Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

התפוקה הגבוהה של DNA פלאגיסינג ומעבר באמצעות טכנולוגיית ננו-לחילוק אקוסטית

Published: August 8, 2019 doi: 10.3791/59570

Summary

פרוטוקול זה מתאר את העברת הפלסטיות הגבוהה ביותר של תאי היונקים בצלחת 384-היטב באמצעות טכנולוגיית הפליטה האקוסטית של ה-droplet. הזמן גוזלת, שגיאות-DNA לחילוק ו ריבוב, אבל גם התרגום המקביל מגיב, הם תוכנה מונחה ומבוצעת על ידי מכשיר ננו. התאים הם הנזרע לאחר מכן בארות מלאות אלה.

Abstract

מעבר תאים, הכרחי למחקרים ביולוגיים רבים, דורש שליטה בפרמטרים רבים להשגת הישגים מדויקים ומוצלחים. בדרך כלל ביצוע בתפוקה נמוכה, זה יותר מדי זמן ושגיאות נוטה, אפילו יותר, כך כאשר ריבוב מספר פלמידים. פיתחנו שיטה קלה, מהירה ומדויקת לביצוע מעבר תאים בפריסת צלחת 384 באמצעות הוצאה אקוסטית של droplet (ADE). מכשיר ננו משמש במחקר זה מבוסס על טכנולוגיה זו ומאפשר משלוח מדויק ננונפח במהירות גבוהה מצלחת מקור היטב ליעד אחד. זה יכול לוותר על מולטיפלקס DNA ו-הזיהום מגיב לפי גיליון אלקטרוני מעוצב מראש. כאן אנו מציגים פרוטוקול אופטימלי כדי לבצע מבוסס אייד התפוקה הגבוהה בתפוקת האוויר הגבוה, מה שמאפשר להגיע ליעילות של עד 90% ו כמעט 100% הזיהום בניסויים הפנים. אנו מרחיבים את העבודה הראשונית על-ידי הצעת מאקרו ידידותי למשתמש המבוסס על גיליון אלקטרוני, מסוגל לנהל עד ארבע פלמידים/בארות מספרייה המכילה עד 1,536 שונים פלמידים, ויישום מדריך ליטוף מבוסס-לוח. המאקרו מעצב את התבניות הדרושות ללוחית המקור (ות) ויוצר את הקבצים המוכנים לשימוש עבור היישומים המבוססים על הננו-מנפק והלוח. פרוטוקול ארבעה שלבים החוצה כרוך i) מדלל לוותר עם מטפל הנוזל הקלאסי, ii) הפצה פלארמיד ו ריבוב, iii) מגיב החוצה על ידי הננו מנפק, ו iv) ציפוי תא על בארות מלאות. השליטה המבוססת על התוכנה של ריבוב הפלגיסינג והתרגום של ADE מאפשרת אפילו לא מומחים בתחום לבצע מעבר תאים אמין בדרך מהירה ובטוחה. שיטה זו מאפשרת זיהוי מהיר של הגדרות מיטביות עבור סוג תא נתון וניתן להשורבן לגישות בקנה מידה גבוה וידני. הפרוטוקול מקל על יישומים, כגון חלבון ORFeome אנושי (סט של מסגרות קריאה פתוח [ORFs] ביטוי הגנום) או CRISPR-Cas9-מבוסס על הפונקציה הגנטית אימות, באסטרטגיות סינון שאינם במאגר.

Introduction

השיטה המוצגת כאן מתארת בפרוטרוט כיצד לבצע בדיקת מידע והעברה של דנ א בתאי היונקים בתפוקה גבוהה באמצעות ננו-מתקן נוזלי מבוסס-אקוסטי בצלחת 384-באר, אפילו עבור שאינם מומחים בתחום. זו שיטה שפורסמה לאחרונה1 מאפשר לבצע ככל 384 באופן עצמאי מרבב ו-DNA בתנאי הזיהום בניסוי אחד, בתוך פחות מ 1 h. ניסויים בודדים או מעבר הצליחו, להגיע קרוב ל 100% זיהום בתוך אוכלוסיית התאים המזוהמים. פרוטוקול זה מאפשר העברה קלה יותר מכיוון שרוב השלבים המייקלים, הצורכים זמן ומועדים לשגיאות הם כעת מונחי תוכנה (ראה איור 1 עבור מבט כללי). מאמצים נוספים נעשו לפתח כלים ייעודיים להגברת קלות השימוש תוך הימנעות מטעויות אנוש במהלך התהליך הכולל ולקידום התפתחות מוצלחת גם עבור שאינם מומחים בתחום. הפרוטוקול המתואר כולל גיליון מאקרו "ידידותי למשתמש" שפיתחנו על מנת לנהל 384 מצבים בלתי תלויים עם אפשרויות ריבוב של עד ארבע פלמידים בכל באר. המאקרו מייצר באופן אוטומטי תבניות של לוחית המקור (s) כדי לטעון את ה-DNA הצפוי באמצעי האחסון להתחיל פתרונות המניה ואת הקבצים הדרושים כדי לכונן את התוכנה ננומנפק על העיצוב הניסיוני כי כבר inputted. כמו הידני מחלק של ה-DNA לוחית מקור 384-ובכן הוא מייגע ומועדים, אנו גם פיתח יישום ייעודי מבוסס לוח כדי להנחות את המשתמש בזמן לחלק פתרון DNA על פי התבנית.

Figure 1
איור 1: זרימת עבודה ניסויית. ייצוג סכמטי של פרוטוקול העברת התפוקה האוטומטית האופטימלי האוטומטי (החל מהתכנון הנסיוני ועד לקבלת שיטת ביולוגית מותאמת אישית). שלבים ידניים מצוינים באמצעות סמל היד והזמן המשוער לכל שלב כתוב בתיבה אדומה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

רבים מבוססי תא ניסויים להתחיל עם התפתחות DNA פלמיד, וגם אם הרבה ריאגנטים ייעודי היו ועדיין מפותחים כדי לשפר את יעילות הטיפול ו/או להקל על ההליך, שנותר הרבה להיעשות2,3 , 4. DNA מעבר התא הזיהום כרוך כמה צעדים כדי להגיע ליעילות גבוהה, כגון ספיגה מורכבת ראשונית, בריחה אנדוזוממית, ו cytoplasmic הובלה לגרעין5,6. בנוסף סידן משקעים או טכניקות פיזיות כגון אלקטרופורציה או מיקרוהזרקה באמצעות מכשירים ייעודיים7, שיטות כימיות מודרניות התמקדו שיפור מסירת ה-DNA בזמן הורדת cytoxicity תא8, . בסדר, תשע השימוש בשומנים או פולימרים מיוצרים ליפובי מתחמים כמו, לאחרונה, מערכות כימיה פולימריים ליפוזוממית הפכה קלה ויעילה יותר10. למרות ההתפתחויות הללו, התפתחות התא עדיין דורש מיומנויות ספציפיות להתבצע באופן מדויק כמו רוב הפרוטוקולים הללו הפיזי או כימי מחייב מדענים להכין ידנית כל מצב תגובת דנ א, ולכן פוגע בתפוקה. כדי לעקוף בעיה זו, היפוך הפרוטוקולים הפוכים פותחו בעזרת ריאגנטים כימי העברת כימיקלים11,12,13, המאפשר למשתמש לבדוק או לשלב מספר פלמידים בצורה מהירה יותר. בפרוטוקולים אלה, חומצות גרעין מתחמים עם ריאגנטים החצייה נוצרות לפני זריעת התאים על התסביכים. עם זאת, פרוטוקולים אלה הפוכה עדיין מוגבלים על ידי טיפול ידני של פתרונות DNA ועל ידי שילוב של כל אחד מהתנאים העצמאיים. למרות שזה אפשרי לבצע אותם בפורמט הצלחת 96-באר, ההכנה DNA והיתר יהיה מייגע, וסביר להניח כי יהיו טעויות. כאשר כמויות שונות של מספר פלמיונים DNA נדרשים ומפולדלים אחד עם השני, הזיהום התא הופך אפילו קשה יותר להשיג יותר זמן רב, ושגיאות האדם להיות די בלתי נמנע. שינוי קנה מידה של עד לפורמט 384-באר בגישה הפוכה לאחור, למרות מספר התנאים הניתנים לשינוי בשיטת ה-DNA, הופך לאתגר בלתי אפשרי עקב הסיבות הבאות. i) כמויות ה-DNA, מגיב העברה, או התגובה תערובת אמצעי לניהול הם נמוכים מ-1 μL עבור כל באר. ii) ריבוב של פלמידים ל384 מצבים עצמאיים הופך למסובך ביותר. המסירה בכל אחד 384 בארות הוא גם iii) מאוד ארוך זמן ו iv) מועדת לשגיאות. ואכן, הפתרון הנכון בבארות הצפויות קשה לניהול מכיוון שאמצעי האחסון הנמוכים כבר אינם מאפשרים מעקב ויזואלי בין הבארות הריקות והמלאות. v) בסופו של דבר, יש סיכון גבוה לייבוש התערובת על ידי התאיידות לפני הוספת התאים בגלל הזמן הדרוש לביצוע הצעדים הדרושים לחילוק. לסיכום, הגורם המגביל להגדיר את ה-DNA התפוקה הגבוהה בשיטת הסינון מראה מופיע להיות המזעור של הטיפול, אשר מרמז על ריבוב בנפח נמוך וניהול כי לא ניתן לטפל באופן ידני יותר, אבל הם גם בקושי השגה ב דרך אמינה ע י מטפלים בנוזלים קלאסיים.

