Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Hög genomströmning DNA plasmid Multiplexing och transfektion med akustisk Nanodispenseringsteknik

Published: August 8, 2019 doi: 10.3791/59570
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Institut Pasteur de Lille, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (Inserm) U1177, Drugs and Molecules for Living Systems, Université de Lille, 2L'atelier du Développeur, Marquette lez Lille

Summary

Detta protokoll beskriver hög genomströmning plasmid transfektion av däggdjursceller i en 384-brunn plattan med hjälp av akustisk dropp ejektion teknik. Den tidskrävande, felbenägna DNA dispensering och Multiplexing, men också transfection reagens dispensering, är programvara driven och utförs av en nanodispenser enhet. Cellerna är sedan seedade i dessa förfyllda brunnar.

Abstract

Cell transfektion, oumbärlig för många biologiska studier, kräver att kontrollera många parametrar för en korrekt och framgångsrik prestation. Oftast utförs vid låga genomströmning, är det dessutom tidskrävande och felbenägna, ännu mer så när Multiplexing flera plasmider. Vi utvecklade en enkel, snabb och noggrann metod för att utföra cell transfektion i en 384-well tallrik layout med akustisk dropp ejektionsfraktion (ade) teknik. Den nanodispenseringsenhet som används i denna studie är baserad på denna teknik och möjliggör exakt nanovolymleverans med hög hastighet från en källbrunn plattan till en destination en. Det kan dispensera och multiplex DNA och transfektion reagens enligt en färdigdesignad kalkylblad. Här presenterar vi ett optimalt protokoll för att utföra ADE-baserade hög genomströmning plasmid transfektion som gör det möjligt att nå en effektivitet på upp till 90% och en nästan 100% cotransfection i cotransfection experiment. Vi utökar det initiala arbetet genom att föreslå ett användarvänligt kalkylbladsbaserat makro, som kan hantera upp till fyra plasmider/brunnar från ett bibliotek som innehåller upp till 1 536 olika plasmider, och en tablett-baserad pipettering guide ansökan. Makrot utformar den eller de nödvändiga mallen (-erna) på käll plattan (-erna) och genererar färdiga filer för nanodispensern och tablettbaserade program. De fyra stegen transfektion protokollet innebär i) en spädningsvätska avstå från en klassisk flytande handler, II) plasmid distribution och Multiplexing, III) en transfektion reagens dispensering av nanodispenser, och IV) cellplätering på de förfyllda brunnarna. Den beskrivna mjukvarubaserad kontroll av ADE plasmid Multiplexing och transfektion tillåter även icke-specialister inom området för att utföra en tillförlitlig cell transfektion på ett snabbt och säkert sätt. Den här metoden möjliggör snabb identifiering av optimala inställningar för en given celltyp och kan överföras till högre skala och manuella metoder. Protokollet underlättar tillämpningar, såsom human ORFeome protein (uppsättning av öppna läsramar [ORFs] i ett genom) uttryck eller CRISPR-Cas9-baserad genfunktion validering, i nonpoolade screening strategier.

Introduction

Den metod som presenteras här beskriver i detalj hur man utför DNA plasmid Multiplexing och transfektion i däggdjursceller vid hög genomströmning med hjälp av en akustisk-baserade flytande nanodispenser i en 384-bra tallrik, även för icke-specialister inom området. Detta nyligen publicerad metod1 gör det möjligt att utföra så mycket som 384 oberoende PLASMID DNA Multiplexing och transfektion villkor i ett experiment, på mindre än 1 h. enstaka eller cotransfektion experiment var framgångsrika, når en nära 100% transfektion inom den överförda cellpopulationen. Detta protokoll gör transfection lättare eftersom de flesta av de tråkiga, tidskrävande och felbenägna steg är nu programvara driven (se figur 1 för en allmän översikt). Ytterligare ansträngningar har gjorts för att utveckla dedikerade verktyg för att förbättra användarvänlighet och samtidigt undvika mänskliga fel under den övergripande processen och att främja framgångsrika transfektion även för icke-specialister inom området. Den beskrev protokoll omfattar en "förbrukaren-vänlig" makro Spreadsheet så pass vi vecklat upp for att hantera 384 oberoende transfektion författningarna med Multiplexing möjlighet av upp till fyra plasmider i var brunn. Makrot genererar automatiskt mallar av käll plattan (s) för att ladda den förväntade DNA plasmid volymen från att starta lagerlösningar och de filer som krävs för att driva nanodispensern programvara på experimentell design som har matas in. Eftersom manuell dispensering av DNA i en 384-well käll plattan är långtråkig och felbenägna, utvecklade vi också en dedikerad tablett-baserad applikation för att vägleda användaren medan dispensering DNA-lösning enligt mallen.

Figure 1
Figur 1: experimentellt arbetsflöde. Schematisk representation av den optimala automatiserade hög genomströmningen omvänd transfection protokoll (från experimentell design till anpassad biologisk analys). Manuella steg indikeras av hand symbolen och Ungefärlig tid för varje steg skrivs i en röd ruta. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Många cell-baserade experiment börjar med plasmid DNA-transfektion, och även om många dedikerade reagenser har varit och fortfarande utvecklas för att öka transfektion effektivitet och/eller underlätta förfarandet, mycket återstår att göra2,3 , 4. DNA-plasmid cell transfektion innebär flera steg för att nå hög effektivitet, såsom ett initialt komplext upptag, endosomala flykt, och cytoplasmiska transport till Nucleus5,6. Förutom kalcium nederbörd eller fysiska tekniker såsom elektroporation eller mikroinjektion med hjälp av dedikerade enheter7, moderna kemiska metoder har fokuserat på att förbättra DNA-cellleverans samtidigt sänka cell cytoxicitet8, 9. Användningen av lipider eller katjoniska polymerer bildar liposomer-liknande komplex och, mer nyligen, nonliposomal polymera kemisystem har gjort transfektion enklare och effektivare10. Trots denna utveckling, cell transfektion kräver fortfarande specifika färdigheter som skall utföras korrekt som de flesta av dessa fysiska eller kemiska transfektion protokoll kräver forskare att manuellt förbereda varje DNA transfektion reaktions tillstånd, vilket försämrar dataflödet. För att kringgå detta problem har omvända transfektion protokoll utvecklats med hjälp av kemiska transfektion reagens11,12,13, så att användaren kan testa eller kombinera flera plasmider på ett snabbare sätt. I dessa protokoll bildas nukleinsyrafkomplexen med transfektionsmedel innan de sådd cellerna på komplexen. Dessa omvända protokoll begränsas dock fortfarande av den manuella hanteringen av DNA-lösningar och av kombinationen av var och en av de oberoende förhållandena. Även om det är möjligt att utföra dem i en 96-bra plåtformat, DNA-förberedelse och dispenserar kommer att vara långtråkig, och det kommer sannolikt att bli misstag. När olika mängder av flera DNA-plasmider krävs och multiplexade med varandra, cell transfektion blir ännu svårare att uppnå och mer tidskrävande, och mänskliga fel blir ganska oundvikligt. Skala upp till 384-well plattan format i en omvänd transfektion strategi, trots få multiplexade DNA transfektion villkor, blir en omöjlig utmaning på grund av följande skäl. i) DNA-mängderna, transfektionsreagens eller reaktions blandnings volymer som ska hanteras är lägre än 1 μL för varje brunn. II) multiplexering av plasmider för 384 oberoende förhållanden blir oerhört komplicerat. Leveransen i var och en av de 384 brunnar är också III) mycket tidskrävande och IV) felbenägna. I själva verket är det svårt att hantera den rätta lösningen i de förväntade brunnarna eftersom de låga volymerna som redan dispenseras inte tillåter visuell övervakning mellan de tomma och redan fyllda brunnarna. v) Slutligen finns det en hög risk för torkning av blandningen genom avdunstning innan cellerna tillsätts på grund av den tid som behövs för att utföra nödvändiga dispenseringssteg. Sammanfattnings faktorn, den begränsande faktor för att inrätta hög genomströmning DNA plasmid transfektion analyser verkar vara miniatyrisering av analysen, vilket innebär låg volym multiplexering och hantera som inte kan hanteras manuellt längre men är också knappast möjligt i en tillförlitligt sätt av klassiska peristatiska vätske hanterare.

Som ett bevis på svårigheter att automatisera sådana analyser och få hög genomströmning, endast ett fåtal försök att automatisera transfektion har publicerats hittills: en 96-väl plattan format med hjälp av en kommersiell vätskehantering enhet och kalciumfosfat nederbörd14 och, mer nyligen, en lipoplex reagens, och en mikroflödessystem chip möjliggör 280 oberoende transfektioner15 men kräver specialiserade färdigheter inom detta område. En annan metod, acoustophoresis, vilket möjliggör flytande levitation och leder till vätske manipulation och blandning, användes för att utföra DNA-transfektion i 24-till 96-väl platta format16. Även om möjligt, denna metod lider av en extremt låg genomströmning som blandning av celler med DNA-transfektion blandning kräver en 60 s inkubering för varje enskild punkt före seedning. Detta innebär en varaktighet på minst 96 min för en komplett 96-brunn plattan. Dessutom är detta protokoll långt ifrån att vara mottagliga för den totala biologer publik eftersom detta arbete utfördes med en egen konstruerad och tillverkad enhet som för närvarande inte finns på marknaden. Tvärtom, under de senaste åren, en lättanvänd programvara driven akustiska-baserade dispenseringsteknik har uppstått med nano dispenser enheter. Med hjälp av fokuserad akustisk energi, dessa enheter tillåter tätt kontrollerad utmatning av små vätskevolymer från 2,5 nL till 500 nL från en källa plattan till en destination en17. Denna teknik, som kallas akustisk dropp utmatning (ade), har många fördelar: det är helt automatiserad, kontaktlös, tipless, exakt, exakt, och mycket reproducerbara, och den har en hög genomströmning18. Först ägnas åt att leverera dimetylsulfoxid (DMSO) lösningar, har inställningarna förbättrats för att avstå vattenhaltiga buffertar19. Akustiska nanodispensers, sedan, verkar lämplig för omvänd cell transfektion protokoll och kan kringgå de flesta av de ovan nämnda manuella begränsningar. Eftersom inga plasmid-transfektionförsök tidigare beskrivits med denna teknik, utvärderade vi nyligen lämpligheten av en akustisk-baserade dispenseringssystem för att utföra omvänd cell transfektion.

Dra nytta av nanodispenser genomströmning och användarvänlighet, vi optimerat en omvänd transfection protokoll för HeLa celler genom att korstesta flera parametrar som kan påverka DNA-transfektion på en 384-väl, enda platta, nämligen den totala DNA-mängden och källans DNA-startkoncentration, spädnings volym, transfektionsreagens och antal spridda celler. Det framkallade protokollet kringtar de ovan beskrivna manuella begränsningarna av cell transfektion och presenterar flera fördelar jämfört med andra automatiserade transfektionförsök. Först är det miniatyriserade, vilket möjliggör kostnadseffektiv transfektion reagens genom att spara DNA plasmid preparat och transfektion reagens. För det andra är det mycket mer hög genomströmning och reproducerbara än den manuella protokoll (även för nybörjare), som transfektion av en hel 384-väl plattan kan uppnås på mindre än 1 h. Slutligen är det programvara driven, vilket gör det möjligt att kontrollera den dispenserade DNA-mängden och multiplexering av flera plasmider. Faktum är att tack vare nanodispensern programvara (tabell över material), kan användaren utarbeta en studieplan för att kontrollera de volymer som ska dispenseras från en definierad källa väl plattan till en destination en.

Det protokoll som presenteras här är främst avsett för dem som har tillgång till en nanodispenser och skulle vilja inrätta transfektion experiment vid hög genomströmning, men också för dem som vill snabbt optimera sina transfection parametrar för en given celltyp av tillämpa detta protokoll för att korstesta flera parametrar vid högt dataflöde. Vi har faktiskt visat att optimerade parametrar som identifierats med detta nanoskala-protokoll kan överföras till storskaliga och manuella transfektionsexperiment. Slutligen, eftersom det transfektionsreagens som används i detta protokoll tillåter DNA-eller siRNA-transfektion enligt tillverkaren, är protokollet också av intresse för dem som siktar på att utföra array-metoder för genöveruttryck eller knockdown. Destinations plattorna förifyllda med DNA kan bevaras upp till 7 dagar före användning i en transfektion test utan förlust av effekt, vilket är en annan fördel med följande protokoll för denna typ av ansökan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. förberedelser på förhand

  1. Beredning av peristaltiska vätske hanterare program
    Anmärkning: för spädnings-och cell dispenseringsstegen i protokollet måste ett särskilt program förberedas med beaktande av utmatnings huvudets höjd till den använda plattan och steg avsikten.
    1. För steg 1 μL spädningsvätska, montera en 1 μL kassett och Förbered ett program med de inställningar som beskrivs i steg 1.1.1.1 och 1.1.1.2.
      1. Justera parametern flödeshastighet till hög för bästa genomströmning eftersom ingen biologisk materiell skada förväntas i det här steget. Justera dispenseringshöjden till 9,6 mm (enligt den cell odlings platta som används, kompletterande figur 1) så att 1 μl droppe vidrör botten av brunnarna under dispens.
        Obs: detta steg är avgörande för att undvika att behålla dropparna på dispenseringshuvudet tills de når en tillräcklig volym för att sjunka.
      2. Justera plattan klar höjd till 14,4 mm för att möjliggöra en fri förskjutning av dispenseringshuvudet över plattan efter dispensering varje rad. Kontrollera de korrekta inställningarna för den peristaltiska vätske hanterarens huvudhöjd: se till att inga droppar finns kvar på dispenseringstippen medan dispensering och kontrollera att huvudet är tillräckligt högt för att tillåta förflyttning av huvudet efter dispensering varje rad.
        Obs: att undvika att släppa kvarhållning är en viktig parameter eftersom det kommer att försämra noggrannheten av volymen av dispens.
    2. För dispensering av 40 μL cellsuspension, montera en 10 μL kassett och Förbered ett program med inställningarna enligt beskrivningen i steg 1.1.2.1-1.1.2.2.
      1. Justera flödes parametern till låg för att fördela celler med låg hastighet för att undvika att främja potentiella skador på cellerna genom skjuvning stress och hög effekt på botten av brunnarna. Justera dispens höjden till 11,43 mm (enligt den cell odlings plåt som används, kompletterande figur 1), tillräckligt hög för att sänka cell påverkan på botten av brunnarna under dispenseringsprocessen men tillräckligt låg för att undvika att dropparna på utmatnings huvudet. Justera plattan klar höjd till 16 mm för att medge fri förskjutning av dispenseringshuvudet över plattan efter dispensering varje rad.
      2. Kontrollera de korrekta inställningarna för den peristaltiska vätske hanterarens huvudhöjd: se till att inga droppar finns kvar på dispenseringstippen medan dispensering och kontrollera att huvudet är tillräckligt högt för att tillåta förflyttning av huvudet efter dispensering varje rad.
        Obs: att undvika att släppa kvarhållning är en avgörande parameter eftersom det kommer att leda till dispensering ett opålitligt cell nummer.
  2. DNA-plasmid beredning (klassisk miniprep extraktion protokoll)
    1. Odla en transformerad DH5α bakteriestam i LB medium kompletterad med 125 μg/mL ampicillin Selection antibiotikum (tabell över material) över natten vid 37 ° c och under mild agitation (200 rpm) på en orbital shaker (tabell över material).
    2. Skörda 2 mL av kulturen, pellets cellerna genom centrifugering för 5 min vid 6 000 x g, och Kassera supernatanten.
    3. Omsuspendera cellpelleten med 250 μL resuspension-buffert som innehåller RNase A (tabell över material). Tillsätt 250 μL lyseringsbuffert och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur enligt tillverkarens anvisningar.
    4. Stoppa lysis reaktionen genom att tillsätta 300 μL neutraliseringsbuffert (tabell över material) och vortextera inom kort. Centrifugera rören i 5 min vid 11 000 x g.
    5. Placera en ny plasmid-minikolonn (tabell över material) i ett 2 ml samlingsrör och dekanera supernatanten i kolonnen genom centrifugering i 1 min vid 11 000 x g.
    6. Kassera genomflödet och placera minikolonnen tillbaka i Samlingsröret.
    7. Tvätta plasmid minikolonnen med 500 μL av valfri tvättbuffert (tabell över material) och Centrifugera i 1 min vid 11 000 x genligt tillverkarens anvisningar.
    8. Kassera genomflödet och placera plasmid-minikolonnen tillbaka i Samlingsröret.
    9. Tillsätt 700 μL tvättbuffert (tabell över material) kompletterad med etanol och Centrifugera i 1 min vid 11 000 x genligt tillverkarens anvisningar.
    10. Kassera genomflödet och centrifugera plasmid-minikolonnen och dess samlingsrör 1x mer för 2 min vid 11 000 x g för att torka kiseldioxid membranet.
    11. Placera den torkade plasmid-minikolonnen i ett nytt 1,5 mL-rör och tillsätt 30 μL destillerat vatten vid 60 ° c, inkubera i 2 minuter vid rumstemperatur, och centrifugera sedan det i 1 min vid 11 000 x g.
    12. Kassera plasmidminikolonnen och förvara eluatet som innehåller den renade DNA-Plasmiden.
    13. Mät DNA-koncentrationen hos det eluerade DNA med hjälp av en mikrovolyms spektrofotometer (tabell över material).
      1. Slå på spektrofotometern och välj DNA -mätningsinställningar.
      2. Höj provtagnings armen på spektrofotometern och Pipettera 1 μL vatten på Mät piedestalen för att utföra en tom kalibrering.
      3. Sänk provtagnings armen, starta den tomma mätningen och vänta tills den är slutförd.
      4. Höj provtagnings armen och torka provet från de övre och nedre piedestalerna.
      5. Pipettera över 1 μL av DNA-lösningen på den nedre piedestalen för att mäta den.
      6. Sänk provtagnings armen, starta DNA-koncentrationsmätningen och vänta på slutförande.
      7. Höj provtagnings armen och torka provet från de övre och nedre piedestalerna.
      8. För ytterligare mätningar av DNA-koncentrationer, upprepa steg 1.2.13.5-1.2.13.7.
    14. När mätningarna är klara, förvara DNA-lösningarna vid 4 ° c tills de används.

2. experimentell utformning och generering av plocklistorna för att driva de ADE-baserade Dispenserna

Anmärkning: ett dedikerat "användarvänligt" kalkylblad makro utvecklades för att hantera DNA-mängder och blanda upp till fyra plasmider i en 384-well plåtformat. Baserat på den angivna experimentella designen, genererar detta makro de nödvändiga filerna för att driva det ADE-baserade DNA-transfektionsprotokollet av nanodispenser. För att generera dessa filer, måste flera fält fyllas i mallen arket som visas i figur 2.

Figure 2
Figur 2 : Generering av plocklistorna för att köra ade-dispenseringen med kalkylblads makrot. Flera parametrar måste fyllas, nämligen (1) transfektionsreagens (TR) och de minimala/maximala volymer som ska användas i käll plattan, (2) de initiala plasmidkoncentrationer som ska dispenseras i käll plattan, och (3) den hel plattans utformning, inklusive förväntade plasmid-mängder och multiplexering i var och en av 384-brunnarna. (4) generera plocklistor aktivering gör att de olika fälten som skall verifieras och, när de väl fylls, plocklistor för DNA och tr dispens och den nödvändiga källan plattan mallen genereras automatiskt. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Ange parametrarna för nanodispenser-protokollet i de rosa fälten. Ange blandnings värde för transfektionsreagens (TR) till 500 nL. Ställ in det minimala volym värdet i käll plattans brunnar på 4 μL. Ställ in maximal volym i käll plattans brunnar till 11,25 μL.
    Obs: den nanodispenser som används här kan bara överföra högst 500 nL i en körning av ADE. Dessa rosa fält är förifyllda med de rekommenderade värdena men kan ändras efter användarens behov.
  2. Ange 100 ng/μL DNA-startkoncentrationer i de blå fälten som motsvarar det underliggande DNA.
    Obs: detta värde är den optimala koncentrationen som tidigare definierats men kan dock ändras för olika användarbehov.
  3. Ange önskat DNA-belopp i de gråa/gröna fälten. Ange beloppen och plasmid namn för 384 brunnar, vilket garanterar samma stavning om samma plasmid används i flera brunnar.
  4. Generera käll plattans design, plocklistfiler och pipettering guide-filen. Klicka på generera plocklistor så att makrot kan generera DNA-picklist. csv, T. R.-picklist. csv och 384-Wells-pipetting-guide. csv filer från data som samlats in på motsvarande blad. Om så önskas, korrigera de orangefärgade cellvärdena eftersom det indikerar fel eller volymer som inte kan hanteras av nanodispensern.
  5. Skriv ut mallen/mal len från käll plattans ark. Plasmid namn och minimal volym för att fylla i brunnarna indikeras. Likaså, transfektion reagens blandnings volymer som nästa kommer att fyllas i följande brunnar anges som tr och markeras i grönt.

3. beredning av DNA-källplattor med hjälp av applikationen 384-well pipettering guide

  1. Späd den lagrade DNA-plasmiden från steg 1.2.14 till 100 ng/μL med destillerat vatten.
  2. Kalibrera 384-brunnen rutnät till plattan mått: öppna 384-well pipettering guide ansökan på en tablett (figur 3). Placera käll plattan på rutnätet på den nedre skärmen, och i den övre vänstra kalibrerings menyn, klicka på + eller - (eller Använd den röda markören) för att förbättra eller minska storleken på rutnätet och brunnar för att justera de gröna brunnarna till de fyra hörn brunnarna på plattan .

Figure 3
Figur 3 : Användning av applikationen 384-well pipettering guide. (1) kalibrering av 384-brunnen rutnät till plattan storlek; (2)) Montera av en universell 3D-tryckt plattadapter till tabletten med dubbelhäftande tejp; (3) placeringen av plattan på adaptern; (4) förskjutning av nätet för att centrera den till den monterade plattan. (5) lås av kalibrerings steget. (6) öppnande av 384 brunnar pipettering guide. csv fil. (7) med tanke på filförteckningen kommer ansökan att ange den förväntade käll skylans namn, reagens (DNA eller transfektionsreagens), koncentrationen och volymen för att fördela i mål brunnarna, som kommer att belysas en efter en. (8) vänster-och högerpilknapparna gör det möjligt för användaren att följa pipettering-guiden för att enkelt fördela reagenserna enligt kalkylbladsmallen/-mallen för makro käll plattan. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Använd dubbelhäftande tejp för att montera den 3D-tryckta plattadaptern på skärmen för att undvika rörelser på käll plattan under dispensering. Om det behövs flyttar du det kalibrerade rutnätet med hjälp av rotations pilarna och knapparna upp/ned/höger/vänster för att justera rutnätet på skärmen till plattans position. När rutnätet och väl storlekarna är korrekt kalibrerade och placerade, kryssa i rutan Lås kalibrering .
  2. Klicka på Arkiv och öppna 384 Wells pipettering guide. csv fil. Följ instruktionerna på skärmen för att manuellt fördela den angivna volymen av den indikerade plasmiden vid den angivna koncentrationen i den vita markerade brunnen som motsvarar den förväntade plattans rätta mål destination. Använd - eller + pilarna för att gå tillbaka eller vidare i DNA dispenseringsprocessen. Sluta dispensera när du når den första Transfektionreagens -lösningen för laddning.
  3. När DNA-dispensationerna är avslutade, ta bort käll plattan från adaptern. Om flera käll plattor måste fyllas, placera en ny käll skylt på adaptern och följ dispenseringsanvisningarna. När DNA-dispenseringen är avslutad, Centrifugera den DNA-fyllda käll plattan (s) (vid 1 500 x g i 2 min) för att säkerställa korrekt vätske utjämning och för att avlägsna bubblor som leder till felaktigheter i ade-baserade överföringar.

4. peristaltisk flytande handler-baserad 1 μL spädningsvätska i destinations plattan

Anmärkning: Utför steg 4.1-4.5 i ett biologiskt säkerhetsskåp.

  1. Desinficera kassett huvudet på 1 μL genom att spraya det med ett desinfektionsmedel (tabell över material) och låt denna lösning komma in i spets hållaren. Absorbera det kvarblivande desinfektionsmedlet på absorberande papper. Montera 1 μL-kassetten på den peristaltiska vätskehanterings enheten. Slå på enheten och kontrollera att kassett typens inställning är korrekt (1 μL), samt plattformat (384 brunnar).
  2. Desinficera hela lumen av slangen: sätt röret arrangören (hålla åtta rören tillsammans) i ett sterilt kärl och fyll den med 5 mL 70% alkohol. Genom att använda den peristaltiska vätske hanterarens grundnings funktion, spola först alkoholen i slangen och skölj den sedan genom att passera 5 mL destillerat vatten och 5 mL serumfritt medium (Dulbecco ' s Modified Eagle ' s medium [DMEM] kompletterat med 100 U/mL penicillin-streptomycin; Material), som successivt fylls på samma fartyg. Se till att ingen av spetsen är igensatt av visuellt inspektera vätskeflödet från alla av dem.
  3. Prime slangen med serumfritt medium genom att fylla ett nytt sterilt kärl med 10 mL förvärmda serumfritt medium och dyka röret arrangören i den. Tryck på Prime-knappen på den peristaltiska vätske hanteraren i ca 10 s. Återigen, se till att ingen spets är igensatt av visuellt inspektera vätskeflödet från alla av dem.
  4. Fyll plattan med 1 μL spädningsvätska. Placera en steril 384-brunn kultur tallrik (destination) på den peristaltiska flytande handler plattan bärare och ta bort locket.
  5. Kör det förkalibrerade programmet för att fördela 1 μl i varje brunn på 384-brunnen plattan. Dispenseringstid är cirka 8 s. Byt sedan locket på 384-brunnen plattan.
    Obs: Alternativt kan detta steg hanteras manuellt, i ett säkerhetsskåp, med hjälp av en multikanalmikropipett.

5. utförande av en undersökning för att kontrollera manuellt dispenserade volymer

Anmärkning: för detaljer, se figur 4.

  1. Kör nanodispenser programmet, gå till diagnostisk fliken, kryssa i käll plattan ut rutan, Ladda käll plattan på plattan hållaren, och kryssa i för att komma in i plattan. När du uppmanas, Välj 384Ldv_aq_b2 att ställa in nanodispenser till vattenlöslig buffert dispenseringsläget, och tryck på OK.
  2. Välj undersökning i diversemenyn och klicka på Launch. Välj de förfyllda brunnar som ska analyseras och klicka på Go -knappen. Kontrollera att de uppmätta volymerna matchar de förväntade och se till att inga brunnar har lästs in med volymer på mer än 12 μL, eftersom detta kommer att undvika överföringar.

Figure 4
Figur 4 : Definiera programparametrarna för undersökningen. (1) Starta nanodispenserprogrammet. (2) öppna fliken diagnostik . (3) sätt in käll plattan genom att kryssa ut för käll plattan och sedan i. (4) Ange käll plattans typ i menyn när du ombeds göra det. (5) i Diverse rutan, Välj undersökning i rullgardinsmenyn. (6) Starta undersökningsprogrammet genom att klicka på Launch. (7) Välj de förfyllda brunnar som ska mäta. (8) starta analysen genom att klicka på go. (9) När undersökningen har utförts skrivs de uppmätta volymerna i motsvarande valda brunnar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

6. ADE-driven DNA-dispens i destinations plattan

  1. Kör programvaran plocklista, Ställ in 384-well källa och destination plattan typer till 384_LDV och Greiner 384PS_781096, respektive (figur 5). Ställ in enheten på vattenbaserad buffertdispenseringsläget genom att välja 384ldv_aq_b2 och avmarkera "optimera överföringsdata flöde".

Figure 5
Figur 5 : Prestanda för plocklistebaserade tidsutdelningar. (1) Starta nanodispenserprogramvaran. På fliken protokoll väljer du (2) samplings plattans format, (3) destinations plattans typ och (4) unfästingar "optimera överföringsflödet". (5) Välj fliken plocklista . (6) Klicka på Importera och välj rätt *. csv-fil (DNA-Plocklista eller T.R.-plocklista). (7) när du är vald, klicka på Importera. (8) Klicka på spela och spara protokollet. (9) utför en dispens simulering genom att klicka på simulera, eller (10) starta den programmerade tidsutdelningen genom att klicka på Kör. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Välj "plocklista"-fliken, klicka på Importera, välj filen DNA-picklist. csv. Klicka på spela och spara protokollet. Klicka på simulera för att utföra en simulering av de programmerade tidsutdelningarna för att se till att plocklistan matchar den förväntade experimentella designen. När du är klar klickar du på Stäng.
  2. Klicka på spela, och sedan köra, för att starta dispenseringsprogrammet: när du tillfrågas, sätt in den begärda käll plattan (DNA-lösningar som fylls i manuellt) och destinations plattan (spädningsvätska) i nanodispensern.
    Obs: dispenseringstid är cirka 5-20 min för en komplett 384-brunn plattan, beroende på de valda volymerna och det totala antalet dispenser i experimentell design.
  3. Alternativt kan du pausa protokollet här eftersom spädningsvätskan-och DNA-fyllda plåtar klarar torr eller fryst förvaring i upp till 7 dagar. För torr förvaring, låt plattorna torka på bänken vid rumstemperatur och sedan förvara dem på samma sätt. Tina och centrifugera (vid 1 500 x g i 2 min) frysta lagrade plåtar före användning i ett transfektionssteg (avsnitt 7).
     

7. ADE-driven transfektion reagensdispensering

  1. I ett biosäkerhetsskåp, extempously utspädd lipopolyplex transfektion reagens i serumfritt medium till en 1x slutkoncentration. Vortex och fördela omedelbart denna transfektionsreagensblandning enligt den fördefinierade käll plattan (-erna) som är designad av makrot och med hjälp av den förkalibrerade 384-well pipettering guide-applikationen enligt beskrivningen i steg 3,4.
    Centrifugera inte käll plattan när den är laddad med reagensen eftersom ingen transfektion upptäcks efter centrifugering.
  2. Kör nanodispenseringsprogrammet för att utföra en "undersökning" som beskrivs i avsnitt 5, för att kontrollera volymerna för alla manuellt fyllda tr -brunnar på käll plattan (-erna) för att undvika att fel på grund av volymer som överskrider 12 μl undviks.
  3. Klicka på Återställ om du vill rensa exempel listan för DNA-plocklistan i programvaran för plocklistan och kontrollera att enhets parametrarna fortfarande är inställda på vattenbuffertar och på de typer av käll-och destinations plattor som används, som i steg 6,1.
  4. Klicka på Importera och välj filen tr-picklist. csv. Klicka på spela och spara protokollet om du uppmanas, och (detta är valfritt men rekommenderas starkt) utföra en simulering av den programmerade transfection reagens blandning dispenser för att säkerställa korrekt utformning av tidsutdelningar genom att klicka på Simulera knapp. När du är klar klickar du på Stäng.
  5. Klicka på spela, och sedan Run -knappen för att starta dispenseringsprogrammet: som begärts, placera käll plattan (er) (TR-blandning-fyllda) och destinations plattan (spädningsvätska-och DNA-fylld) i nanodispensern.
    Obs: dispenseringstid är mindre än 20 min för en komplett 384-brunn plattan vid dispensering 500 nL av TR blandning.
  6. Inkubera 15-30 min vid rumstemperatur efter tillsats av TR till det DNA som anges i tillverkarens protokoll.

8. peristaltisk flytande handler-baserad cell dispens

  1. Förbered den peristaltiska vätske hanteraren för dispensering av celler. Desinficera en 10 μL kassett huvud genom att spraya den med Aniospray Surf 29 desinfektionsmedel och absorbera resterna på papper. Montera kassetten på den peristaltiska vätskehanterings enheten, ändra kassett typs inställningen till 10 μL och kontrollera att plattans format är inställt på 384 brunnar.
  2. Desinficera de 10 μL kassettslangar som tidigare beskrivits i steg 4,2. röret arrangören i ett sterilt kärl och spola slangen med 5 mL 70% alkohol, sedan med 5 mL destillerat vatten, och slutligen, med 5 mL av serumfritt medium, successivt fylls i samma kärl och tills varje rör är tom.
  3. Förbered cellsuspensionen att avstå. Från en konfluenta hela cell B10-kultur skålen, tvätta cellerna 1x med 1x fosfat-buffrad saltlösning (PBS) lösningen, och sedan separera cellerna med trypsin/EDTA i 5 min vid 37 ° c.
  4. Kontrollera cell dissociation under ett mikroskop och stoppa trypsin/EDTA åtgärder genom att tillsätta 10 mL av hela mediet (DMEM kompletteras med 10% foster bovint serum och 100 U/mL penicillin-streptomycin, se tabellen av material) i kultur skålen. Skörda celler i en 50 mL rör och räkna cellerna under mikroskopet, med hjälp av en Malassez cell eller en automatisk cell räknare.
  5. Bered minst 25 mL HeLa cellsuspensionen vid en koncentration av 37 500 celler/mL i hela mediet (dvs. 1 500 celler/40 μL) för en komplett 384-brunn-platta, för att säkerställa att röret priming och 40 μL/brunn dispensering.
  6. För att fördela cellerna, Fyll en ny steril kärl med den beredda cellsuspensionen och rör om den för att undvika sedimentering som leder till felaktigheter i CELLTÄTHETEN av tidsutdelningen. Sätt i röret organisatören i denna lösning och tryck på Prime -knappen tills cellsuspensionen börjar spola från dispenseringshuvudet. Se till att ingen av spetsen är igensatt av visuellt inspektera vätskeflödet från dem alla, och se till att varje rör är laddad med cellsuspension.
  7. Fyll på DNA och TR-fyllda 384-väl destinations plattan på peristaltiska flytande handler plattan bärare och ta bort locket. Kör det förkalibrerade programmet för att fördela 40 μl av cellsuspensionen på den kompletta 384-brunnen plattan (dvs., 1 500 celler/brunn). Dispenseringstid är ca 8 s. sätt tillbaka locket på 384-brunnen plattan.
    Obs: Alternativt kan 40 μL cellsuspension manuellt dispenseras med en flerkanalslympipett.

9. anpassad biologisk analys (cell transfektion effektivitets övervakning)

Anmärkning: efter experimentella inställningar och avsikten med experimentet, använda de metoder som krävs för luminescence, fluorescens, hög innehåll screening och omvänd Transkription kvantitativ polymeras kedjereaktion (RT-qPCR). I detta avsnitt av protokollet utvärderas cell transfektionseffektiviteten genom automatiserad fluorescens-mikroskopi och bildanalys.

  1. Inkubera plattan vid 37 ° c med 5% CO2 i en vattenmättad atmosfär och tills korrekt proteinuttryck.
    Obs: här, en 48 h inkubationstid används för HeLa celler för att övervaka transfektion effektivitet, med hjälp av tdTomato-och mVenus-uttrycker plasmider.
  2. Ta bort odlingsmediet 48 h efter transfektion genom att invertera plattan, tillsätt 30 μL/brunn av 10% formalin med hjälp av den peristaltiska vätske hanteraren (10 μL kassett) och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur.
  3. Ta bort formalin genom att invertera plattan; sedan, inkubera cellerna i 15 min vid rumstemperatur med 0,1 ng/mL Hoechst utspädd i 1x PBS lösning.
  4. Tvätta cellerna 3x i 15 min med 80 μL 1x PBS justerad till pH = 8 för att återfå den höga fluorescenssignalen som förlorats av 6,9 pH i formalin Solution inkuberingsteststeget.
  5. Med hjälp av ett automatiserat fluorescerande Mikroskop, förvärva bilder av två eller tre lysrör (Hoechst, tdTomato och mVenus) sekventiellt med 10X mål och en ordentlig utsläpp Filter Set (4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole [DAPI], dsRed, och fluorescein respektive isotiocyanat [FITC]).
  6. För att utvärdera transfektion effektivitetsvinster, använda bildanalysprogram vara för att bestämma transfektion effektivitetsvinster med hjälp av skript analys baserad på kärnor färgning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

fIn för att avgöra om ADE-tekniken kan användas för en automatiserad omvänd transfektion protokoll, vi övervakade cell transfektion effektivitet genom fluorescens mikroskopi, med hjälp av en röd fluorescerande tdTomato uttrycker plasmid. Först siktade på att bestämma de bästa parametrarna för transfektion, var olika spädnings volymer och totala mängder av DNA korstestade. Spädnings volymen användes för att tillåta att DNA-dropparna, en gång dispenserades, spreds över brunnarna för att kringgå inhomogena transfektion som observerades i preliminära experiment (dvs. endast i mitten av brunnarna). Som framgår av figur 6a, var transfektion av hela celler med lipopolyplex reagens20 framgångsrik. Intressant är, genom att använda en 1 μL spädnings volym, DNA-mängder från 5 till 30 ng visade samma effektivitet och upp till 90% cell transfektion jämfört med högre belopp, såsom 50 och 100 ng, för vilka en plötslig minskning observerades. Vi har provat olika spädnings volymer från 15 nL till 4 μL och identifierat 1 μL som bästa tillstånd, vilket exemplifieras av 30 ng DNA.

Figure 6
Figur 6 : Representativa resultat. A) effekten av DNA-mängden och spädnings volymen på transfektionseffektiviteten. Hela cells var omvänd transfekterade med hjälp av nanodispenserenheten och lipopolyplex, med en 1x koncentration som rekommenderas av tillverkaren. Av den rekommenderade spädningsvätskan (serumfritt medium), 15-4000 nL användes med 10-100 ng mängder av röd-fluorescerande-uttrycker plasmid (tdTomato). Transfektion effektivitetsvinster bestämdes 48 h post-transfektion med hjälp av bildbaserad analysprogramvara. Resultaten uttrycks som en procentandel av transfekterade celler för det ökande DNA-värdet, och spädnings volymen visar de optimala förhållandena: 30 ng av totalt DNA med en ökande spädnings volym och 1 μl spädningsvätska med ökande DNA-mängder. Felstaplarna representerar SEM med n ≥ 4. Tvåvägsanova och Bonferroni post-test användes för statistisk analys. *p < 0,05 jämfört med andra prickar. B) stabiliteten hos de PREPARERADE DNA-plattorna. Spädningsvätskan (1 μl) dispenserades med hjälp av den peristaltiska vätske hanteraren och 30 ng av DNA dispenserades och omedelbart transfekterade med lipopolyplex-reagens som expedierades av ade (kontroll) eller antingen lagrades i rumstemperatur en gång torr eller fryst vid-20 ° c. Vid dag 0, 2 eller 7 återhydrerades torrt DNA med 1 μL spädningsvätska med hjälp av den peristaltiska vätske hanteraren, och frysta plåtar tinades vid rumstemperatur och centrifugerades (vid 1 500 x g i 2 min). Celler sedan seedade med hjälp av peristaltiska flytande hanterare enligt det beskrivna protokollet. Felstaplarna representerar SEM med n ≥ 3. Tvåvägsanova och Bonferroni post-test användes för statistisk analys. ns = obetydligt annorlunda. C) PLASMID-DNA cotransfektionseffektivitet. HeLa cells transfekterade med 30 ng av mvenus-och tdtomato-uttrycker plasmid lastas i två separata källbrunnar (med en 1,7 förhållandet mellan mvenus över tdtomato för att nivå deras relativa fluorescens utgång). Transfektion effektivitetsvinster jämfördes 48 h post-transfektion med hjälp av bildbaserad analysprogramvara och uttrycktes i procent av transfekterade celler och en procentandel av cotransfected celler inom den transfekterade populationen. Procentsatsen av cotransfected celler bestämdes genom att beräkna den gröna-Fluorescence-uttrycker cell nummer i den röda fluorescerande befolknings celler. Felstaplarna representerar SEM med n ≥ 3. Tvåvägsanova och Bonferroni post-test användes för statistisk analys. ns = obetydligt annorlunda. D) representativa fält av fluorescensmikroskopi från bild förvärvet som visas i panel C med hjälp av tre fluorescerande kanaler (Hoechst, Tdtomato och mvenus) som har förvärvats av en avbildnings plattform (tabell över material ), med hjälp av 10X mål och en riktig utsläpps filteruppsättning (DAPI, dsRed respektive FITC). Denna siffra har modifierats från Colin et al.1. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

För att ytterligare förbättra genomflödet av detta protokoll, undersökte vi nästa om en käll skylt lagring fylld med DNA och spädningsvätska lösningar skulle kunna lagras och användas i ett senare skede. Två sätt att effektivt lagra DNA testades, nämligen torr förvaring av plattan genom att låta den torka på bänken eller fryst lagring (vid-20 ° c). Båda lagringsmetoderna ledde inte till signifikant olika resultat än den nyligen dispenserade DNA-lösningen som lagrades i upp till 7 dagar (figur 6b), och båda metoderna gjorde det möjligt att utföra transfektion från lagrade DNA-förfyllda plåtar, såsom en bank av Plasmider.

Slutligen, som plasmid transfektion oftast sker med hjälp av minst två olika plasmider, undersökte vi nästa DNA Multiplexing förmåga protokollet presenteras här med hjälp av de bästa identifierade förhållanden (1 μL spädningsvätska och 30 ng av DNA). Den tidigare använda tdTomato röd-fluorescerande-protein-uttrycker plasmid ändrades för att uttrycka mVenus, en ljusgul fluorescerande protein, och båda användes sedan i cotransfection försök. Röd-eller grön-fluorescerande-positiv cell analys (figur 6C) visade att transfektionseffektiviteten var cirka 80%. men i den röda befolkningen, nästan 100% av cellerna var också cotransfected med mVenus-uttrycker plasmid som kan ses i den representativa programvarubaserade bildanalys av figur 6D.

Kompletterande figur 1: diagram som visar en lämplig dispenseringshöjd för droppe för att röra vid botten av brunnen för att undvika dess kvarhållning på dispenseringsspetsen. Till vänster, rätt inställningar tillåter Drop att sprida sig på brunnen ytan undvika dess retention på dispenseringstips. Till höger leder dåliga inställningar till lagring av DROPP-filer som kan observeras under huvud förflyttningen till nästa RAW. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Etablering och optimering av en exakt hög genomströmning metod för en given cellinjer kräver forskare att följa några viktiga parametrar som beskrivs i det här avsnittet. Vi uppmuntrar starkt att börja med de rekommenderade värdena i hela protokollet eftersom dessa inställningar optimerade för HeLa celler också visat sig vara effektiva för HEK-celler. Men eftersom de bästa parametrarna kan bero på cellinjer och transfektion reagenser, optimala förhållanden kan definieras genom att variera cell nummer, spädnings volym, totalt DNA-belopp, och transfektion reagens natur, koncentration, eller till och med volym som används som var fallet under optimeringen av detta protokoll för HeLa celler1.

Det övergripande protokollet som presenteras här har utvecklats och ytterligare optimerad för att tillåta cell transfektion även av nybörjare på fältet. För att nå detta mål, viktiga verktyg för att göra protokollet så enkelt som möjligt och undvika mänskliga fel har utvecklats: ett användarvänligt kalkylblad makro för att enkelt designa experimentet och ett Tablet-program för att vägleda användaren att korrekt fylla källan Skylt(ar).

För att säkerställa protokollets tillförlitlighet måste därför endast ett fåtal kritiska steg kontrolleras: i) en ordentlig experimentell utformning; II) de korrekta peristaltiska dispensationerna från den klassiska peristaltiska vätske hanteraren; III) rätt DNA och transfektion reagens akustiska-baserade dispenser; IV) undvika centrifugering av käll plattan före transfektion reagensdispensering som tycktes försämra transfektion. Efter dessa få rekommendationer skulle säkerställa en effektiv transfektion av cellerna.

Ordentlig experimentell design

Den experimentella installationen har gjorts användarvänliga av utvecklingen av makro kalkylblad som bara måste fyllas med den förväntade DNA plasmider namn, önskat belopp, och några viktiga parametervärden. När den är fylld analyserar makrot först de inmatade parametrarna för att upptäcka potentiella fel, till exempel lämpliga minimala och maximala volymer som angetts för käll brunnarna och volymen för transfektionsreagensdispensering. Dessutom, baserat på de DNA-koncentrationer som anges i var och en av de fyra möjliga raderna och plasmidkvantiteten som anges i de underliggande fälten, kontrollerar makrot om de förväntade volymerna att fördela är multiplar av 2,5 nL (volymen av dropparna som dispenseras av nanodispenser). När en kontroll av eventuella fel har utförts beräknar makrot den totala mängden av varje DNA-prov som måste dispenseras och designar sedan käll plattans mall (genom att sortera DNA-namnen i alfabetisk ordning). De volymer som anges i käll skylten (-erna) tar hänsyn till de arbets volymer som förväntas i en käll brunn (beräknat från de minimala och maximala volym värden som fylls i mallarket). Alla de förväntade DNA-dispensationerna i var och en av brunnarna skrivs sedan på DNA-plocklistebladet. Listan över DNA-transfected brunnar används sedan för att skriva TR-plocklistebladet med den transfektionreagensvolym som anges på mallarket. De volymer som beräknats på käll plattans ark överförs sedan till 384-well pipettering guide Sheet. Data från DNA-plocklistan, TR-picklist och 384-well pipettering guide används sedan för att generera motsvarande filer i *. CSV-format.

Korrekt DNA och TR dispens på käll plattan

Som dispensering på en 384-väl käll plattan och, mer specifikt, lokalisera målet väl kan främja fel och är dessutom tidskrävande, vi har utvecklat en dedikerad tablett-baserade program som liknar iPipet21. Tycka illa om iPipet, den en beskrev här kanna bli brukat med Android (bara Android version 4,4 och upp är stöttat). Baserat på filen 384-Wells-pipetting-guide. csv som genereras av makro kalkylbladet, hjälper den användaren i den övergripande dispenseringsprocessen. Medan dess användning för ett fåtal dispenser är inte värt det, kan det vara intressant att spara tid och undvika fel om ett stort antal DNA och TR-dispenser väntas. CSV-filen måste innehålla information om brunn, plåt, namn, koncentration och volym. Denna ansökan kan sedan användas för andra program, såsom dispenseringslösningar (reagens, färgämne, förening, etc.) i målet väl, enligt en användare dedikerad CSV-fil. Dessutom, det tillåter användaren att belysa en hel rad eller linje genom att ange relevant information i målet väl kolumnen med detta förväntade format: Row_1 (till 24) eller Line_A (till P).

Felsöka dålig cell transfektion effektivitet

Flera parametrar som beskrivs nedan kan försämra cell transfektion i det beskrivna ADE-baserade protokollet och måste kontrolleras individuellt och kringgås i händelse av effektivitetsproblem.

En av de första viktiga parametrarna för transfektion är kvaliteten på cellerna och densiteten som används under sådden. Även om varje celltyp kommer att kräva olika parametrar, vissa av dem måste respekteras för att säkerställa en lyckad transfektion. Först av allt, måste cellsuspensionen förberedas extemporerat från en subconfluent plattan för att undvika cell stress innan transfektion, och de bör inte lämnas liggande på bänken för länge (2 h max). För det andra måste sådd tätheten av cellerna vara tillräckligt låg för två skäl: för att undvika cellulära kontakter och främja en hög cellyta gång sprids, men också för att aktivt dividera celler bättre ta upp utländska nukleinsyra22,23. Tyvärr, den optimala CELLTÄTHETEN för transfektion varierar beroende på celltyper och transfektion teknik och måste bestämmas för varje cellinje. Dessa är avgörande parametrar för att säkerställa effektiv transfektion.

En annan viktig parameter som kan modulera transfektion effektivitet är cell passage nummer24. I själva verket utsätts celler i kulturen ständigt för evolutionen på grund av konkurrens och naturligt urval. Det är välkänt att differential genuttryck mellan låg och hög cell passage nummer förväntas i de flesta cellinjer på grund av Dedifferentiering som passagen antalet ökar. Efter detta fenomen kan även transfektionseffektiviteten påverkas. Emellertid, passage-relaterade effekter har visat sig vara starkt beroende av cell linjen och odlingsförhållanden. Ovanpå det, vad som anses vara en "hög" passage nivå varierar från en cellinjer till en annan. Detta innebär att det passage nummerintervall under vilket en uppsättning experiment kan utföras på ett tillförlitligt sätt måste bestämmas för varje given cellinje.

En annan parameter som förstärker svårigheten att fastställa de bästa förutsättningarna för transfektion är att kultur medium komposition också spelar en avgörande roll eftersom närvaron av serum och/eller antibiotika modulera transfektion effektivitet. Faktum är att de flesta kommersiella protokoll rekommenderar användning av serumfritt medium under transfektion steg för att öka effektiviteten eller kringgå problem med dålig verkningsgrad3,25,26,27. Men denna parameter är verkligen mer komplicerad att gripa som det har visat att, för en given cellinjer, tidiga kontra sena passager kan öka eller lägre effektivitet beroende på serum närvaro eller frånvaro i kulturen medium28. Andra forskare preconize bruket av antibiotikum-fritt medel för passagen för transfection, när att odling celler, för att erhålla högkvalitativa celler för transfection29. Sammanfattningsvis, när optimera transfektion villkor för en given celltyp, var och en av dessa parametrar bör testas: tidiga eller sena passage celler och användning av medel med eller utan serum under den sista passagen innan du skördar cellerna och/eller under själva transfection-steget.

Under optimeringen av det protokoll som presenteras här, två typer av reagens användes: en liposomalt reagens bildar Liposome-liknande komplex och lipopolyplex reagens, en nonliposomal polymer förening1. Medan vi hade framgång i flera år manuellt transfecting HeLa celler med den första, dålig transfektion effektivitet observerades i det nuvarande automatiserade protokollet. Detta var förmodligen på grund av ett nödvändigt vortexa steg när du blandar DNA med transfektion reagens som inte kan utföras i 384-väl plattan format. Den lipopolyplex behöver inte ett sådant steg och, därför, ledde till högre transfektion effektivitetsvinster i alla testade inställningar. Även om detta inte har bekräftats i den aktuella studien, undvika transfektion reagens som kräver en fysisk blandning steg sådan har pipettering eller vortexa kommer förmodligen att leda till bättre resultat.

Vi rekommenderar också användning av ett transfektionsreagens kompatibelt med omvänd transfektion eftersom det presenterade protokollet är baserat på en omvänd transfektion. Vissa celler är kända för att vara svåra att transfect och vissa särskilda kemiska föreningar utvecklas för att främja högre transfektion effektivitet30,31. Om siktar på transfecting svåra att transfect celler, rekommenderar vi att testa den givna cell-typ eller cell-line-dedikerade transfektion reagens, förutsatt omvänd transfektion är möjligt med dessa sådana.

Flera parametrar som beskrivs i de underliggande styckena kan ha en inverkan och något försämra ADE dispenseringsprocessen, möjligen förstör det slutliga experimentet.

Nanodispensern utvecklades för att fördela 2,5 nL droppar från källbrunnar fyllda med 3-12 μL vattenbuffert (d.v.s. 9 μL arbetsvolym). Den nanodispenseringsenhet som används i denna studie integrerar en dynamisk vätske analysteknik för bestämning av vätske sammansättningen och vätske höjden i käll plattan för att styra den effekt som behövs för att mata ut 2,5 nL droppar19. Medan du fyller käll plattan manuellt eller använder en klassisk peristaltisk vätske hanterare, är volymerna oftast inte så exakta än de som bestäms av den dynamiska vätske analysen. Detta är en avgörande punkt att ta hänsyn till eftersom enheten inte kan avstå från källbrunnar laddade med mer än 12 μL. Därför skulle deras närvaro äventyra experimentet. Naturligtvis kan en lista över de utförda tidsutdelningar genereras i slutet av programmet, men detta kräver att användaren att justera volymer och köra ett program för att återställa de missade tidsutdelningar bara. För att undvika dessa meningsskiljaktigheter rekommenderas att utföra en "undersökning" när DNA-plasmiderna har laddats för att kontrollera den förväntade volymen i varje berörd brunn.

En avgörande parameter för dropp utmatning är variationen i vätske ytans spänning17,32. Vatten DNA-lösningar är kända för sin viskositet; Detta kan försämra dispenseringsprocessen av ADE. De fysikaliska parametrarna fastställdes inte i vår tidigare studie1, högre DNA-lösningskoncentrationer i käll plattan resulterade i lägre verkningsgrad, även för samma totala mängd DNA som dispenserades, antagligen på grund av detta Fenomen. Sålunda, vi rekommenderar att du använder en Plasmid utspädning av 100 ng/μL för bästa resultat, även om andra koncentrationer kan testas för användarbekvämlighet. För att säkerställa korrekt ade med användaren behövs DNA-koncentration, kan ett färgämne läggas till lösningen för att övervaka dropp ejektion i brunnar eller, ännu bättre, på plattan locket. Eftersom det presenterade protokollets första mål var att få hög genomströmning, billiga minicolumn-baserade plasmid DNA minipreparation kit kompatibel med plattbaserade hög genomströmning plasmid renings protokoll användes. Det fungerade korrekt under utförandet av experimentet, i händelse av låg verkningsgrad och dålig cellviabilitet efter transfektion, rekommenderas att använda högre kvalitet DNA reningsmetoder såsom MIDI-eller Maxi-preparat eller ens endotoxin-fri kommersiellt tillgängliga kit som skulle säkerställa en bättre DNA renhet och lägre toxicitet för cellerna33.

Felsökning av inhomogena cell transfektion över brunnen ytbehandlar

Första försöken när inrättandet av protokollet ledde till cell transfektion endast i mitten av brunnarna, där dropparna skickades av ADE. Faktum är att vi märkte att DNA och transfection blandningen inte spred sig över hela brunnen ytan och var torkning innan cell tillägg på grund av de låga volymerna dispenseras (knappt 500 nL). För att kringgå detta problem, ett spädningsmedel dispenseringssteg lades till för att tillåta DNA/TR blandningen att spridas över hela brunnarna innan cell addition. Detta resulterade i en homogen cell transfektion i brunnen. Vid återgivning av experimentet och DNA/TR-blandningen inte sprids över brunnarna, kan utspädningsvolymen därför justeras efter användarens behov.

Eftersom den akustiska vätske hanteraren kan fördela volymer i nanoliterområdet, har den beskrivna metoden potentiellt inte några tekniska begränsningar. Vi märkte dock att vattenhaltiga lösningsfyllda brunnar är föremål för avdunstning, vilket skulle kunna utgöra en begränsning. Om de exakta volymerna som skall dispenseras sänks genom denna avdunstning, kommer nanodispensering inte att utföras till det förväntade slutet. I detta fall genereras en felrapport av nanodispensern. För att kringgå detta problem, använda högre volymer än väntat samtidigt vistas i den acceptabla övre intervallet (faktiskt, lägre än 12 μL). Men om avdunstning leder till försämring av vissa dispenser, en felrapport genereras av nanodispenser. Denna fil kan användas för att fylla käll plattan med nytt reagens som skall dispenseras på de berörda destinations brunnarna. Att göra detta i ett kort tidsintervall verkade inte försämra transfektionseffektiviteten.

Det protokoll som beskrivs här är den första att få en sådan genomströmning för oberoende DNA plasmid transfektioner. Bästa priserna nås innan var för 288 olika förhållanden som krävde mycket specialiserade färdigheter som skall utföras samtidigt15. Detta, bortsett från dess höga genomströmning, det nuvarande protokollet har andra betydande fördelar som den övergripande processen har optimerats för att tillåta dess användning av icke-specialister och verktyg har utvecklats för att undvika fel, nämligen i) en dedikerad kalkylblad makro som tillåter den enkla utformningen av den experimentella mallen, II) den automatiska generationen av motsvarande DNA-och transfektionsreagenskällskylt (s) mall av detta makro, III) generering av två färdiga att använda filer för att kontrollera programvara driven dispenser av DNA och transfektionsreagens av nanodispenseranordningen, och IV) exporten av en "384-well pipettering guide"-fil som motsvarar den/de käll platta (er) som utformats för att användas av en särskild tablett-baserad applikation som också utvecklats för att undvika mänskliga fel dispensering i 384-brunnen källa plattan (s).

Framtida förbättringar av protokollet

För att öka genomströmningen och reproducerbarheten, kan käll plattan fylld med plasmider förvaras vid 4 ° c eller frysas som vanligt för DNA-lagerlösningar. Dessutom visade vi att den förladdade destinations plattan som fyllts med DNA också kan förvaras torrt eller fryst i minst 7 dagar innan den tillför transfektionsreagens och celler, vilket leder till en förbättring av den totala genomströmningen och underlätta för protokollet. DNA-bevarande i mer än 4 år har tidigare rapporterats med hjälp av optimerade medier34 och bör därför testas i samband med detta protokoll eftersom det kommer att driva det ett steg längre, vilket möjliggör långsiktig lagring av plattor som är förfyllda med banker av plasmider och färdiga att använda i transfektion experiment.

Vi visade tidigare att identifierade optimala transfektion villkor kan överföras till högre skala experiment, från 96-väl till 10 cm kultur rätter1, genom att beräkna DNA-mängd, transfektion reagens volym, och celltäthet som bör användas baserat på det optimerade 384-well-plattprotokollet. Som 1536-brunn plattan dispens är hanterbar av nanodispenser också, protokollet kan också utföras i lägre skala, vilket förbättrar dess genomströmning. Men en stor begränsning för att nå detta format är förmågan att fördela celler och hantera den slutliga uppläsning i ett sådant miniatyriserat format. Cell dispensering av ADE har redanframgångsrikt utförts i 1536-well plattan format35 med hjälp av en lösning av neutral densitet som förhindrade cell sådd och säkerställde lika celltäthet i tid. Baserat på det cell nummer som används här och ytförhållandet på 384 (0,056 cm2) kontra 1536 brunnar (0,025 cm2), skulle 500-650 celler dispenseras i detta sista format. Ett sådant nummerintervall för cell dispens har visat sig vara mycket tillförlitligt om 14%-18% koncentrerad lösning av neutral densitet används. Under dessa inställningar, 100 nL av cellsuspensionen skulle fördelas över 1536 brunnar. Med en fungerande lösning av 5-8 μL i sådana brunnar, lägga till 5-8 μL av odlingssubstrat med hjälp av klassiska peristaltiska flytande hanterare skulle späda ut den AntiSeeding lösningen till mindre än 0,3%, vilket möjliggör korrekt cell sådd. Transfecting celler på så låg skala verkar därför tekniskt möjligt; effekten av restkoncentrationen av den neutrala densitetslösningen på transfektionseffektiviteten återstår dock att fastställa genom ytterligare arbete.

Använda käll skylt typer med högre arbets volymer för att fördela celler, såsom 384-brunn polypropylen käll plattor med en arbetsvolym på 45 μL, skulle tillåta 100 nL cell Solution dispenser från endast fyra källbrunnar för en total 1536-bra tallrik. Dessutom, nya nanodispensers kan avstå droppar 25 nL i stället för 2,5 nL som användes i detta protokoll. Denna droppe storlek, dividerar sedan 10 gånger dispenseringstid men antyder att använda flera av 25 nL volymer som, dock, hålla sig förenlig med de olika volymer som dispenserats i protokollet som presenteras här.

Baserat på dessa senaste verk och tekniska förbättringar, en ytterligare ADE cell dispensering steg för att uppnå en 1536-väl plattan transfektion kan enkelt läggas till det aktuella protokollet. Men att nå sådana miniatyriseringar är bara värt det om bioassay är samtidigt genomförbart i en sådan miniatyriserade format.

Sammanfattningsvis utvecklade vi en enkel, hög genomströmning och noggrann transfektion metod med flera fördelar på grund av miniatyrisering: (1) sänka kostnaderna för transfektion reagens; 2. minskning av avfallet från DNA-preparat. (3) se till att även nybörjare kan framgångsrikt utföra cell transfektion. Det kräver i själva verket bara några enkla manuella steg, nämligen att späda ut DNA till 100 ng/μL, dispensera det på en käll platta (en Plasmid/brunn) enligt den kalkylbladsgenererade mallen och använda den tabletsbaserade pipettguiden, och förbereda cellsuspensionen innan sådd. Den ADE-baserade nanodispenser är ansvarig för tidskrävande och felbenägna dos leverans och Multiplexing av plasmiderna, enligt den givna mallen av experimentet.

Även om detta protokoll skulle kunna garantera de flesta av de grundläggande biologiska intenterna i klassiska transfektionexperiment, skulle det också kunna öppna upp nya sätt för Array-baserade experiment. Till exempel, att uttrycka eller knacka ner varje mänsklig protein-kodning gen från Human ORFeome Collection36 eller CRISPR-Cas9 biblioteksbaserade metoder37, respektive, skulle kräva mindre än 24 h på en dedikerad automatiserad plattform (53 x 384- och plattor), snarare än 2-3 dagar av mänskligt arbete, förutsatt att användningen av en DNA-förladdad plattbank. På grund av sin höga effektivitet och höga prestanda, kan det protokoll som presenteras här till och med kunna uppnå nya nonpoolade metoder för CRISPR-Cas9-baserade studier med gRNA bibliotek/CRISPR-Cas9-uttrycker plasmider. Faktum, mild cellulära fenotyp förändringar, som för närvarande inte kan tillåta den erforderliga cell-sortering steg, skulle slutligen vara hanterbar, som en väl skulle representera en knackade genen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Författarna avslöjade ett kvitto på följande ekonomiska stöd för forskning, författarskap, och/eller publicering av denna artikel: INSERM, Lille University, Lille Pasteur Institute, Conseil Régional du Nord, och PRIM-HCV1 och 2 (Pôle de Recherche Interdisciplinaire sur le Médicament), Agence nationale de la Recherche (ANR-10-EQPX-04-01), Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) och Europeiska gemenskapen (ERC-STG INTRACELLTB n ° 260901). Författarna vill tacka Dr. S. Moureu, Dr. B. villemagne, Dr. R. Ferru-Clément, och Dr. H. Groult för deras kritiska granskning och korrigeringar av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384LDV Microplate Labcyte LP-0200
384-well Microplate μClear Black Greiner 781906
Ampicilin Sigma A9393-5G Selection antibiotic for bacteria transformed with ampicilin expressing vector
Android Tablet Samsung Galaxy Note 8 used to guide the user while the source plate manual dispense
Aniospray Surf 29 Anios 2421073 disinfectant to clean the MicroFlo head
Columbus software Perkin Elmer image analysis software
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate Thermo Fisher Scientific 10566032 cell culture medium
Echo Cherry Pick 1.5.3 software Labcyte Software enabling ADE-based dispenses by the Echo550 device from a *.csv file; nanodispenser software
Echo550 Labcyte ADE-based dispenser
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16000044 to add in cell culture medium
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128-4L to fix cell
HeLa cells ATCC HeLa (ATCC® CCL-2™)
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Thermo Fisher Scientific H3570 10 mg/mL Solution in Water
INCell Analyzer 6000 GE Healthcare 29043323 automated laser-based confocal imaging platform
LB medium Thermoischer Scientific
LB Broth Base (Lennox L Broth Base)®, powder		 12780052 culture medium for bacteria growth
Lysis Buffer (A2)  Macherey-Nagel 740912.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
MicroFlo 10µL cassette Biotek Instruments Inc 7170013 to use with the Microflo Dispenser
MicroFlo 1μL cassette Biotek Instruments Inc 7170012 to use with the Microflo Dispenser
MicroFlo Dispenser Biotek Instruments Inc 7171000 peristaltic pump-based liquid handler device
Microvolume spectrophotometer Denovix DS-11 Spectrophotometer Measure the DNA concentration of samples
mVenus plasmid mVenus cDNA was cloned by enzymatic restriction digestion and ligation in Age1/BsrG1 sites of the tdTomato-N1 plasmid Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: mVenus
Neutralization Buffer (A3)  Macherey-Nagel 740913.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
NucleoSpin Plasmid kit Macherey-Nagel 740588.50 used to prepare plasmid from bacterial culture
Optimal-Modified Eagle Medium (Opti-MEM) Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
optional Wash bufferWash Buffer (A4) Macherey-Nagel 740914.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
orbital shaker  incubated large capacity shaker 444-7084 Used to grow bacteria under gentle agitation and 37°C
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 10,000 U/mL
Phosphate-Buffered Saline Thermo Fisher Scientific 10010001
Plasmid mini-columns Macherey-Nagel 740499.250 Silica membrane mini-column to prepare plasmid from bacterial culture
Resuspension Buffer (A1)  Macherey-Nagel 740911.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
RNAse A Macherey-Nagel 740505 Enzyme from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
tdTomato-N1 plasmid Addgene Plasmid #54642 Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: tdTomato 
TransIT-X2 Dynamic Delivery System Mirus Bio MIR 6000
Wash Buffer (AW) Macherey-Nagel 740916.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
3D printer Creality CR10S used to print the plate adapter
Blender Software   https://www.blender.org/
Free software under GNU General Public License (GPL).		 version 2.79b used to design the plate adapter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Colin, B., Deprez, B., Couturier, C. High-Throughput DNA Plasmid Transfection Using Acoustic Droplet Ejection Technology. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. , 2472555218803064 (2018).
  2. Mirus Bio. Optimising Transfection Performance. , (2019).
  3. Thermo Fisher Scientific. Factors Influencing Transfection Efficiency | Thermo Fisher Scientific - FR. , https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/references/gibco-cell-culture-basics/transfection-basics/factors-influencing-transfection-efficiency.html (2019).
  4. Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).
  5. Figueroa, E., et al. A mechanistic investigation exploring the differential transfection efficiencies between the easy-to-transfect SK-BR3 and difficult-to-transfect CT26 cell lines. Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 36 (2017).
  6. Kirchenbuechler, I., Kirchenbuechler, D., Elbaum, M. Correlation between cationic lipid-based transfection and cell division. Experimental Cell Research. 345 (1), 1-5 (2016).
  7. Zhang, Z., Qiu, S., Zhang, X., Chen, W. Optimized DNA electroporation for primary human T cell engineering. BMC Biotechnology. 18 (1), 4 (2018).
  8. Cao, D., et al. Transfection activity and the mechanism of pDNA-complexes based on the hybrid of low-generation PAMAM and branched PEI-1.8k. Molecular bioSystems. 9 (12), 3175-3186 (2013).
  9. Bos, A. B., et al. Development of a semi-automated high throughput transient transfection system. Journal of Biotechnology. 180, 10-16 (2014).
  10. Colosimo, A., et al. Transfer and expression of foreign genes in mammalian cells. BioTechniques. 29 (2), 314-318 (2000).
  11. Villa-Diaz, L. G., Garcia-Perez, J. L., Krebsbach, P. H. Enhanced transfection efficiency of human embryonic stem cells by the incorporation of DNA liposomes in extracellular matrix. Stem Cells and Development. 19 (12), 1949-1957 (2010).
  12. Sabatini, D. M. Reverse transfection method. , WO2001020015A1 (2001).
  13. Raymond, C., et al. A simplified polyethylenimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods (San Diego, CA). 55 (1), 44-51 (2011).
  14. Junquera, E., Aicart, E. Recent progress in gene therapy to deliver nucleic acids with multivalent cationic vectors. Advances in Colloid and Interface Science. 233, 161-175 (2016).
  15. Woodruff, K., Maerkl, S. J. A High-Throughput Microfluidic Platform for Mammalian Cell Transfection and Culturing. Scientific Reports. 6, 23937 (2016).
  16. Vasileiou, T., Foresti, D., Bayram, A., Poulikakos, D., Ferrari, A. Toward Contactless Biology: Acoustophoretic DNA Transfection. Scientific Reports. 6, 20023 (2016).
  17. Hadimioglu, B., Stearns, R., Ellson, R. Moving Liquids with Sound: The Physics of Acoustic Droplet Ejection for Robust Laboratory Automation in Life Sciences. Journal of Laboratory Automation. 21 (1), 4-18 (2016).
  18. Grant, R. J., et al. Achieving accurate compound concentration in cell-based screening: validation of acoustic droplet ejection technology. Journal of Biomolecular Screening. 14 (5), 452-459 (2009).
  19. Sackmann, E. K., et al. Technologies That Enable Accurate and Precise Nano- to Milliliter-Scale Liquid Dispensing of Aqueous Reagents Using Acoustic Droplet Ejection. Journal of Laboratory Automation. 21 (1), 166-177 (2016).
  20. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chemical Society Reviews. 38 (10), 2887-2921 (2009).
  21. Zielinski, D., Gordon, A., Zaks, B. L., Erlich, Y. iPipet: sample handling using a tablet. Nature Methods. 11 (8), 784-785 (2014).
  22. Brunner, S., et al. Cell cycle dependence of gene transfer by lipoplex, polyplex and recombinant adenovirus. Gene Therapy. 7 (5), 401-407 (2000).
  23. Nii, T., et al. Single-Cell-State Culture of Human Pluripotent Stem Cells Increases Transfection Efficiency. BioResearch Open Access. 5 (1), 127-136 (2016).
  24. Noonan, D. J., Henry, K., Twaroski, M. L. A High-Throughput Mammalian Cell-Based Transient Transfection Assay. Signal Transduction Protocols. 284, 051-066 (2004).
  25. Transfection | TransIT Transfection Reagents | Mirus Bio. , https://www.mirusbio.com/products/transfection (2015).
  26. American Type Culture Collection. General protocol for transfection of stem cells, primary cells, and continuous cell lines with ATCC TransfeX Transfection Reagent. , https://www.atcc.org/~/media/Transfection%20protocols/TransfeX/TransfeX%20General%20Protocol%20on%20letterhead.ashx (2017).
  27. American Type Culture Collection. Transfection Reagents for Nucleic Acid Transfer into ATCC Cells. , http://www.lgcstandards-atcc.org/~/media/PDFs/Marketing%20Material/Cell%20Biology/Transfection%20reagents%20for%20nucleic%20acid.ashx (2017).
  28. de Los Milagros Bassani Molinas, M., Beer, C., Hesse, F., Wirth, M., Wagner, R. Optimizing the transient transfection process of HEK-293 suspension cells for protein production by nucleotide ratio monitoring. Cytotechnology. 66 (3), 493-514 (2014).
  29. Promega. FuGENE® 6 Transfection Reagent. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/101/fugene-6-transfection-reagent-protocol.pdf (2019).
  30. Olden, B. R., Cheng, Y., Yu, J. L., Pun, S. H. Cationic polymers for non-viral gene delivery to human T cells. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 282, 140-147 (2018).
  31. Park, E., Cho, H. B., Takimoto, K. Effective gene delivery into adipose-derived stem cells: transfection of cells in suspension with the use of a nuclear localization signal peptide-conjugated polyethylenimine. Cytotherapy. 17 (5), 536-542 (2015).
  32. Wood, R. W., Loomis, A. L. The physical and biological effects of high-frequency sound-waves of great intensity. The London, Edinburgh, and Dublin Philosophical Magazine and Journal of Science. 4 (22), 417-436 (1927).
  33. Eliminating Endotoxin at the Source - A Novel Competent Cell Line with Modified Lipopolysaccharide for Low-Endotoxin Plasmid Production. Mamat, U., et al. 28th Annual Symposium of the Protein Society, San Diego, CA, , (2014).
  34. Ivanova, N. V., Kuzmina, M. L. Protocols for dry DNA storage and shipment at room temperature. Molecular Ecology Resources. 13 (5), 890-898 (2013).
  35. Lesnick, J., Lejeune-Dodge, A., Ruppert, N., Jarman, C. High-Precision Cell Dispensing with the Labcyte Echo® Liquid Handler. , https://www.labcyte.com/content/applications/high-precision-cell-dispensing-with-the-labcyte-echo-liquid-handler (2017).
  36. Yang, X., et al. A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs. Nature Methods. 8 (8), 659-661 (2011).
  37. Peng, J., Zhou, Y., Zhu, S., Wei, W. High-throughput screens in mammalian cells using the CRISPR-Cas9 system. The FEBS journal. 282 (11), 2089-2096 (2015).

Tags

Retraktion akustisk dropp utmatning hög genomströmning transfektion DNA plasmid däggdjursceller vätskehantering fluorescerande protein
Hög genomströmning DNA plasmid Multiplexing och transfektion med akustisk Nanodispenseringsteknik
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Colin, B., Rocq, N., Deprez, B.,… More

Colin, B., Rocq, N., Deprez, B., Couturier, C. High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology. J. Vis. Exp. (150), e59570, doi:10.3791/59570 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter