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Biochemistry

MicroRNA के साथ देशी Lipoprotein कणों का संवर्धन और उनके निरपेक्ष के बाद दृढ़ संकल्प/

Published: May 9, 2019 doi: 10.3791/59573
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 2
1Center for Pathobiochemistry and Genetics, Institute of Medical Chemistry and Pathobiochemistry, Medical University Vienna, 2School of Medical Engineering and Applied Social Sciences, University of Applied Sciences Upper Austria

Summary

यहां, एक मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन आधारित प्रोटोकॉल के निर्धारण के लिए प्रस्तुत किया जाता है देशी माइक्रो-आरएनए सामग्री लिपोप्रोटीन कणों की (निरपेक्ष/रिश्तेदार) । इसके अलावा, माइक्रो-आरएनए स्तर को बढ़ाने के लिए एक विधि, साथ ही लिपोप्रोटीन कणों के सेलुलर तेज दर का निर्धारण करने के लिए एक विधि का प्रदर्शन किया है ।

Abstract

लिपोप्रोटीन के कण प्रबल रूप से लिपिड और कोलेस्ट्रोल के ट्रांसपोर्टर होते हैं । इसके अलावा, वे noncoding microRNA (मिरना) की किस्में की छोटी मात्रा में होते हैं. सामान्य तौर पर मीरना मेसेंजर-आरएनए (एमआरएनए) के साथ बातचीत के कारण प्रोटीन एक्सप्रेशन प्रोफाइल को बदल देते हैं । इस प्रकार, लेपोप्रोटीन कणों के सापेक्ष और निरपेक्ष मिरना सामग्री के ज्ञान सेलुलर कण तेज के जैविक प्रभाव का अनुमान लगाने के लिए आवश्यक है । यहां, एक मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qpcr) आधारित प्रोटोकॉल लिपोप्रोटीन कणों की निरपेक्ष mirna सामग्री का निर्धारण करने के लिए प्रस्तुत किया जाता है-उदाहरण के लिए देशी और mirna-समृद्ध लिपोप्रोटीन कणों के लिए दिखाया । रिश्तेदार मिरना सामग्री multiwell microfluidic सरणी कार्ड का उपयोग कर मात्रा निर्धारित है । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल वैज्ञानिकों सेलुलर मिरना का अनुमान है और इस प्रकार, लिपोप्रोटीन कण तेज दर की अनुमति देता है । सेलुलर miRNA स्तर की एक महत्वपूर्ण वृद्धि नमूदार है जब उच्च घनत्व लेपोप्रोटीन (HDL) कृत्रिम रूप से मिरना के साथ लोड कणों का उपयोग कर, जबकि देशी HDL कणों के साथ ऊष्मायन कोई महत्वपूर्ण उनके बजाय कम miRNA सामग्री की वजह से प्रभाव पैदावार । इसके विपरीत, कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (एलडीएल) कणों के सेलुलर तेज-न तो देशी मिरना के साथ और न ही कृत्रिम रूप से इसके साथ भरी हुई-सेलुलर मिरना स्तर में परिवर्तन नहीं किया ।

Introduction

लिपोप्रोटीन के कण उभयलिस्टीय लिपिड्स और कोलेस्ट्रॉल के एक मोनोलेयर से बने होते हैं जो कोलेस्ट्राल एस्टर और ट्राइग्लिसराइड वसा के एक कोर को enclosing करते हैं । पूरे कण झिल्ली एंबेडेड apolipoproteins है, जो कण की जैविक कार्यशीलता को परिभाषित द्वारा स्थिर है । लिपोप्रोटीन कणों को उनके संबंधित वर्धमान घनत्व के अनुसार प्रतिष्ठित किया जा सकता है और इस प्रकार घटते हुए आकार, नामत बहुत कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (वीएलडीएल), मध्यवर्ती-घनत्व लिपोप्रोटीन (आईडीएल), एलडीएल और एचडीएल कणों के रूप में । खून में पानी अघुलनशील घटकों के परिवहन के बावजूद, यह प्रदर्शन किया गया है कि एचडीएल कणों मिरना1,2के noncoding किस्में ले । माइक्रो-rnas कम (आमतौर पर दो दर्जन न्यूकोटाइड) आरएनए किस्में, जो intracellularly पूरक mrna किस्में नीचा और, जिससे कुछ प्रोटीन की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल बदलने के एक वर्ग हैं3,4,5, ६। इसके अलावा, miRNA प्रोफ़ाइल के परिवर्तन रोगों की एक किस्म में पाया गया है और, इस प्रकार, प्रोफ़ाइल निदान और रोग का निदान के लिए एक biomarker के रूप में लागू होता है. लिपोप्रोटीन कणों के माध्यम से कोशिकाओं के बीच mirnas के extracellular परिवहन अंतराकोशिक mrna स्तर मॉडुलन के लिए एक अतिरिक्त तंत्र के रूप में सेवा कर सकते हैं । मात्रात्मक रूप से जैविक प्रभाव का अनुमान लगाने के लिए, लिपोप्रोटीन कणों के निरपेक्ष और सापेक्ष mirna सामग्री के बारे में ज्ञान की जरूरत है ।

मात्रात्मक रीयल-टाइम पीसीआर इस जानकारी को प्राप्त करने के लिए एक उपयुक्त और अपेक्षाकृत त्वरित विधि है । इसलिए, सापेक्ष परिमाणीकरण (rq) मूल्य की गणना की जा सकती है, और विभिन्न नमूनों और लिपोप्रोटीन भागों के बीच सापेक्ष अंतर बहुमूल्य हैं । Multiwell microfluidic सरणी कार्ड एक तेज और आसान करने के लिए उपयोग करने के लिए संबंधित उपस्थिति निर्धारित विधि (RQ मूल्य के लिए equates) एक नमूना में miRNAs के हैं । Multiwell microfluidic सरणी कार्ड एक microfluidic डिवाइस में एम्बेडेड व्यक्तिगत qPCR प्रतिक्रियाओं के लिए ९६ या ३८४ व्यक्तिगत प्रतिक्रिया कक्षों से मिलकर. प्रत्येक कक्ष में आवश्यक हाइड्रोलिसिस जांच और विशिष्ट qpcr प्राइमर्स एक व्यक्ति मिरना के लिए शामिल हैं । लाभ मानकीकरण, एक सरल कार्यप्रवाह, और pipetting चरणों की एक कम संख्या के कारण एक कम हैंडलिंग समय कर रहे हैं. इसके अलावा, आवश्यक नमूना मात्रा कम है । सापेक्ष मात्रा के विपरीत, निरपेक्ष miRNA सामग्री मिरना strands की ज्ञात निरपेक्ष संख्या के मानक curves के साथ qPCR नमूना परिणामों की तुलना की आवश्यकता है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि, उनके अपेक्षाकृत कम mirna सामग्री के कारण, मानक और, इसके अलावा, यहां तक कि एकल अणु संवेदनशील इमेजिंग तकनीक व्यवहार्य नहीं हैं-मिरना के साथ लिपोप्रोटीन कणों के कृत्रिम संवर्धन सेलुलर अध्ययन करने के लिए अपरिहार्य है लाइपोप्रोटीन पार्टिकल इंटरेक्शन और मिन्ना ट्रांसफर । इस के बारे में, बाद में relipidation7 के साथ पीछा एचडीएल कण के delipidation की अनुमति देता है और इस प्रकार, मिरना strands के साथ संवर्धन । इसी प्रकार, एमआईएनए के साथ एलडीएल कणों का संवर्धन एपीओबी-१०० प्रोटीन के हाइड्रोफोटोसिटी के कारण व्यवहार्य नहीं है, जो एलडीएल कण का मुख्य संघटक है । हालांकि, ध्रुवीय विलायक डाइमेथिल सल्फॉनाइड (dmso), जो लिपिड झिल्ली घुसना करने में सक्षम है के अलावा, ldl कणों कृत्रिम रूप से अच्छी तरह से mirna किस्में के साथ भरी हुई हो सकता है ।

उच्च-गति परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एचएस-AFM) सुक्ष्ममापी स्थानिक और subद्वितीया लौकिक संकल्प8की पेशकश जैविक नमूनों के लक्षण वर्णन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है । इसलिए, यह संशोधित लिपोप्रोटीन कणों की गुणवत्ता नियंत्रण के लिए एक अच्छी तरह से अनुकूल तकनीक है, क्योंकि देशी/पुनर्गठित/लेबल वाले लिपोप्रोटीन कणों को निकट-शरीरक्रियात्मक वातावरण के अंतर्गत प्रत्यारोपित किया जा सकता है ।

यहां, एक qpcr आधारित प्रोटोकॉल कदम दर कदम प्रस्तुत है लिपोप्रोटीन कणों और सेल नमूनों, जो सेलुलर लिपोप्रोटीन कण तेज की कीमत का एक अनुमान की अनुमति देता है की निरपेक्ष/ इसके अलावा, मिरना के साथ लिपोप्रोटीन कणों के संवर्धन के लिए एक विधि का प्रदर्शन किया है । इस विधि को लिपोप्रोटीन सामग्री के सामान्य हेरफेर के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और इसलिए यह औषध वितरण के लक्ष्य के रूप में लिपोप्रोटीन कणों की प्रयोज्यता को प्रदशत करता है ।

Protocol

रक्त दान को एथिक्स कमेटी, मेडिकल यूनिवर्सिटी ऑफ विएना (EK-Nr. 511/2007, EK-Nr. 1414/2016) ने मंजूरी दे दी है । नामकरण, मात्रात्मक रीयल-टाइम पीसीआर प्रयोग (एमआईक्यूई)9 दिशा-निर्देशों के प्रकाशन के लिए न्यूनतम सूचना के अनुसार है ।

1. मानव रक्त से lipoprotein कण अलगाव

  1. एक ultracentrifuge से 4 डिग्री सेल्सियस precool । रात भर उपवास के बाद स्वस्थ स्वयंसेवकों से रक्त खींचें ।
    नोट: आम तौर पर आवश्यक तीन दाताओं, ८० मिलीलीटर प्रत्येक दान कर रहे हैं, और रक्त संग्रह ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) के रूप में anticoagulant युक्त ट्यूबों ।
  2. 4 ° c और हार्वेस्ट प्लाज्मा (ऊपरी चरण) में 20 मिनट के लिए २,००० x g पर अपकेंद्रित्र; कतरनी बलों से बचें । कुल खंड V का निर्धारण और समायोजित, यदि आवश्यक हो, तो एक से अधिक के लिए अपकेंद्रण ट्यूब मात्रा फॉस्फेट-buffered खारा (pbs) का उपयोग कर । 1 उस् 3x के द्रव्यमान को मापें तथा औसत घनत्व ρपरिकलित कीजिए ।
  3. निम्न समीकरण के साथ घनत्व समायोजन के लिए पोटेशियम ब्रोमाइड (KBr) की आवश्यक मात्रा की गणना करें (ग्राम/milliliter में वांछित घनत्व के लिए, का उपयोग एक = १.०१९, और kbr के विशिष्ट खंड के Equation 1 लिए, का उपयोग करें = ०.३६४ मिलीलीटर/ प्लाज्मा के लिए KBr जोड़ें और धीरे से कतरनी बलों से बचने के लिए जब तक KBr पूरी तरह से भंग है हलचल ।
    Equation 2
  4. चरण १.२ में वर्णित के रूप में घनत्व को मापने और फिर से समायोजित करें, यदि आवश्यक हो, और अधिक KBr. Fill और सील अपकेंद्रित्र ट्यूबों को जोड़कर प्लाज्मा के साथ ultracentrifugation के लिए उपयुक्त । किसी भी हवा बुलबुले से बचें; अन्यथा ट्यूब गिर सकती है । रोटर में ट्यूबों निर्माता के निर्देशों के अनुसार और २१४,००० x g पर केंद्राभ के लिए 20 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें ।
  5. निर्माता के निर्देशों के अनुसार ट्यूबों खोलें और उच्च VLDL और IDL युक्त चरण त्यागने । कुल खंड V का निर्धारण और समायोजित, यदि आवश्यक हो, तो एक से अधिक के लिए अपकेंद्रण नलिका मात्रा pbs का उपयोग कर ।
  6. नीचे के अंश का घनत्व ρ ज्ञात कीजिए । घनत्व समायोजन के लिए KBr की आवश्यक राशि की गणना ( एक = १.०६३ का उपयोग करें) । हिलाओ धीरे कतरनी बलों से बचने के लिए जब तक KBr भंग है । दोहराएं चरण १.४ ।
  7. निकालें और उच्च चरण LDL कणों युक्त इकट्ठा । 4 ° ब् पर एक अक्रिय गैस वायुमंडल के अंतर्गत एलडीएल कण विलयन को भंडारित करिए । कुल खंड V का निर्धारण और समायोजित, यदि आवश्यक हो, तो एक से अधिक के लिए अपकेंद्रण नलिका मात्रा pbs का उपयोग कर । चरण १.२ में वर्णित के अनुसार नीचे अंश का घनत्व ρ का निर्धारण करें ।
  8. घनत्व समायोजन के लिए KBr की आवश्यक राशि की गणना ( एक = १.२२० का उपयोग करें) और इसे जोड़ें । हिलाओ धीरे कतरनी बलों से बचने के लिए जब तक KBr भंग है । दोहराएं चरण १.४ ।
  9. निकालें और उच्च एचडीएल कणों युक्त चरण इकट्ठा । अपने कुल खंड V का निर्धारण और समायोजित, यदि आवश्यक हो, तो एक से अधिक के लिए अपकेंद्रण नलिका मात्रा pbs का उपयोग कर । Ρका घनत्व ज्ञात कीजिए । ऊपरी चरण के एक दूसरे अपकेंद्रण चरण में २१४,००० x g पर 20 ज के लिए 4 डिग्री सेल्सियस एल्ब्युमिन को दूर करने के लिए सिफारिश की है । यदि आवश्यक हो, तो चरण १.८ दोहराएं । निकालें और उच्च एचडीएल कणों युक्त चरण इकट्ठा ।
  10. (०.९% NaCl, ०.१% EDTA [pH ७.४]) से 4 ° c डायलिसिस बफर के कम से 20 एल तैयार और precool । Prewet डायलिसिस ट्यूबों (आणविक वजन में कटौती: 12-14 केडीए) और निर्माता के निर्देशों के अनुसार एलडीएल और एचडीएल कण समाधान जोड़ें । 4 ° c पर डायलिसिस बफर के 5 एल के खिलाफ dialyze और 1, 2 के बाद बफर बदलने, और 4 ज.
  11. 24 घंटे के बाद, डायलिसिस ट्यूबों से लिपोप्रोटीन कण समाधान ठीक है और प्रोटीन ब्रैडफोर्ड परख11 या किसी अंय उपयुक्त एक का उपयोग एकाग्रता निर्धारित करते हैं । 4 ° ब् पर अक्रिय गैस वायुमंडल के अंतर्गत एचडीएल और एल डी एल कण विलयन को भंडारित करें ।

2. सिंथेटिक मिरना aliquots

नोट: आरएनए ओलिनोन्यूक्लियोटाइड से निपटने, RNase मुक्त काम करते हैं । केवल ताजा, डिस्पोजेबल प्लास्टिक उपभोग्य सामग्रियों के साथ काम और हमेशा दस्ताने पहनते हैं, जो अक्सर बदल जाना चाहिए । केवल nuclease मुक्त समाधान का उपयोग करें । हमेशा बर्फ पर काम करते हैं ।

  1. अधिकतम बल पर निर्माता से प्राप्त शीशी नीचे स्पिन करने के लिए lyophilized सिंथेटिक मिरना की एक गोली के रूप में । 10 मिमी Tris (hydroxymethyl) aminomethane (TRIS) बफर, पीएच ७.५ की एक उचित मात्रा 10 μM (स्टॉक एकाग्रता) मिरना की एक अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ें ।
  2. धीरे पिपेट ऊपर और नीचे के लिए समय की एक जोड़ी फिर से निलंबन के लिए । बाँझ ट्यूबों में १०० μL प्रत्येक के aliquots तैयार करते हैं । उंहें-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर अगर तुरंत इस्तेमाल नहीं किया । बारबार थकी हुई और ठंड से बचें ।

3. एचडीएल कणों का पुनर्गठन

  1. Delipidation
    1. बफर एक तैयार (१५० मिमी NaCl, ०.०१% EDTA, 10 मिमी Tris ८.०/ -10 डिग्री सेल्सियस के लिए अपकेंद्रित्र precool । इथेनॉल के मिश्रण के १०० मिलीलीटर precool: diethyl ईथर (3:2)-20 डिग्री सेल्सियस पर ।
      चेतावनी: डाइएथिल ईथर हैंडलिंग के रूप में यह अत्यंत ज्वलनशील और त्वचा के लिए हानिकारक है, जबकि एक धूआं हुड में उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनते हैं और काम करते हैं ।
    2. एक मात्रा मिश्रण के साथ 5 एचडीएल कणों की मिलीग्राम के ५० मिलीलीटर के साथ preशीतलित इथेनॉल: diethyl ईथर (3:2) मिश्रण और के लिए इनक्यूबेट 2 एच में-20 ° c. 10 मिनट में 10 डिग्री सेल्सियस के लिए २,५०० x g पर अपकेंद्रित्र ।
    3. छोड़ supernatant, ५० में पेलेट को निलंबित preशीतलित इथेनॉल के: diethyl ईथर मिश्रण vortexing द्वारा, और 2 ज के लिए एक दूसरी बार सेते में-20 डिग्री सेल्सियस । 10 मिनट 10 डिग्री सेल्सियस के लिए २,५०० x g पर फिर से अपकेंद्रित्र ।
      नोट: यदि वांछित, lyophilize HDL कणों के लिपिड अंश में miRNA सामग्री के एक विश्लेषण के लिए supernatant ।
    4. N2 गैस प्रवाह के तहत गोली सूखी और यह बफर के २५० μl में Resuspend एक (कदम 3.1.1 देखें) । प्रोटीन की एकाग्रता का निर्धारण ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख या किसी अंय उपयुक्त एक और प्रोटीन के 1 मिलीग्राम की एक अंतिम एकाग्रता को तनु/
      नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है । अक्रिय गैस वातावरण के तहत 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर समाधान स्टोर ।
  2. पुनर्गठन
    1. क्लोरोफॉर्म के मिश्रण का उपयोग करते हुए एक फॉस्फेट (पीसी) स्टॉक समाधान तैयार करें: मेथनॉल (2:1) पीसी/एमएल के ५.६ मिलीग्राम की एकाग्रता पर । इसी प्रकार कोलेस्ट्राल ओलिएट (5 मिग्रा की सह/एमएल) और कोलेस्ट्रोल (सी/एमएल की 5 मिग्रा) का स्टाक समाधान तैयार करें । -20 डिग्री सेल्सियस पर सभी समाधान स्टोर ।
    2. एक स्वच्छ ग्लास ट्यूब में, पीसी के ५०० μL, सह के १०० μL, और सी के १३.५ μL मिश्रण ये खंड १०० पीसी के अनुमानित मोलर अनुपात के अनुरूप हैं: 22 CO: 4.8 C. N2 गैस प्रवाह के तहत मिश्रण सूखी जबकि एक सजातीय सतह परत उपज ट्यूब घूर्णन ।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है । -20 ° c पर अक्रिय गैस वायुमंडल के अंतर्गत काँच की शीशी (यदि वांछित हो तो संचय करना संभव है) को भंडारित करें ।
    3. बफर में एक ताजा 30 मिमी spermine समाधान तैयार करें. मिश्रण एक aliquot (१०० μL, 10 μM) सिंथेटिक मिरना (चरण २.२ देखें) के साथ १०० μL spermine समाधान और 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट में तीस
      नोट: नकारात्मक नियंत्रण प्रयोगों के लिए, miRNA और/या spermine समाधान बफ़र A. की एक ही वॉल्यूम के साथ प्रतिस्थापित करें ।
    4. भंग चरण 3.2.3 से मिश्रण में एक पीसी/CO/C मास्टर मिक्स aliquot.
    5. बफर ए में 30 मिलीग्राम/एमएल सोडियम डिऑक्सीचेलेट का घोल तैयार करें और स्टेप 3.2.4 से समाधान में ५० μL जोड़ें । 2 ज के लिए 4 ° c पर हलचल ।
    6. चरण 3.1.4 से delipidated HDL समाधान के २५० μL जोड़ें । यह मात्रा १०० पीसी के एक अनुमानित मोलर अनुपात से मेल खाती है: 22 सीओ: 4.8 C:1 delipidated HDL प्रोटीन । 4 ° c रात में हलचल ।
  3. डायलिसिस
    1. 4 ° c पर PBS के कम से 15 एल precool । डबल आसुत जल (ddh2O) के ८०० मिलीलीटर के लिए अधिशोषक मोती के ५० ग्राम जोड़ें और 1 मिनट के लिए हलचल । 15 मिनट प्रतीक्षा करें, supernatant छानना, और pbs के साथ प्रक्रिया को दोहराने ।
    2. Prewet डायलिसिस कैसेट (आणविक वजन में कटौती: 20 केडीए) या उचित डायलिसिस ट्यूबों और कदम 3.2.6 से समाधान जोड़ने के लिए, एक सिरिंज का उपयोग कर निर्माता के निर्देशों के अनुसार.
    3. 4ण्23 ° ब् पर एक-एक कर के-----------------------। 1 h और 2 h के बाद बफ़र और मोती परिवर्तित करें ।
    4. 24 घंटे के बाद, पुनर्गठित HDL (rHDL) कण समाधान ठीक हो और प्रोटीन ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग एकाग्रता निर्धारित करते हैं । 4 डिग्री सेल्सियस पर अक्रिय गैस वातावरण के तहत rHDL कण समाधान स्टोर ।

4. एलडीएल कणों की लेबलिंग

  1. 10x LDL बफर (१.५ एम NaCl, 3 मिमी EDTA, 1 मिमी एथिलीन ग्लाइकोल-बीआईएस (β-aminoethyl ईथर)-N, N, N ', '-tetraacetic एसिड [EGTA, पीएच ७.४]) और इसे कमरे के तापमान पर स्टोर तैयार करें ।
  2. RNase मुक्त पानी में एक ताजा 30 मिमी spermine समाधान तैयार करें. एक aliquot (१०० μL, 10 μM) संश्लेषित मिररना (२.२ चरण देखें) के साथ १०० μL spermine समाधान और 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट के साथ मिलाएं ।
    नोट: नकारात्मक नियंत्रण प्रयोगों के लिए, miRNA और/या spermine समाधान 1x LDL बफ़र का एक ही वॉल्यूम के साथ प्रतिस्थापित करें ।
  3. मिरना/spermine समाधान करने के लिए चरण ४.२ से DMSO के १०० μL जोड़ें और यह आगे कमजोर 1x एलडीएल बफर के १.२ मिलीलीटर के साथ ।
  4. PBS के साथ लगभग 4 मिलीग्राम/एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए एलडीएल कण समाधान पतला और 10x एलडीएल बफर के ५० μL के साथ मिश्रण ४५० μL । यह बर्फ पर 10 मिनट के लिए सेते ।
  5. पिछले चरण से एलडीएल कण समाधान और मिन्ना/(चरण ४.३ से) एमएसओ समाधान का मिश्रण है और इसे 2 घंटे के लिए ४० डिग्री सेल्सियस पर क्यूबेट ।
  6. ३.३ अनुभाग में वर्णित के रूप में डायलिसिस समान प्रदर्शन और तदनुसार लेबल LDL कण समाधान की दुकान ।

5. पुनर्गठित/लेबल लिपोप्रोटीन कणों की गुणवत्ता नियंत्रण

नोट: गुणवत्ता नियंत्रण के लिए, व्यास और लिपोप्रोटीन कणों के सामांय आकार का उपयोग कर निर्धारित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, afm या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM) । यहां, HS-afm देशी/पुनर्गठित/लेबल लिपोप्रोटीन कणों के आकार के वितरण को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है ।

  1. PBS (1:100 – 1:1000) में HDL/LDL कण समाधान को पतला करें और इसे 5 मिनट के लिए हौसले से cleaved अभका पर सेते । अभ्रक के लिए12cleaving के लिए, सब्सट्रेट के खिलाफ चिपकने वाला टेप दबाएँ और टेप खींच से ऊपरी अभ्रक परतों को दूर.
    नोट: विशेष AFM साधन पर निर्भर करता है, अवलोकन क्षेत्र, और कणों की प्रारंभिक एकाग्रता, तनुता कारक के लिए व्यक्तिगत कणों का निरीक्षण करने के लिए समायोजित किया जाना है.
  2. ऊष्मायन के बाद, PBS के साथ नमूना कुल्ला और एच एस-AFM इमेजिंग PBS में प्रदर्शन और kखिचड़ी भाषा के वसंत स्थिरांकों होने cantilevers के साथ दोहन मोड में ≪ ०.२ N/ यह स्कैन आकार < 1 μm2 का उपयोग करने के लिए और इमेजिंग बलों के रूप में संभव के रूप में कम रखने के लिए सिफारिश की है ।
  3. उपयुक्त सॉफ्टवेयर के साथ अभया सतह के संबंध में imaged कणों की ऊंचाई निर्धारित करते हैं ।
    1. Gwyddion में डेटा लोड (फ्रीवेयर), अनाज विश्लेषण (सीमा से चिह्नित अनाज) के माध्यम से कणों का पता लगाने और सब्सट्रेट पृष्ठभूमि के ऊपर दहलीज सेट. छवि समतल (बहुपद पृष्ठभूमि निकालें) का चयन बाहर नकाबपोश क्षेत्र विकल्प को चुनने ।
    2. खोजे गए कणों (विभिन्न ग्रेन विशेषताओं का वितरण) के ऊंचाई मानों को निर्यात करें और सभी रिकॉर्डेड छवियों के लिए इन चरणों को दोहराएं । या तो histograms बनाने या प्राप्त कण हाइट्स की संभावना घनत्व कार्यों की गणना द्वारा सांख्यिकीय विश्लेषण करते हैं ।
  4. दोहराएं कदम 5.1-5.3 के साथ देशी के रूप में अच्छी तरह के रूप में पुनर्गठित/ यदि मलबा और/या समूह देख रहे हैं, तो नमूना छोड़ें ।

6. सेल संस्कृति

  1. एक स्थापित प्रोटोकॉल के अनुसार आसंन कोशिकाओं को विकसित (उदाहरण के लिए, ldlA7-SRBI13) संगम तक पहुंचने तक ।
    नोट: कई स्वतंत्र प्रयोगों की संख्या के आधार पर कक्षों (अनुशंसित प्रयोगात्मक सेटिंग के अनुसार दो कक्षों हैं) और नकारात्मक नियंत्रण प्रयोगों (लिपोप्रोटीन कणों के अलावा के बिना दो कक्षों की सिफारिश कर रहे हैं) की जरूरत है । इसके अतिरिक्त, कक्ष संख्या के निर्धारण के लिए दो कक्षों की आवश्यकता है ।
  2. धीरे सेल मलबे को हटाने और सीरम मुक्त विकास माध्यम की एक उचित मात्रा के साथ सेल परत को कवर करने के लिए prewarmed हैंक संतुलित नमक समाधान (HBSS) के साथ 3x कोशिकाओं को धोने । ५० μg/mL लिपोप्रोटीन कणों की एक अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए लिपोप्रोटीन कण समाधान की एक उचित मात्रा में जोड़ें । 16 ज के लिए ३७ ° c और 5% सह2 पर सेक्यूबेट
    नोट: प्रयोगात्मक डिजाइन और सेल लाइन पर निर्भर करता है, ऊष्मायन समय के लिए एक पर्याप्त (यानी, औसत दर्जे का) सेलुलर मिरना स्तर में वृद्धि को प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जाना है ।
  3. धीरे से सेल 3x prewarmed (३७ डिग्री सेल्सियस) HBSS के साथ धोने के लिए कोशिका मलबे को हटाने/
  4. एक उपयुक्त विधि का उपयोग कर सेल घनत्व निर्धारित (उदा., hemocytometer, स्वचालित सेल काउंटर) कम से कम दो स्वतंत्र कक्षों में नमूना मात्रा में कक्षों की संख्या से चरण ६.३ की गणना करने के लिए । यह संख्या सामान्यीकरण के लिए उपयोग किया जाता है ।

7. सेल और लिपोप्रोटीन कण नमूने से मिररना निष्कर्षण

नोट: कोशिकाओं से मिरना का निष्कर्षण निंनलिखित संशोधनों के साथ miRNA निष्कर्षण किट का उपयोग कर किया जाता है ।

  1. सेल नमूने
    1. 4 डिग्री सेल्सियस के लिए अपकेंद्रित्र precool । दो कक्षों से युक्त कक्ष के लिए प्रत्येक lysis अभिकर्मक के ३५० μL जोड़ें । एक नकारात्मक नियंत्रण प्रयोग के रूप में, कोशिकाओं के बिना एक कक्ष का उपयोग करें ।
      चेतावनी: उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण पहनें और एक धूआं हुड में काम करते हुए lysis अभिकर्मक हैंडलिंग के रूप में यह phenol और thiocyanate शामिल हैं ।
    2. सेल टुकड़ी के लिए 3 – 5 मिनट (सेल लाइन के आधार पर) के लिए प्रतीक्षा करें । यदि आवश्यक हो, ब्राइटफील्ड microscopy के साथ सेल टुकड़ी के लिए जांच करें । एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में दो कक्षों की सामग्री पूल ।
    3. एक 20 जी सुई और एक 5 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करना, homogenize/5 मिनट के लिए आकांक्षा और सेर्बेट द्वारा नमूना 5x-10x को बाधित । क्लोरोफॉर्म (CHCl3) के १४० Μl जोड़ें, 15 एस के लिए तेजी से हिला, और 3 मिनट के लिए सेते ।
    4. 4 ° c पर 15 मिनट के लिए १२,००० x g पर अपकेंद्रित्र । इसके बाद अपकेंद्रित्र को ठंडा होने से रोकें ।
    5. एक नए १.५ मिलीलीटर ट्यूब के लिए ऊपरी जलीय चरण स्थानांतरण; फेज मिक्सिंग/संदूषण से बचें क्योंकि इंटरफेज में डीएनए होता है और लोअर फेज में प्रोटीन होता है । 1.5 x १००% इथेनॉल की मात्रा जोड़ें और अच्छी तरह से pipetting द्वारा मिश्रण ।
    6. एक 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में एक स्पिन कॉलम प्लेस और कदम 7.1.5 से मिश्रण के ७०० μL जोड़ें । कमरे के तापमान पर 15 एस के लिए ८,००० एक्स जी पर अपकेंद्रित्र । प्रवाह के माध्यम से त्यागें और अवशिष्ट नमूना मात्रा के साथ इस चरण को दोहराएं ।
    7. के माध्यम से प्रवाह त्यागने और स्पिन स्तंभ के लिए पहले धोने बफर के ७०० μL जोड़ें । यह ८,००० x g पर 15 एस के लिए कमरे के तापमान पर अपकेंद्रित्र ।
    8. के माध्यम से प्रवाह त्यागने और स्पिन स्तंभ के लिए दूसरे धोने बफर के ५०० μL जोड़ें । यह ८,००० x g पर 15 एस के लिए कमरे के तापमान पर अपकेंद्रित्र । इस पूरे कदम को अपकेंद्रण समय के 2 मिनट के साथ एक दूसरी बार दोहराएं ।
    9. एक नया 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में स्पिन कॉलम प्लेस और यह पूरी गति से अपकेंद्रित्र 1 मिनट के लिए झिल्ली सूखी ।
    10. स्पिन स्तंभ को १.५ मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में रखें । क्षालन के लिए झिल्ली के केंद्र में rnase-नि: शुल्क पानी की 30 μl जोड़ें और यह 1 मिनट के लिए ८,००० x g पर अपकेंद्रित्र । इस पूरे कदम के रूप में पहला प्रवाह के साथ एक दूसरी बार दोहराएं के रूप में क्षालन समाधान । रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन कदम निष्कर्षण के तुरंत बाद किया जाता है; अंयथा,-20 डिग्री सेल्सियस पर निकाले miRNA नमूनों की दुकान ।
  2. वसाप्रोटीन कण
    1. न्यूनतम प्रोटीन एकाग्रता के साथ नमूना की मात्रा सेट करने के लिए १०० μL (= अधिकतम नमूना मात्रा). इस सामान्यीकरण के अनुसार अन्य नमूनों की नमूना मात्रा की गणना, उनकी एकाग्रता के व्युत्क्रम. नकारात्मक नियंत्रण प्रयोगों के लिए, RNase मुक्त पानी की १०० μL का उपयोग करें ।
      नोट: सामांयीकरण की आवश्यकता नहीं है लेकिन qPCR कदम और विश्लेषण के दौरान परिणामों की सीधी तुलना सरल ।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस के लिए अपकेंद्रित्र precool । चरण 7.2.1 के नमूना वॉल्यूम के लिए lysis अभिकर्मक के ७०० μL जोड़ें ।
    3. कदम के अनुसार miRNA निष्कर्षण प्रदर्शन 7.1.3 – 7.1.10.

8. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन

नोट: मिरना के रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन निंनलिखित संशोधनों के साथ एक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किट का उपयोग किया जाता है ।

  1. किट अभिकर्मकों और रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्राइमर्स बर्फ पर पिघलना । बर्फ पर एक रिएक्शन ट्यूब में निम्नलिखित मास्टर मिक्स तैयार करें: ४५.७ μl की rnase-मुक्त एच 2 ओ १६.५, 10x रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन बफर के 11 μl, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन एंजाइम के २.१ μl, और dntp मिक्स के १.७ μl । धीरे से मिलाएं, भंवर नहीं है ।
    नोट: स्केल नमूना मात्रा पर निर्भर करता है; यहां, यह 10 प्रतिक्रियाओं के लिए गणना की है ।
  2. लेबल ०.२ मिलीलीटर ट्यूब तदनुसार और मिश्रण चरण ८.१ से मास्टर मिक्स के 7 μL कदम 7.1.10 और रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्राइमर के 3 μL से निकाले गए नमूने के 5 μL के साथ । मिश्रण धीरे, अपकेंद्रित्र शीघ्र ही, और बर्फ पर मिश्रण की दुकान ।
  3. प्रत्येक कक्ष रेखा के लिए समान कक्ष संख्या का उपयोग करने के लिए, कक्ष रेखा का नमूना वॉल्यूम किसी उच्च कुल कक्ष संख्या के साथ घटाएं; इस अवशिष्ट मात्रा के रूप में उपयोग करने के लिए कुल नमूना मात्रा के 5 μL के RNase मुक्त पानी ।
    नोट: लिपोप्रोटीन कण नमूने पहले से ही कदम 7.2.1 में सामांयीकृत कर रहे हैं । मानक वक्र तैयारी के लिए, RNase-मुक्त पानी में मिरना क्रमिक रूप से एक aliquot पतला और नमूना मात्रा प्रति किस्में की संख्या की गणना । आवश्यक परिणामी नमूना परिमाणीकरण चक्र (cq) मान की श्रेणी के भीतर न्यूनतम पाँच डेटा बिंदु हैं । आमतौर पर, 102 से 106 से लेकर कुल कमजोर पड़ने कारक उपयुक्त हैं ।
  4. Thermocycler मशीन में जगह ट्यूबों और निंनलिखित कार्यक्रम शुरू: 30 मिनट में 16 डिग्री सेल्सियस (annealing कदम), 30 मिनट पर ४२ डिग्री सेल्सियस (रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन), 5 मिनट में ८५ डिग्री सेल्सियस (पिघलने कदम), और 4 डिग्री सेल्सियस (भंडारण) पर ठहराव । रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के तुरंत बाद qPCR कदम प्रदर्शन; अंयथा, पूरक डीएनए (cDNA)-20 डिग्री सेल्सियस पर miRNA नमूनों से संश्लेषित स्टोर ।

9. qPCR

  1. CDNA के एक qPCR प्रदर्शन (मिरना से प्रतिलिखित रिवर्स) एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध परख का उपयोग कर ( सामग्री की तालिकादेखें) निंनलिखित संशोधनों के साथ ।
  2. सभी अभिकर्मकों को पिघलना (supermix, RNase-मुक्त एच2ओ), cdna नमूने (कदम से ८.४), और बर्फ पर प्राइमर्स. बर्फ पर एक रिएक्शन ट्यूब में निम्नलिखित मास्टर मिक्स तैयार: supermix की ७५ μL, ४७.५-एल RNase मुक्त एच2ओ, प्राइमर के ७.५६ μl. धीरे से मिलाएं, भंवर नहीं है ।
    नोट: स्केल नमूना मात्रा पर निर्भर करता है; यहां, यह 10 प्रतिक्रियाओं के लिए गणना की है ।
  3. लेबल ०.२ मिलीलीटर ट्यूब तदनुसार और मास्टर मिश्रण के 13 μL को cDNA नमूने के 2 μL जोड़ें और धीरे मिश्रण । सामान्य में, प्रत्येक नमूना 2x उपाय.
    नोट: न्यूनतम दो नकारात्मक नियंत्रण नमूनों की आवश्यकता है इसके अतिरिक्त-एक नमूना के रूप में RNase-मुक्त पानी का उपयोग करें. अंशांकन वक्र नमूने के रूप में एक ही रन में निर्धारित नहीं है, तो अंशांकन वक्र माप से एक नमूना भी आवश्यक है । यह एक ही प्रतिक्रिया दक्षता के लिए प्रत्येक व्यक्ति को चलाने के कैलिनेट करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
  4. पीसीआर मशीन में ट्यूब प्लेस और निंनलिखित कार्यक्रम शुरू: ५० डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट, 10 मिनट में ९५ डिग्री सेल्सियस, 15 एस पर ९५ डिग्री सेल्सियस, और ६० एस ६० डिग्री सेल्सियस पर । प्रोग्राम के अंतिम दो चरणों को 50x तक दोहराएं ।
  5. सीक्यू मूल्यों के पीसीआर मशीन के सॉफ्टवेयर पैकेज के साथ एक विश्लेषण के लिए, Dynamictube सामांयीकरण सक्रिय (अलग पृष्ठभूमि स्तर के मुआवजे के लिए प्रत्येक नमूना ट्रेस के दूसरे व्युत्पंन का उपयोग कर) और शोर ढाल सुधार (शोर स्तर को सामान्यीकरण).
    नोट: cq मान ऋणात्मक नियंत्रण का उच्चतम नमूना cq मान से अधिक कई चक्र होना चाहिए ।
    1. एक अंशांकन वक्र विश्लेषण के लिए, प्रत्येक मिररना के मानक curves से प्रत्येक mirna के लिए सीक्यू की गणना के लिए सीमा निर्धारित व्यक्तिगत रूप से, सॉफ्टवेयर पैकेज के स्वत: खोज दहलीज समारोह का उपयोग कर, और यह लगातार रखना प्रत्येक विशिष्ट मिरना के लिए ।
    2. नमूना विश्लेषण के लिए, यदि आवश्यक हो, तो अंशांकन वक्र नमूने से डेटा बिंदु के साथ नमूना चलाएँ के विभिन्न प्रतिक्रिया क्षमता के लिए क्षतिपूर्ति । सॉफ्टवेयर संबंधित अंशांकन वक्र माप की दहलीज स्तर से नमूनों की सीक्यू मूल्यों की गणना करता है.

10. मीरना सामग्री की गणना

  1. अंशांकन वक्र
    1. की गणना, aliquot प्रति mirna किस्में की प्रारंभिक संख्या से (१०० μl 10 μm मिरना, डेटा पत्रक से आणविक वजन) और बाद में धारावाहिक तनुता कदम, नमूना मात्रा में mirna किस्में की संख्या (5 μl नमूना मात्रा से कदम ८.३) ।
      नोट: 1 की रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन दक्षता संभालने, इस संख्या cDNA strands की संख्या के बराबर है ।
    2. चरण ९.३ से 2 μl का नमूना मात्रा में cdna किस्में की संख्या की गणना । इस प्रकार ७.५ के अतिरिक्त तनुकरण कारक पर विचार करें (चरण ८.४ से 15 μL नमूना मात्रा से चरण ९.४ से 2 μL नमूना मात्रा) ।
    3. एक आधार-10 semilogगणितीय साजिश में कदम 10.1.2 में गणना किस्में nकिस्में की संख्या के खिलाफ कदम 9.5.1 से सीक्यू मान प्लॉट, और निम्न प्रतीपगमन वक्र के साथ डेटा बिंदुओं फिट (M = रैखिक की ढलान प्रतीपगमन वक्र, B ऑफ़सेट =) ।
      Equation 3
      पुष्टि करें कि सहसंबंध गुणांक (R2) पंक्ति के लिए > 0.99 है ।
  2. वसाप्रोटीन कण
    1. मापा नमूना सीक्यू मान का उपयोग कर नमूना मात्रा प्रति mirna किस्में की संख्या की गणना (चरण 9.5.2) और निम्नलिखित समीकरण (एम और बी विशिष्ट mirna के अंशांकन वक्र पैरामीटर हैं).
      Equation 4
    2. नमूना मात्रा में लिपोप्रोटीन कणों की इसी संख्या की गणना, चरण में मात्रा से शुरू 7.2.1 (१०० μl), इसकी ज्ञात एकाग्रता, और बाद में तनुता चरणों (चरण 7.1.10 में १०० μl-> 30 μl नमूना मात्रा-> 5 μl [तनुजा 1:6] चरण में 15 μL कुल मात्रा में नमूना ८.४-> 2 μL [तनुता 1:7.5] चरण ९.४ में) । एक आणविक वजन मान लें २५० केडीए के लिए एचडीएल कणों और 3 एमडीए के लिए LDL कणों और मिरना निष्कर्षण चरण के दौरान एक १००% मीना की वसूली (आणविक वजन करने के लिए किसी भी लिपिड योगदान की अनदेखी पैदावार की संख्या के एक मामूली overestimation उपज प्रति लिपोप्रोटीन कण) ।
    3. चरण 10.2.1 से मिरना किस्में की संख्या पिछले कदम में की गणना करने के लिए लिपोप्रोटीन कण प्रति mirna किस्में की संख्या उपज को विभाजित करने के लिए ।
  3. कक्षों
    1. चरण 10.2.1 के अनुसार नमूना मात्रा प्रति mirna किस्में की संख्या की गणना.
    2. चरण 10.2.2, प्रारंभिक कक्ष संख्या एकाग्रता चरण ६.४ में मापा के साथ शुरू करने के अनुसार नमूना वॉल्यूम में कक्षों की संगत संख्या परिकलित करें ।
    3. 10.3.1 से mirna किस्में की संख्या पिछले चरण में परिकलित कक्षों की संख्या से विभाजित करने के लिए कक्ष प्रति mirna किस्में की संख्या उपज ।
    4. मिरना/कण अनुपात द्वारा एक नकारात्मक नियंत्रण प्रयोग से प्राप्त कोशिकाओं के पृष्ठभूमि mirna स्तर के लिए सुधार के बाद पिछले कदम से mirna किस्में की कुल राशि को विभाजित करके लिपोप्रोटीन कणों की तेज दर की गणना 10.2.3 ) और ऊष्मायन समय (16 ज, चरण ६.२ देखें) ।

11. multiwell microfluidic arrays

  1. मिरना निष्कर्षण
    1. चरण 7 में वर्णित के रूप में मिररना निष्कर्षण निष्पादित करें ।
  2. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन
    1. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्राइमर्स, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किट घटकों, और बर्फ पर MgCl2 (25 मिमी) पिघलना । आठ नमूनों के लिए, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्राइमर्स (10x) के 8 μL मिश्रण, डीआईटीपी के २.२५ μL (१०० मिमी), १६.८८ μL रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस (५० यू/μL), ९.०० μl की 10x रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन बफर, १०.१२ μl का MgCl2, १.१२ Μl का RNase अवरोध करनेवाला (20 U/μl) , और 1 μL के nuclease-मुक्त पानी ।
    2. मिश्रण धीरे और अपकेंद्रित्र संक्षेप में । एक ट्यूब और मिश्रण में निकाले miRNA के ३.५ μL करने के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन रिएक्शन मिश्रण के ४.३ μL जोड़ें, नीचे स्पिन, और 5 मिनट के लिए बर्फ पर सेबेट. एक thermocycler मशीन में ट्यूब प्लेस और निंनलिखित प्रोग्राम शुरू: 1 मिनट के लिए 16 ° c 2 मिनट, ४२ ° c के लिए , और ५० ° c 1 s के लिए कुल में 40x दोहराया, और फिर, के रूप में stop प्रतिक्रिया, ८५ ° c 5 मिनट के लिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर रोक जब तक रोके ।
  3. पूर्वप्रवर्धन
    1. बर्फ और उलटा और अपकेंद्रित्र संक्षेप पर प्राइमरों पिघलना । बोतल घूमता द्वारा प्रीप्रवर्धन मास्टर मिक्स (2x) मिलाएं । आठ नमूनों के लिए निम्नलिखित अनुदेश के अनुसार प्रीप्रवर्धन अभिक्रिया मिश्रण तैयार करें: प्रीप्रवर्धन मास्टर मिक्स (2x) के ११२.५ μL, २२.५ μL प्रीप्रवर्धन प्राइमर्स, और ६७.५ μL के न्यूक्लेस-मुक्त पानी. उलटा और अपकेंद्रित्र संक्षेप में ।
    2. पिछले चरण से preamplification प्रतिक्रिया मिश्रण के २२.५ μL के साथ चरण 11.2.2 से रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन रिएक्शन उत्पाद के २.५ μL मिश्रण और संक्षेप और अपकेंद्रित्र संक्षिप्त । 5 मिनट के लिए बर्फ पर नमूनों को सेते ।
    3. एक thermocycler मशीन में ट्यूबों प्लेस और निंनलिखित सेटिंग्स में सेते: 10 मिनट के लिए ९५ ° c पर एंजाइम सक्रियण, 2 मिनट के लिए ५५ डिग्री सेल्सियस पर अनीलन, 2 मिनट के लिए ७२ डिग्री सेल्सियस पर विस्तार, दोहराया 12x: ९५ डिग्री सेल्सियस पर 15 एस और अनीलन के लिए denaturing ६०/ , 10 मिनट के लिए ९९.९ ° c पर एंजाइम निष्क्रियण, और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ ।
    4. नीचे स्पिन, 1x TE के ७.५ μL (पीएच ८.०) और nuclease मुक्त पानी के ६७.५ μL, पलटे, और अपकेंद्रित्र संक्षेप में जोड़ें । नमूनों को 1 सप्ताह तक के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
  4. qPCR
    1. बोतल घूमता हुआ मास्टर मिक्स मिलाएं । एक कार्ड के लिए पीसीआर रिएक्शन मिश्रण तैयार: मास्टर मिक्स के ४५० μL, nuclease मुक्त पानी की ४४१ μL, और चरण 11.3.4 से प्रीप्रवर्धन नमूना के 9 μL. उलटा और अपकेंद्रित्र संक्षेप में ।
    2. निर्माता के निर्देशों और ३,००० एक्स जीमें 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र 2x के अनुसार तैयार पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण के १०० μl के साथ multiwell microfluidic सरणी कार्ड के प्रत्येक भरण जलाशय लोड करें । लगातार दो अपकेंद्रण चरणों के दौरान त्वरण कार्ड को ठीक से भरने के लिए महत्वपूर्ण है । निर्माता के निर्देशों के अनुसार कार्ड को सील करें ।
    3. निम्नलिखित कार्यक्रम के साथ एक पीसीआर प्रणाली का प्रयोग करें: 10 मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस पर एंजाइम सक्रियण और फिर, दोहराया 40x: 15 के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस पर denaturing और annealing/1 मिनट के लिए ६० डिग्री सेल्सियस पर विस्तार ।
    4. पीसीआर सिस्टम से परिणाम फ़ाइल आयात करें और निम्न विश्लेषण सेटिंग्स के साथ सिस्टम के सॉफ़्टवेयर पैकेज का उपयोग कर RQ मान परिकलित करें: एक अधिकतम स्वीकार्य cq मान ४०.०, परिकलन में अधिकतम cq मान शामिल हैं, और outliers बीच में बाहर प्रतिकृति । Benjamini – hochberg गलत खोज दर के लिए विकल्प के रूप में p-मान समायोजन (गलत सकारात्मक14की पुनरावृत्ति का सुधार) और वैश्विक सामान्यीकरण के रूप में सामान्यीकरण विधि (सभी नमूनों के लिए एक मीडियन थ्रेशोल्ड मान का उपयोग करके सक्रिय करें 15) ।

Representative Results

लिपोप्रोटीन कण अलगाव की एक सामांय योजना
चित्रा 1 पोलप्रोटीन कण अलगाव की सामान्य योजना पूरे रक्त से शुरू करने के लिए, अनुक्रमिक फ्लोटेशन ultracentrifugation16का उपयोग कर पता चलता है. यदि चाहें, तो अन्य लिपोप्रोटीन कण अंशों जैसे वीएलडीएल और आईडीएल कणों को इस प्रोटोकॉल के दौरान काटा जा सकता है । पॉलीप्रोपलीन क्विक-सील ट्यूबों के साथ संयोजन में फिक्स्ड-एंगल टाइटेनियम रोटर, अपकेंद्रण बलों को झेलने के लिए उपयुक्त है । ट्यूब ढहने से बचने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि ट्यूब में हवा के बुलबुले से बचें । प्रोटीन अवक्रमण को कम करने के लिए 4 ° ब् पर अपकेंद्रण किया जाता है । आम तौर पर प्लाज्मा से शुरू-तीन स्वयंसेवकों के जमा रक्त दान के (60-80 मिलीलीटर प्रति दाता), 1-3 मिलीग्राम/एमएल की सीमा में सांद्रता के साथ 3 मिलीलीटर प्रत्येक के एलडीएल और एचडीएल कण समाधान मात्रा की उपज की उम्मीद की जा सकती है । पूरी प्रक्रिया, रक्त दान से शुरू, लगभग 7 दिन लग गए ।

Figure 1
चित्रा 1: लिपोप्रोटीन अलगाव के फ़्लोचार्ट । वैक्यूम कंटेनर ट्यूबों में स्वस्थ स्वयंसेवकों से अपकेंद्रित्र रक्त और प्लाज्मा (ऊपरी चरण) इकट्ठा । इसकी सघनता के समायोजन के पश्चात् ρ = १.०१९ ळ/उस् का उपयोग करते हुए, विलयन को २१४,००० × ळ पर 4 ° ब् पर 20 ज के लिए अपकेंद्रित्र करें । नीचे के भाग के घनत्व के समायोजन के बाद ρ = १.०६३ ळ/मिलीलीटर kbr का उपयोग करके, समाधान को फिर से २१४,००० x g पर 20 ज के लिए 4 ° c पर अपकेंद्रित्र करें । एलडीएल कणों वाले ऊपरी अंश को 4 ° ब् पर अस्थायी रूप से भंडारित करिए । नीचे के भाग के घनत्व के समायोजन के बाद ρ = १.२२० ळ/मिलीलीटर केबीआर का उपयोग करके, विलयन को दो बार २१४,००० × छ पर 20 ज के लिए 4 ° ब् पर अपकेंद्रित्र करें । एचडीएल कणों युक्त ऊपरी अंश ले लीजिए, दोनों HDL और LDL कण समाधान dialyze और 1, 2, और 4 ज के बाद बफर विनिमय । 24 ज के बाद, प्रोटीन सांद्रण निर्धारित करें और नमूनों को अक्रिय गैस के अंतर्गत 4 ° ब् पर भंडारित कीजिए । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

एचडीएल कणों का पुनर्गठन
HDL कणों का पुनर्गठन पहले जोनास7द्वारा प्रकाशित एक प्रोटोकॉल के अनुसार प्रदर्शन किया गया था । पहला कदम एचडीएल कणों के delipidation के रूप में चित्रा 2aमें दिखाया गया था, relipidation के दूसरे चरण के बाद (यानी, पुनर्गठन) चित्रा 2bमें दिखाया गया है, के रूप में लिपिड पीसी, सह का उपयोग कर, और सी mirna और spermine के मिश्रण के अलावा. हम मानव परिपक्व मीर-२२३ और मीर-१५५ क्योंकि मीर-२२३ एक उच्च बहुतायत और मीर-१५५ से पता चलता है चुना लिपोप्रोटीन कणों में दुर्लभ है17। आमतौर पर, दोनों चरणों दो क्रमिक दिनों पर किया जाता है । पुनर्गठन के दौरान, अन्य lipophilic और/या एम्फीफिलिक घटकों के रूप में वांछित जोड़ा जा सकता है. इथेनॉल का पूर्ण वाष्पीकरण/डाइएथिल ईथर और पीसी, कं, और सी के मेथनॉल/क्लोरोफॉर्म सॉल्वेंट महत्वपूर्ण था । अंतिम चरण-के रूप में चित्र 2cमें दिखाया गया था-डायलिसिस प्रक्रिया के लिए अलग से पुनर्गठित एचडीएल कणों (rhdl) से मुक्त lipids/ यह एक अतिरिक्त 1-2 दिन लग गए । डायलिसिस समाधान करने के लिए शोषक मोतियों के अलावा डायलिसिस झिल्ली स्थिरांक के साथ घनत्व ढाल रखा । RHDL कणों की ५०% की उपज की उंमीद की जा सकती है ।

Figure 2
चित्रा 2: एचडीएल कण पुनर्गठन का प्रवाह संचित्र । (क) दिल्लीकरण: एचडीएल पार्टिकल सॉल्यूशन को प्रीकूल्ड एथेनॉल/डाईएथिल ईथर के साथ मिलाएं और 2 ज के लिए-20 ° c पर इनक्यूबेट करें । Supernatant discarding के बाद, गोली फिर से निलंबित और प्रक्रिया को दोहराने । N2 गैस के साथ गोली सूखी और बफर ए में फिर से निलंबित । एकाग्रता के निर्धारण के बाद, delipडिलीट एचडीएल को अक्रिय गैस वायुमंडल के अंतर्गत 4 ° ब् पर भंडारित करें । (ख) पुनर्गठन: फॉस्फेट-कोलीन (पीसी), कोलेस्ट्राल OLEATE (CO), और कोलेस्ट्रॉल (सी) के मिश्रण के बाद, ट्यूब घूर्णन जबकि एन2 गैस का उपयोग कर विलायक लुप्त हो जाना । 30 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए spermine समाधान के साथ मिरना aliquot सेते, सोडियम deoxycholate जोड़ने और सूखे लिपिड फिल्म resuspend । 4 ° c पर 2 ज के लिए नमूना हलचल, delipडिलीट HDL समाधान जोड़ने के लिए, और नमूना फिर से हलचल, इस बार अक्रिय गैस वातावरण के तहत 4 डिग्री सेल्सियस पर रात । (ग) डायलिसिस: समाधान को पैनल बी से स्थानांतरित कर दिया जाता है जिसमें पुनर्गठित एचडीएल (आरएचडीएल) कण डायलिसिस मेम्ब्रेन चैम्बर में (आणविक भार कट-ऑफ 20 केडीए) और 4 ° c पर पीबीएस और शोषक मोतियों के खिलाफ dialyze होते हैं । विनिमय बफर और मोती के बाद 1 ज और 2 ज. rHDL कण समाधान के बाद 24 घंटे की वसूली, एकाग्रता का निर्धारण, और 4 डिग्री सेल्सियस पर अक्रिय गैस वातावरण के तहत नमूना स्टोर । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

एलडीएल कणों की लेबलिंग
एमआईएनए के साथ एलडीएल कणों की लेबलिंग (चित्रा 3) एचडीएल कणों के लिए प्रदर्शन के रूप में apob-१०० प्रोटीन, जो एलडीएल कण का मुख्य घटक है की हाइड्रोफोटोसिटी के कारण व्यवहार्य नहीं था । Dmso ldl कण के लिपिड monolayer के प्रवेश के लिए इस्तेमाल किया गया था और इस प्रकार, मीरना एसोसिएशन मध्यस्थता । पूरी प्रक्रिया १००% के पास एक उपज के साथ 1-2 दिन लग गए ।

Figure 3
चित्रा 3: एलडीएल कण के फ़्लोचार्ट लेबलिंग । 30 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए spermine समाधान के साथ मिरना aliquot सेते और DMSO और एलडीएल बफर जोड़ें । बर्फ पर 10 मिनट के लिए एलडीएल नमूना बुद्धि एलडीएल बफर सेते और मिरना/ 2 ज के लिए ४० डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के बाद, एक डायलिसिस झिल्ली चैंबर में समाधान स्थानांतरण (आणविक वजन में कटौती: 20 केडीए) और 4 डिग्री सेल्सियस पर PBS और शोषक मोतियों के खिलाफ dialyze । एक्सचेंज बफर और मोती के बाद 1 & 2 ज. 24 ज के बाद लेबल LDL कण समाधान पुनर्प्राप्त, एकाग्रता और + 4 डिग्री सेल्सियस पर अक्रिय गैस वातावरण के तहत स्टोर का निर्धारण । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

लिपोप्रोटीन कणों की गुणवत्ता नियंत्रण
एचएस-AFM का आकार और आकार की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । बस का उपयोग करने से पहले, अभया को हौसले से cleaved होना (चिपकने वाला टेप का उपयोग करने के लिए ऊपरी परत [एस] हटाने) के लिए एक साफ और सपाट सतह प्रदान करने के लिए है । जब mica पर एचडीएल/LDL कणों इन्क्यूबेशन, तनुता कारक (और/या ऊष्मायन समय) व्यक्तिगत कणों का निरीक्षण करने के लिए समायोजित करने की आवश्यकता है । क्लस्टर्स कण आयामों के निर्धारण की अनुमति नहीं देते । एचडीएल कणों mica पर मोबाइल हैं । जब एचएस-AFM के बजाय पारंपरिक AFM का उपयोग कर, स्थिरीकरण प्रोटोकॉल तदनुसार (बफर, सतह कोटिंग) के लिए पार्श्व कण गतिशीलता को कम करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए । नमूना स्कैनिंग करते समय, इमेजिंग बल कम रखा जाना चाहिए (दोहन मोड) कणों के किसी भी विरूपण से बचने के लिए, जिसके फलस्वरूप मापा मूल्यों को प्रभावित करेगा. डेटा विश्लेषण के लिए, कणों का पता एक थ्रेसहोल्ड एल्गोरिथ्म (उदा., Gwyddion में) के माध्यम से लगाया गया था (उदाहरण के लिए, थ्रेशोल्ड से अनाज > चिह्न) और उनकी ऊंचाई अभका सतह के संबंध में निर्धारित की गई थी । कणों की ऊंचाई को मापने के कण के आकार का निर्धारण करने के लिए सबसे सटीक तरीका है, के रूप में स्पष्ट पार्श्व आयाम टिप आकार द्वारा विस्तृत कर रहे हैं ( चित्रा 4में अनुकरणीय चित्र देखें). सांख्यिकीय मूल्यांकन और विभिन्न लिपोप्रोटीन कणों के आकार वितरण की तुलना के लिए कण ऊंचाइयों की प्रायिकता घनत्व फ़ंक्शंस (pdfs) की गणना की गई । देशी और mirna-लेबल ldl कणों की तुलना के रूप में चित्रा 4 में दिखाया गया है यह संभव लेबल और nonlabeled के बीच प्रिंसिपल समानता सत्यापित करता है (यानी, मूल) लिपोप्रोटीन कणों (मीरना के अलावा ldl कणों लेबल के बिना/ spermine मिश्रण लेबलिंग प्रक्रिया के लिए ही एक नियंत्रण के रूप में दिखाया गया है). पूरी प्रक्रिया लगभग 1 दिन लिया ।

Figure 4
चित्र 4: फ़्लोचार्ट और एचएस-AFM माप के प्रतिनिधि परिणाम । PBS (1:102-1:103) में एचडीएल/ldl कण नमूना पतला और 5 मिनट के लिए हौसले से cleaved अभक पर इसे सेते, pbs के साथ एक सावधान कुल्ला द्वारा पीछा करने के लिए नि: शुल्क (नहीं electrostatically अधिशोषित) कणों को दूर । एच एस-AFM इमेजिंग प्रदर्शन और सतह पर कण घनत्व की जांच करें । कमरे के तापमान पर PBS में माप बाहर ले । इस चित्र के शीर्ष छवि एक बहुत उच्च कण घनत्व से पता चलता है; नीचे की छवि विश्लेषण के लिए उपयुक्त है । एकल कणों की ऊंचाई को थ्रेसहोल्डिंग और नेटिव (ब्लैक कर्व) के बाद विश्लेषित किया गया था और पुनर्गठित/लेबल (लाल और हरे रंग की वक्र) कणों की तुलना सांख्यिकीय मूल्यांकन में की गई थी । स्केल बार = १०० एनएम । यह आंकड़ा Axmann एट अल19से संशोधित किया गया है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

मिरना निष्कर्षण, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन, और qPCR
देशी/कृत्रिम रूप से समृद्ध लिपोप्रोटीन या सेल नमूनों से मिरना के निष्कर्षण के रूप में चित्र 5aमें दिखाया गया एक mirna निष्कर्षण किट का उपयोग किया गया था । इसके द्वारा, एक RNase मुक्त वातावरण महत्वपूर्ण था । इस कदम से लगभग 1 घंटे के रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन निकाला miRNA नमूना (चित्रा 5B) के रूप में निर्माता द्वारा वर्णित मानक जैव रासायनिक प्रक्रियाओं का उपयोग किया गया था । यह चरण लगभग १.५ h लिया गया है । अंत में, अंतिम चरण के दौरान प्राप्त सीडीएनए की मात्रा qPCR का उपयोग करके निर्धारित की गई थी (चित्र 5C) । एक मानक वक्र, जो पूर्ण मिररना भूग्रस्त संख्या के लिए प्राप्त सीक्यू मूल्यों से संबंधित है, प्रारंभिक नमूने के निरपेक्ष mirna सामग्री मिले । यह लगभग २.५ h लिया ।

Figure 5
चित्र 5: मिररना निष्कर्षण, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन, और qPCR का फ़्लोचार्ट । (क) मिरना निष्कर्षण: lysis अभिकर्मक के साथ नमूना मिश्रण और यह एक सिरिंज का उपयोग आकांक्षा के माध्यम से lyse. 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट और3chcl जोड़ें । 15 एस के लिए तेजी से हिला और 3 मिनट के लिए सेते । 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए १,२०० x g पर अपकेंद्रण के बाद, शीर्ष चरण इकट्ठा करने और यह इथेनॉल के साथ मिश्रण । एक स्पिन कॉलम (अधिकतम मात्रा < 700 μL) के लिए समाधान हस्तांतरण और यह 15 एस के लिए ८,००० x g पर केंद्रान्तरण यह eluent त्यागने और समाधान के बाकी के साथ अंतिम चरण को दोहराने । 15 एस के लिए ८,००० एक्स जी पर पहले धोने बफर और केंद्राचयक जोड़ें, दूसरा धोने बफर जोड़ने के लिए, और 15 एस के लिए ८,००० एक्स जी पर अपकेंद्रित्र । इसके अलावा 1 मिनट के लिए अधिकतम गति से अपकेंद्रण के माध्यम से झिल्ली सूखी Elute 1 मिनट के लिए ८०,००० x g पर एच2ओ और केंद्रागयन के साथ मिन्ना । (ख) रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन: बर्फ पर 10x बफर, एच2ओ, dntp मिक्स, अवरोध करनेवाला, और एंजाइम पिघलना और मास्टर मिक्स तैयार करते हैं । मास्टर मिक्स और रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्राइमर और प्रदर्शन रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन एक thermocycler मशीन का उपयोग करने के लिए एक पैनल से निकाले mirna जोड़ें । सीडीएनए नमूना-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । (ग) क्यूपीसीआर: Supermix, एच2ओ, और बर्फ पर प्राइमर पिघलना और मास्टर मिक्स तैयार करते हैं । मास्टर मिक्स करने के लिए पैनल बी से cdna जोड़ें और qpcr प्रदर्शन. सीक्यू मूल्यों को प्राप्त करने के लिए डेटा का विश्लेषण और नमूने के निरपेक्ष mirna सामग्री की गणना ( चित्रा 6 और विवरण के लिए प्रतिनिधि परिणाम देखें). इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

निरपेक्ष मीरना सामग्री और स्थानांतरण दर
मूल और कृत्रिम रूप से समृद्ध एचडीएल और एलडीएल कणों की निरपेक्ष miRNA सामग्री के नमूने के सीक्यू मूल्यों और संबंधित मिरना के एक मानक वक्र के रूप में चित्रा 6में दिखाया से गणना की गई थी । चित्र 6a विश्लेषण सॉफ़्टवेयर द्वारा परिकलित डेटा दिखाता है (सक्रिय dynamictube सामांयीकरण के साथ [प्रत्येक नमूना ट्रेस के दूसरे व्युत्पंन का उपयोग करते हुए भिंन पृष्ठभूमि स्तर के लिए] और शोर प्रवणता सुधार [शोर स्तर को सामांयीकरण]) । मानक वक्रों के cq मान, qpcr मशीन द्वारा मापा गया सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति संकेत पर सॉफ़्टवेयर पैकेज के स्वत:-खोज थ्रेशोल्ड फ़ंक्शन का उपयोग करके निर्धारित किए गए थे । इसके द्वारा, सॉफ्टवेयर के लिए मानक वक्र के फिट के आर मूल्य maximized । प्रत्येक विशिष्ट मिररना नमूना विश्लेषण के लिए थ्रेशोल्ड स्तर को स्थिर रखा गया था । बाद में, cq मान मिरना strands की संख्या के एक समारोह के रूप में प्लॉट किए गए थे, और एक प्रतीपगमन रेखा की गणना की गई थी । नमूना cq मान समान थ्रेशोल्ड स्तर के साथ निर्धारित किए गए थे जैसा आरेख 6bमें दिखाया गया है; रिएक्शन दक्षता विभिन्न qPCR रन के बीच अंतर प्रत्येक रन में शामिल एक अतिरिक्त अंशांकन वक्र नमूना का उपयोग कर सॉफ्टवेयर द्वारा स्वचालित रूप से मुआवजा दिया गया. प्रतीपगमन रेखा समीकरण का उपयोग करते हुए, नमूना में मिरना की अज्ञात राशि की गणना की जा सकती है । लिपोप्रोटीन कण संख्या प्रारंभिक प्रोटीन एकाग्रता और उसके औसत आणविक वजन (मेगावाटएचडीएल ~ २५० केडीए) से अनुमान लगाया गया था । इस प्रकार, आणविक भार के लिए कोई लिपिड योगदान मान लिया गया था-इस तरह, प्रति लिपोप्रोटीन कण मिन्ना किस्में की संख्या थोड़ा overestimated किया गया था । इसके अलावा, मीरना निष्कर्षण चरण के दौरान मिन्ना की १००% रिकवरी दर ग्रहण की गई । इसके अलावा, एचडीएल कणों के साथ ऊष्मायन के पहले और बाद में कोशिकाओं की मिरना सामग्री का निर्धारण किया गया था और मिरना हस्तांतरण दर की गणना चित्र 6Cमें दर्शाए अनुसार की गई थी ।

Figure 6
चित्रा 6: पूर्ण miRNA सामग्री और स्थानांतरण दर की गणना के फ़्लोचार्ट. (क) मीर के लिए मानक वक्र-१५५: एक मीर-१५५ aliquot (१०० μl, 10 μm) serially के रूप में आरएनए मुक्त पानी से पतला था । qPCR प्रत्येक धारावाहिक तनुता नमूना के लिए सीक्यू मूल्यों (दो बार मापा) स्वत: सॉफ्टवेयर पैकेज की दहलीज समारोह का उपयोग कर मिले । ऋणात्मक नियंत्रण प्रयोग (मिरना के अतिरिक्त के बिना) > 35 के cq मान मिले । नमूना मात्रा प्रति miRNA किस्में की संख्या के समारोह के रूप में सीक्यू मूल्यों के डेटा अंक (प्रारंभिक एकाग्रता और धारावाहिक dilutions से गणना) प्रस्तुत समीकरण के साथ लगे थे (लाल रेखा, सही छवि), उपज एम =-३.३६ और B = ४२.१२ । निर्धारित पीसीआर की क्षमता ०.९८ थी । त्रुटि पट्टियां प्रायोगिक repetitions के परिणामों से परिकलित की गई थी और डेटा बिंदु वृत्त के व्यास से छोटी थीं । (ख) मूल/कृत्रिम रूप से संवधत एचडीएल कणों के सीक्यू मूल्यों का निर्धारण पैनल ए में निर्धारित समान सीमा स्तर के साथ किया गया था और क्यूपीसीआर नमूना मात्रा में मीरना किस्में की संख्या में परिवतत कर दिया गया था । मूल नमूने के miRNA के निरपेक्ष अनुपात (३.२ x 1011 कणों) नमूना मात्रा में hdl कणों की संख्या (एकाग्रता) से गणना की गई थी. (ग) सेल नमूनों (सेल लाइन LDLA7-एसआरबीआई) को कृत्रिम रूप से संवधत एचडीएल कणों (५० Μg/एमएल) के साथ 16 घंटे के लिए इन्क्यूबेटिड किया गया था और इसी प्रकार से विश्लेषित किए गए थे । Cq मान २२.५, २२.५, और १९.३ कक्षों के लिए केवल, मूल hdl के साथ कक्षों के लिए, या कक्षों के लिए rhdl कण समाधान (दोनों ५० μg/ इन मानों को पैनल खमें किए गए अनुसार मिरना किस्में की संख्या में परिवतत कर दिया गया था । ऊष्मायन के बाद मिरना किस्में की संख्या (७.३ x 106) ऊष्मायन (८.६ x 105) से पहले मिरना किस्में की संख्या के घटाव द्वारा सही थे । परिणाम नमूना मात्रा (३,१००) में कोशिकाओं की संख्या से विभाजित किया गया था, मिरना-कण-अनुपात (१.५ एक्स 10-4), और ऊष्मायन समय अवधि (16 एच). यह मिरना तेज के माध्यम से लिपोप्रोटीन कणों के स्थानांतरण दर (२४० hdl कण तेज घटनाओं प्रति सेल और दूसरा) मिले । यह आंकड़ा Axmann एट अल19से संशोधित किया गया है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

बहुकूप माइक्रोफ्लुइडिक सरणी
मिरना निष्कर्षण की छोटी पैदावार के कारण, निकाले गए मिरना का रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन एक पूर्वप्रवर्धन कदम के बाद किया गया । अंत में, qPCR, के रूप में चित्र 6में दिखाया गया था, प्रदर्शन किया । सभी चरणों के लिए, मानक जैव रासायनिक प्रक्रियाओं निर्माता द्वारा वर्णित के रूप में इस्तेमाल किया गया । यहां, मैक्रोफेजेस18 से कोलेस्ट्रॉल बहिस्राव पर सीआरएफ के प्रभाव पर अध्ययन के लिए भर्ती किए गए यूरेमिक रोगियों के एचडीएल कणों पर ग्लोबल मिरना प्रोफाइल का एक हिस्सा दिखाया गया है । इस अध्ययन में, एचडीएल या सीरम के कोलेस्ट्रॉल स्वीक्टर क्षमता-दूसरों के अलावा-17 युवा वयस्क यूरेमिक रोगियों (सीकेडी चरणों 3-5) और 14 युवा वयस्क हीमोडायलिसिस रोगियों जुड़े रोगों और मिलान नियंत्रण के बिना मापा गया था । डेटा का विश्लेषण करने के लिए, डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स का उपयोग किया गया (अधिकतम स्वीकार्य सीटी मान: ४०.०, जिसमें परिकलन में अधिकतम CT मान और replicates के बीच outliers को छोड़कर) । पीमूल्यों Benjamini-hochberg झूठी खोज दर (झूठी सकारात्मक की घटना के सुधार) का उपयोग कर समायोजित किया गया, और सामांयीकरण विधि के रूप में, वैश्विक सामान्यीकरण , जो पाता है आम assays हैं सभी के बीच चुना गया था नमूने सामांयीकरण के लिए अपनी औसत सीटी का उपयोग करने के लिए । प्रतिनिधि परिणामों में, यूरेमिक रोगियों के HDLs से अलग miRNAs के कुछ RQs (नियंत्रण के RQs 1 हैं) चित्रित कर रहे हैं । जाहिर है, मीर-१२२ और मीर-२२४ अत्यधिक यूरेमिक रोगियों के hdls में व्यक्त कर रहे हैं । इस पूरे कदम लगभग 1 दिन लिया ।

Figure 7
चित्रा 7: फ़्लोचार्ट और multiwell microfluidic सरणी के प्रतिनिधि परिणाम. मिरना निष्कर्षण के रूप में चित्रा 5aमें दिखाया गया है, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्राइमर और एक मास्टर 10x बफर, एच2ओ, dntp मिक्स, Inhibitor, mgcl2, और एंजाइम युक्त मिश्रण के साथ मिरना नमूना मिश्रण । 5 मिनट के लिए बर्फ पर ऊष्मायन के बाद, एक thermocycler मशीन का उपयोग रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रदर्शन । प्रीप्रवर्धन मास्टर मिक्स, बर्फ पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट जोड़ें, और एक थर्मोसाइक्लर मशीन का उपयोग प्रीप्रवर्धन प्रदर्शन करते हैं । 0.1 x TE (पीएच ८.०) जोड़ें और पीसीआर मास्टर मिक्स और एच2ओ पिपेट के साथ एक aliquot मिश्रण multiwell microfluidic सरणी के भरण बंदरगाह में पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण और 1 मिनट के लिए दो बार ३,००० x g पर स्पिन । एक पीसीआर प्रणाली का उपयोग कर qpcr प्रदर्शन और rq मूल्यों उपज के लिए डेटा का विश्लेषण (यहां, आंकड़ा एक स्वस्थ नियंत्रण समूह18की तुलना में यूरीमिया रोगियों के एचडीएल कणों के rq मूल्यों से पता चलता है) ।  इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Discussion

यहां, लिपोप्रोटीन कण मानव रक्त से भागों के अलगाव और उनके व्यक्तिगत mirna सामग्री के निर्धारण कदम दर कदम वर्णित है । यह एक rnase मुक्त वातावरण में काम करने के लिए महत्वपूर्ण है, जबकि अलग हैंडलिंग और संश्लेषित मिरना-कण-एम्बेडेड मिरना जाहिर है एंजाइमी गिरावट से आश्रय है । के रूप में mirna/कण अनुपात देशी लिपोप्रोटीन कणों के बजाय कम है, mirna के साथ कृत्रिम संवर्धन कोशिकाओं के holo कण तेज अध्ययन करने के लिए आवश्यक है । इस प्रकार, HDL कणों का पुनर्गठन के रूप में पहले वर्णित7 mirna किस्में शामिल करने के लिए संशोधित किया गया है । इसके अलावा, इस प्रक्रिया के दौरान लिपिड और प्रोटीन अंश के पृथक्करण वैज्ञानिकों लिपिड की जांच करने के लिए अनुमति देता है-और लिपोप्रोटीन कण के प्रोटीन से जुड़े घटक19। इसी तरह, LDL कणों की लेबलिंग प्रक्रिया अनुकूलित है । गौर करने वाली बात यह है कि शुक्रवारों के एक प्राकृतिक स्टेबलाइजर-मिरना/कण अनुपात को प्रभावित नहीं किया । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सिद्धांत रूप में, विधि एक लिपोप्रोटीन कण के भीतर मिरना से अंय पदार्थों के infolding अनुमति देता है । बेशक, एचडीएल (व्यास: 5-12 एनएम) और एलडीएल कणों (व्यास: 18-25 एनएम) के समग्र आकार के आधार पर पदार्थ के भौतिक आकार के संबंध में एक सीमा है ।

पुनर्गठित/लेबल लिपोप्रोटीन कणों के गुणवत्ता नियंत्रण से संबंधित, एच एस afm एक लागू करने के लिए एक कण के स्तर पर एचडीएल/ EM की तुलना में, यह कम तैयारी के समय और निकट शारीरिक स्थितियों (गीला, कमरे के तापमान) के लिए अनुमति देता है ।

अपनी अंतर्निहित संवेदनशीलता और प्रवर्धन के कारण, qPCR विकल्प की विधि को कम मिररना सांद्रता का पता लगाने है । वैकल्पिक रूप से, एकल अणु संवेदी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, जो भी व्यक्तिगत अणुओं का पता लगाने में सक्षम है, की कम सांद्रता के कारण उपयुक्त नहीं होगा, उदाहरण के लिए, fluorescently प्रति कण मिन्ना किस्में लेबल. इस प्रकार, मिरना किस्में प्रति नेटिव लिपोप्रोटीन कण का अनुपात 10-8पाया गया है । कृत्रिम संवर्धन १०,००० के एक कारक है, जो सेलुलर लिपोप्रोटीन तेज दर के अनुमान की सुविधा (कोई महत्वपूर्ण अंतर देशी लिपोप्रोटीन कणों 19का उपयोग कर पता चला है) के अनुपात से बढ़ जाती है । क्यूपीसीआर की उच्च संवेदनशीलता ऊष्मायन समय और मिरना/कण अनुपात के बाद मिरना किस्में की संख्या को मापने के द्वारा इस तेज दर का निर्धारण करने के लिए संभव बनाता है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि परिकलित मान सेल्युलर अवक्रमण और मिरना की रिहाई पर ध्यान नहीं देता है और, इस प्रकार, लिपोप्रोटीन कण तेज अनुपात के लिए एक कम से कम एक सीमा का प्रतिनिधित्व करता है ।

भविष्य में, विधि दवाओं (विशेष रूप से भी lipophilic वाले) कोशिकाओं में हस्तांतरण और intracellular एकाग्रता के लिए उनके जैविक प्रभाव सहसंबंधी करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है (लिपोप्रोटीन कणों के तेज दर के द्वारा निर्धारित) ।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम ऑस्ट्रिया के विज्ञान कोष परियोजना P29110-B21 द्वारा समर्थित किया गया था, "Hochschulzur Förderung डर Wissenschaft" परियोजना एच-3065/2011, यूरोपीय क्षेत्रीय विकास के लिए कोष (EFRE, IWB2020), ऊपरी के संघीय राज्य ऑस्ट्रिया, और "भूमि ओमो Basisfinanzierung" ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ultracentrifuge Beckman Optima L-100 XP Lipoprotein isolation
Ultracentrifuge rotor Beckman TI 55.2 Lipoprotein isolation
Vacutainer (EDTA) Becton Dickinson 366643 Lipoprotein isolation
Kaliumbromid Sigma Aldrich 2110 Lipoprotein isolation
Ultracentrifuge tubes Beckman 342414 Lipoprotein isolation
Ultracentrifuge tube sealer Beckman 342428 Lipoprotein isolation
Sodiumchlorid Carl Roth GmbH P029.2 Lipoprotein isolation
EDTA Fisher Scientific D/0650/50 Lipoprotein isolation
Dialysis tubes, MWCO 12 - 14k Spectra 132700 Lipoprotein isolation
synthetic miRNA microSynth - synthetic miRNA
TRIS buffer pH 7 Ambion AM9850G synthetic miRNA
TRIS buffer pH 8 Ambion AM9855G synthetic miRNA
sterile tubes Carl Roth GmbH ENE8.1 synthetic miRNA
Photometer Eppendorf Eppendorf Biophotometer Bradford assay
Cuvette Carl Roth GmbH XK20 Bradford assay
Coomassie G-250 Stain BioRad GmbH 161-0786 Bradford assay
Sodiumchlorid Carl Roth GmbH 3957.1 Delipitation
EDTA Fluka Analytical 03690-100ML Delipitation
TRIS buffer pH 8.0 Ambion AM9855G Delipitation
Ethanol 100% AustrAlco Ethanol Absolut 99.9% Delipitation
Diethyl ether Carl Roth GmbH 3942.1 Delipitation
Centrifuge Thermo Scientific Multifuge X3R Delipitation
Chloroform Carl Roth GmbH 3313.1 Reconstitution
Methanol Carl Roth GmbH 4627.1 Reconstitution
Phosphatidylcholine Sigma Aldrich GmbH P3556-25mg Reconstitution
Cholesterol oleate Sigma Aldrich GmbH C-9253-250mg Reconstitution
cholesterol Sigma Aldrich GmbH C8667-500mg Reconstitution
glass tubes Carl Roth GmbH K226.1 Reconstitution
spermine Sigma Aldrich GmbH S3256-1G Reconstitution
Thermomixer Eppendorf Thermomixer comfort Reconstitution
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich GmbH 3097-25G Reconstitution
Magnetic stir bar Carl Roth GmbH 0955.2 Reconstitution
100µL micropipettes Carl Roth GmbH A762.1 Reconstitution
PBS Carl Roth GmbH 9143.2 Dialysis
Amberlite XAD-2 beads Sigma Aldrich GmbH 10357 Dialysis
Slide-A-Lyzer casette (cut-off 20 kDa) Thermo Scientific 66003 Dialysis
Syringe Braun 9161406V Dialysis
Syringe needle Braun 465 76 83 Dialysis
EGTA Carl Roth GmbH 3054.2 Labeling of LDL particles
DMSO life technologies D12345 Labeling of LDL particles
Atomic Force Microscope RIBM SS-NEX Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles
Muscovite Mica (V-1 Grade) Christine Gröpl G250-1/V1 Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles
AFM Cantilever Nanoworld USC-F1.2-k0.15 Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles
Gwyddion 2.49 Czech Metrology Institute http://gwyddion.net Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles
Chamber slides, Nunc Lab-Tek VWR 734-2122 Cell culture
HBSS Carl Roth GmbH 9117.1 Cell culture
Cell counter Omni Life Science GmbH Casy Cell culture
miRNeasy Mini Kit QIAGEN 217004 miRNA extraction
Centrifuge Eppendorf 5415R miRNA extraction
20G needle Braun Sterican 465 75 19 miRNA extraction
5ml syringe Becton Dickinson 309050 miRNA extraction
PCR cabinet Esco PCR-3A1 Reverse Transcription
TaqMan Reverse Transcription Kit Thermo Scientific 4366596 Reverse Transcription
Rnase-free water Carl Roth GmbH T143 Reverse Transcription
0.2 ml tubes Brand 781305 Reverse Transcription
Centrifuge Carl Roth GmbH Microcentrifuge AL Reverse Transcription
Thermocycler Sensoquest Labcycler Reverse Transcription
TaqMan Primer Thermo Scientific - qPCR
iTaq Universal probe supermix BioRad GmbH 1725131 qPCR
PCR machine Corbett Rotor-Gene RG-6000 qPCR
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems 4366596 TaqMan Array
Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 Applied Biosystems 4399966 TaqMan Array
TaqMan PreAmp Master Mix Applied Biosystems 4391128 TaqMan Array
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 Applied Biosystems 4399933 TaqMan Array
TaqMan Universal Master Mix II, no UNG Applied Biosystems 4440040 TaqMan Array
TaqMan Advanced miRNA Human A Cards Applied Biosystems A31805 TaqMan Array
Nuclease-free water Thermo Scientific R0581 TaqMan Array
MgCl2 (25mM) Thermo Scientific R0971 TaqMan Array
TE, pH 8.0 Invitrogen AM9849 TaqMan Array
7900HT Fast Real-Time PCR System Applied Biosystems 4351405 TaqMan Array
TaqMan Array Card Sealer Applied Biosystems - TaqMan Array

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References

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जैव रसायन मुद्दा १४७ lipoprotein कणों माइक्रो-आरएनए एचडीएल एलडीएल qpcr निरपेक्ष सामग्री सीक्यू मूल्य स्थानांतरण दर सेलुलर तेज
MicroRNA के साथ देशी Lipoprotein कणों का संवर्धन और उनके निरपेक्ष के बाद दृढ़ संकल्प/
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Axmann, M., Karner, A., Meier, S.… More

Axmann, M., Karner, A., Meier, S. M., Stangl, H., Plochberger, B. Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate. J. Vis. Exp. (147), e59573, doi:10.3791/59573 (2019).

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