כהוכחה לקושי לספק מידע שכזה ולהשיג תפוקה גבוהה, רק נסיונות מעטים להפוך את החצייה לאוטומטית פורסמו עד כה: בתבנית צלחת 96-באר באמצעות מכשיר מסחרי טיפול נוזלי וסידן פוספט משקעים14 ו, לאחרונה, מגיב ליפולקס, ו שבב מיקרופלואידיג המאפשר 280 בלתי תלוי העברה של15 אבל דורש כישורים מיוחדים בתחום זה. שיטה נוספת, המאפשרת ריחוף נוזלי והובלת מניפולציה וערבוב נוזלים, נעשה שימוש כדי לבצע העברה של דנ א ב 24-כדי 96-צלחת לוחית בפורמטים16. למרות ריאלי, גישה זו סובלת תפוקה נמוכה מאוד כמו ערבוב של תאים עם התערובת DNA הזיהום דורש 60 s דגירה עבור כל נקודה אחת לפני זריעת. זה מרמז על משך של לפחות 96 דקות עבור צלחת מלאה 96-באר. יתר על כן, פרוטוקול זה הוא רחוק מלהיות קלה הקהל הכולל של הביולוגים כמו עבודה זו נעשתה עם מכשיר בבית מעוצב ומיוצר אשר כרגע לא זמין בשוק. להיפך, בשנים האחרונות, קל לשימוש מונחה תוכנה בטכנולוגיה מבוססת אקוסטי התפתחה עם מכשירי מנפק ננו נפח. באמצעות אנרגיה אקוסטית ממוקדת, התקנים אלה מאפשרים הוצאה בשליטה הדוקה של כרכים נוזליים קטנים מ 2.5 nL כדי 500 nL מלוחית המקור ליעד אחד17. טכנולוגיה זו, הנקראת לפליטה אקוסטית (ADE), היא בעלת יתרונות רבים: היא אוטומטית לחלוטין, ללא מגע, מדויקת, מדוייקת, מדויקת ומאוד מתאימה, והיא בעלת תפוקה גבוהה של18. המוקדש הראשון להעברת diמתיל סולפוקסיד (DMSO) פתרונות, הגדרות שופרו כדי לוותר על מאגרים מימית19. מכשירי ננו אקוסטי, לאחר מכן, נראה מתאים להפוך פרוטוקולים הפוכה תא החצייה והוא יכול לעקוף את רוב המגבלות הנ ל המדריך. מאחר שלא תוארו בעבר בטכנולוגיה זו, הערכנו לאחרונה את התאמתו של מערכת החילוק האקוסטית המבוססת לביצוע הפיכת תאים הפוכים.

ניצול תפוקת הננו וקלות השימוש, אנו אופטימיזציה פרוטוקול היפוך החוצה עבור תאי הלה על ידי החוצה בדיקה מספר פרמטרים שיכולים להשפיע על העברת דנ א על 384-ובכן, צלחת אחת, כלומר, סכום ה-dna סה כ ו מקור ה-DNA מתחיל ריכוז, מדלל נפח, מגיב העברה, ומספר תאים כפולה. הפרוטוקול המפותח חוסם את המגבלות הידניות שתוארו לעיל, ומציג מספר יתרונות על פני ניסיונות אחרים לשימוש אוטומטי. ראשית, זה מיניאטורי, ובכך מאפשר מגיב חסכונית הזיהום על ידי שמירת DNA ההכנות והזיהום התרגום. שנית, היא הרבה יותר גבוהה התפוקה והניתנת לקריאה מאשר הפרוטוקול הידני (אפילו למתחילים), כמו העברת הצלחת של 384 שלם-באר ניתן להשיג בפחות מ 1 h. לבסוף, זה מונחה תוכנה, המאפשר את השליטה של כמות ה-DNA מבוקר ואת ריבוב של מספר פלמידים. אכן, הודות לתוכנה ננו מנפק (טבלה של חומרים), המשתמש יכול להרחיב את תוכנית המחקר כדי לשלוט על אמצעי האחסון כדי להיות מוכן צלחת מקור מוגדר היטב ליעד אחד.

הפרוטוקול המוצג כאן מיועד בעיקר לאלה שיש להם גישה לננו-מנפק ורוצים להגדיר ניסויים בתפוקה גבוהה, אלא גם עבור אלה שרוצים למטב במהירות את הפרמטרים שלהם עבור סוג תא נתון על ידי החלת פרוטוקול זה כדי להצליב מספר פרמטרים בתפוקה גבוהה. אכן, הצגנו כי הפרמטרים אופטימיזציה מזוהה עם פרוטוקול זה ננו-סולם יכול להיות משתנה לניסויים בקנה מידה גדול וידני. בסופו של דבר, כמו מגיב החידוש המשמש בפרוטוקול הנוכחי מאפשר DNA או siRNA העברה על פי היצרן, הפרוטוקול הוא גם מעניין לאלה המכוונים לבצע גישות מערך עבור הבעות היתר של הגן או הנוק-אובר. לוחיות היעד המלאות מראש ב-DNA ניתן לשנות עד 7 ימים לפני השימוש בתוך שיטת החצייה ללא אובדן של יעילות, שהוא יתרון נוסף של הפרוטוקול הבא עבור סוג זה של יישום.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ההכנות מראש

  1. הכנת תוכניות המטפל הנוזלי הפריסטלטיות
    הערה: לגבי הצעדים המידללים והסלולאריים של הפרוטוקול, יש להכין תוכנית ייעודית, תוך התחשבות בגובה הראש החלק לצלחת המשמשת ובכוונת השלב.
    1. עבור 1 μL דילול הצעד, הר a 1 הקלטת μL ולהכין תוכנית עם ההגדרות כמתואר בשלבים 1.1.1.1 ו 1.1.1.2.
      1. התאם את פרמטר קצב הזרימה לגבוה עבור התפוקה הטובה ביותר כיוון שלא צפוי נזק לחומרים ביולוגיים בשלב זה. כוונן את גובה מדבקות ל 9.6 מ"מ (בהתאם ללוח התרבות של התא המשמש, משלים איור 1) כדי לאפשר את טיפת μl 1 לגעת בתחתית הבארות במהלך היתר.
        הערה: שלב זה חיוני כדי למנוע שמירה של טיפות על הראש מחלק עד להגיע נפח מספיק לרדת.
      2. להתאים את הצלחת ברורה לגובה 14.4 מ"מ כדי לאפשר עקירה חינם של הראש מחלק על הצלחת לאחר החילוק כל שורה. שלוט באופן חזותי על ההגדרות המתאימות של גובה ראש המטפל הנוזלי הפריסטטי: ודא שלא נשמרים טיפות על העצות המקובעות בזמן החילוק ולוודא שהראש מספיק גבוה כדי לאפשר עקירה של הראש לאחר שהוא מחלק כל שורה.
        הערה: הימנעות משמירת השחרור היא פרמטר מכריע כפי שהוא יפגע בדיוק של עוצמת הקול של היתר.
    2. עבור לחילוק השעיית תא 40 μL, טעינת קלטת 10 μL והכנת תוכנית עם ההגדרות כמתואר בשלבים 1.1.2.1-1.1.2.2.
      1. כוונן את פרמטר קצב הזרימה לנמוך כדי לחלק את התאים במהירות נמוכה כדי להימנע מקידום נזקים פוטנציאליים לתאים על-ידי הטיית מתח והשפעה גבוהה בתחתית הבארות. להתאים את גובה היתר כדי 11.43 מ"מ (על פי צלחת תרבות התא המשמש, משלים איור 1), גבוה מספיק כדי להקטין את השפעת התא על החלק התחתון של הבארות במהלך התהליך מחילוק אבל נמוך מספיק כדי למנוע שמירה של טיפות על ה . הראש החוצה להתאים את הצלחת ברורה גובה 16 מ"מ כדי לאפשר הזחה חינם של הראש מחלק על הצלחת לאחר החילוק כל שורה.
      2. שלוט באופן חזותי על ההגדרות המתאימות של גובה ראש המטפל הנוזלי הפריסטטי: ודא שלא נשמרים טיפות על העצות המקובעות בזמן החילוק ולוודא שהראש מספיק גבוה כדי לאפשר עקירה של הראש לאחר שהוא מחלק כל שורה.
        הערה: הימנעות החזקת שחרור היא פרמטר מכריע כפי שהוא יוביל לחילוק מספר סלולרי לא אמין.
  2. הכנה לבדיקת דנ א (פרוטוקול מיני הכנה קלאסית)
    1. לגדול DH5α חיידקים שינוי זן בינונית LB בתוספת עם 125 μg/mL אמפיצילין בחירה אנטיביוטי (טבלה של חומרים) לילה ב 37 ° c ו תחת עצבנות עדינה (200 rpm) על שייקר מסלולית (לוח חומרים).
    2. הקציר 2 מ ל של התרבות, גלולה את התאים על ידי תפרידו עבור 5 דקות ב 6,000 x g, ולמחוק את supernatant.
    3. השהה מחדש את הגלולה הסלולרית עם 250 μL של מאגר מחדש המכיל RNase A (טבלת חומרים). הוסף 250 μL של מאגר הליזה ו דגירה עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, על פי הוראות היצרן.
    4. להפסיק את תגובת הליזה על ידי הוספת 300 μL של ניטרול מאגר (טבלת חומרים) ו-הודעות בזמן קצר. צנטריפוגה את הצינורות עבור 5 דקות ב 11,000 x g.
    5. המקום החדש פלבאמצע מיני-מיני (לוח חומרים) בתוך שפופרת אוסף של 2 מ"ל ו decant סופרנטאנט בעמודה על ידי תפרידו עבור 1 דקות ב 11,000 x g.
    6. למחוק את הזרימה ולמקם את מיקום בחזרה בצינור האוסף.
    7. שטוף את מועדון הפלבין בינוני עם 500 μL של מאגר כביסה אופציונלי (טבלת חומרים) וצנטריפוגה עבור 1 דקות ב 11,000 x g, על פי הוראות היצרן.
    8. להשליך את הזרימה-דרך ולמקם את הפלבאמצע מועדון בחזרה בצינור האוסף.
    9. הוסף 700 μL של מאגר כביסה (טבלת חומרים) שיושלם עם אתנול וצנטריפוגה עבור 1 דקות ב 11,000 x g, על פי הוראות היצרן.
    10. להשליך את הזרימה-through ו צנטריפוגה את הפלבאמצע הפלסטיק ואת שפופרת האוסף שלה 1x יותר עבור 2 דקות ב 11,000 x g כדי לייבש את קרום סיליקה.
    11. המקום היבשים ביותר מיני מיני בצינור 1.5 mL חדש ולהוסיף 30 μL של מים מזוקקים prewarmed ב 60 ° צ', מודתיאת זה עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן, צנטריפוגה אותו עבור 1 דקות ב 11,000 x g.
    12. ולשמור על המנוע המכיל את ה-DNA מטוהרים פלמיד.
    13. מדוד את ריכוז ה-DNA של ה-DNA חומקת באמצעות ספקטרוסקופיה מיקרוvolume (טבלת חומרים).
      1. הפעל את הספקטרוסקופיה ובחר את הגדרות מדידת ה-DNA .
      2. הרימו את זרוע הדגימה של הספקטרוסקופיה והפיפטה 1 μL של מים על המעמד המדידה כדי לבצע כיול ריק.
      3. הנמך את זרוע הדגימה, הפעל את המדידה הריקה והמתן להשלמה.
      4. הרם את זרוע הדגימה ונגב את הדגימה מהכנים העליונים והתחתונים.
      5. פיפטה 1 μL של פתרון ה-DNA על המעמד התחתון כדי למדוד אותו.
      6. הנמך את זרוע הדגימה, הפעל את מדידת הריכוז של הדנ א, והמתן להשלמה.
      7. הרם את זרוע הדגימה ונגב את הדגימה מהכנים העליונים והתחתונים.
      8. לקבלת מדידות ריכוז DNA נוספות, חזור על שלבים 1.2.13.5-1.2.13.7.
    14. לאחר סיום המדידות, לאחסן את פתרונות ה-DNA ב 4 ° צ' עד השימוש.

2. תכנון ניסיוני והדור של רשימות הפיקסים לכונן את החלק המבוסס על אייד

הערה: מאקרו אלקטרוני ייעודי "ידידותי למשתמש" פותח לניהול כמויות DNA ולערבב עד ארבעה פלמידים בפורמט 384-צלחת. בהתבסס על העיצוב הניסיוני המוזן, מאקרו זה יוצר את הקבצים הדרושים כדי לכונן את פרוטוקול ה-DNA מבוסס-ADE על ידי ננו מנפק. כדי ליצור קבצים אלה, יש למלא מספר שדות בגיליון התבניות כמוצג באיור 2.

Figure 2
איור 2 : יצירת רשימות הפיקפיזציה לכונן היתר של ADE באמצעות מאקרו הגיליון האלקטרוני. יש למלא פרמטרים שונים, כלומר (1) את מגיב המשגר (TR) ואת אמצעי האחסון המינימליים/מרביים שישמשו בלוחית המקור, (2) ריכוזי הפלפ1 הראשוניים שניתן לחלק בלוחית המקור, ו (3) ה עיצוב לוחית שלמה, כולל כמויות הפלסטיות הצפויות ו ריבוב בכל אחד 384-בארות. (4) הפעלת רשימות בפיקדות מאפשרת אימות של השדות השונים, ולאחר מכן מולאו כראוי, רשימות ברירת מקור ל-DNA ו-TR, ותבנית המקור הדרושה נוצרת באופן אוטומטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. הזן את הפרמטרים של פרוטוקול ננו-מנפק בשדות הוורודים. הגדר את ערך התערובת של מגיב ההעברה (TR) ל-500 nL. הגדר את ערך אמצעי האחסון המינימלי בבארות לוח המקור ל-4 μL. הגדר את אמצעי האחסון המקסימלי בבארות לוח המקור ל-11.25 μL.
    הערה: הננו-מתקן המשמש כאן יכול רק להעביר מקסימום של 500 nL בהפעלה אחת של ADE. שדות ורודים אלה מתמלאים מראש בערכים המומלצים, אך ניתן לשנותם בהתאם לצורכי המשתמש.
  2. הזן 100 ng/μL ה-DNA מתחיל ריכוזי בשדות הכחולים המתאימים לדנ א הבסיסי.
    הערה: ערך זה הוא הריכוז האופטימלי שהוגדר בעבר אך יכול, עם זאת, להשתנות לצורכי משתמש שונים.
  3. הזן את כמות ה-DNA הרצויה בשדות האפורים/הירוקים. הזן את הכמויות ואת שמות הפלביניים עבור 384 בארות, להבטיח את האיות זהה אם באותו פלבמיד משמש במספר בארות.
  4. צור את העיצוב של לוחית המקור, קבצי הפיקרשימות וקובץ מדריך ליטוף. לחץ על צור רשימות בחירה כדי לאפשר למאקרו ליצור את ה-DNA-Picklist. csv, את ה-T. R.-picklist הבחירה. csv ואת 384 מספר קבצי ה-. csv של מדריך הנתונים שנאספו בגיליון המתאים. אם התבקש, תקן את ערכי התא המלאים בכתום כפי שהוא מציין שגיאות או אמצעי אחסון שלא ניתן לטפל בהם על-ידי הננו-מנפק.
  5. הדפס את התבניות מגיליון לוח המקור . שמות פלמיד ונפח מינימלי למילוי הבארות מצוינים. באופן דומה, כמויות התערובת הכימית שיהיו בהמשך יהיו מלאות בבארות הבאות, מסומנות כ- TR ומודגשות בירוק.

3. צלחת מקור ה-DNA הכנה באמצעות 384-היטב pipetting יטוף מדריך יישום

  1. לדלל את ה-DNA מאוחסן פלמיד משלב 1.2.14 כדי 100 ng/μL באמצעות מים מזוקקים.
  2. כיול את הרשת 384-היטב למידות הצלחת: פתח את היישום המנחה 384-היטב ליטוף על לוח (איור 3). מקם את לוחית המקור על הרשת במסך התחתון, ובתפריט הכיול השמאלי העליון, לחץ על + או - (או השתמש בסמן האדום) כדי לשפר או להקטין את גודל הרשת והבארות כדי לכוונן את הבארות הירוקות לארבע בארות הפינה של הלוח .

Figure 3
איור 3 : שימוש בטופס 384-מדריך ליטוף. (1) כיול של הרשת 384-ובכן לגודל הצלחת; (2)) הר של מתאם לוח אוניברסלי תלת-ממד המודפס ללוח באמצעות קלטת כפולה; (3) מיקום הלוחית על המתאם; (4) העקירה של הרשת כדי למרכז אותו לצלחת רכוב. (5) נעילת שלב הכיול. (6) פתיחת הקובץ מדריך ליטוף בארות 384. (7) בהתחשב ברשימת הקבצים, היישום יציין את שם לוחית המקור הצפוי, מגיב (ה-DNA או מגיב העברה), את הריכוז, ואת הנפח לוותר על בארות היעד, אשר יהיה מואר אחד על ידי אחד. (8) לחצני החיצים שמאלה וימינה לאפשר למשתמש לעקוב אחר מדריך ליטוף כדי לוותר בקלות את הריאגנטים בהתאם לתבנית המקור של מאקרו הגיליון (s). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. באמצעות קלטת דו-צידית, טען את מתאם הלוח התלת-ממדי על המסך כדי למנוע תנועות לוחית המקור בעת החילוק. במידת הצורך, הזז את הרשת המכוילת באמצעות חיצי הסיבוב והלחצנים למעלה/למטה/ימינה/שמאלה כדי לכוונן את הרשת על המסך למיקום הלוח. ברגע שהרשת והמידות הנאות מכוילים כראוי וממוקמות, סמן את תיבת הכיול Lock .
  2. לחץ על הקובץ ופתח את הקובץ 384 בארות ליטוף מדריך. csv . עקוב אחר הוראות המסך באופן ידני לוותר על הנפח המצוין של הפלבאמצע המצוין על הריכוז המצוין הלבן מודגש המתאים ליעד היעד המתאים של הצלחת הצפויה. השתמש בחיצים או בחצים כדי לחזור או להמשיך בתהליך החילוק של הדנ א. להפסיק לחילוק כאשר מגיעים לפתרון הראשון לטעינת התמיסה הכימית.
  3. לאחר הקלות היתר של DNA הם סיימו, להסיר את לוחית המקור מהמתאם. אם יש למלא לוחיות מקור מסוימות, לאחר מכן הצב לוחית מקור חדשה על המתאם ובצע את ההוראות המשונות. לאחר היתר היתר של dna סיימה, צנטריפוגה את הצלחת המקור dna (s) (ב 1,500 x g עבור 2 דקות) כדי להבטיח איזון נוזלי הנכון כדי להסיר בועות המובילות כדי חוסר דיוק ב-ADE מבוססי העברות.

4. הטיפול הנוזלי הפריסטסטי-בסיס 1 μL מדלל את היתר בלוח היעד

הערה: בצע את השלבים 4.1-4.5 בארון בטיחות ביולוגי.

  1. חטא את ראש הקלטת 1 μL על-ידי התזת החומר בריסוס תרסיס (טבלת חומרים), ואפשר לפתרון זה להיכנס למחזיק הטיפים. לספוג את שארית חיטוי על נייר סופג. טען את הקלטת 1 μL בהתקן המטפל הנוזלי הפריסטטי. הפעל את ההתקן וודא שהגדרת סוג הקלטת נכונה (1 μL), כמו גם את תבנית הלוח (384 בארות).
  2. לחטא את לומן כולו של אבובים: להוסיף את הסדרן צינור (להחזיק את שמונת הצינורות יחד) בתוך כלי סטרילי ולמלא אותו עם 5 מ ל של 70% אלכוהול. באמצעות הפונקציה לטרמה של המטפל נוזלי קנולות, הראשון לשטוף את האלכוהול אבובים ולאחר מכן לשטוף אותו על ידי העברת 5 מ ל של מים מזוקקים 5 מ ל של סרום ללא מדיום (בינונית שונה של הנשר של דולבקה [dmem] שיושלם עם 100 U/mL פניצילין-סטרפטומיצין; טבלה של חומר), מילוי ברציפות באותו כלי. ודא שאף אחד מהעצות אינו סתום על-ידי בדיקה חזותית של זרימת הנוזלים מכולן.
  3. הממשלה אבובים עם מדיום ללא סרום על ידי מילוי כלי סטרילי חדש עם 10 מ ל של בינונית ללא תשלום סרום וצלילה מארגן הצינור בו. לחץ על הלחצן הראשי של המטפל הנוזלי הפריסטטי במשך כ -10 ס. שוב, ודא ששום עצה אינה סתומה על-ידי בדיקה חזותית של זרימת הנוזלים מכולן.
  4. למלא את הצלחת עם 1 μL של דילול. מניחים לוחית סטרילית 384-היטב לתרבות (יעד) על המנשא הנוזלי הפריסטטי המטפל ולהסיר את המכסה שלה.
  5. הפעל את התוכנית מכוילים מראש כדי לוותר על 1 μL בכל אחד מיטב הצלחות של 384-ובכן. . זמן החילוק הוא בערך 8 שנות ואז להחליף את המכסה של הצלחת 384-היטב.
    הערה: לחלופין, שלב זה יכול להיות מטופל באופן ידני, בארון בטיחות, באמצעות מיקרופיפטה רב-ערוצי.

5. ביצוע סקר לשליטה באמצעי האחסון שעברו באופן ידני

הערה: לקבלת פרטים, ראה איור 4.

  1. הפעל את התוכנית nanodispenser נפק, עבור אל הכרטיסיה אבחון, סמן את לוחית המקור Out box, טען את לוחית המקור על מחזיק הצלחת, ו לתקתק כדי להיכנס לצלחת. כשתתבקש, בחר 384Ldv_ Aq_2 כדי להגדיר את הננו-מנפק למצב מאגר ממים מימית ולחץ על אישור.
  2. בחר סקר בתפריט ' שונות ' ולחץ על ' הפעלה '. בחר את הבארות מילא כדי לנתח ולחץ על כפתור Go . ודא שאמצעי האחסון שנמדדו תואמים לאלה הצפויים וודא שאין בארות שנטענו עם אמצעי אחסון של יותר מ-12 μL מאחר שפעולה זו תמנע העברות.

Figure 4
איור 4 : הגדרת פרמטרי תוכנת הסקר. (1) להתחיל בתוכנית nanodispenser נפק. (2) פתח את הכרטיסיה ' אבחון '. (3) הכנס את לוחית המקור על ידי תקתוק לוחית המקור ולאחר מכן, בתוך. (4) הגדר את סוג לוחית המקור בתפריט כשתתבקש. (5) בתיבה שונות, בחר באפשרות סקר בתפריט הנפתח. (6) השקת תוכנית הסקר על ידי לחיצה על ההשקה. (7) בחר את הבארות שמולאו מראש כדי למדוד. (8) להתחיל את הניתוח על ידי לחיצה על ללכת. (9) לאחר הסקר מבוצע, הכרכים הנמדדים נכתבים בבארות הנבחרות המתאימות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

6. מונע אייד DNA היתר לתוך לוחית היעד

  1. הפעל את תוכנת רשימת הבחירה, הגדר את סוגי לוחית המקור והיעד של 384-היטב ל-384_LDV ו-Greiner 384PS_ 781096, בהתאמה (איור 5). הגדר את ההתקן למצב של מאגר ממים מימית על-ידי בחירה באפשרות 384ldv_ aq_2, ופרוש "מיטוב תפוקת העברה ".

Figure 5
איור 5 : ביצועים של הקלות בחירה מבוססי הקלות. (1) הפעל את תוכנת ננו-מנפק. בכרטיסיה פרוטוקול, בחר (2) תבנית הלוחית לדוגמה (3) סוג לוח היעד ו-(4) ללא קרציות "מיטוב תפוקת העברה". (5) בחר בכרטיסיה רשימת בחירה . (6) לחץ על ייבוא ובחר את הקובץ המתאים *. csv (DNA-רשימת בחירה או טי-בחירה). (7) נבחר לאחר מכן, לחץ על יבא. (8) לחץ על הפעל ושמור את הפרוטוקול. (9) לבצע סימולציה היתר על ידי לחיצה על הדמיית, או (10) להתחיל את היתר מתוכנתים על ידי לחיצה על הפעלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. בחר בכרטיסיה "בחר רשימה", לחץ על יבא, בחר את הקובץ DNA-Picklist. csv. לחץ על הפעל ושמור את הפרוטוקול. לחץ על הדמיית כדי לבצע הדמיה של היתר מתוכנתים כדי לוודא כי רשימת הבחירה תואם את העיצוב הניסיוני צפוי. לאחר השלמתו, לחץ על סגור.
  2. לחץ על הפעל, ולאחר מכן להפעיל, כדי להתחיל את התוכנית לחילוק: כאשר נשאל, להכניס את לוחית המקור המבוקש (פתרונות DNA מלאים ידנית) ואת לוחית היעד (מדלל) הננו.
    הערה: זמן החילוק הוא כ 5-20 דקות לצלחת מלאה 384-באר, בהתאם לאמצעי האחסון הנבחרים ולמספר הכולל של הקלות בתכנון הניסיוני.
  3. לחילופין, להשהות את הפרוטוקול כאן כמו לדילול-ו-DNA צלחות מלאות יכול להתמודד עם אחסון יבש או קפוא עד 7 ימים. לאחסון יבש, ניתן ללוחות להתייבש על הספסל בטמפרטורת החדר ולאחר מכן לאחסן אותם באותה דרך. הפשרה וצנטריפוגה (ב 1,500 x g עבור 2 דקות) מוקפאים לוחות מאוחסנים לפני השימוש בשלב החצייה (סעיף 7).
     

7. היתר מגיב בשיטת אייד

  1. בארונית ביו-בטיחות, extemporaneously ליפופיוליקס מגיב בינונית ללא סרום לריכוז סופי של 1x. מערבולת ומיד לוותר על תערובת מגיב זה בהתאם ללוח המקור המוגדרים מראש (s) שתוכנן על ידי המאקרו ובאמצעות מכויל 384-ובכן מדריך ללטף את היישום כמתואר בשלב 3.4.
    הערה: אין לצנטריפוגה את לוחית המקור ברגע שהוא טעון עם מגיב כאשר החצייה לא הבחין לאחר צנטריפוגה.
  2. הפעל את התוכנית nanodispenser נפק כדי לבצע "סקר" כמתואר בסעיף 5, על מנת לשלוט על כרכים של כל מילא באופן ידני TR וולס של לוחית המקור (s) כדי למנוע שגיאות לחילוק בשל אמצעי אחסון העולה על 12 μl.
  3. לחץ על איפוס כדי לנקות את הרשימה לדוגמה של רשימת הבחירה של ה-DNA בתוכנת רשימת הבחירה, וודא שפרמטרי ההתקן עדיין מוגדרים למאגרים מימית ולסוגי לוחית המקור והיעד בהם נעשה שימוש, כמו בשלב 6.1.
  4. לחץ על יבא ובחר את הקובץ TR-Picklist. csv. לחץ על הפעל ולשמור את הפרוטוקול אם תתבקש, ו (זה אופציונלי אך מומלץ מאוד) לבצע הדמיה של הקלות מתוכנתים התערובת מגיב להקלות כדי להבטיח את העיצוב הנכון של היתר על ידי לחיצה על הדמיית לחצן. לאחר השלמתו, לחץ על סגור.
  5. לחץ על הפעל, ולאחר מכן להפעיל כפתור כדי להתחיל את התוכנית לחילוק: כפי שביקשת, למקם את לוחית המקור (עם) (TR-תערובת-מלא) ואת לוחית היעד (לדלל-ו-DNA מלא) ב nanodispenser נפק.
    הערה: זמן החילוק הוא פחות מ-20 דקות עבור צלחת מלאה 384-היטב כאשר מחלק 500 nL של תערובת TR.
  6. דגירה 15-30 דקות בטמפרטורת החדר לאחר הוספת TR ל-DNA כפי שמצוין על ידי פרוטוקול היצרן.

8. תא מפעיל לטיפול בנוזלים

  1. הכן את המטפל הנוזלי הפריסטטי. לתאים מסוימים חטא מראש קלטת 10 μL על-ידי ריסוס עם הגולש Aniospray לגלישה 29 חיטוי וקליטת השריד על הנייר. הר את הקלטת על המכשיר המטפל בנוזל הפריסטלטי, לשנות את הגדרת סוג הקלטת ל 10 μL, וודא שתבנית הלוח מוגדרת ל-384 בארות.
  2. חטא את הצינורות הקסטה 10 μL כפי שמתואר בעבר בשלב 4.2. לצלול מארגן הצינור בכלי סטרילי ולשטוף את אבובים עם 5 מ ל של 70% אלכוהול, אז עם 5 מ ל של מים מזוקקים, ולבסוף, עם 5 מ ל של סרום ללא מדיום, מלא ברציפות באותו כלי ו עד כל צינור ריק.
  3. הכינו את ההשעיה של התא כדי לוותר. מצלחת B10-תרבות של החברה, לשטוף את התאים 1x עם תמיסת מלח באגירה 1 x פוספט (PBS), ולאחר מכן לנתק את התאים עם טריפסין/EDTA עבור 5 דקות ב 37 ° c.
  4. בדוק את הדיסוציאציה של התא מתחת למיקרוסקופ ולהפסיק את הפעולה טריפסין/EDTA על-ידי הוספת 10 מ ל של בינונית מלאה (DMEM בתוספת הסרום העוברי 10% ו-100 U/mL פניצילין-סטרפטומיצין; לראות את הטבלה של חומר) בצלחת התרבות. הקציר תאים בצינור 50 mL ולספור את התאים מתחת למיקרוסקופ, באמצעות תא Mal, או מונה תאים אוטומטי.
  5. הכינו לפחות 25 מ ל של השעיית תא הלה בריכוז של 37,500 תאים/mL במדיום המלא (כלומר, 1,500 תאים/40 μL) עבור צלחת מלאה 384-באר, כדי להבטיח הטרמה הצינור 40 μL/ובכן היתר.
  6. כדי לוותר על התאים, למלא כלי סטרילי חדש עם ההשעיה התא המוכן ולעורר אותו כדי למנוע שיפוכי המוביל לחוסר דיוק בצפיפות התא של היתר. הכנס את מארגן הצינור בפתרון זה ולחץ על הלחצן הראשי עד שההשעיה של התא מתחילה לשטוף מהראש החילוק. ודא שאף אחד מהעצות אינו סתום על-ידי בדיקה חזותית של זרימת הנוזלים מכולן, וודא שכל צינורית נטענת עם השעיית תא.
  7. טען את ה-DNA ו-TR-מלא 384-ובכן לוחית היעד על המוביל לוחית הטיפול הנוזלי הפריסטלטית ולהסיר את המכסה שלה. הפעל את התוכנית מכוילים מראש כדי לוותר על 40 μL של השעיית התא על צלחת השלם 384-באר (כלומר, 1,500 תאים/טוב). . זמן החילוק הוא בערך שמונה החלף את המכסה של הצלחת 384-היטב.
    הערה: לחילופין, השעיית תא 40 μL ניתן לשימוש ידני באמצעות מיקרופיפטה רב-ערוצית.

9. שיטת ביולוגית מותאמת אישית (מעקב ביעילות התא)

הערה: בעקבות ההגדרות הנסיוניות וכוונת הניסוי, השתמש בשיטות הנדרשות לאור השמש, בקרינה פלואורסצנטית, בהקרנה בתוכן הגבוה ובשיעתוק הפוך ותגובת שרשרת פולימראז כמותית (RT-qPCR). בחלק זה של הפרוטוקול, יעילות החצייה של התא מוערכת באמצעות מיקרוסקופ קרינה אוטומטי וניתוח תמונה.

  1. מודקת את הצלחת ב 37 ° c עם 5% CO2 באווירה רווי המים עד הביטוי חלבון תקין.
    הערה: כאן, זמן דגירה 48 h משמש עבור תאי הלה לפקח על יעילות החצייה, באמצעות tdTomato-ו-mVenus-ביטוי פלמידים.
  2. הסר את התרבות בינונית 48 h לאחר ההעברה על ידי היפוך הצלחת, להוסיף 30 μl/טוב של 10% פורמלין באמצעות המטפל נוזלי הפריסטטיק (10 μl קלטת), ו דגירה עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. הסר את פורמלין על ידי היפוך הצלחת; אז, מודלת את התאים 15 דקות בטמפרטורת החדר עם 0.1 ng/mL Hoechst מדולל בפתרון 1x PBS.
  4. לשטוף את התאים 3x עבור 15 דקות עם 80 μl של 1 x PBS מותאם ל-pH = 8 כדי לשחזר את האות הפלואורסצנטית גבוה איבד על ידי 6.9 ה-ph של השלב הדגירה של פתרון פורמלין.
  5. באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט אוטומטי, לרכוש תמונות של שניים או שלושה ערוצי פלורסנט (Hoechst, tdTomato, ו mVenus) ברצף עם מטרות 10x ו מסנן פליטה נכונה סט (4 ′, 6-diamidino-2-פנילילינדול [DAPI], dsRed, ו fluorescein isothiocyanate [FITC], בהתאמה).
  6. כדי להעריך את היעילות המוגברת, השתמש בתוכנת ניתוח תמונה כדי לקבוע את היעילות המוגברת באמצעות ניתוח סקריפט המבוסס על צביעת גרעינים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי לקבוע אם טכנולוגיית ה-ADE יכולה לשמש לפרוטוקול היפוך אוטומטי לאחור, אנו מנטרים את יעילות השימוש בתאי הקרינה על-ידי המיקרוסקופיה הפלואורסצנטית, באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט אדום. ראשית מכוון לקביעת הפרמטרים הטובים ביותר החצייה, כמויות שונות של מדלל וכמות מוחלטת של DNA היו בדיקה צולבת. נפח דילול שימש כדי לאפשר את טיפות ה-DNA, לאחר הפריסה, להתפשט בכל רחבי הבארות כדי לעקוף את הזיהום הומוגנית נצפתה בניסויים ראשוניים (כלומר, רק במרכז הבארות). כפי שמוצג באיור 6A, הגלגול של תאי הלה באמצעות ליפולילקס מגיב20 היה מוצלח. מעניין, על ידי שימוש 1 μL מדלל נפח, כמויות DNA החל 5 כדי 30 ng הראה את היעילות באותו עד 90% מעבר התא לעומת כמויות גבוהות יותר, כגון 50 ו 100 ng, אשר ירידה פתאומית נצפתה. ניסינו שונים מדלל כרכים החל 15 nL כדי 4 μL וזיהה 1 μL להיות המצב הטוב ביותר, כפי שניתן לזהות באופן משמעותי כאן באמצעות 30 ng של דנ א.

Figure 6
איור 6 : תוצאות מייצגות. (א) השפעת כמות ה-DNA ונפח הדילול על יעילות הזיהום. תאי הלה הפוכים הפוך באמצעות המכשיר nanodispenser נפק וליפוולילקס, באמצעות ריכוז 1x כפי שמומלץ על ידי היצרן. של דילול מומלץ (סרום-ללא מדיום), 15-4000 nL שימש עם 10-100 ng כמויות של אדום-פלורסנט ביטוי פלסמיד (tdTomato). יעילות החצייה היתה נחושה 48 h לאחר ההעברה באמצעות תוכנת ניתוח מבוססת תמונה. התוצאות מבוטא כאחוז של תאים מזוהמים עבור כמות ה-DNA הגוברת, ואת נפח דילול מראה את התנאים האופטימליים: 30 ng של ה-DNA הכולל נפח דילול גדל 1 μL של מדלל עם הגדלת כמויות DNA. קווי השגיאה מייצגים את ה-SEM עם n ≥ 4. מבחן ANOVA דו כיוון ובונפררוני שימשו לניתוח סטטיסטי. *p < 0.05 לעומת נקודות אחרות. (ב) יציבות צלחות ה-DNA המוכנות. דילול (1 μL) היה ויתרו באמצעות המטפל נוזלי הפריסטטיק, ו 30 ng של ה-DNA היה ויתרו מיד באמצעות ליפוולילקס מגיב באופן שניתן על ידי ADE (שליטה) או מאוחסן בטמפרטורת החדר פעם אחת יבש או קפוא ב-20 ° c. בימים 0, 2, או 7, יבש DNA היה מיובש עם 1 μL של דילול באמצעות המטפל נוזלי הפריסטטי, וצלחות קפואות הופלו בטמפרטורת החדר ו centrifuged (ב 1,500 x g עבור 2 דקות). התאים הופרה לאחר מכן באמצעות המטפל נוזלי הפריסטטיק בהתאם לפרוטוקול המתואר. קווי השגיאה מייצגים את ה-SEM עם n ≥ 3. מבחן ANOVA דו כיוון ובונפררוני שימשו לניתוח סטטיסטי. ns = אינו שונה באופן משמעותי. (ג) התייעלות גנטית של דנ א. תאי הלה היו מזוהמים עם 30 ng של mVenus-ו tdTomato-ביטוי פלפמיד נטען בשני בארות מקור נפרד (באמצעות 1.7 היחס של mVenus מעל tdTomato על מנת לדרג את התפוקה שלהם זריחה היחסי). יעילות החצייה הושוו 48 h לאחר ההעברה באמצעות תוכנת ניתוח מבוססי תמונה וביטאו כאחוז של תאים מזוהמים ואחוז של תאים מזוהמים בתוך האוכלוסיה המנוכר. אחוז התאים המזוהמים נקבע על-ידי חישוב מספר התא המבטא הירוק-פלואורסצנטי בתאים האדומים של אוכלוסיית הפלורסנט. קווי השגיאה מייצגים את ה-SEM עם n ≥ 3. מבחן ANOVA דו כיוון ובונפררוני שימשו לניתוח סטטיסטי. ns = אינו שונה באופן משמעותי. (ד) שדות מייצגים של מיקרוסקופ ניאון מתוך רכישת התמונה המוצגת בלוח C באמצעות שלושה ערוצי פלורסנט (Hoechst, Tdtomato ו-mvenus) שנרכשו באופן רציף על ידי פלטפורמת דימות (טבלת חומרים ), באמצעות יעדי 10x וערכת מסנני פליטה נכונה (DAPI, dsRed ו-FITC, בהתאמה). דמות זו שונתה מקולין ואח '1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

כדי לשפר עוד יותר את התפוקה של פרוטוקול זה, אנו בחנו הבא אם לוחית מקור אחסון מלאה עם דנ א פתרונות מדלל ניתן לאחסן ולהשתמש בשלב מאוחר יותר. שתי דרכים של ביעילות לאחסן ה-DNA נבדקו, כלומר יבש לאחסן את הצלחת על ידי מאפשר לו להתייבש על הספסל או אחסון קפוא (ב-20 ° c). שתי שיטות האחסון לא הובילו לתוצאות שונות באופן משמעותי מאשר פתרון ה-DNA המאוחסן במשך עד 7 ימים (איור 6B), ושני השיטות אפשרו לבצע העברה של לוחות dna מאוחסנים לוחיות הקדם, כגון בנק של פלסמידים הן.

בסופו של דבר, כמו מעבר פלגיאמצע מתרחשת לעתים קרובות באמצעות לפחות שני פלמידים שונים, אנחנו הבאים בחנו את היכולת ריבוב ה-DNA של הפרוטוקול המוצג כאן באמצעות התנאים המזוהים ביותר (1 μL של דילול ו 30 ng של DNA). TdTomato בשימוש הקודם בצבע אדום-פלורסנט-חלבון-המבטא פלאמאמצע שונה לבטא mVenus, חלבון פלורסנט צהוב בהיר, ושניהם שימשו לאחר מכן ניסיונות העברה. בדיקת תאים בצבע אדום או ירוק-פלורסנט (איור 6C) הראתה את היעילות ה80 לפני הניתוח. עם זאת, באוכלוסייה האדומה, כמעט 100% של התאים היו גם מזוהמים עם מרכז הבדיקה של mVenus-ביטוי כפי שניתן לראות בניתוח התמונה מבוסס תוכנה ייצוגית של איור 6D.

איור משלים 1: תרשים המציג גובה מותאם מתאים לירידה כדי לגעת בחלק התחתון של הבאר כדי למנוע שמירה על קצה החילוק. בצד שמאל, הגדרות נאות לאפשר את הירידה להתפשט על משטח הבאר הימנעות ההחזקה שלה על הטיפים מחילוק. מימין, הגדרות רע להוביל droplet שמירה כי ניתן לצפות במהלך התנועה הראש אל raw הבאה. אנא לחץ כאן כדי להוריד איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הקמתה והאופטימיזציה של שיטת העברה מדויקת של תפוקה גבוהה עבור קו תאים נתון מחייבת מדענים לעקוב אחר כמה פרמטרים מרכזיים המתוארים בסעיף זה. אנו מעודדים מאוד להתחיל עם הערכים המומלצים במהלך הפרוטוקול כמו הגדרות אלה אופטימיזציה עבור תאי הלה הוכיחו גם להיות יעיל עבור תאי HEK. עם זאת, ככל שהפרמטרים הטובים ביותר עשויים להיות תלויים בקווי התאים ובחומרים השונים, התנאים האופטימליים יכולים להיות מוגדרים על-ידי שינוי מספר התאים, נפח הדילול, סכום ה-DNA הכולל, והטבעה מגיב, ריכוז, או אפילו אמצעי אחסון המשמשים כ מקרה במהלך האופטימיזציה של פרוטוקול זה עבור תאי הלה1.

הפרוטוקול הכולל שהוצג כאן פותח וממוטב נוסף כדי לאפשר העברת תאים גם על ידי טירונים בתחום. כדי להגיע למטרה זו, כלי מפתח כדי לעבד את הפרוטוקול פשוט ככל האפשר ולהימנע שגיאות אנושיות פותחו: מאקרו משתמש בגיליון אלקטרוני ידידותי כדי לעצב בקלות את הניסוי ויישום לוח כדי להנחות את המשתמש למלא כראוי את המקור צלחות.

לכן, כדי להבטיח את אמינות הפרוטוקול, יש לשלוט רק בכמה צעדים קריטיים: i) עיצוב ניסיוני מתאים; ii) הקלות הפריסטלטיות המתאימות מהמטפל הנוזלי הקלאסי; iii) ה-DNA והזיהום הנכון מגיב בצורה אקוסטית מבוססת הקלות; iv) הימנעות מצנטריפוגה של לוחית המקור לפני היתר מגיב היתר כמו זה נראה לפגוע בזיהום. בעקבות ההמלצות הללו יבטיחו את הזיהום היעיל של התאים.

תכנון ניסיוני תקין

ההתקנה הניסיונית כבר מעובד ידידותי למשתמש על ידי פיתוח הגיליון האלקטרוני של המאקרו אשר רק צריך להיות מלא עם שם המצופה ה-DNA, הסכום הרצוי, וכמה ערכי פרמטרים מרכזיים. לאחר המילוי, המאקרו מנתח תחילה את הפרמטרים שהוזנו כדי לזהות שגיאות פוטנציאליות, כגון אמצעי אחסון מינימליים ומרביים מתאימים שהוזנו עבור בארות המקור והעוצמה המממנת את עוצמת ההעברה הכימית. יתרה מזאת, בהתבסס על ריכוזי ה-DNA שהוזנו בכל אחת מארבע השורות האפשריות וכמות הפלביניים שהוזנה בשדות המשמשים כבסיס, המאקרו מוודא אם אמצעי האחסון הצפויים לוותר הם כפולות של 2.5 nL (נפח הטיפות המוחלק על-ידי ה ננו-מתקן). לאחר ביצוע צ'ק של שגיאות כלשהן, המאקרו מחשב את הסכום הכולל של כל דגימת דנ א שיהיה צורך לעבור ולאחר מכן, עיצוב תבנית המקור (על-ידי מיון שמות ה-DNA בסדר אלפביתי). אמצעי האחסון המצוינים בלוח המקור מתבקשים לקחת בחשבון את אמצעי האחסון הפועלים הצפויים במקור היטב (מחושבים מערכי אמצעי האחסון המינימליים והמקסימלי המלאים בגיליון התבניות). כל הקלות הצפויות של ה-DNA בכל אחת מבארות כתובים בגיליון הבחירה של ה-DNA. רשימת הבארות של ה-DNA משמשת לכתיבת גיליון ת א-רשימת בחירה בנפח התרגום המצוין בגיליון התבנית. אמצעי האחסון המחושבים בגיליון לוחית המקור מועברים לאחר מכן לגיליון מדריך ה384-הטוב ביותר. נתונים מ-DNA-רשימת בחירה, TR-בחירה, ו 384-ובכן pipetting יטוף מדריך משמשים אז כדי ליצור את הקבצים המתאימים בפורמט *. csv.

ד. נ. א נכון והיתר היתר על לוחית המקור

כמו לחילוק על לוחית מקור 384-ובכן, באופן ספציפי יותר, איתור היטב את היעד יכול לקדם שגיאות הם בנוסף זמן רב, פיתחנו יישום ייעודי מבוסס לוח דומה iPipet21. בניגוד iPipet, האחד שמתואר כאן יכול לשמש עם אנדרואיד (רק אנדרואיד גרסה 4.4 ומעלה נתמך). מבוסס על קובץ מדריך. csv של 384-Wellst-p-pt-gaouo-i שנוצר על-ידי הגיליון האלקטרוני של המאקרו, הוא מסייע למשתמש בתהליך החילוק הכולל. בעוד השימוש שלה עבור כמה הקלות היתר אינו שווה את זה, זה יכול להיות מעניין כדי לחסוך זמן ולהימנע שגיאות אם מספר גדול של DNA ו-TR הקלות מצפים. על קובץ ה-. csv להכיל היטב, צלחת, שם, ריכוז ומידע אודות אמצעי אחסון. לאחר מכן ניתן להשתמש ביישום זה עבור יישומים אחרים, כגון פתרונות לחילוק (ריאגנטים, צבען, מתחם וכו ') היטב במטרה, בהתאם לקובץ csv ייעודי של המשתמש. יתרה מזאת, היא מאפשרת למשתמש להאיר שורה שלמה או קו על-ידי הזנת המידע הרלוונטי לתוך עמודת היעד המתאימה באמצעות תבנית צפויה זו: Row_1 (עד 24) או Line_A (ל-P).

פתרון בעיות בנצילות התאים הירודים

כמה פרמטרים המתוארים להלן עלול לפגוע הזיהום התאים בפרוטוקול מבוסס ADE המתוארת ויהיה צריך להיבדק בנפרד ולעקוף במקרה של בעיות יעילות.

אחד הפרמטרים החשובים הראשונים לזיהום הוא איכות התאים והצפיפות המשמשת במהלך הזריעה. למרות שכל סוג תא ידרוש פרמטרים שונים, יש לכבד חלק מהם כדי להבטיח העברה מוצלחת. קודם כל, השעיית התא חייב להיות מוכן extemporaneously מתוך צלחת subconfluent כדי למנוע לחץ התא לפני החצייה, ואין להשאיר אותם שוכב על הספסל זמן רב מדי (2 h מקסימום). השני, הצפיפות הזריעה של התאים חייבת להיות נמוכה מספיק בשביל שתי סיבות: כדי למנוע מאנשי קשר סלולריים ולקדם משטח תא גבוה לאחר התפשטות, אך גם משום שתאים מתחלקים באופן פעיל עדיף לקחת חומצה גרעין זר22,23. למרבה הצער, צפיפות התא המיטבית עבור החצייה משתנה בהתאם לסוגי התאים ולטכנולוגיית השידור, והיא צריכה להיקבע לכל קו תא. אלו הם פרמטרים מכריעים להבטחת הזיהום האפקטיבי.

פרמטר חשוב נוסף שיכול לווסת את יעילות המעבר הוא מספר הטלפון24. אכן, תאים בתרבות הם חשופים ללא הרף לאבולוציה בשל התחרות והבחירה הטבעית. ידוע היטב כי הביטוי הגנטי הדיפרנציאלי בין מספרים מעבר נמוך לבין התאים הגבוהים צפוי ברוב קווי התאים בשל ביטול מספר המעבר עולה. בעקבות תופעה זו עלולה להיות גם השפעה על יעילות ההעברה. עם זאת, תופעות הקשורות המעבר הוכחו להיות תלויים בכבדות בקו התא ואת תנאי התרבות. בנוסף לכך, מה שנחשב לרמת מעבר "גבוהה" משתנה מקו תא אחד למשנהו. משמעות הדבר היא שטווח מספר המעבר שתחתיו ניתן לבצע מערכת ניסויים באופן אמין חייב להיקבע עבור כל קו תאים מסוים.

פרמטר נוסף, המשפר את הקושי בקביעת התנאים הטובים ביותר לצורך העברה, הוא שהרכב התרבותי של התרבות גם ממלא תפקיד מכריע מאז הימצאות סרום ו/או אנטיביוטיקה מווסת את היעילות. ואכן, רוב הפרוטוקולים המסחריים ממליצים על שימוש במדיום ללא סרום במהלך שלב החצייה כדי לשפר את היעילות או לעקוף בעיות של יעילות לקויה3,25,26,27. עם זאת, פרמטר זה הוא אכן מורכב יותר לעצור כפי שהוא הוכח כי, עבור קו התאים הנתון, מוקדם לעומת מעברים מאוחרים עשוי לשפר או להפחית את היעילות בהתאם לנוכחות סרום או היעדרות במדיום התרבות28. חוקרים אחרים לקדם את השימוש במדיום ללא אנטיביוטיקה עבור המעבר לפני החצייה כאשר תאים culturing, על מנת להשיג תאים באיכות גבוהה עבור העברה של29. לסיכום, כאשר מיטוב תנאי המעבר עבור סוג תא נתון, כל אחד מהפרמטרים הללו צריך להיבדק: מוקדם או מאוחר בתאי מעבר ושימוש בינוני עם או בלי נסיוב במהלך המעבר האחרון לפני איסוף התאים ו/או במהלך ה צעד בעצמו

במהלך אופטימיזציה של הפרוטוקול המוצג כאן, שני סוגים של החומר הכימי שימשו: ליפוזומבית היוצרים ליפובי מתחמים כמו ליפופיוליקס מגיב, תרכובת פולימריים ליפוזומבית1. בעוד שהיה לנו הצלחה במשך שנים באופן ידני לעגל את תאי הלה עם הראשון, היעילות של הזיהום המסכן נצפתה בפרוטוקול האוטומטי הנוכחי. זה היה כנראה בגלל צעד וורטקנג נדרש בעת ערבוב ה-DNA עם הזיהום מגיב כי לא ניתן לבצע בפורמט 384-באר צלחת. ליפוקולוליקס לא צריך צעד כזה, ולכן, הוביל יעילות החצייה גבוהה יותר בכל ההגדרות נבדק. למרות זאת לא אושרה במחקר הנוכחי, הימנעות החוצה ריאגנטים הדורשים צעד שילוב פיזי כגון ליטוף או vortexing יהיה כנראה להוביל תוצאות טובות יותר.

כמו כן, אנו ממליצים על השימוש באגמת מגיב התואם לגלגול הפוך כאשר הפרוטוקול המוצג מבוסס על העברה הפוכה. תאים מסוימים ידועים להיות קשה transfect וכמה תרכובות כימיות ייעודי מפותחים כדי לקדם את היעילות מעבר גבוה יותר30,31. אם מכוונים לעבר התאים הקשים להעברה, מומלץ לבדוק את החומרים הניתנים לזיהוי מסוג תא או תא, בהנחה שהגלגול ההפוך הוא אפשרי עם אלה.

מספר פרמטרים המפורטים בפסקאות המשמשות כבסיס עשויים להשפיע ולפגוע במידת מה בתהליך החילוק של ADE, ואולי להרוס את הניסוי הסופי.

ננו מתקן פותחה כדי לוותר על 2.5 nL טיפות מתוך בארות מקור מלא 3-12 μL של מאגר מים (כלומר, 9 μL עבודה נפח). מכשיר ננו משתמש במחקר זה משלב טכנולוגיה דינמית ניתוח נוזלים לקביעת הרכב הנוזלים גובה נוזלי בלוח המקור כדי לשלוט על הכוח הדרוש כדי להוציא 2.5 nL טיפות19. בעת מילוי לוחית המקור באופן ידני או באמצעות מטפל הנוזל הקלאסי הפריסטלטי, אמצעי האחסון הם לרוב לא כל כך מדויק מאלה שנקבעו על ידי ניתוח נוזל דינמי. זוהי נקודה מכרעת לקחת בחשבון כמו המכשיר אינו מסוגל לוותר על בארות מקור טעון עם יותר מ 12 μL. לכן, נוכחותם תסכן את הניסוי. כמובן, רשימה של היתר ביצוע ניתן ליצור בסוף התוכנית, אבל זה דורש המשתמש להתאים את אמצעי האחסון ולהפעיל תוכנית כדי לשחזר את היתר היתר בלבד. כדי למנוע חילוקי דעות אלה, מומלץ לבצע "סקר" ברגע שהפלמידים של ה-DNA נטענו כדי לאמת את הנפח הצפוי בכל הקשור היטב.

פרמטר מכריע לפליטה של droplet הוא הווריאציה במתח משטח נוזלי17,32. פתרונות DNA מים ידועים בצמיגות שלהם; הדבר עלול לפגוע בתהליך החילוק באמצעות ADE. בעוד הפרמטרים הפיזיים לא נקבעו במחקר הקודם שלנו1, ריכוז גבוה יותר של פתרון ה-DNA בלוחית המקור הביא ליעילות הזיהום התחתון, גם עבור אותה כמות מוחלטת של DNA שולל, כנראה בגלל זה תופעה. כך, אנו ממליצים באמצעות דילול פלמיד של 100 ng/μL עבור התוצאות הטובות ביותר, למרות ריכוזים אחרים עשויים להיבדק עבור נוחות המשתמש. כדי להבטיח ADE נכונה עם ריכוז ה-DNA הדרוש למשתמש, צבע ניתן להוסיף לפתרון כדי לפקח על הפליטה droplet בבארות או, אפילו טוב יותר, על מכסה הצלחת. כמו המטרה הראשונה של הפרוטוקול המוצג היה לצבור תפוקה גבוהה, מיני זול מבוססי באמצע ה-DNA בינוני הכנה ערכות להתאים עם הלוח מבוססי התפוקה הגבוהה בפרוטוקולים טיהור שימשו. בעוד זה עבד כראוי במהלך הביצועים של הניסוי, במקרה של יעילות נמוכה והכדאיות התא המסכן לאחר הטיהור, מומלץ להשתמש גבוה כיתה שיטות טיהור DNA כגון midi-או מקסי-ההכנות או אפילו אנדוטוקסין-חינם ערכות זמינות מסחרית אשר יבטיחו טוהר DNA טוב יותר רעילות נמוכה עבור התאים33.

פתרון בעיות בהעברה של תאים הומוגניות מעל משטח הבאר

ניסיונות ראשונים בעת הקמת הפרוטוקול הובילו לזיהום התאים רק במרכז הבארות, כאשר הטיפות נשלחו על ידי ADE. אכן, שמנו לב כי ה-DNA ואת תערובת התרגום לא היה מתפשט על פני השטח היטב והיה ייבוש לפני התוספת התאים בשל כרכים נמוך שופץ (בקושי 500 nL). כדי לעקוף בעיה זו, צעד מדלל התווסף כדי לאפשר את התערובת DNA/TR להתפשט בכל רחבי הבארות לפני בתוספת התאים. זה הביא לזיהום של תא הומוגנית בבאר. כך, כאשר משחזר את הניסוי ואת התערובת DNA/TR לא מתפשט בכל רחבי הבארות, נפח מדלל יכול להיות מותאם על פי צורכי המשתמש.

כמו מטפל נוזלי אקוסטי יכול להפיץ אמצעי אחסון בטווח nanoliter, השיטה המתוארת עלולה להיות לא כל מגבלות טכניות. עם זאת, שמנו לב כי הבארות המלאות בתמיסה הינן כפופות לאידוי, שיכולות להוות הגבלה. אם הכרכים המדויקים שניתן לסדר, מונשים על ידי התאיידות, הננו-מחילוק לא יבוצעו עד לסוף הצפוי. במקרה זה, דוח שגיאות נוצרת על-ידי הננו-מנפק. כדי לעקוף בעיה זו, השתמש באמצעי אחסון גבוהים יותר מהצפוי בעת שהייה בטווח העליון המקובל (אכן, נמוך מ-12 μL). עם זאת, אם אידוי מוביל לפגיעה של כמה הקלות, דו ח שגיאה נוצר על ידי ננו מנפק. ניתן להשתמש בקובץ זה כדי למלא את לוחית המקור עם מגיב חדש כדי להיות מוכל על בארות היעד מודאג. לעשות את זה בזמן קצר לא נראה לפגוע ביעילות הזיהום.

הפרוטוקול המתואר כאן הוא הראשון להשיג תפוקה בלתי תלויה של דנ א עצמאי. התעריפים הטובים ביותר שהגיעו בעבר היו עבור 288 מצבים שונים שנדרשו כישורים מיוחדים מאוד כדי להתבצע בו15. זה, מלבד התפוקה הגבוהה שלה, הפרוטוקול הנוכחי יש יתרונות משמעותיים אחרים כמו התהליך הכולל כבר אופטימיזציה כדי לאפשר את השימוש שלה על ידי מומחים וכלים פותחו כדי למנוע שגיאות, כלומר i) המאקרו הייעודי גיליון אלקטרוני המאפשר את העיצוב הקל של התבנית ניסיוני, ii) את הדור האוטומטי של ה-DNA המתאים לוחית המקור (s) תבנית של מאקרו זה, iii) הדור של שני קבצים מוכנים לשימוש כדי לשלוט על הקלות תוכנה מונחה הקלות של DNA ו-התפתחות מגיב על ידי המכשיר ננו, ו iv) הייצוא של "384-טוב pipetting יטוף מדריך" קובץ המתאים ללוח המקור (עם) מתוכנן, לשמש על ידי יישום מבוסס לוח ייעודי גם פיתח על מנת למנוע טעויות אנוש בעוד מ384 את לוחית המקור של הבאר (s).

שיפורים עתידיים בפרוטוקול

על מנת לשפר את התפוקה ואת היכולת, לוחית המקור מלא פלמידים יכול להיות מאוחסן ב 4 ° צ' או קפוא כרגיל עבור פתרונות ה-DNA מניות. יתר על כן, הראינו כי לוחית היעד טעונה מראש שמולאו עם ה-DNA יכול גם להיות מאוחסן יבש או קפוא לפחות 7 ימים לפני הוספת מגיב ותאים הקשר, המוביל לשיפור התפוקה הכוללת קלות של הפרוטוקול. שימור ה-DNA עבור יותר מ 4 שנים דווחו בעבר באמצעות מיטוב מדיה34 וצריך, לכן, להיבדק בהקשר של פרוטוקול זה כפי שהוא ידחוף אותו צעד נוסף, המאפשר אחסון לטווח ארוך של צלחות מלאות בבנקים של ומוכנים לשימוש. בניסויי החצייה

בעבר הצגנו כי ניתן להעביר את תנאי החצייה האופטימליים לניסויים בקנה מידה גבוה יותר, החל מ-96 עד 10 ס מ מנות תרבות1, על-ידי חישוב כמות ה-DNA, נפח הגידול הניתן לתרגום וצפיפות התא האמורה ל להשתמש בהתבסס על הפרוטוקול הממוטב 384-לוחית רישוי. כמו 1536-ובכן היתר הצלחת ניתן לטפל על ידי ננו מנפק מדי, הפרוטוקול יכול גם להתבצע בקנה מידה נמוך יותר, ובכך לשפר את התפוקה שלה. עם זאת, מגבלה מרכזית כדי להגיע לתבנית זו היא היכולת לוותר על תאים ולנהל את הקריאה הסופית בפורמט מיניאטורי כזה. תא שחלק על ידי ADE כבר בוצע בהצלחה בפורמט 1536-ובכן הצלחת35 באמצעות פתרון של דחיסות נייטרלית שמנעה את זריעת התאים והבטיחו צפיפות תא שווה בזמן. מבוסס על מספר התא המשמש כאן ואת יחס פני השטח של 384 (0.056 ס"מ2) לעומת 1536 בארות (0.025 ס"מ2), 500-650 תאים יהיה בפורמט זה האחרון. מגוון היתר של תאים מסוג זה הוכח כמהימן מאוד אם נעשה שימוש בפתרון מרוכז של 14%-18% מהדחיסות הנייטרלית. תחת הגדרות אלה, 100 nL של ההשעיה התא יחולקו מעל 1536 בארות. עם פתרון עובד של 5-8 μL בבארות כאלה, הוספת 5-8 μL של התרבות בינונית באמצעות מטפלים הקלאסי נוזלי הפריסטלטיים יהיה לדלל את הפתרון אנטי זריעה כדי פחות מ 0.3%, ובכך לאפשר זריעת תאים נאותה. מעבר תאים בקנה מידה כה נמוך ולכן נראה מבחינה טכנית אפשרי; עם זאת, ההשפעה של הריכוז השרידי של פתרון הדחיסות הנייטרלית ביעילות היכולת להיות נקבעת על-ידי עבודה נוספת.

באמצעות לוחית המקור סוגים הנושאים נפח עבודה גבוה יותר כדי לחלק את התאים, כגון 384-היטב לוחות פוליפרופילן מקור בעל נפח עבודה של 45 μL, יאפשר 100 nL פתרון תאים הקלות מתוך ארבע בארות מקור רק עבור הכולל 1536-צלחת. יתר על כן, ננודיספנסרים חדשים מסוגלים לוותר על טיפות של 25 nL במקום 2.5 nL ששימש בפרוטוקול זה. גודל השחרור הזה, לאחר מכן, מחלק את הזמן המפריד באמצעות 10, אך מרמז להשתמש במספר כרכים של 25 nL, אשר לעומת זאת, להישאר תואמים לאמצעי האחסון השונים הנמצאים בפרוטוקול המוצג כאן.

בהתבסס על העבודות האחרונות ושיפורים טכנולוגיים, צעד נוסף של תא ADE לשלב כדי להשיג 1536-צלחת להגביר את היכולת להוסיף בקלות לפרוטוקול הנוכחי. עם זאת, הגעה למזעור מסוג זה שווה רק במידה והדבר ניתן במקביל בפורמט מיניאטורי כזה.

לסיכום, פיתחנו שיטת העברה קלה, תפוקה גבוהה ומדויקת הנושאת מספר יתרונות בגלל המזעור: (1) הפחתת עלויות הזיהום; (2) הפחתת בזבוז של ההכנות DNA; (3) להבטיח כי גם למתחילים יכול בהצלחה לבצע הזיהום התא. אכן, זה דורש רק כמה צעדים ידני קל, כלומר דילול ה-DNA כדי 100 ng/μL, לחלק אותו על צלחת המקור (אחד פלבאמצע/טוב) על פי התבנית הנוצרת בגיליון אלקטרוני באמצעות מדריך מבוסס הלוח, והכנת ההשעיה התא לפני זריעה. הננו-מתקן מבוססי אייד הוא אחראי על משלוח הזמן והטעויות הנוטה לטעות, וריבוב של הפלמידים, על פי התבנית הנתונה של הניסוי.

יתר על כן, בעוד פרוטוקול זה יכול להבטיח את רוב המטרות הביולוגי הבסיסי של ניסויים באמצעות החצייה הקלאסית, זה יכול גם לפתוח דרכים חדשות עבור ניסויים מבוססי מערך. לדוגמה, ביטוי או להפיל כל אחד החלבון קידוד האדם גן מאוסף ORFeome אנושי36 או CRISPR-Cas9 מבוססי הספרייה גישות37, בהתאמה, ידרוש פחות מ 24 שעות על פלטפורמת אוטומטי ייעודי (53 x 384- צלחות), במקום 2-3 ימים של עבודה אנושית, בהנחה את השימוש בבנק צלחת DNA-מראש. בשל יעילות גבוהה וביצועים בתפוקה גבוהה, הפרוטוקול המוצג כאן עשוי אפילו להיות מסוגל להשיג גישות חדשות שאינן במאגר עבור CRISPR-Cas9 מבוסס-מחקרים עם ספריות gRNA/CRISPR-Cas9-ביטוי פלמידים. אכן, שינויים מתון פנוטיפ הסלולר, אשר כרגע לא יכול לאפשר את הצעד הנדרש מיון התא, לבסוף יהיה לניהול, כמו אחד גם מייצג גן אחד הפיל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

המחברים חשף קבלת התמיכה הפיננסית הבאה למחקר, מחבר ו/או פרסום מאמר זה: Inserm, אוניברסיטת ליל, מכון ליל-פסטר, Conseil Régional du Nord, ופרים-HCV1 ו-2 (שיא דה רצ'רצ'ה) למשל, סוכנות הידיעות הלאומית דה לה רצ'רצ'ה (ANR-10-04-01), הפדר (12001407 (ד-אל) ציוד לשעבר ביומד והקהילה האירופית (ERC-STG n ° 260901). המחברים רוצים להודות לד ר ש. מוראד, ד ר ב. וילרומאן, ד ר ר. פרירו-קלנט, וד ר ח. גראשט על הביקורת הקריטית והתיקונים של כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384LDV Microplate Labcyte LP-0200
384-well Microplate μClear Black Greiner 781906
Ampicilin Sigma A9393-5G Selection antibiotic for bacteria transformed with ampicilin expressing vector
Android Tablet Samsung Galaxy Note 8 used to guide the user while the source plate manual dispense
Aniospray Surf 29 Anios 2421073 disinfectant to clean the MicroFlo head
Columbus software Perkin Elmer image analysis software
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate Thermo Fisher Scientific 10566032 cell culture medium
Echo Cherry Pick 1.5.3 software Labcyte Software enabling ADE-based dispenses by the Echo550 device from a *.csv file; nanodispenser software
Echo550 Labcyte ADE-based dispenser
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16000044 to add in cell culture medium
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128-4L to fix cell
HeLa cells ATCC HeLa (ATCC® CCL-2™)
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Thermo Fisher Scientific H3570 10 mg/mL Solution in Water
INCell Analyzer 6000 GE Healthcare 29043323 automated laser-based confocal imaging platform
LB medium Thermoischer Scientific
LB Broth Base (Lennox L Broth Base)®, powder
12780052 culture medium for bacteria growth
Lysis Buffer (A2)  Macherey-Nagel 740912.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
MicroFlo 10µL cassette Biotek Instruments Inc 7170013 to use with the Microflo Dispenser
MicroFlo 1μL cassette Biotek Instruments Inc 7170012 to use with the Microflo Dispenser
MicroFlo Dispenser Biotek Instruments Inc 7171000 peristaltic pump-based liquid handler device
Microvolume spectrophotometer Denovix DS-11 Spectrophotometer Measure the DNA concentration of samples
mVenus plasmid mVenus cDNA was cloned by enzymatic restriction digestion and ligation in Age1/BsrG1 sites of the tdTomato-N1 plasmid Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: mVenus
Neutralization Buffer (A3)  Macherey-Nagel 740913.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
NucleoSpin Plasmid kit Macherey-Nagel 740588.50 used to prepare plasmid from bacterial culture
Optimal-Modified Eagle Medium (Opti-MEM) Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
optional Wash bufferWash Buffer (A4) Macherey-Nagel 740914.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
orbital shaker  incubated large capacity shaker 444-7084 Used to grow bacteria under gentle agitation and 37°C
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 10,000 U/mL
Phosphate-Buffered Saline Thermo Fisher Scientific 10010001
Plasmid mini-columns Macherey-Nagel 740499.250 Silica membrane mini-column to prepare plasmid from bacterial culture
Resuspension Buffer (A1)  Macherey-Nagel 740911.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
RNAse A Macherey-Nagel 740505 Enzyme from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
tdTomato-N1 plasmid Addgene Plasmid #54642 Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: tdTomato 
TransIT-X2 Dynamic Delivery System Mirus Bio MIR 6000
Wash Buffer (AW) Macherey-Nagel 740916.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
3D printer Creality CR10S used to print the plate adapter
Blender Software   https://www.blender.org/
Free software under GNU General Public License (GPL).
version 2.79b used to design the plate adapter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Colin, B., Deprez, B., Couturier, C. High-Throughput DNA Plasmid Transfection Using Acoustic Droplet Ejection Technology. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. , 2472555218803064 (2018).
  2. Mirus Bio. Optimising Transfection Performance. , (2019).
  3. Thermo Fisher Scientific. Factors Influencing Transfection Efficiency | Thermo Fisher Scientific - FR. , https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/references/gibco-cell-culture-basics/transfection-basics/factors-influencing-transfection-efficiency.html (2019).
  4. Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).
  5. Figueroa, E., et al. A mechanistic investigation exploring the differential transfection efficiencies between the easy-to-transfect SK-BR3 and difficult-to-transfect CT26 cell lines. Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 36 (2017).
  6. Kirchenbuechler, I., Kirchenbuechler, D., Elbaum, M. Correlation between cationic lipid-based transfection and cell division. Experimental Cell Research. 345 (1), 1-5 (2016).
  7. Zhang, Z., Qiu, S., Zhang, X., Chen, W. Optimized DNA electroporation for primary human T cell engineering. BMC Biotechnology. 18 (1), 4 (2018).
  8. Cao, D., et al. Transfection activity and the mechanism of pDNA-complexes based on the hybrid of low-generation PAMAM and branched PEI-1.8k. Molecular bioSystems. 9 (12), 3175-3186 (2013).
  9. Bos, A. B., et al. Development of a semi-automated high throughput transient transfection system. Journal of Biotechnology. 180, 10-16 (2014).
  10. Colosimo, A., et al. Transfer and expression of foreign genes in mammalian cells. BioTechniques. 29 (2), 314-318 (2000).
  11. Villa-Diaz, L. G., Garcia-Perez, J. L., Krebsbach, P. H. Enhanced transfection efficiency of human embryonic stem cells by the incorporation of DNA liposomes in extracellular matrix. Stem Cells and Development. 19 (12), 1949-1957 (2010).
  12. Sabatini, D. M. Reverse transfection method. , WO2001020015A1 (2001).
  13. Raymond, C., et al. A simplified polyethylenimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods (San Diego, CA). 55 (1), 44-51 (2011).
  14. Junquera, E., Aicart, E. Recent progress in gene therapy to deliver nucleic acids with multivalent cationic vectors. Advances in Colloid and Interface Science. 233, 161-175 (2016).
  15. Woodruff, K., Maerkl, S. J. A High-Throughput Microfluidic Platform for Mammalian Cell Transfection and Culturing. Scientific Reports. 6, 23937 (2016).
  16. Vasileiou, T., Foresti, D., Bayram, A., Poulikakos, D., Ferrari, A. Toward Contactless Biology: Acoustophoretic DNA Transfection. Scientific Reports. 6, 20023 (2016).
  17. Hadimioglu, B., Stearns, R., Ellson, R. Moving Liquids with Sound: The Physics of Acoustic Droplet Ejection for Robust Laboratory Automation in Life Sciences. Journal of Laboratory Automation. 21 (1), 4-18 (2016).
  18. Grant, R. J., et al. Achieving accurate compound concentration in cell-based screening: validation of acoustic droplet ejection technology. Journal of Biomolecular Screening. 14 (5), 452-459 (2009).
  19. Sackmann, E. K., et al. Technologies That Enable Accurate and Precise Nano- to Milliliter-Scale Liquid Dispensing of Aqueous Reagents Using Acoustic Droplet Ejection. Journal of Laboratory Automation. 21 (1), 166-177 (2016).
  20. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chemical Society Reviews. 38 (10), 2887-2921 (2009).
  21. Zielinski, D., Gordon, A., Zaks, B. L., Erlich, Y. iPipet: sample handling using a tablet. Nature Methods. 11 (8), 784-785 (2014).
  22. Brunner, S., et al. Cell cycle dependence of gene transfer by lipoplex, polyplex and recombinant adenovirus. Gene Therapy. 7 (5), 401-407 (2000).
  23. Nii, T., et al. Single-Cell-State Culture of Human Pluripotent Stem Cells Increases Transfection Efficiency. BioResearch Open Access. 5 (1), 127-136 (2016).
  24. Noonan, D. J., Henry, K., Twaroski, M. L. A High-Throughput Mammalian Cell-Based Transient Transfection Assay. Signal Transduction Protocols. 284, 051-066 (2004).
  25. Transfection | TransIT Transfection Reagents | Mirus Bio. , https://www.mirusbio.com/products/transfection (2015).
  26. American Type Culture Collection. General protocol for transfection of stem cells, primary cells, and continuous cell lines with ATCC TransfeX Transfection Reagent. , https://www.atcc.org/~/media/Transfection%20protocols/TransfeX/TransfeX%20General%20Protocol%20on%20letterhead.ashx (2017).
  27. American Type Culture Collection. Transfection Reagents for Nucleic Acid Transfer into ATCC Cells. , http://www.lgcstandards-atcc.org/~/media/PDFs/Marketing%20Material/Cell%20Biology/Transfection%20reagents%20for%20nucleic%20acid.ashx (2017).
  28. de Los Milagros Bassani Molinas, M., Beer, C., Hesse, F., Wirth, M., Wagner, R. Optimizing the transient transfection process of HEK-293 suspension cells for protein production by nucleotide ratio monitoring. Cytotechnology. 66 (3), 493-514 (2014).
  29. Promega. FuGENE® 6 Transfection Reagent. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/101/fugene-6-transfection-reagent-protocol.pdf (2019).
  30. Olden, B. R., Cheng, Y., Yu, J. L., Pun, S. H. Cationic polymers for non-viral gene delivery to human T cells. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 282, 140-147 (2018).
  31. Park, E., Cho, H. B., Takimoto, K. Effective gene delivery into adipose-derived stem cells: transfection of cells in suspension with the use of a nuclear localization signal peptide-conjugated polyethylenimine. Cytotherapy. 17 (5), 536-542 (2015).
  32. Wood, R. W., Loomis, A. L. The physical and biological effects of high-frequency sound-waves of great intensity. The London, Edinburgh, and Dublin Philosophical Magazine and Journal of Science. 4 (22), 417-436 (1927).
  33. Eliminating Endotoxin at the Source - A Novel Competent Cell Line with Modified Lipopolysaccharide for Low-Endotoxin Plasmid Production. Mamat, U., et al. 28th Annual Symposium of the Protein Society, San Diego, CA, , (2014).
  34. Ivanova, N. V., Kuzmina, M. L. Protocols for dry DNA storage and shipment at room temperature. Molecular Ecology Resources. 13 (5), 890-898 (2013).
  35. Lesnick, J., Lejeune-Dodge, A., Ruppert, N., Jarman, C. High-Precision Cell Dispensing with the Labcyte Echo® Liquid Handler. , https://www.labcyte.com/content/applications/high-precision-cell-dispensing-with-the-labcyte-echo-liquid-handler (2017).
  36. Yang, X., et al. A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs. Nature Methods. 8 (8), 659-661 (2011).
  37. Peng, J., Zhou, Y., Zhu, S., Wei, W. High-throughput screens in mammalian cells using the CRISPR-Cas9 system. The FEBS journal. 282 (11), 2089-2096 (2015).

Tags

נסיגה גיליון 150 הוצאה לפליטה אקוסטית תפוקה גבוהה העברה העברה מפלסי דנ א תאי יונקים טיפול בנוזלים חלבון פלורסנט
התפוקה הגבוהה של DNA פלאגיסינג ומעבר באמצעות טכנולוגיית ננו-לחילוק אקוסטית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Colin, B., Rocq, N., Deprez, B.,More

Colin, B., Rocq, N., Deprez, B., Couturier, C. High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology. J. Vis. Exp. (150), e59570, doi:10.3791/59570 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter