الخليط عن طريق التبخر قبل إضافة الخلايا بسبب الوقت اللازم لتنفيذ الخطوات اللازمة الاستغناء. وباختصار، يبدو أن العامل المقيد لإعداد اختبارات الاستئصال بلازميد الحمض النووي عالية الإنتاجية هو تصغير الاختبار، مما يعني تعدد الإرسال والإدارة بكميات منخفضة والتي لا يمكن معالجتها يدوياً بعد الآن ولكن هاهي أيضاً بالكاد يمكن تحقيقها في طريقة موثوق بها من قبل معالجات السائل حول الاستاتيكيه الكلاسيكية.

وكدليل على صعوبة أتمتة مثل هذه الاختبارات والحصول على الإنتاجية العالية، لم يتم نشر سوى عدد قليل من المحاولات لأتمتة التغوط: شكل لوحة 96 بئر باستخدام جهاز مناولة السائل التجاري وهطول الأمطار فوسفات الكالسيوم14 ومؤخرا، كاشف lipoplex، ورقاقة microfluidic تمكين 280 transfections مستقلة15 ولكن تتطلب مهارات متخصصة في هذا المجال. طريقة أخرى، acoustophoresis، مما يسمح رفع السائل ويؤدي إلى التلاعب السائل وخلط، واستخدمت لأداء التغوط الحمض النووي في 24- إلى 96 جيدا أشكال لوحة16. وعلى الرغم من أن هذا النهج ممكن، إلا أنه يعاني من انخفاض شديد في الإنتاجية لأن اختلاط الخلايا بخليط الانفعالات الحمض النووي يتطلب حضانة 60 درجة لكل نقطة قبل البذر. وهذا يعني مدة لا تقل عن 96 دقيقة للوحة كاملة 96 جيدا. وعلاوة على ذلك، فإن هذا البروتوكول بعيد كل البعد عن أن يكون قابلاً لجمهور علماء الأحياء عموماً لأن هذا العمل قد أنجز باستخدام جهاز داخلي مصمم ومصنع غير متوفر حالياً في السوق. على العكس من ذلك، في السنوات القليلة الماضية، ظهرت تكنولوجيا صرف سهلة الاستخدام تستند إلى البرمجيات والصوتية مع أجهزة موزع نانوحجم. باستخدام الطاقة الصوتية المركزة، تسمح هذه الأجهزة بالطرد بإحكام للأحجام السائلة الصغيرة من 2.5 نل إلى 500 نل من لوحة المصدر إلى وجهة واحدة17. هذه التكنولوجيا، وتسمى طرد قطرات الصوتية (ADE)، لديها العديد من المزايا: أنها مؤتمتة بالكامل، لا تلامس، tipless، دقيقة، ودقيقة، واستنساخ للغاية، ولها نسبة عالية من الإنتاجية18. أول مكرسة لتقديم حلول كبريتيد ثنائي الميثيل (DMSO)، وقد تم تعزيز إعدادات لتوزيع المخازن المؤقتة المائية19. ثم، تبدو موزعات النانو الصوتية مناسبة لبروتوكولات نقل الخلايا العكسية ويمكن أن تتحايل على معظم القيود اليدوية المذكورة أعلاه. وبما أنه لم يتم وصف أي محاولات للمُخِّل البلازميد باستخدام هذه التكنولوجيا، فقد قمنا مؤخرًا بتقييم مدى ملاءمة نظام الاستغناء الصوتي لأداء عمليات نقل الخلايا العكسية.

الاستفادة من الإنتاجية nanodispenser وسهولة الاستخدام، ونحن الأمثل بروتوكول التغوط العكسي لخلايا HeLa عن طريق عبر اختبار العديد من المعلمات التي يمكن أن تؤثر على الحمض النووي transfection على 384 جيدا، لوحة واحدة، وهي كمية الحمض النووي الإجمالي و مصدر تركيز الحمض النووي بداية، حجم مخفف، كاشف التغوط، وعدد من الخلايا انتشار. يتحايل البروتوكول المطور على القيود اليدوية الموصوفة أعلاه لسلك الخلايا ويعرض العديد من المزايا على محاولات الانسياق الآلي الأخرى. أولا، هو مصغرة، مما يسمح لكاشف الانفعال من حيث التكلفة عن طريق حفظ الاستعدادات بلازميد الحمض النووي وكاشف التغوط. ثانيا، هو أكثر من ذلك بكثير عالية الإنتاجية واستنساخها من البروتوكول اليدوي (حتى للمبتدئين)، كما يمكن تحقيق التغوط من لوحة 384 جيدا كامل في أقل من 1 ساعة. وأخيرا، هو البرمجيات يحركها، مما يسمح للسيطرة على كمية الحمض النووي الاستغناء عنها ومضاعفات من العديد من بلازميدات. في الواقع، وذلك بفضلبرنامج nanodispenser (جدول المواد)، يمكن للمستخدم وضع خطة دراسية للسيطرة على وحدات التخزين التي سيتم الاستغناء عنها من مصدر محدد لوحة جيدا إلى وجهة واحدة.

البروتوكول المعروض هنا مخصص بشكل رئيسي لأولئك الذين لديهم إمكانية الوصول إلى موزع نانوويرغبون في إعداد تجارب التغوط بالإنتاجية العالية، ولكن أيضًا لأولئك الذين يرغبون في تحسين معلمات الانفبنسبة بسرعة لنوع خلية معين من خلال تطبيق هذا البروتوكول لاختبار عدة معلمات في الإنتاجية العالية. وفي الواقع، أظهرنا أن البارامترات المحسنة المحددة بهذا البروتوكول على نطاق نانوي يمكن نقلها إلى تجارب عمليات الانعترا بالكامل وعلى نطاق أوسع. وأخيراً، بما أن كاشف الانفة المستخدمة في هذا البروتوكول يسمح بالحمض النووي أو الكسر في الحمض النووي وفقاً للشركة المصنعة، فإن البروتوكول يهم أيضاً أولئك الذين يهدفون إلى تنفيذ نُهُج الصفيف للإفراط في التعبير الجيني أو الضربة القاضية. لوحات الوجهة المليئة مسبقا مع الحمض النووي يمكن الحفاظ عليها تصل إلى 7 أيام قبل استخدامها في اختبار التغوط دون فقدان الفعالية، والتي هي ميزة أخرى من البروتوكول التالي لهذا النوع من التطبيق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1 - الأعمال التحضيرية المسبقة

  1. إعداد برامج معالج السائل التمعجي
    ملاحظة: للحصول على خطوات الاستغناء عن الخلية والخلية من البروتوكول، يجب إعداد برنامج مخصص، مع الأخذ في الاعتبار ارتفاع رأس الاستغناء إلى اللوحة المستخدمة والقصد الخطوة.
    1. بالنسبة لخطوة الاستغناء عن الاستغناء عن الديّة 1 ميكرول، قم بتركيب كاسيت 1 ميكرولتر وإعداد برنامج مع الإعدادات الموضحة في الخطوتين 1-1-1-1 و1.1.1.2.
      1. ضبط معلمة معدل التدفق إلى عالية للحصول على أفضل الإنتاجية كما لا يتوقع أي ضرر المواد البيولوجية في هذه الخطوة. ضبط ارتفاع الاستغناء إلى 9.6 ملم (وفقا للوحة ثقافة الخلية المستخدمة، الشكل التكميلي1) للسماح لإسقاط 1 درجة مئوية للمس الجزء السفلي من الآبار أثناء الاستغناء.
        ملاحظة: هذه الخطوة حاسمة لتجنب الاحتفاظ قطرات على رئيس الاستغناء حتى الوصول إلى حجم كاف لإسقاط.
      2. ضبط ارتفاع لوحة واضحة إلى 14.4 ملم للسماح التشريد الحر من رئيس الاستغناء على لوحة بعد الاستغناء عن كل صف. التحكم بصريا في الإعدادات المناسبة لارتفاع رأس معالج السائل التمعجي: تأكد من عدم الاحتفاظ بأي قطرات على نصائح الاستغناء أثناء الاستغناء والتحقق من أن الرأس مرتفع بما فيه الكفاية للسماح بإزاحة الرأس بعد الاستغناء عن كل صف.
        ملاحظة: تجنب الاحتفاظ قطرة معلمة حاسمة كما أنها سوف تضعف دقة حجم الاستغناء.
    2. لتوزيع تعليق الخلية 40 درجة مئوية، قم بتركيب كاسيت 10 ميكرولتر وإعداد برنامج مع الإعدادات الموضحة في الخطوات 1.1.2.1-1.2.2.
      1. ضبط المعلمة معدل التدفق إلى منخفض لتوزيع الخلايا بسرعة منخفضة لتجنب تعزيز الأضرار المحتملة للخلايا عن طريق الإجهاد القص وتأثير كبير على الجزء السفلي من الآبار. ضبط ارتفاع الاستغناء إلى 11.43 ملم (وفقا للوحة ثقافة الخلية المستخدمة، الشكل التكميلي1)، عالية بما يكفي لخفض تأثير الخلية على الجزء السفلي من الآبار خلال عملية الاستغناء ولكن منخفضة بما فيه الكفاية لتجنب الاحتفاظ قطرات على صرف الرأس. ضبط ارتفاع لوحة واضحة إلى 16 ملم للسماح التشريد الحر من رئيس الاستغناء على لوحة بعد الاستغناء عن كل صف.
      2. التحكم بصريا في الإعدادات المناسبة لارتفاع رأس معالج السائل التمعجي: تأكد من عدم الاحتفاظ بأي قطرات على نصائح الاستغناء أثناء الاستغناء والتحقق من أن الرأس مرتفع بما فيه الكفاية للسماح بإزاحة الرأس بعد الاستغناء عن كل صف.
        ملاحظة: تجنب الاحتفاظ بالإفلات معلمة هامة كما أنها سوف تؤدي إلى الاستغناء عن رقم خلية غير موثوق بها.
  2. إعداد بلازميد الحمض النووي (بروتوكول استخراج مصغرة الكلاسيكية)
    1. تنمو سلالة البكتيريا DH5α تحول في LB المتوسطة تستكمل مع 125 ميكروغرام/ مل أمبيسيلين اختيار المضادات الحيوية (جدول المواد) بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية وتحت التحريض لطيف (200 دورة في الدقيقة) على شاكر المداري (جدولالمواد).
    2. حصاد 2 مل من الثقافة، بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 6000 × ز، وتجاهل supernatant.
    3. إعادة تعليق بيليه الخلية مع 250 درجة مئوية منالعازلة إعادة تعليق تحتوي على RNase A (جدول المواد). إضافة 250 درجة مئوية من العازلة lysis وحضانة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    4. وقف رد فعل lysis عن طريق إضافة 300 درجة مئوية من العازلة تحييد (جدولالمواد)ودوامة قريبا. الطرد المركزي الأنابيب لمدة 5 دقائق في 11،000 × ز.
    5. وضع عمود مصغر بلازميد جديد (جدولالمواد)في أنبوب جمع 2 مل وdecant supernatant في العمود عن طريق الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة في 11،000 × ز.
    6. تجاهل التدفق من خلال ووضع العمود المصغر مرة أخرى في أنبوب جمع.
    7. اغسل العمود المصغّر بلازميد بـ500 ميكرولتر من مخزن الغسيل الاختياري (جدول المواد) والطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة عند 11000 × ز،وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة.
    8. تجاهل التدفق من خلال ووضع العمود المصغر بلازميد مرة أخرى في أنبوب جمع.
    9. إضافة 700 درجة مئويةمن العازلة الغسيل (جدول المواد) تستكمل مع الإيثانول والطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة في 11،000 × ز،وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    10. تخلص من التدفق والطرد المركزي العمود المصغر بلازميد وأنبوب جمعها 1X أكثر لمدة 2 دقيقة في 11000 × ز لتجفيف غشاء السيليكا.
    11. ضع العمود المصغّر البلازميد المجفف في أنبوب جديد بسعة 1.5 مل وأضف 30 ميكرولتر من الماء المقطر المُسخّن في درجة حرارة 60 درجة مئوية، واحتضنه لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة، ثم طرد مركزي لمدة دقيقة واحدة عند 11000 × ز.
    12. تخلص من العمود المصغّر بلازميد وحافظ على الإيلات الذي يحتوي على بلازميد الحمض النووي النقي.
    13. قياس تركيز الحمض النووي للحمض النووي المنصهر باستخداممقياس الطيف الضوئي الدقيق (جدول المواد).
      1. قم بتشغيل مقياس الطيف واختر إعدادات قياس الحمض النووي.
      2. رفع ذراع أخذ العينات من مقياس الطيف وماصة 1 ميكرولتر من الماء على قاعدة القياس لإجراء معايرة فارغة.
      3. خفض ذراع أخذ العينات، وبدء القياس فارغة، والانتظار للإنجاز.
      4. رفع ذراع أخذ العينات ومسح العينة من الركائز العليا والسفلى.
      5. ماصة 1 ميكرولتر من محلول الحمض النووي على قاعدة التمثال السفلى لقياسذلك.
      6. خفض ذراع أخذ العينات، وبدء قياس تركيز الحمض النووي، والانتظار للإنجاز.
      7. رفع ذراع أخذ العينات ومسح العينة من الركائز العليا والسفلى.
      8. وللحصول على قياسات تركيز الحمض النووي الأخرى، كرر الخطوات 1-2-13-5-1-2-13-7.
    14. بمجرد الانتهاء من القياسات، قم بتخزين حلول الحمض النووي عند درجة حرارة 4 درجة مئوية حتى يتم استخدامها.

2. التصميم التجريبي وتوليد قوائم الاختيار لدفع الاستغناء القائم على ADE

ملاحظة: تم تطوير ماكرو جدول بيانات "سهل الاستخدام" مخصص لإدارة كميات الحمض النووي وخلط ما يصل إلى أربعة بلازميدات في تنسيق لوحة 384 جيداً. استناداً إلى التصميم التجريبي الذي تم إدخاله، ينشئ هذا الماكرو الملفات الضرورية لدفع بروتوكول تحويل الحمض النووي المستند إلى ADE بواسطة nanodispenser. لإنشاء هذه الملفات، يجب ملء العديد من الحقول في ورقة القالب كما هو موضح في الشكل 2.

Figure 2
الشكل 2 إنشاء قوائم الاختيار لدفع الاستغناء ADE باستخدام ماكرو جدول البيانات. يجب ملء العديد من المعلمات، وهي (1) كاشف الانف (TR) وكميات الحد الأدنى / القصوى لاستخدامها في لوحة المصدر، (2) تركيزات بلازميد الأولية التي سيتم الاستغناء عنها في لوحة المصدر، و (3) تصميم لوحة كاملة، بما في ذلك كميات بلازميد المتوقعة ومتعددة في كل من الآبار 384. (4) إنشاء تنشيط Picklists يسمح للحقول المختلفة ليتم التحقق منها، وبمجرد ملء بشكل صحيح، يتم إنشاء قوائم الاختيار للحمض النووي وTR الاستغناء والقالب لوحة المصدر اللازمة تلقائيا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. أدخل معلمات بروتوكول nanodispenser في الحقول الوردية. تعيين قيمة خليط الكاشف المتحول (TR) إلى 500 نمل. تعيين الحد الأدنى لقيمة الحجم في آبار لوحة المصدر إلى 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: nanodispenser المستخدمة هنا يمكن فقط نقل الحد الأقصى 500 نانولتر في تشغيل واحد من ADE. يتم تعبئة هذه الحقول الوردية مسبقًا بالقيم الموصى بها ولكن يمكن تعديلها وفقًا لاحتياجات المستخدم.
  2. أدخل 100 نانوغرام/ميكرولتر من الحمض النووي بدءاً من التركيزات في الحقول الزرقاء المقابلة للحمض النووي الأساسي.
    ملاحظة: هذه القيمة هي التركيز الأمثل المعرفة مسبقاً ولكن، ومع ذلك، يمكن تعديلها لاحتياجات المستخدم المختلفة.
  3. أدخل كمية الحمض النووي المطلوبة في الحقول الرمادية/ الخضراء. أدخل الكميات والأسماء البلازمية للآبار 384، وضمان نفس الهجاء إذا تم استخدام نفس البلازميد في العديد من الآبار.
  4. إنشاء تصميم لوحة المصدر وملفات قوائم الاختيار وملف دليل توجيه الأنابيب. انقر على إنشاء قوائم الانتقاء للسماح للماكرو لتوليد الحمض النووي-Picklist.csv، وT.R.-Picklist.csv وملفات 384-Wells-Pipetting-Guide.csv من البيانات التي تم جمعها على الورقة المقابلة. إذا طُلب منه ذلك، قم بتصحيح قيم الخلايا المملوءة بالبرتقال لأنها تشير إلى أخطاء أو وحدات تخزين لا يمكن معالجتها بواسطة nanodispenser.
  5. طباعة القالب (القوالب) من ورقة "لوحة المصدر". يشار إلى أسماء بلازميد والحد الأدنى من حجم لملء الآبار. وبالمثل، يشار إلى أحجام خليط كاشف الانف الكاشف التي سيتعين بعد ذلك ملؤها في الآبار التالية على أنها TR وإبرازها باللون الأخضر.

3. الحمض النووي إعداد لوحة مصدر باستخدام تطبيق دليل pipetting 384-well

  1. تخفيف بلازميد الحمض النووي المخزن من الخطوة 1.2.14 إلى 100 نانوغرام/ميكرولتر باستخدام الماء المقطر.
  2. معايرة الشبكة 384 جيدا لأبعاد لوحة: فتح 384 جيدا تطبيق دليلالأنابيب على قرص (الشكل 3). ضع لوحة المصدر على الشبكة على الشاشة السفلية، وفي قائمة المعايرة العلوية اليسرى، انقر فوق + أو - (أو استخدم المؤشر الأحمر) لتحسين أو تقليل حجم الشبكة والآبار من أجل ضبط الآبار الخضراء إلى الآبار الزاوية الأربعة للطبقة .

Figure 3
الشكل 3 استخدام تطبيق دليل الأنابيب 384-well. (1) معايرة الشبكة 384 جيدا لحجم لوحة؛ (2) ) جبل من محول لوحة 3D المطبوعة العالمية إلى الكمبيوتر اللوحي باستخدام الشريط على الوجهين؛ (3) وضع لوحة على المحول؛ (4) إزاحة الشبكة لوسطها إلى لوحة شنت. (5) قفل خطوة المعايرة. (6) افتتاح 384 الآبار pipetting ملف guide.csv. (7) وبالنظر إلى قائمة الملفات، فإن التطبيق يشير إلى اسم لوحة المصدر المتوقع، الكاشف (الحمض النووي أو الكاشف عبر التغوط)، والتركيز، وحجم الاستغناء في الآبار المستهدفة، والتي سيتم مضيئة واحدا تلو الآخر. (8) أزرار الأسهم اليسرى واليسرى تسمح للمستخدم باتباع دليل الأنابيب لتوزيع الكواشف بسهولة وفقا لقالب (ق) لوحة مصدر جدول البيانات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. باستخدام الشريط على الوجهين، قم بتركيب محول اللوحة المطبوع ثلاثي الأبعاد على الشاشة لتجنب حركات اللوحة المصدر أثناء الاستغناء. إذا لزم الأمر، حرك الشبكة المعايرة باستخدام أسهم الدوران وأزرار لأعلى/لأسفل/لليمين/اليسار لضبط الشبكة على الشاشة إلى موضع اللوحة. بمجرد معايرة الشبكة وأحجام الآبار بشكل صحيح ومكانها، ضع علامة في مربع معايرة القفل.
  2. انقر على FILE وفتح 384 الآبار pipetting الملف guide.csv. اتبع تعليمات الشاشة لتوزيع الحجم المشار إليه يدوياً من البلازميد المشار إليه في التركيز المشار إليه في الأبيض أبرز جيدا ً المقابلة للوجهة المستهدفة المناسبة لللوحة المتوقعة. استخدام - أو + الأسهم للعودة أو أبعد من ذلك في عملية توزيع الحمض النووي. توقف عن الاستغناء عند الوصول إلى أول حل كاشف Transfection لتحميل.
  3. بمجرد الانتهاء من توزيعات الحمض النووي، قم بإزالة لوحة المصدر من المحول. إذا كان يجب ملء عدة لوحات المصدر، ثم وضع لوحة مصدر جديد على المحول واتبع تعليمات الاستغناء. وبمجرد الانتهاء من توزيع الحمض النووي، يقوم الطرد المركزي بالطرد المركزي للوحة (لوحات) المصدر المملوءة بالحمض النووي (عند 1500 × ز لمدة 2 دقيقة) لضمان التسوية السائلة المناسبة وإزالة الفقاعات التي تؤدي إلى عدم الدقة في عمليات النقل المستندة إلى ADE.

4. التمعجي السائل المعالج القائم على 1 μL الاستغناء في لوحة الوجهة

ملاحظة: تنفيذ الخطوات 4.1-4.5 في خزانة السلامة البيولوجية.

  1. تطهير 1 € L كاسيت الرأس عن طريق رشهبمطهر رذاذ (جدول المواد)، والسماح لهذا الحل لدخول حامل غيض. امتصاص مطهر بقايا على امتصاص الورق. قم بتركيب كاسيت 1 ميكرولتر على جهاز معالج السائل التمعجي. قم بتشغيل الجهاز وتأكد من صحة إعداد نوع الكاسيت (1 درجة مئوية)، بالإضافة إلى تنسيق اللوحة (384 بئرًا).
  2. تطهير التجويف بأكمله من الأنابيب: إدراج منظم أنبوب (عقد أنابيب ثمانية معا) في وعاء معقمة وملء مع 5 مل من الكحول 70٪. باستخدام وظيفة فتيلة من معالج السائل التمعجي، أولا دافق الكحول في الأنابيب ومن ثم شطفه عن طريق تمرير 5 مل من الماء المقطر و 5 مل من المصل خالية من المتوسطة (دولبكو تعديل النسر المتوسطة [DMEM] تستكمل مع 100 U / مل البنسلين العقدية. جدولالمواد)، وملء على التوالي في نفس السفينة. تأكد من عدم انسداد أي من الطرف عن طريق فحص تدفق السائل بصريا من كل منهم.
  3. قم بتعبئة الأنابيب بوسيلة خالية من المصل عن طريق ملء وعاء معقم جديد بـ 10 مل من الوسط الخالي من المصل المُسخن مسبقاً والغوص معمنظم الأنبوب فيه. اضغط على الزر الرئيسي للمعالج السائل التمعجي لمدة 10 ق تقريبًا. مرة أخرى، تأكد من عدم انسداد أي طرف عن طريق فحص بصريا تدفق السائل من كل منهم.
  4. ملء لوحة مع 1 ميكرولتر من مخفف. ضع لوحة ثقافة معقمة 384 بئر (الوجهة) على حامل لوحة معالج السائل التمعجي وإزالة غطاءه.
  5. تشغيل البرنامج معايرة مسبقا لتوزيع 1 € L في كل بئر من لوحة 384 جيدا. وقت الاستغناء هو ما يقرب من 8 s. ثم استبدال غطاء لوحة 384 جيدا.
    ملاحظة: بدلاً من ذلك، يمكن التعامل مع هذه الخطوة يدوياً، في خزانة أمان، باستخدام micropipette متعددة القنوات.

5 - إجراء دراسة استقصائية للتحكم في الكميات التي يتم توزيعها يدويا

ملاحظة: للحصول على التفاصيل، راجع الشكل 4.

  1. تشغيل برنامج nanodispenser، انتقل إلى علامة التبويب التشخيص، ووضع علامة على لوحة المصدر خارج مربع، وتحميل لوحة المصدر على حامل لوحة، ووضع علامة في لإدخال لوحة. عند المطالبة، حدد 384LDV_AQ_B2 لتعيين nanodispenser إلى وضع الاستغناء المخزن المؤقت المائي، واضغط على موافق.
  2. حدد استطلاع في القائمة المتنوعة وانقر على تشغيل. حدد الآبار المعبأة مسبقا لتحليل وانقر على زر الذهاب. تحقق من أن الأحجام المقاسة تتطابق مع الأحجام المتوقعة وضمان عدم تحميل أي آبار بأحجام تزيد عن 12 ميكرولتر لأن ذلك سيتجنب عمليات النقل.

Figure 4
الشكل 4 تعريف معلمات برامج الاستطلاع. (1) بدء برنامج nanodispenser. (2) فتح علامة التبويب التشخيص. (3) إدراج لوحة المصدر عن طريق وضع علامة خارج للوحة المصدر ، ثم ، في. (4) تعريف نوع لوحة المصدر في القائمة عند المطالبة. (5) في المربع متنوع، حدد مسح في القائمة المنسدلة. (6) إطلاق برنامج المسح من خلال النقر على إطلاق. (7) حدد الآبار المعبأة مسبقا لقياس. (8) بدء التحليل عن طريق النقر على الذهاب. (9) بمجرد إجراء المسح، تتم كتابة المجلدات المقاسة في الآبار المختارة المقابلة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

6. ADE يحركها توزيع الحمض النووي في لوحة الوجهة

  1. تشغيل برنامج picklist، تعيين 384-جيدا المصدر وأنواع لوحة الوجهة إلى 384_LDV وGreiner 384PS_781096، على التوالي (الشكل5). تعيين الجهاز إلى وضع الاستغناء المخزن المؤقت المائي عن طريق تحديد 384LDV_AQ_B2ثم إلغاء تحديد "تحسين نقل الإنتاجية".

Figure 5
الشكل 5 أداء الإعفاءات المستندة إلى قائمة الاختيار: (1) بدء تشغيل برنامج nanodispenser. في علامة التبويب بروتوكول، حدد (2) شكل لوحة عينة ، (3) نوع لوحة الوجهة و (4) الأمم المتحدة "تحسين نقل الإنتاجية". (5) حدد علامة التبويب قائمة الانتقاء. (6) انقر على استيراد وحدد ملف *.csv المناسب (DNA-PickList أو T.R.-Picklist). (7) بمجرد تحديده ، انقر على استيراد. (8) انقر على اللعب وحفظ البروتوكول. (9) إجراء محاكاة الاستغناء عن طريق النقر على محاكاة، أو (10) بدء الاستغناء المبرمج ة عن طريق النقر على تشغيل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. حدد علامة التبويب "اختيار قائمة"، انقر على استيراد، حدد ملف DNA-Picklist.csv. انقر على تشغيل وحفظ البروتوكول. انقر على محاكاة لإجراء محاكاة للالاستغناء المبرمج للتأكد من أن قائمة الاختيار يطابق التصميم التجريبي المتوقع. بمجرد الانتهاء، انقر على إغلاق.
  2. انقر على اللعب، ثم قم بتشغيل، لبدء برنامج الاستغناء: عندما يطلب منك، إدراج لوحة المصدر المطلوبة (حلول الحمض النووي شغلها يدويا) ولوحة الوجهة (المؤن شغلها) في nanodispenser.
    ملاحظة: وقت الاستغناء هو ما يقرب من 5-20 دقيقة للوحة كاملة 384 جيدا، اعتمادا على وحدات التخزين المحددة وإجمالي عدد الاستنات في التصميم التجريبي.
  3. بدلا من ذلك، وقفة البروتوكول هنا كما لوحات مخففة والحمض النووي مليئة يمكن التعامل مع التخزين الجاف أو المجمدة لمدة تصل إلى 7 أيام. للتخزين الجاف، والسماح لوحات تجف على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة ومن ثم تخزينها بنفس الطريقة. ذوبان والطرد المركزي (في 1500 × ز لمدة 2 دقيقة) ألواح مخزنة المجمدة قبل استخدامها في خطوة التغوط (القسم 7).
     

7. ADE يحركها الكاشف التغوط الاستغناء

  1. في خزانة السلامة البيولوجية، تمييع بشكل مؤقت الكاشف الانفذي بالبولي بلفيلكفيلك في وسط خال ٍ من المصل إلى تركيز نهائي 1x. دوامة والاستغناء على الفور هذا المزيج الكاشف transfection وفقا للوحة (لوحات) مصدر محددة مسبقا مصممة من قبل الماكرو واستخدام تطبيق دليل pre2step 384 جيدا الأنابيب كما هو موضح في الخطوة 3.4.
    ملاحظة: لا تطرد لوحة المصدر بمجرد تحميلها بالكاشف حيث لا يلاحظ أي انتراب بعد الطرد المركزي.
  2. قم بتشغيل برنامج nanodispenser لإجراء "مسح" كما هو موضح في القسم 5، من أجل التحكم في أحجام جميع آبار TR المملوءة يدويًا للوحة (لوحات) المصدر لتجنب صرف الأخطاء بسبب أحجام تتجاوز 12 ميكرولتر.
  3. انقر فوق إعادة تعيين لمسح قائمة نموذج قائمة انتقاء الحمض النووي في برنامج picklist ثم تحقق من أن معلمات الجهاز لا يزال يتم تعيين إلى المخازن المؤقتة المائية وإلى أنواع لوحة المصدر والوجهة المستخدمة كما في الخطوة 6.1.
  4. انقر على استيراد واختر ملف TR-Picklist.csv. انقر على اللعب وحفظ البروتوكول إذا طُلب منك ذلك، و (هذا هو اختياريا ولكن ينصح بشدة) إجراء محاكاة للبرمجة الكاشف الكاشف الإعفاءات لضمان التصميم السليم للالاستنمسا عن طريق النقر على زر المحاكاة. بمجرد الانتهاء، انقر على إغلاق.
  5. انقر على اللعب ، ثم قم بتشغيل زر لبدء برنامج الاستغناء: كما هو مطلوب، ضع لوحة المصدر (TR-خليط مليئة) ولوحة الوجهة (مخفف- والحمض النووي مليئة) في nanodispenser.
    ملاحظة: وقت الاستغناء هو أقل من 20 دقيقة للوحة كاملة 384 جيدا عند الاستغناء عن 500 نل من خليط TR.
  6. احتضان 15-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بعد إضافة TR إلى الحمض النووي كما هو مبين في بروتوكول الشركة المصنعة.

8. التمعجي السائل السائل القائم على معالج الخلية الاستغناء

  1. إعداد معالج السائل التمعجي لتوزيع الخلايا. تطهير 10 ميكرولتر كاسيت الرأس عن طريق رشه مع Aniospray تصفح 29 مطهر وامتصاص بقايا على الورق. قم بتركيب الكاسيت على جهاز معالج السائل التمعجي، وتغيير إعداد نوع الكاسيت إلى 10 ميكرولتر، وتأكد من تعيين تنسيق اللوحة إلى 384 بئرًا.
  2. تطهير أنابيب كاسيت 10 درجة مئوية كما هو موضح سابقا في الخطوة 4.2. الغوص منظم أنبوب في وعاء معقمة ودافق الأنابيب مع 5 مل من الكحول 70٪، ثم مع 5 مل من الماء المقطر، وأخيرا، مع 5 مل من المصل خالية من المتوسطة، شغلها على التوالي في نفس السفينة وحتى كل أنبوب فارغ.
  3. إعداد تعليق الخلية للصرف. من طبق خلية HeLa B10-culture، اغسل الخلايا 1x بمحلول ملحي 1x بالفوسفات المخزن (PBS)، ثم فصل الخلايا باستخدام التربسين/إدتا لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  4. تحقق من تفكك الخلية تحت المجهر ووقف عمل التربسين / EDTA عن طريق إضافة 10 مل من المتوسط الكامل (DMEM تستكمل مع 10٪ مصل البقر الجنيني و 100 U / مل البنسلين-ستريبتوميسين؛ انظر جدولالمواد) في طبق الثقافة. حصاد الخلايا في أنبوب 50 مل وعد الخلايا تحت المجهر، وذلك باستخدام خلية Malassez أو عداد الخلية التلقائي.
  5. إعداد ما لا يقل عن 25 مل من تعليق خلية HeLa بتركيز 37,500 خلية/مل في وسط كامل (أي 1,500 خلية/40 درجة مئوية) للوحة كاملة 384 بئر, لضمان فتيلة أنبوب و 40 درجة مئوية / جيدا الاستغناء.
  6. لتوزيع الخلايا، ملء وعاء معقم جديد مع تعليق الخلية المعدة وتحريكها لتجنب الترسيب مما يؤدي إلى عدم دقة في كثافة الخلية من الاستغناء. أدخل منظم الأنبوب في هذا الحل واضغط على زر Prime حتى يبدأ تعليق الخلية في التدفق من رأس التوزيع. تأكد من عدم انسداد أي من البقشيش عن طريق فحص تدفق السائل بصريا من كل منهم، وضمان تحميل كل أنبوب مع تعليق الخلية.
  7. قم بتحميل الحمض النووي ولوحة الوجهة 384-well المليئة بـ TR على حامل لوحة معالج السائل التمعجي وإزالة غطاءه. قم بتشغيل البرنامج المعاير مسبقًا لتوزيع 40 ميكرولتر من تعليق الخلية على اللوحة الكاملة التي تبلغ مساحتها 384 بئرًا (أي 1500 خلية/بئر). وقت الاستغناء حوالي 8 s. استبدال غطاء لوحة 384 جيدا.
    ملاحظة: بدلاً من ذلك، يمكن الاستغناء عن تعليق الخلية 40 درجة مئوية يدويًا باستخدام ميكرومازيت متعدد القنوات.

9. العرف التحقيق البيولوجي (خلية رصد كفاءة التغوط)

ملاحظة: بعد الإعدادات التجريبية والغرض من التجربة، استخدم الطرق المطلوبة للإنارة، والفلورة، وفحص المحتوى العالي، والنسخ العكسي تفاعل سلسلة بوليميراز كمي (RT-qPCR). في هذا القسم من البروتوكول، يتم تقييم كفاءة نقل الخلايا عن طريق الفحص المجهري المؤتمت وتحليل الصورة.

  1. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 في جو مشبعة بالماء وحتى التعبير البروتين السليم.
    ملاحظة: هنا، يتم استخدام وقت حضانة 48 ساعة لخلايا HeLa لمراقبة كفاءة التغوط، وذلك باستخدام tdTomato- وmVenus-expressing plasmids.
  2. إزالة وسط الثقافة 48 ساعة بعد trans-transfection عن طريق عكس لوحة، إضافة 30 درجة مئوية / جيدا من 10٪ فورمالين باستخدام معالج السائل التمعجي (10 × كاسيت)، وحضانة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. إزالة formalin عن طريق عكس لوحة. ثم، حضانة الخلايا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع 0.1 نانوغرام / مل Hoechst المخففة في 1X PBS الحل.
  4. اغسل الخلايا 3x لمدة 15 دقيقة مع 80 ميكرولتر من 1x PBS المعدلة إلى درجة الحموضة = 8 من أجل استعادة إشارة الفلورة العالية المفقودة من قبل 6.9 درجة الحموضة من الخطوة الحضانة الحل formalin.
  5. باستخدام مجهر الفلورسنت الآلي، والحصول على صور من اثنين أو ثلاثة قنوات الفلورسنت (Hoechst، tdTomato، وmVenus) بالتتابع مع أهداف 10X ومجموعة تصفية الانبعاثات المناسبة (4′، 6-دياميدينو-2-فينيليندول [DAPI]، dsRed، وfluorescein إيزوثيوسيانات [FITC]، على التوالي).
  6. لتقييم كفاءة التغوط، استخدم برنامج تحليل الصور لتحديد كفاءة التغوط باستخدام تحليل البرنامج النصي استنادًا إلى تلطيخ النوى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

fIn لتحديد ما إذا كان يمكن استخدام تكنولوجيا ADE لبروتوكول الانقباة العكسية الآلي، رصدنا كفاءة الانفذيب الخلوي عن طريق الفحص المجهري الفلوري، وذلك باستخدام tdTomato الفلورسنت الأحمر التعبير عن بلازميد. تهدف أولاً إلى تحديد أفضل معلمات التغوط، وأحجام مخففة مختلفة وكميات إجمالية من الحمض النووي تم اختبارها عبر. وقد استخدم حجم مخفف للسماح لقطرات الحمض النووي، بمجرد الاستغناء عنها، بالانتشار في جميع أنحاء الآبار للتحايل على الانفذيب غير المتجانس الذي لوحظ في التجارب الأولية (أي فقط في وسط الآبار). كما هو مبين في الشكل 6A، كان الانف من خلايا HeLa باستخدام كاشف lipopolyplex20 ناجحة. ومن المثير للاهتمام، باستخدام حجم مخفف 1 ميكرولتر، أظهرت كميات الحمض النووي التي تتراوح بين 5 إلى 30 نانوغرام نفس الكفاءة وتصل إلى 90٪ نقل الخلايا مقارنة بكميات أعلى، مثل 50 و 100 نانوغرام، والتي لوحظ انخفاض مفاجئ. حاولنا أحجام مخففة مختلفة تتراوح بين 15 نانوكل إلى 4 ميكرولتر وحدد 1 ميكرولتر لتكون أفضل حالة، كما هو موضح بشكل ملحوظ هنا باستخدام 30 نانوغرام من الحمض النووي.

Figure 6
الشكل 6 النتائج التمثيلية: (أ) تأثير كمية الحمض النووي وحجم مخفف على كفاءة الانتبر. كانت خلايا HeLa عكس transfected باستخدام جهاز nanodispenser وlipopolyplex، وذلك باستخدام تركيز 1X كما أوصت الشركة المصنعة. من الموصى بها مخفف (المصل خالية من المتوسطة)، تم استخدام 15-4000 نانوكل مع 10-100 نانوغرام كميات من بلازميد أحمر الفلورسنت التعبير (tdTomato). تم تحديد كفاءة الانقباة 48 ساعة بعد الانتراب باستخدام برامج التحليل المستندة إلى الصور. يتم التعبير عن النتائج كنسبة مئوية من الخلايا المتحولة لكمية الحمض النووي المتزايدة، ويظهر حجم مخفف الظروف المثلى: 30 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي مع زيادة حجم مخفف و1 ميكرولتر من مادة مخففة مع زيادة كميات الحمض النووي. تمثل أشرطة الخطأ SEM مع n ≥ 4. واستُخدمت كل من ANOVA وBonferroni في اتجاهين لإجراء تحليل إحصائي. *p < 0.05 مقارنة مع النقاط الأخرى. (ب) استقرار لوحات الحمض النووي المعدة. تم الاستغناء عن مادة مخففة (1 درجة مئوية) باستخدام معالج السائل التمعجي، وتم الاستغناء عن 30 نانوغرام من الحمض النووي ونقلها على الفور باستخدام كاشف lipopolyplex الاستغناء عنه من قبل ADE (السيطرة) أو إما تخزينها في درجة حرارة الغرفة مرة واحدة جافة أو مجمدة في -20 درجة مئوية. في الأيام 0 أو 2 أو 7، تم إعادة ترطيب الحمض النووي الجاف مع 1 ميكرولتر من مخفف الاستغناء باستخدام معالج السائل التمعجي، وذابت لوحات مجمدة في درجة حرارة الغرفة والطرد المركزي (في 1500 × ز لمدة 2 دقيقة). ثم بذرت الخلايا باستخدام معالج السائل التمعجي وفقا للبروتوكول الموصوف. تمثل أشرطة الخطأ SEM مع n ≥ 3. واستُخدمت كل من ANOVA وBonferroni في اتجاهين لإجراء تحليل إحصائي. ns = مختلف بشكل غير ملحوظ. (C) بلازميد الحمض النووي كفاءة cotransfection. تم نقل خلايا HeLa مع 30 نانوغرام من mVenus- و tdTomato-express plasmid تحميلها في اثنين من الآبار مصدر منفصلة (باستخدام نسبة 1.7 من الزهرة على tdTomato من أجل تسوية إنتاجها الفلورة النسبية). تمت مقارنة كفاءة الانعترا بـ 48 ساعة بعد الانتراب باستخدام برامج التحليل المستندة إلى الصور وتم التعبير عنها كنسبة مئوية من الخلايا المتحولة ونسبة مئوية من الخلايا المتحولة داخل السكان المتحولين. تم تحديد النسبة المئوية للخلايا الكترانسفيكت عن طريق حساب رقم الخلية الخضراء- الفلورية في الخلايا السكانية الفلورية الحمراء. تمثل أشرطة الخطأ SEM مع n ≥ 3. واستُخدمت كل من ANOVA وBonferroni في اتجاهين لإجراء تحليل إحصائي. ns = مختلف بشكل غير ملحوظ. (د) المجالات التمثيلية للتنظير المجهري الفلوري من الحصول على الصورة المبينة في اللوحة C باستخدام ثلاث قنوات فلورية (Hoechst و tdTomato وmVenus) تم الحصول عليها بالتتابع بواسطة منصة تصوير (جدولالمواد) ) ، باستخدام أهداف 10x ومجموعة فلتر الانبعاثات المناسبة (DAPI وdsRed وFITC على التوالي). تم تعديل هذا الرقم من كولن وآخرون1. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ومن أجل زيادة تعزيز الإنتاجية لهذا البروتوكول، قمنا بعد ذلك بفحص ما إذا كان من الممكن تخزين مخزن لوحات المصدر المملوء مسبقاً بالحمض النووي وحلول مخففة واستخدامه في مرحلة لاحقة. تم اختبار طريقتين لتخزين الحمض النووي بكفاءة، وهما تخزين الجافة لوحة عن طريق السماح لها الجافة على مقاعد البدلاء أو التخزين المجمدة (في -20 درجة مئوية). كلا أساليب التخزين لم تؤد إلى نتائج مختلفة إلى حد كبير من محلول الحمض النووي الاستغناء حديثا المخزنة لمدة تصل إلى 7 أيام (الشكل6B)،وكلا الأسلوبين جعلت من الممكن إجراء عمليات الانفص من لوحات الحمض النووي المخزنة مسبقة، مثل بنك البلازميدات.

وأخيرا، كما يحدث في معظم الأحيان التغوط بلازميد باستخدام اثنين على الأقل من بلازميدات مختلفة، ونحن بعد ذلك فحص القدرة على تعدد الحمض النووي من البروتوكول المعروض هنا باستخدام أفضل الظروف المحددة (1 ميكرولتر من مخفف و 30 نانوغرام من الحمض النووي). تم تعديل tdTomato المستخدمة سابقا الأحمر الفلورسنت البروتين التعبير عن بلازميد للتعبير عن mVenus، بروتين الفلورسنت الأصفر مشرق، وكلاهما ثم استخدمت في محاولات cotransfection. الأحمر أو الأخضر الفلورسنت إيجابية تحليل الخلية (الشكل6C)أظهرت كفاءة التغوط أن يكون حوالي 80٪؛ ومع ذلك، في السكان الحمراء، ما يقرب من 100٪ من الخلايا كانت أيضا cotransfected مع بلازميد mVenus-express كما يمكن أن نرى في تحليل الصورة المستندة إلى البرمجيات التمثيلية من الشكل 6D.

الشكل التكميلي 1: رسم بياني يبين ارتفاع الاستغناء مناسبة للقطرة للمس الجزء السفلي من البئر لتجنب الاحتفاظ بها على طرف الاستغناء. على اليسار، تسمح الإعدادات المناسبة للانخفاض بالانتشار على سطح البئر مع تجنب الاحتفاظ به على نصائح الاستغناء. على اليمين، تؤدي الإعدادات السيئة إلى الاحتفاظ بقطرات التي يمكن ملاحظتها أثناء حركة الرأس إلى الخام التالي. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يتطلب إنشاء وتحسين طريقة نقل عالية الإنتاجية دقيقة لخط خلية معين من العلماء اتباع بعض المعلمات الرئيسية الموضحة في هذا القسم. ونحن نشجع بقوة بدءا من القيم الموصى بها في جميع أنحاء البروتوكول كما أثبتت هذه الإعدادات الأمثل لخلايا HeLa أيضا أن تكون فعالة لخلايا HEK. ومع ذلك، كما أن أفضل المعلمات قد تعتمد على خطوط الخلايا والكواشف transfection، يمكن تحديد الظروف المثلى عن طريق تغيير عدد الخلايا، وحجم مخفف، وكمية الحمض النووي الإجمالي، وطبيعة الكاشف transfection، والتركيز، أو حتى حجم المستخدمة كما كان حالة خلال التحسين من هذا البروتوكول لخلايا HeLa1.

وقد تم تطوير البروتوكول العام المعروض هنا وجرى تحسينه بشكل أكبر للسماح بتبديل الخلايا حتى من قبل المبتدئين في هذا المجال. من أجل تحقيق هذا الهدف، تم تطوير أدوات رئيسية لجعل البروتوكول بسيطًا قدر الإمكان وتجنب الأخطاء البشرية: ماكرو جدول بيانات سهل الاستخدام لتصميم التجربة بسهولة وتطبيق لوحي لتوجيه المستخدم لملء المصدر بشكل صحيح لوحة (ق).

وبالتالي، ولضمان موثوقية البروتوكول، لا بد من عدم الرقابة إلا على بضع خطوات حاسمة هي: '1' تصميم تجريبي سليم؛ '2' تصميم تجريبي سليم؛ '3' تصميم تجريبي سليم؛ '3' تصميم تجريبي سليم؛ '3' تصميم تجريبي سليم؛ '3' تصميم تجريبي سليم؛ '3' تصميم تجريبي سليم؛ '3' تصميم تجريبي سليم؛ '3' تصميم تجريبي سليم؛ '3 '2' الاستنهات التمعجي السليم من معالج السائل التمعجي الكلاسيكي؛ '3' الحمض النووي السليم والاكلر المتحول القائم على التوزيعات الصوتية؛ '4' تجنب الطرد المركزي للوحة المصدر قبل الاستغناء عن كاشف الانسياق لأن ذلك يبدو أنه يضعف التغوط. اتباع هذه التوصيات القليلة من شأنه أن يضمن كفاءة نقل الخلايا.

التصميم التجريبي السليم

تم إجراء الإعداد التجريبي سهل الاستخدام من خلال تطوير جدول بيانات الماكرو الذي يجب فقط أن يتم ملؤه باسم بلازميدس الحمض النووي المتوقع، والكمية المطلوبة، وبعض قيم المعلمات الرئيسية. بمجرد تعبئتها، يقوم الماكرو أولاً بتحليل المعلمات التي تم إدخالها للكشف عن الأخطاء المحتملة، مثل وحدات التخزين القصوى والقصوى المناسبة التي تم إدخالها لآبار المصدر ووحدة تخزين توزيع كاشف الانشف. وعلاوة على ذلك، واستنادا إلى تركيزات الحمض النووي التي دخلت في كل من الصفوف الأربعة الممكنة وكمية البلازميد التي دخلت في الحقول الأساسية، يتحقق الماكرو مما إذا كانت الأحجام المتوقعة للصرف هي مضاعفات 2.5 نمل (حجم القطرات التي تصرفها نانوموزع). بمجرد إجراء فحص لأي أخطاء، يقوم الماكرو بحساب المبلغ الإجمالي لكل عينة من عينات الحمض النووي التي يجب الاستغناء عنها، ثم يقوم بتصميم قالب اللوحة المصدر (عن طريق فرز أسماء الحمض النووي بالترتيب الأبجدي). تأخذ وحدات التخزين المشار إليها في لوحة (لوحات) المصدر في الاعتبار وحدات تخزين العمل المتوقعة في بئر مصدر (محسوبة من قيم وحدة التخزين الدنيا والقصوى المعبأة في ورقة القالب). ثم يتم كتابة جميع الإعفاءات الحمض النووي المتوقعة في كل من الآبار على ورقة قائمة الحمض النووي. ثم يتم استخدام قائمة الآبار التي يتم نقلها من الحمض النووي لكتابة ورقة قائمة اختيار TR باستخدام وحدة تخزين كاشف الانشفات المشار إليها في ورقة القالب. ثم يتم نقل وحدات التخزين المحسوبة على ورقة لوحة المصدر إلى ورقة دليل الأنابيب 384-well. ثم يتم استخدام البيانات من قائمة انتقاء الحمض النووي وTR-picklist ودليل الأنابيب 384-well لإنشاء الملفات المقابلة في تنسيق *.csv.

الحمض النووي السليم وTR الاستغناء على لوحة المصدر

كما الاستغناء على لوحة مصدر 384 جيدا، وبشكل أكثر تحديدا، وتحديد موقع الهدف بشكل جيد يمكن أن تعزز الأخطاء، وعلاوة على ذلك تستغرق وقتا طويلا، قمنا بتطوير تطبيق مخصص على أساس قرص مماثل لiPipet21. على عكس iPipet، واحد وصفها هنا يمكن استخدامها مع الروبوت (يتم دعم الروبوت فقط الإصدار 4.4 وما فوق). استناداً إلى ملف 384-Wells-Pipetting-Guide.csv التي تم إنشاؤها بواسطة جدول بيانات الماكرو، فإنه يساعد المستخدم في عملية التوزيع الكلي. في حين أن استخدامه لعدد قليل من الاستغناء لا يستحق ذلك، فإنه يمكن أن يكون من المثير للاهتمام لتوفير الوقت وتجنب الأخطاء إذا كان من المتوقع عدد كبير من الحمض النووي وTR الاستغناء. يجب أن يحتوي ملف .csv على معلومات جيدة ولوحة واسم وتركيز ومستوى صوت. ويمكن بعد ذلك استخدام هذا التطبيق لتطبيقات أخرى، مثل الاستغناء عن الحلول (الكواشف، صبغ، مجمع، الخ) في الهدف بشكل جيد، وفقا لملف csv مخصص للمستخدم. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح للمستخدم بإضاءة صف أو سطر بأكمله عن طريق إدخال المعلومات ذات الصلة في عمود البئر الهدف باستخدام هذا التنسيق المتوقع: Row_1 (إلى 24) أو Line_A (إلى P).

استكشاف أخطاء ضعف كفاءة نقل الخلايا وإصلاحها

وقد تعوق عدة بارامترات موصوفة أدناه نقل الخلايا في البروتوكول الموصوف المستند إلى ADE، وسيتعين فحصها والتحايل عليها بشكل فردي في حالة حدوث مشاكل في الكفاءة.

واحدة من المعلمات الهامة الأولى للتغوط هو نوعية الخلايا والكثافة المستخدمة أثناء البذر. على الرغم من أن كل نوع خلية سوف تتطلب معلمات مختلفة، يجب احترام بعضها لضمان التغوط بنجاح. أولاوقبل كل شيء، يجب أن يتم إعداد تعليق الخلية بشكل مؤقت من لوحة subconfluent لتجنب الإجهاد الخلية قبل التغوط، وأنها لا ينبغي أن تترك ملقاة على مقاعد البدلاء لفترة طويلة جدا (2 ساعة كحد أقصى). ثانيا، يجب أن تكون كثافة البذر من الخلايا منخفضة بما فيه الكفاية لسببين: لتجنب الاتصالات الخلوية وتعزيز سطح الخلية عالية مرة واحدة تنتشر ولكن أيضا لأن الخلايا تقسيم بنشاط أفضل تناول حمض نووي أجنبي22،23. لسوء الحظ، تختلف الكثافة المثلى للخلايا للتغوط اعتمادا على أنواع الخلايا وتكنولوجيا التغوط ويجب تحديدها لكل خط خلية. وهذه بارامترات حاسمة لضمان الانفعال.

معلمة هامة أخرى يمكن أن تعدل كفاءة الانعطاف هو رقم مرور الخلية24. والواقع أن الخلايا في الثقافة تخضع باستمرار للتطور بسبب المنافسة والاختيار الطبيعي. ومن المعروف جيدا أن التعبير الجيني التفاضلي بين أرقام مرور الخلايا المنخفضة والعالية من المتوقع في معظم خطوط الخلايا بسبب التمايز مع زيادة عدد الممرات. وفي أعقاب هذه الظاهرة، قد تتأثر أيضاً كفاءة التغوط. ومع ذلك، فقد ثبت أن الآثار المتصلة بالمرور تعتمد اعتمادا كبيرا على خط الخلية وظروف الثقافة. وعلاوة على ذلك، فإن ما يعتبر مستوى مرور "مرتفع" يختلف من خط خلية إلى آخر. وهذا يعني أن نطاق رقم المرور الذي يمكن في إطاره إجراء مجموعة من التجارب بشكل موثوق يجب أن يحدد لكل خط خلية معين.

معلمة أخرى التي تعزز صعوبة في تحديد أفضل الظروف للتغوط هو أن تكوين الثقافة المتوسطة يلعب أيضا دورا حاسما منذ وجود المصل و / أو المضادات الحيوية تعدل كفاءة الانف. في الواقع، توصي معظم البروتوكولات التجارية باستخدام وسيلة خالية من المصل خلال خطوة التغوط لتعزيز الكفاءة أو التحايل على مشاكل ضعف الكفاءة3،25،26،27. ومع ذلك، فإن هذه المعلمة هي في الواقع أكثر تعقيدا للقبض كما ثبت أنه، بالنسبة لخط خلية معين، في وقت مبكر مقابل الممرات في وقت متأخر قد تعزز أو انخفاض الكفاءة اعتمادا على وجود المصل أو غياب في وسط الثقافة28. باحثون آخرون preconize استخدام المتوسطة الخالية من المضادات الحيوية للمرور قبل التغوط عند زراعة الخلايا، من أجل الحصول على خلايا عالية الجودة للمتدخلة29. في الختام، عند تحسين ظروف التغوط لنوع خلية معين، يجب اختبار كل من هذه المعلمات: خلايا المرور المبكرة أو المتأخرة واستخدام المتوسطة مع أو بدون المصل خلال الممر الأخير قبل حصاد الخلايا و / أو أثناء خطوة الانعطاف نفسها.

خلال تحسين البروتوكول المعروض هنا، تم استخدام نوعين من الكاشف: كاشف ليبوسومال تشكيل المجمعات مثل liposome وكاشف lipopolyplex، وهو مركب بوليميرالي nonliposomal1. في حين كان لدينا النجاح لسنوات يدويا نقل خلايا HeLa مع أول واحد، لوحظ ضعف كفاءة التغوط في البروتوكول الآلي الحالي. وربما كان هذا بسبب خطوة الدوامة المطلوبة عند خلط الحمض النووي مع كاشف التغوط التي لا يمكن تنفيذها في شكل لوحة 384 جيدا. لا يحتاج lipopolyplex إلى مثل هذه الخطوة، وبالتالي، أدى إلى كفاءة أعلى في التغوط في جميع الإعدادات التي تم اختبارها. على الرغم من أن هذا لم يتم تأكيدها في الدراسة الحالية، وتجنب الكواشف الانفسيالتي تتطلب خطوة خلط المادية مثل الأنابيب أو الدوامة من المحتمل أن يؤدي إلى نتائج أفضل.

نوصي أيضا باستخدام كاشف الانف متوافق مع الانسياق العكسي كما يستند البروتوكول المقدم ة على التغوط العكسي. ومن المعروف أن بعض الخلايا من الصعب نقل هاووووببعض المركباتالكيميائية المخصصة لتطوير كفاءة عالية في الانف 30و31. إذا كان يهدف إلى نقل الخلايا التي يصعب نقلها، نوصي باختبار الكواشف المحمولة من نوع الخلية أو خط الخلية المخصص، على افتراض أن الانفذيب العكسي ممكن مع هذه الكواشف.

وقد يكون للعديد من البارامترات المفصلة في الفقرات الأساسية أثر وتضعف إلى حد ما عملية الاستغناء عن الـ ADE، مما قد يؤدي إلى تدمير التجربة النهائية.

تم تطوير nanodispenser لتوزيع 2.5 قطرات NL من آبار المصدر مليئة 3-12 درجة مئوية من المخزن المؤقت المائي (أي، 9 حجم العمل. جهاز nanodispenser المستخدمة في هذه الدراسة يدمج تكنولوجيا تحليل السوائل الديناميكية لتحديد تكوين السوائل وارتفاع السائل في لوحة المصدر من أجل السيطرة على الطاقة اللازمة لإخراج قطرات 2.5 نل19. أثناء ملء لوحة المصدر يدوياً أو باستخدام معالج سائل تمعجي كلاسيكي، تكون وحدات التخزين في معظم الأحيان غير دقيقة جداً من تلك التي يحددها تحليل السوائل الديناميكية. هذه نقطة حاسمة يجب أخذها في الاعتبار لأن الجهاز غير قادر على الاستغناء عن آبار المصدر المحملة بأكثر من 12 ميكرولتر. وبالتالي، فإن وجودهم من شأنه أن يعرض التجربة للخطر. وبطبيعة الحال، يمكن إنشاء قائمة من الإعفاءات التي تم تنفيذها في نهاية البرنامج ولكن هذا يتطلب من المستخدم لضبط وحدات التخزين وتشغيل برنامج لاسترداد الإعفاءات الفائتة فقط. ولتجنب هذه الخلافات، يوصى بإجراء "دراسة استقصائية" بمجرد تحميل بلازميدات الحمض النووي للتحقق من الحجم المتوقع في كل بئر معني.

وهناك معلمة حاسمة لطرد قطرات هو الاختلاف في التوتر السطحي السائل17،32. ومن المعروف أن حلول الحمض النووي المياه لزوجة لها. وهذا قد يضعف عملية الاستغناء من قبل ADE. في حين لم يتم تحديد المعلمات الفيزيائية في دراستنا السابقة1، أدى ارتفاع تركيزات محلول الحمض النووي في لوحة المصدر إلى انخفاض كفاءة الانسياق ، حتى بالنسبة لنفس الكمية الإجمالية من الحمض النووي الاستغناء عنها ، ربما بسبب هذا ظاهره. وبالتالي، نوصي باستخدام تخفيف بلازميد من 100 نانوغرام / ميكرولتر للحصول على أفضل النتائج، على الرغم من أن تركيزات أخرى قد يتم اختبارها لراحة المستخدم. لضمان ADE السليم مع تركيز الحمض النووي الذي يحتاجه المستخدم، يمكن إضافة صبغة إلى الحل لمراقبة طرد قطرات في الآبار أو، حتى أفضل، على غطاء لوحة. وبما أن الهدف الأول للبروتوكول المعروض هو الحصول على نسبة عالية من الإنتاجية، فقد استُخدمت مجموعات إعداد الحمض النووي البلازميد الرخيصة القائمة على الأعمدة المصغرة والمتوافقة مع بروتوكولات تنقية البلازميد عالية الإنتاجية القائمة على الصفائح. في حين أنها عملت بشكل صحيح خلال أداء التجربة، في حالة انخفاض الكفاءة وضعف قدرة الخلايا بعد التغوط، فمن المستحسن استخدام أساليب تنقية الحمض النووي أعلى درجة مثل ميدي أو ماكسي الاستعدادات أو حتى خالية من السموم مجموعات متاحة تجاريا من شأنها أن تضمن نقاء أفضل للحمض النووي وانخفاض سمية للخلايا33.

استكشاف أخطاء نقل الخلايا غير المتجانسة على سطح البئر وإصلاحها

أدت المحاولات الأولى عند إعداد البروتوكول إلى نقل الخلايا فقط في وسط الآبار، حيث تم إرسال قطرات من قبل ADE. في الواقع، لاحظنا أن الحمض النووي وخليط التغوط لم ينتشر في جميع أنحاء سطح البئر وكان يجف قبل إضافة الخلية بسبب انخفاض أحجام الاستغناء (بالكاد 500 نمل). للتحايل على هذه المشكلة، تمت إضافة خطوة الاستغناء مخفف للسماح للحمض النووي / TR خليط تنتشر في جميع أنحاء الآبار قبل إضافة الخلية. وأدى ذلك إلى نقل خلية متجانسة في البئر. وهكذا، عند استنساخ التجربة وخليط الحمض النووي /TR لا ينتشر في جميع أنحاء الآبار، يمكن تعديل حجم مخفف وفقا لاحتياجات المستخدم.

بما أنّ ال [كلسّ] سمعيّة سائل معالج يستطيع وزّعت حجوم في ال [نانوليتر] مدى, ال يوصف طريقة من المحتمل لا يتلقّى أيّ قيود فنّيّة. ومع ذلك، لاحظنا أن الآبار المملوءة بالمحلول المائي تخضع للتبخر، مما قد يمثل قيدا. إذا تم تخفيض الأحجام الدقيقة التي سيتم الاستغناء عنها عن طريق هذا التبخر، لن يتم تنفيذ النانو الاستغناء إلى النهاية المتوقعة. في هذه الحالة، يتم إنشاء تقرير خطأ بواسطة nanodispenser. للتحايل على هذه المشكلة، استخدم أحجام أعلى من المتوقع أثناء البقاء في النطاق العلوي المقبول (في الواقع، أقل من 12 درجة مئوية). ومع ذلك، إذا كان التبخر يؤدي إلى إضعاف بعض الإعفاءات، يتم إنشاء تقرير خطأ من قبل nanodispenser. يمكن استخدام هذا الملف لملء لوحة المصدر مع كاشف جديد ليتم الاستغناء عنها على الآبار الوجهة المعنية. القيام بذلك في فترة زمنية قصيرة لا يبدو أن يضعف كفاءة التغوط.

البروتوكول الموصوف هنا هو أول واحد للحصول على مثل هذه الإنتاجية لالتغوط بلازميد الحمض النووي المستقلة. وكانت أفضل المعدلات التي تم التوصل إليها من قبل ل 288 ظروف مختلفة التي تتطلب مهارات متخصصة للغاية لأداء في وقت واحد15. وبصرف النظر عن الإنتاجية العالية، فإن البروتوكول الحالي له مزايا هامة أخرى حيث تم تحسين العملية الشاملة للسماح باستخدامه من قبل غير المتخصصين، وقد تم تطوير أدوات لتجنب الأخطاء، وهي'1' ماكرو جدول بيانات مخصص يسمح بالسماح التصميم السهل للقالب التجريبي، '2' التوليد التلقائي لقالب (لوحات) مصدر الكاشف اتلاف الحمض النووي والكاشف المتلّق من هذا الماكرو، '3' توليد ملفين جاهزين للاستخدام للتحكم في توزيعات الحمض النووي التي تعتمد على البرمجيات وكاشف الانفتيف بواسطة جهاز nanodispenser، و4) تصدير ملف "دليل الأنابيب 384-welltting" المقابلة للوحة (لوحات) المصدر المصممة، لاستخدامها من قبل تطبيق مخصص المستندة إلى قرص وضعت أيضا من أجل تجنب الأخطاء البشرية في حين الاستغناء في لوحة (ق) مصدر 384 جيدا.

التحسينات المقبلة للبروتوكول

من أجل تعزيز الإنتاجية واستنساخ، لوحة المصدر مليئة ببلازميدات يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية أو المجمدة كالمعتاد لحلول مخزون الحمض النووي. وعلاوة على ذلك، أظهرنا أن لوحة الوجهة المحملة مسبقا مع الحمض النووي يمكن أيضا تخزينها الجافة أو المجمدة لمدة 7 أيام على الأقل قبل إضافة كاشف الانف الصغير والخلايا، مما يؤدي إلى تعزيز الإنتاجية الشاملة وسهولة البروتوكول. وقد تم الإبلاغ عن حفظ الحمض النووي لأكثر من 4 سنوات من قبل باستخدام وسائل الإعلام المحسنة34، وبالتالي، ينبغي اختبارها في سياق هذا البروتوكول كما أنه سوف يدفع إلى أبعد من ذلك، مما يتيح التخزين على المدى الطويل من لوحات مليئة مسبقا مع البنوك من بلازميدات وجاهزة للاستخدام في تجارب التغوط.

أظهرنا في السابق أن ظروف الانف اللاسيفي الأمثل المحددة يمكن نقلها إلى تجارب علىنطاق أعلى، من 96-well إلى 10 سم أطباق الثقافة 1، عن طريق حساب كمية الحمض النووي، وحجم الكاشف transfection، وكثافة الخلايا التي ينبغي أن أن تستخدم على أساس بروتوكول لوحة 384 جيدا الأمثل. كما 1536 جيدا لوحة الاستغناء يمكن التحكم فيها من قبل nanodispenser جدا، ويمكن أيضا أن يتم تنفيذ البروتوكول على نطاق أقل، وبالتالي تعزيز الإنتاجية. ومع ذلك، فإن أحد القيود الرئيسية للوصول إلى هذا الشكل هو القدرة على الاستغناء عن الخلايا وإدارة القراءة النهائية في مثل هذا الشكل المصغر. وقد تم بالفعل تنفيذ توزيع الخلايا من قبل ADE بنجاح في شكل لوحة 1536 جيدا35 باستخدام حل الكثافة المحايدة التي منعت البذر الخلية وضمان كثافة الخلية على قدم المساواة في الوقت المناسب. استناداً إلى رقم الخلية المستخدمة هنا ونسبة السطح من 384 (0.056 سم2)مقابل 1536 بئر (0.025 سم2)،سيتم الاستغناء عن 500-650 خلية في هذا الشكل الأخير. وقد ثبت أن مثل هذا النطاق رقم توزيع الخلية لتكون موثوقة للغاية إذا تم استخدام 14٪ -18٪ محلول مركز من الكثافة المحايدة. في إطار هذه الإعدادات، سيتم توزيع 100 مل من تعليق الخلية على 1536 بئراً. مع حل العمل من 5-8 درجة مئوية في مثل هذه الآبار، مضيفا 5-8 ميكرولتر من وسط الثقافة باستخدام معالجات السائل التمعجي الكلاسيكية من شأنه أن يخفف من محلول مضاد للبذر إلى أقل من 0.3٪، مما يسمح البذر الخلية المناسبة. وبالتالي يبدو من الممكن من الناحية التقنية نقل الخلايا على هذا النطاق المنخفض؛ ومع ذلك، فإن تأثير التركيز المتبقي للمحلول المحايد الكثافة على كفاءة التغوط غير صحيح لا يزال يتعين تحديده من خلال مزيد من العمل.

استخدام أنواع لوحة المصدر تحمل كميات عمل أعلى لتوزيع الخلايا، مثل لوحات مصدر البولي بروبلين 384-well وجود حجم العمل من 45 درجة مئوية، من شأنه أن يسمح 100 نمل حل الخلايا الاستغناء من أربعة آبار مصدر فقط للوحة 1536 جيدا عموما. وعلاوة على ذلك، فإن موزعات النانو الجديدة قادرة على الاستغناء عن قطرات قدرها 25 نانولتر بدلاً من 2.5 نانولتر التي استخدمت في هذا البروتوكول. هذا الحجم قطرة، ثم، يقسم 10 أضعاف وقت الاستغناء ولكن يعني استخدام متعددة من 25 وحدات التخزين nL التي، ومع ذلك، تبقى متوافقة مع وحدات التخزين المختلفة الاستغناء عنها في البروتوكول المعروض هنا.

واستنادا إلى هذه الأعمال الأخيرة والتحسينات التكنولوجية، يمكن بسهولة إضافة خطوة أخرى لتوزيع الخلايا ADE لتحقيق الانفثي بطبق 1536 جيدا إلى البروتوكول الحالي. ومع ذلك، فإن الوصول إلى مثل هذه التصغيرات لا يستحق كل هذا العناء إلا إذا كان من الممكن في الوقت ذاته إجراء اختبار حيوي في مثل هذا الشكل المصغر.

في الختام، قمنا بتطوير طريقة سهلة وعالية الإنتاجية ودقيقة للتغوط تحمل العديد من المزايا بسبب التصغير: (1) خفض تكاليف كاشف الانف. (2) الحد من النفايات من مستحضرات الحمض النووي؛ (3) ضمان أن حتى المبتدئين يمكن أن تؤدي بنجاح تبديل الخلايا. في الواقع، فإنه يتطلب سوى عدد قليل من الخطوات اليدوية سهلة، وهي تخفيف الحمض النووي إلى 100 نانوغرام / ميكرولتر، الاستغناء عنها على لوحة مصدر (واحد بلازميد / جيدا) وفقا للقالب الذي تم إنشاؤه في جدول البيانات واستخدام دليل الأنابيب المستندة إلى قرص، وإعداد تعليق الخلية قبل البذر. وNanodispenser القائم على ADE هو المسؤول عن تسليم الجرعة المستهلكة للوقت وعرضة للخطأ ومضاعفة البلازميدات، وفقا لقالب معين من التجربة.

وعلاوة على ذلك، ففي حين أن هذا البروتوكول يمكن أن يكفل معظم المقاصد البيولوجية الأساسية لتجارب التغوط التقليدية، فإنه يمكن أيضا أن يفتح سبلا جديدة للتجارب القائمة على الصفيف. على سبيل المثال، إن التعبير عن أو إسقاط كل جين من جينات ترميز البروتين البشري من مجموعة ORFeome البشرية36 أو النهج المستندة إلى مكتبة CRISPR-Cas937،على التوالي، سيتطلب أقل من 24 ساعة على منصة آلية مخصصة (53 × 384- لوحات جيدا)، بدلا من 2-3 أيام من العمل البشري، على افتراض استخدام الحمض النووي مسبقة تحميل البنك لوحة. ونظراً لكفاءته العالية وأدائه العالي الإنتاجية، فإن البروتوكول المعروض هنا قد يكون قادراً حتى على تحقيق نُهُج جديدة غير مجمعة للدراسات القائمة على كريسبر-كاس9 مع مكتبات الرنا/كريسبر-كاس9-بلازميدات التعبير. وفي الواقع، فإن التغيرات الفينومينية الخلوية الخفيفة، التي لا يمكن أن تسمح حاليا ً بخطوة فرز الخلايا المطلوبة، ستكون في نهاية المطاف قابلة للإدارة، كما أن بئراً واحداً سيمثل جينًا واحدًا طرقت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

كشف المؤلفون عن تلقي الدعم المالي التالي للبحث و/أو التأليف و/أو نشر هذه المقالة: Inserm, Lille University, Lille Pasteur Institute, Council Régional du Nord, and PRIM-HCV1 and 2 (Pôle de Recherche Interdisciplinaire sur le Médicament), Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-EQPX-04-01), the Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) and the European Community (ERC-STG INTRACELLTB n° 260901). ويود المؤلفان أن يشكرا الدكتور س. موريو، والدكتور ب. فيلماغني، والدكتور ر. فيرو - كليمنت، والدكتور ه. غرولت على استعراضهم النقدي للمخطوطة وتصحيحاتهم لها.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384LDV Microplate Labcyte LP-0200
384-well Microplate μClear Black Greiner 781906
Ampicilin Sigma A9393-5G Selection antibiotic for bacteria transformed with ampicilin expressing vector
Android Tablet Samsung Galaxy Note 8 used to guide the user while the source plate manual dispense
Aniospray Surf 29 Anios 2421073 disinfectant to clean the MicroFlo head
Columbus software Perkin Elmer image analysis software
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate Thermo Fisher Scientific 10566032 cell culture medium
Echo Cherry Pick 1.5.3 software Labcyte Software enabling ADE-based dispenses by the Echo550 device from a *.csv file; nanodispenser software
Echo550 Labcyte ADE-based dispenser
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16000044 to add in cell culture medium
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128-4L to fix cell
HeLa cells ATCC HeLa (ATCC® CCL-2™)
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Thermo Fisher Scientific H3570 10 mg/mL Solution in Water
INCell Analyzer 6000 GE Healthcare 29043323 automated laser-based confocal imaging platform
LB medium Thermoischer Scientific
LB Broth Base (Lennox L Broth Base)®, powder		 12780052 culture medium for bacteria growth
Lysis Buffer (A2)  Macherey-Nagel 740912.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
MicroFlo 10µL cassette Biotek Instruments Inc 7170013 to use with the Microflo Dispenser
MicroFlo 1μL cassette Biotek Instruments Inc 7170012 to use with the Microflo Dispenser
MicroFlo Dispenser Biotek Instruments Inc 7171000 peristaltic pump-based liquid handler device
Microvolume spectrophotometer Denovix DS-11 Spectrophotometer Measure the DNA concentration of samples
mVenus plasmid mVenus cDNA was cloned by enzymatic restriction digestion and ligation in Age1/BsrG1 sites of the tdTomato-N1 plasmid Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: mVenus
Neutralization Buffer (A3)  Macherey-Nagel 740913.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
NucleoSpin Plasmid kit Macherey-Nagel 740588.50 used to prepare plasmid from bacterial culture
Optimal-Modified Eagle Medium (Opti-MEM) Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
optional Wash bufferWash Buffer (A4) Macherey-Nagel 740914.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
orbital shaker  incubated large capacity shaker 444-7084 Used to grow bacteria under gentle agitation and 37°C
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 10,000 U/mL
Phosphate-Buffered Saline Thermo Fisher Scientific 10010001
Plasmid mini-columns Macherey-Nagel 740499.250 Silica membrane mini-column to prepare plasmid from bacterial culture
Resuspension Buffer (A1)  Macherey-Nagel 740911.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
RNAse A Macherey-Nagel 740505 Enzyme from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
tdTomato-N1 plasmid Addgene Plasmid #54642 Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: tdTomato 
TransIT-X2 Dynamic Delivery System Mirus Bio MIR 6000
Wash Buffer (AW) Macherey-Nagel 740916.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
3D printer Creality CR10S used to print the plate adapter
Blender Software   https://www.blender.org/
Free software under GNU General Public License (GPL).		 version 2.79b used to design the plate adapter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Colin, B., Deprez, B., Couturier, C. High-Throughput DNA Plasmid Transfection Using Acoustic Droplet Ejection Technology. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. , 2472555218803064 (2018).
  2. Mirus Bio. Optimising Transfection Performance. , (2019).
  3. Thermo Fisher Scientific. Factors Influencing Transfection Efficiency | Thermo Fisher Scientific - FR. , https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/references/gibco-cell-culture-basics/transfection-basics/factors-influencing-transfection-efficiency.html (2019).
  4. Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).
  5. Figueroa, E., et al. A mechanistic investigation exploring the differential transfection efficiencies between the easy-to-transfect SK-BR3 and difficult-to-transfect CT26 cell lines. Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 36 (2017).
  6. Kirchenbuechler, I., Kirchenbuechler, D., Elbaum, M. Correlation between cationic lipid-based transfection and cell division. Experimental Cell Research. 345 (1), 1-5 (2016).
  7. Zhang, Z., Qiu, S., Zhang, X., Chen, W. Optimized DNA electroporation for primary human T cell engineering. BMC Biotechnology. 18 (1), 4 (2018).
  8. Cao, D., et al. Transfection activity and the mechanism of pDNA-complexes based on the hybrid of low-generation PAMAM and branched PEI-1.8k. Molecular bioSystems. 9 (12), 3175-3186 (2013).
  9. Bos, A. B., et al. Development of a semi-automated high throughput transient transfection system. Journal of Biotechnology. 180, 10-16 (2014).
  10. Colosimo, A., et al. Transfer and expression of foreign genes in mammalian cells. BioTechniques. 29 (2), 314-318 (2000).
  11. Villa-Diaz, L. G., Garcia-Perez, J. L., Krebsbach, P. H. Enhanced transfection efficiency of human embryonic stem cells by the incorporation of DNA liposomes in extracellular matrix. Stem Cells and Development. 19 (12), 1949-1957 (2010).
  12. Sabatini, D. M. Reverse transfection method. , WO2001020015A1 (2001).
  13. Raymond, C., et al. A simplified polyethylenimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods (San Diego, CA). 55 (1), 44-51 (2011).
  14. Junquera, E., Aicart, E. Recent progress in gene therapy to deliver nucleic acids with multivalent cationic vectors. Advances in Colloid and Interface Science. 233, 161-175 (2016).
  15. Woodruff, K., Maerkl, S. J. A High-Throughput Microfluidic Platform for Mammalian Cell Transfection and Culturing. Scientific Reports. 6, 23937 (2016).
  16. Vasileiou, T., Foresti, D., Bayram, A., Poulikakos, D., Ferrari, A. Toward Contactless Biology: Acoustophoretic DNA Transfection. Scientific Reports. 6, 20023 (2016).
  17. Hadimioglu, B., Stearns, R., Ellson, R. Moving Liquids with Sound: The Physics of Acoustic Droplet Ejection for Robust Laboratory Automation in Life Sciences. Journal of Laboratory Automation. 21 (1), 4-18 (2016).
  18. Grant, R. J., et al. Achieving accurate compound concentration in cell-based screening: validation of acoustic droplet ejection technology. Journal of Biomolecular Screening. 14 (5), 452-459 (2009).
  19. Sackmann, E. K., et al. Technologies That Enable Accurate and Precise Nano- to Milliliter-Scale Liquid Dispensing of Aqueous Reagents Using Acoustic Droplet Ejection. Journal of Laboratory Automation. 21 (1), 166-177 (2016).
  20. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chemical Society Reviews. 38 (10), 2887-2921 (2009).
  21. Zielinski, D., Gordon, A., Zaks, B. L., Erlich, Y. iPipet: sample handling using a tablet. Nature Methods. 11 (8), 784-785 (2014).
  22. Brunner, S., et al. Cell cycle dependence of gene transfer by lipoplex, polyplex and recombinant adenovirus. Gene Therapy. 7 (5), 401-407 (2000).
  23. Nii, T., et al. Single-Cell-State Culture of Human Pluripotent Stem Cells Increases Transfection Efficiency. BioResearch Open Access. 5 (1), 127-136 (2016).
  24. Noonan, D. J., Henry, K., Twaroski, M. L. A High-Throughput Mammalian Cell-Based Transient Transfection Assay. Signal Transduction Protocols. 284, 051-066 (2004).
  25. Transfection | TransIT Transfection Reagents | Mirus Bio. , https://www.mirusbio.com/products/transfection (2015).
  26. American Type Culture Collection. General protocol for transfection of stem cells, primary cells, and continuous cell lines with ATCC TransfeX Transfection Reagent. , https://www.atcc.org/~/media/Transfection%20protocols/TransfeX/TransfeX%20General%20Protocol%20on%20letterhead.ashx (2017).
  27. American Type Culture Collection. Transfection Reagents for Nucleic Acid Transfer into ATCC Cells. , http://www.lgcstandards-atcc.org/~/media/PDFs/Marketing%20Material/Cell%20Biology/Transfection%20reagents%20for%20nucleic%20acid.ashx (2017).
  28. de Los Milagros Bassani Molinas, M., Beer, C., Hesse, F., Wirth, M., Wagner, R. Optimizing the transient transfection process of HEK-293 suspension cells for protein production by nucleotide ratio monitoring. Cytotechnology. 66 (3), 493-514 (2014).
  29. Promega. FuGENE® 6 Transfection Reagent. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/101/fugene-6-transfection-reagent-protocol.pdf (2019).
  30. Olden, B. R., Cheng, Y., Yu, J. L., Pun, S. H. Cationic polymers for non-viral gene delivery to human T cells. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 282, 140-147 (2018).
  31. Park, E., Cho, H. B., Takimoto, K. Effective gene delivery into adipose-derived stem cells: transfection of cells in suspension with the use of a nuclear localization signal peptide-conjugated polyethylenimine. Cytotherapy. 17 (5), 536-542 (2015).
  32. Wood, R. W., Loomis, A. L. The physical and biological effects of high-frequency sound-waves of great intensity. The London, Edinburgh, and Dublin Philosophical Magazine and Journal of Science. 4 (22), 417-436 (1927).
  33. Eliminating Endotoxin at the Source - A Novel Competent Cell Line with Modified Lipopolysaccharide for Low-Endotoxin Plasmid Production. Mamat, U., et al. 28th Annual Symposium of the Protein Society, San Diego, CA, , (2014).
  34. Ivanova, N. V., Kuzmina, M. L. Protocols for dry DNA storage and shipment at room temperature. Molecular Ecology Resources. 13 (5), 890-898 (2013).
  35. Lesnick, J., Lejeune-Dodge, A., Ruppert, N., Jarman, C. High-Precision Cell Dispensing with the Labcyte Echo® Liquid Handler. , https://www.labcyte.com/content/applications/high-precision-cell-dispensing-with-the-labcyte-echo-liquid-handler (2017).
  36. Yang, X., et al. A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs. Nature Methods. 8 (8), 659-661 (2011).
  37. Peng, J., Zhou, Y., Zhu, S., Wei, W. High-throughput screens in mammalian cells using the CRISPR-Cas9 system. The FEBS journal. 282 (11), 2089-2096 (2015).

Tags

التراجع، العدد 150، طرد قطرات الصوتية، عالية الإنتاجية، الانفسيد، بلازميد الحمض النووي، خلايا الثدييات، مناولة السوائل، بروتين الفلورسنت
عالية الإنتاجية الحمض النووي بلازميد تعدد الإرسال والتحويل باستخدام تكنولوجيا نانوالاستغناء الصوتية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Colin, B., Rocq, N., Deprez, B.,… More

Colin, B., Rocq, N., Deprez, B., Couturier, C. High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology. J. Vis. Exp. (150), e59570, doi:10.3791/59570 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter