Summary
本文提出了一种定量实时聚合酶链反应的方法, 用于测定脂蛋白颗粒的原生微 rna 含量 (绝对相对)。此外, 还演示了一种提高微 rna 水平的方法, 以及一种测定脂蛋白颗粒细胞吸收率的方法。
Abstract
脂蛋白颗粒主要是血液中脂质和胆固醇的转运体。此外, 它们含有少量的非编码微 Rna (miRNA) 链。一般来说, 由于与消息-rna (mRNA) 的相互作用, miRNA 改变了蛋白质表达谱。因此, 了解脂蛋白颗粒的相对和绝对 miRNA 含量对于估计细胞颗粒吸收的生物学效应至关重要。本文提出了一种定量实时聚合酶链反应 (qPCR) 的协议, 用于确定脂蛋白颗粒的绝对 miRNA 含量, 如本原生和富 mirna 蛋白颗粒所示。使用多井微流体阵列卡对相对 miRNA 含量进行量化。此外, 该协议允许科学家估计细胞 miRNA, 从而估计脂蛋白颗粒的吸收率。当使用人工加载 miRNA 的高密度脂蛋白 (HDL) 颗粒时, 可以观察到细胞 miRNA 水平的显著提高, 而与原生 HDL 颗粒的培养由于其相当低的 miRNA 含量而不会产生显著影响。相反, 低密度脂蛋白 (LDL) 颗粒的细胞吸收--既不与原生 miRNA, 也不人工加载--并没有改变细胞 miRNA 水平。
Introduction
脂蛋白颗粒由单层两亲性脂质和胆固醇组成, 包围了一核心的胆固醇酯和甘油三酯脂肪。整个粒子通过膜内嵌入的载蛋白来稳定, 这些载蛋白定义了粒子的生物学功能。脂蛋白颗粒可以根据其各自的增加密度来区分, 从而减小大小, 即极低密度脂蛋白 (VLDL)、中密度脂蛋白 (IDL)、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白颗粒。尽管在血液中运输了不溶于水的成分, 但已经证明 hdl 颗粒携带 mirna 1,2的非编码链。微 rna 是一类短 (通常是二十多个核苷酸) rna 链, 它降解细胞内互补的 mrna 链, 从而改变某些蛋白质的表达谱 3,4,5, 6。此外, 在各种疾病中发现了 miRNA 特征的改变, 因此, 该剖面可作为诊断和预后的生物标志物。通过脂蛋白颗粒在细胞间的 mirna 细胞外迁移可能是细胞间 mRNA 水平调节的另一个机制。为了定量估计生物效应, 需要了解脂蛋白颗粒的绝对和相对 miRNA 含量。
定量实时 PCR 是获取此信息的一种合适且相对快速的方法。因此, 可以计算出相对定量 (RQ) 值, 并可估计不同样品与脂蛋白分数之间的相对差异。多井微流体阵列卡是一种快速且易于使用的方法, 用于确定样品中 Mirna 的相对存在 (相当于 RQ 值)。多井微流体阵列卡由96或384个单独的反应室组成, 用于嵌入微流体装置中的单个 qPCR 反应。每个室包含所需的水解探针和一个单独的 Mirna 的特定 qPCR 引物。其优点是由于标准化、工作流程简单以及移液步骤的减少而缩短了处理时间。此外, 所需的样品量降至最低。与相对定量相比, 绝对 miRNA 含量需要将 qPCR 样本结果与已知 miRNA 链绝对数的标准曲线进行比较。需要注意的是, 由于 miRNA 含量相对较低, 标准的, 甚至单分子敏感的成像技术都是不可行的--用 miRNA 人工浓缩脂蛋白颗粒是细胞研究的必然。脂蛋白颗粒相互作用和 miRNA 转移。关于这一点, DHL 粒子的去解, 然后进行了随后的氧化7 , 从而可以与 mirna 链结合并因此而富集。由于作为低密度脂蛋白颗粒主要成分的 apoB-蛋白的疏水性, 将 LDL 颗粒与 MIRNA 相似富集是不可行的。然而, 通过添加能够穿透脂质膜的极性溶剂二甲基亚硫酸 (DMSO), 低密度脂蛋白颗粒也可以人工加载 miRNA 链。
高速原子力显微镜 (HS-AFM) 是生物标本表征的有力工具, 提供亚纳米空间和亚秒时间分辨率8。因此, 它是一种很适合的技术, 用于质量控制改性脂蛋白颗粒, 因为在近生理环境下可以对被标记的脂蛋白颗粒进行成像。
在这里, 提出了一个基于 qPCR-based 的协议逐步确定单蛋白颗粒和细胞样本的绝对相对 miRNA 含量, 从而可以估计细胞脂蛋白颗粒的吸收率。此外, 还演示了用 miRNA 富集脂蛋白颗粒的方法。该方法可用于脂蛋白含量的一般操作, 从而证明脂蛋白颗粒作为药物传递靶点的适用性。
Protocol
献血已得到维也纳医科大学道德委员会的批准 (EK-Nr. 511-2007, EK-Nr. 1414/2016)。命名是根据发布定量实时 PCR 实验 (MIQE)9 指南的最小信息。
1. 从人体血液中分离脂蛋白颗粒
- 将超离心机预置至4°C。从健康的志愿者身上抽血后过夜。
注: 通常需要三个捐献者, 每个捐献者捐赠80毫升, 以及含有乙二胺四乙酸 (EDTA) 作为抗凝剂的采血管。 - 在4°C 条件下以 2, 000 x g离心 20分钟, 并收获等离子体 (上相);避免剪切力。确定总体积v , 并在必要时使用磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 调整到离心管体积的倍数。测量1毫升3倍的质量, 并计算平均密度.
- 用以下公式计算密度调整所需的碳酸钾 (KBr) 量 (对于以克拉米为单位的所需密度, 使用a = 1.019, 对于 kbr 的具体体积, 使用
= 0.364 ml")。将 KBr 加入等离子体中, 轻轻搅拌, 以避免剪切力, 直到 KBr 完全溶解。
- 测量步骤1.2 中所述的密度, 必要时再调整, 添加更多的 KBr. 填充和密封适合用等离子体超离心的离心机管。避免任何气泡;否则, 管可能会塌陷。根据制造商的说明将管材放置在转子中, 离心机在4°c 下以 214,000, 000 x克的速度放置在20小时内。
- 根据制造商的说明打开管道, 并丢弃含有 VLDL 和 IDL 的上相。确定总体积v , 并在必要时使用 pbs 调整为离心管体积的倍数。
- 确定底部分数的密度.计算密度调整所需的 KBr 量 (使用a = 1.063)。轻轻搅拌, 以避免剪切力, 直到 KBr 溶解。重复步骤1.4。
- 去除并收集含有低密度脂蛋白颗粒的上相。将 LDL 颗粒溶液储存在4°C 的惰性气体气氛中。确定总体积v , 并在必要时使用 pbs 调整为离心管体积的倍数。如步骤1.2 中所述, 确定底部分数的密度.
- 计算密度调整所需的 KBr 量 (使用a = 1.220) 并添加它。轻轻搅拌, 以避免剪切力, 直到 KBr 溶解。重复步骤1.4。
- 去除并收集含有 HDL 颗粒的上相。确定其总体积v , 并在必要时使用 pbs 调整为离心管体积的倍数。确定密度. 建议在4°c 下, 在 214,000, 000 x克的情况下, 在20小时内进行第二离心步骤, 以去除白蛋白。如果需要, 重复步骤1.8。去除并收集含有 HDL 颗粒的上相。
- 制备和预置至少20升的透析缓冲液 (0.9% 氯化钠, 0.1% EDTA [pH 7.4]) 至4°c。湿法透析管 (分子量截止: 12–14 kDa), 并根据制造商的说明添加低密度脂蛋白和高密度脂蛋白颗粒溶液。在4°C 对透析缓冲液的5升进行透析, 并在1、2和4小时后改变缓冲液。
- 24小时后, 从透析管中回收脂蛋白颗粒溶液, 并使用布拉德福德检测11或其他适当的方法确定蛋白质浓度。将 HDL 和 LDL 颗粒溶液储存在4°c 的惰性气体气氛中。
= 0.364 ml")。将 KBr 加入等离子体中, 轻轻搅拌, 以避免剪切力, 直到 KBr 完全溶解。
2. 合成 miRNA 等价物
注: 处理 RNA 寡核苷酸时, 工作不含 rnase。只使用新鲜的一次性塑料耗材, 并始终戴手套, 应经常更换。仅使用无核酸酶解决方案。总是在冰上工作。
- 将从制造商获得的最大力的小瓶向下旋转, 形成冻干合成 miRNA 的颗粒。加入适当体积的 10 mM Tris (羟基甲基) 氨基甲烷 (tris) 缓冲液, pH 7.5, 最终浓度为 10μm (库存浓度) miRNA。
- 轻轻移液器向上和向下几次重新悬挂。在无菌管中制备100Μl 的等价物。如果不立即使用, 请将其存放在-20°c。避免反复解冻和冷冻。
3. HDL 颗粒的重组
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破坏
- 准备缓冲液 A (150 mM 氯化碳, 0.01% edta, 10mm tris任何 hcl [pH 8.0])。将离心机预安装至-10°c。乙醇混合物的前置100毫升:-20°c 时的乙醚 (3:2)。
注意: 在处理乙醚极为易燃且对皮肤有害的情况下, 请佩戴适当的个人防护设备, 并在烟罩中工作。 - 将相当于5毫克的 HDL 颗粒与预含乙醇的50毫升混合: 二乙醚 (3:2) 混合物, 在-20°c 时孵育2小时。在-10°c 下, 以 2, 500 x g 离心10分钟。
- 丢弃上清液, 在预冷乙醇50毫升中重新悬浮颗粒: 通过涡流进行二乙醚混合物, 并在-20°c 下第二次孵育2小时。在-10°c 下, 以 2, 500 x g 再次离心10分钟。
注: 如果需要, 对上清液进行冻干, 以分析 HDL 颗粒脂质分数中的 miRNA 含量。 - 在 n2气体流动下干燥颗粒, 并在250μl 的缓冲液 a 中重新悬浮 (参见步骤 3.1.1)。使用布拉德福德蛋白测定或另一种适当的方法确定蛋白质浓度, 并将其稀释到最终浓度为1毫克的蛋白质/250μl 的缓冲液 A。
注: 协议可以在此处暂停。在惰性气体气氛下, 将溶液在4°c 下过夜。
- 准备缓冲液 A (150 mM 氯化碳, 0.01% edta, 10mm tris任何 hcl [pH 8.0])。将离心机预安装至-10°c。乙醇混合物的前置100毫升:-20°c 时的乙醚 (3:2)。
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重建
- 使用氯仿混合物制备磷脂酰胆碱 (PC) 库存溶液: 甲醇 (2:1), 浓度为5.6 毫克的 Pc/2。同样, 制备胆固醇油酸盐 (5 毫克的可糖) 和胆固醇 (5 毫克的 C/2) 的库存溶液。将所有溶液存放在-20°c。
- 在干净的玻璃管中, 混合500Μl 的 PC、100μl 的 CO 和13.5μl 的 C。这些体积对应于大约摩尔比 100 PC:22 PC:22 c. 在 n2 气体流动下干燥混合物 , 同时旋转管产生均匀的表面层。
注: 协议可以在此处暂停。将玻璃瓶 (如果需要, 可在-20°c 的惰性气体气氛中储存)。 - 在缓冲液 a 中制备新鲜的 30 mM 精矿溶液, 将合成 miRNA (见步骤 2.2) 的一个 (100Μl, 10μm) 与100μl 的精矿溶液混合在一起, 在30°c 下孵育30分钟。
注: 对于负对照实验, 将 miRNA 和/或精胺溶液替换为相同体积的缓冲液 A。 - 从步骤3.2.3 溶解混合物中的 pcco 主混合物。
- 在缓冲液 A 中制备 30 Mg/mml 脱氧胆酸钠的溶液, 并从步骤3.2.4 向溶液中添加50μl。在4°c 下搅拌2小时。
- 从步骤3.1.4 添加25μl 的已失效 HDL 解决方案。该卷对应于大约摩尔比 100 PC:22 PC:22. PC:22 分层 HDL 蛋白。在4°c 下搅拌过夜。
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透析
- 在4°C 下预置至少 15 L 的 PBS。将50克吸附剂珠加入800毫升双蒸馏水 (Ddh2o)中, 搅拌 1分钟, 等待 15分钟, 将上清液脱色, 并用 pbs 重复该过程。
- 湿法透析盒式磁带 (分子量截止:20 kDa) 或适当的透析管, 并根据制造商的说明使用注射器, 从步骤3.2.6 添加溶液。
- 将3.3.1 步骤中的吸附剂珠加入到 PBS 的3升中, 并在4°c 时进行透析。在1小时和2小时后更换缓冲液和珠子。
- 24小时后, 用布拉德福德法回收重组后的 HDL (rHDL) 颗粒溶液, 并测定蛋白质浓度。将 rHDL 颗粒溶液储存在4°C 的惰性气体气氛中。
4. 低密度脂蛋白颗粒的标签
- 制备10倍低密度脂蛋白缓冲液 (1.5 M 氯化钠, 3 mm edta, 1 mM 乙二醇-双 (β-氨基乙醚)-n, N, N ', N '-四乙酸 [EGTA, pH 7.4]), 并将其存放在室温下。
- 在无 rnase 的水中准备一个新的 30 mM 精矿溶液。将合成 mirna 的 aliquot (100Μl, 10μm) (见步骤 2.2) 与100μl 的精矿溶液混合, 在30°c 下孵育30分钟。
注: 对于负对照实验, 将 miRNA 和/或精胺溶液替换为相同体积的 1x LDL 缓冲液。 - 从步骤4.2 开始, 在 mirna/精矿溶液中加入100μl 的 DMSO, 并用 1x LDL 缓冲液的 1.2 mL 进一步稀释。
- 用 PBS 将低密度脂蛋白颗粒溶液稀释到约 4 mgml 的最终浓度, 并用50μl 的 10x LDL 缓冲液混合450Μl。在冰上孵化10分钟。
- 将上一步的低密度脂蛋白粒子溶液与 Mirnaeminininemin/dmso 溶液 (步骤 4.3) 结合起来, 在40°c 下孵育2小时。
- 按照第3.3 节所述进行类似的透析, 并相应地存储标记为低密度脂蛋白的颗粒溶液。
5. 重组/标记脂蛋白颗粒的质量控制
注: 为了进行质量控制, 可以使用 AFM 或电子显微镜 (EM) 等方法来确定脂蛋白颗粒的直径和一般形状。在这里, HS-AFM 被用来测量大小分布的 native\ resedtet"标记的脂蛋白颗粒。
- 在 PBS (1:100–1:1000) 中稀释 hdlldl 颗粒溶液, 并将其孵育5分钟。为了将云母12 切割, 请将胶带压在基板上, 并通过将胶带拉下, 将上云母层移除。
注: 根据特定的 AFM 仪器、观察区域和颗粒的初始浓度, 必须调整稀释系数以观察单个颗粒。 - 孵育后, 用 PBS 冲洗样品, 并在 PBS 和攻丝模式下进行 HS-AFM 成像, 悬臂的弹簧常数不能< 0.2 n/m。建议使用扫描尺寸 <1 μm 2, 并将成像力保持在尽可能低的水平。
- 使用合适的软件确定成像粒子相对于云母表面的高度。
- 将数据加载到 Gwyddion (免费软件) 中, 通过颗粒分析 (按阈值标记颗粒) 检测粒子, 并将阈值设置在基板背景之上。平展图像 (删除多项式背景) 选择 "排除蒙版区域" 选项。
- 导出检测到的粒子的高度值 (各种颗粒特性的分布), 并对所有记录的图像重复这些步骤。通过创建直方图或计算所获得粒子高度的概率密度函数来执行统计分析。
- 重复步骤5.1-5.3 与原生和重组的脂蛋白颗粒, 并比较所获得的结果, 以验证颗粒质量。如果观察到碎片和或砾岩, 请丢弃样品。
6. 细胞培养
- 根据既定的协议 (例如, Lda7-srbi13) 生长粘附细胞, 直到达到融合。
注: 根据实验次数 (建议为每个实验设置的两个腔) 和负控制实验 (建议为两个室, 不添加脂蛋白颗粒), 需要几个独立的室。此外, 还需要两个室来确定细胞数量。 - 用预热的 Hank 平衡盐溶液 (HBSS) 轻轻清洗细胞 3x, 以去除细胞碎片, 并以适当体积的无血清生长介质覆盖细胞层。加入适当体积的脂蛋白颗粒溶液, 使其最终浓度达到50μgml 脂蛋白颗粒。在37°c 和 5% CO2 下孵化 16小时 。
注: 根据实验设计和细胞系, 孵育时间必须进行调整, 以实现细胞 miRNA 水平的充分 (即可测量) 增加。 - 用预热 (37°c) HBSS 轻轻清洗细胞 3x, 去除细胞脱皮蛋白颗粒, 并用适当体积的无血清介质覆盖细胞层。
- 使用适当的方法 (例如, 血细胞仪、自动细胞计数器) 确定至少两个独立腔中的细胞密度, 以便从步骤6.3 开始计算样本体积中的细胞数量。此数字用于规范化。
7. 从细胞和脂蛋白颗粒样品中提取 miRNA
注: 从细胞中提取 miRNA 是使用 miRNA 提取试剂盒进行的, 并进行了以下修改。
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细胞样本
- 将离心机预安装至4°C。在两个含有细胞的腔中加入350μl 的裂解试剂。作为一个负对照实验, 使用一个没有细胞的腔。
注意: 在处理含有苯酚和硫氰酸酯的裂解试剂时, 请佩戴适当的个人防护设备, 并在烟罩中工作。 - 等待 3-5分钟 (取决于细胞系) 进行细胞分离。如有必要, 用明亮场显微镜检查细胞脱离情况。将两个腔的内容集中在一个 1.5 mL 管中。
- 使用 20 G 针和5毫升注射器, 通过吸入和孵育 5分钟, 使样品5x–10x 破坏, 加入140Μl 氯仿 (CHCl 3), 用力晃动 15秒, 孵育 3分钟.
- 在4°C 下, 以 12, 000 x g离心15分钟。然后, 停止冷却离心机。
- 将上水相转移到新的 1.5 mL 管;避免相混合/污染, 因为相间包含 DNA, 而下相含有蛋白质。加入1.5倍的100% 乙醇体积, 通过移液彻底混合。
- 将自旋柱放置在2毫升的收集管中, 并从步骤7.1.5 中加入700Μl 的混合物。在室温下以 8, 000 x g离心, 为15秒。丢弃流经, 然后使用剩余样品量重复此步骤。
- 丢弃流经, 并在自旋柱中添加第一洗涤缓冲液的700μl。在室温下以 8, 000 x g的速度离心15秒。
- 丢弃流经流, 并在旋转柱中添加500μl 的第二洗涤缓冲液。在室温下以 8, 000 x g的速度离心15秒。用2分钟的离心时间重复整个步骤。
- 将旋转柱放入新的2毫升收集管中, 并以全速离心1分钟使膜干燥。
- 将旋转柱放入 1.5 mL 收集管中。在膜的中心加入30微克的无 rnase 水进行洗脱, 并以 8, 000 x克的速度离心 1分钟. 第二次重复这整个步骤, 第一道流成洗作为洗脱液。逆转录酶步骤是在提取后立即完成的;否则, 将提取的 miRNA 样本存储在-20°c。
- 将离心机预安装至4°C。在两个含有细胞的腔中加入350μl 的裂解试剂。作为一个负对照实验, 使用一个没有细胞的腔。
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脂蛋白颗粒
- 将蛋白质浓度最低的样品体积设置为 100μl (= 最大样品体积)。根据此归一化计算其他样品的样本量, 与它们的浓度成反比。对于负控制实验, 请使用100μl 的无 rnase 水。
注: 不需要规范化, 但简化了 qPCR 步骤和分析过程中结果的直接比较。 - 将离心机预安装至4°C。在7.2.1 的步骤样品体积中加入700Μl 裂解试剂。
- 根据7.1.3 的步骤-7.1.10 执行 miRNA 提取。
- 将蛋白质浓度最低的样品体积设置为 100μl (= 最大样品体积)。根据此归一化计算其他样品的样本量, 与它们的浓度成反比。对于负控制实验, 请使用100μl 的无 rnase 水。
8. 逆转录酶
注: miRNA 的逆转录酶是使用逆转录酶试剂盒进行的, 并进行了以下修改。
- 解冻试剂盒试剂和冰上的逆转录酶引物。在冰上的反应管中制备以下主混合物: 45.7μl 的 RNase-free h2o、16.5 微米的10x 逆转录酶、11μl 的逆转录酶、2.1 μL 的 Rnase 抑制剂和1.7 微米的 dNTP 混合物.轻轻混合, 不要涡旋。
注: 刻度取决于样品数量;在这里, 它是为10反应计算。 - 标签 0.2 mL 管相应地并且混合7μl 的主混合从步骤8.1 与5μl 的提取样品从步进7.1.10 和3μl 的逆转录引物。轻轻混合, 离心机不久, 并将混合物储存在冰上。
- 为了对每个细胞系使用相同的细胞号, 减少整体细胞数较高的细胞系的样本量;以此作为剩余体积, 达到无 rnase 水的总样品体积为5μl。
注: 脂蛋白颗粒样本已在步骤7.2.1 中归一化。对于标准曲线制备, 在无 rnase 的水中依次稀释 miRNA 的一个碱基, 并计算每个样本体积的链数。所需的数据点至少是生成的样本量化周期 (cq) 值范围内的五个数据点。通常情况下, 总稀释系数从 10 2 到 106 不等是合适的。 - 将管子放入热环机, 并启动以下程序: 16°c (退火步骤) 30分钟, 42°c 30分钟 (逆转录酶), 85°c (熔融步骤) 5分钟, 4°c 暂停 (存储)。逆转录酶后立即执行 qPCR 步骤;否则, 将从 mirna 样品合成的互补 Dna (cDNA) 存储在-20°c。
9. qPCR
- 使用商业上可获得的检测方法 (见材料表) 进行 cdna (从 mirna 逆转录酶) 的 Qpr, 并进行以下修改。
- 解冻所有试剂 (超混合, 无 Rnase-h2o), cdna 样品 (从步骤 8.4), 和在冰上的引物。在冰上的反应管中制备以下主混合物: 75μl 的超级混合物, 47.5μl 的 Rnase-f2o, 7.56 微米的底漆.轻轻混合, 不要涡旋。
注: 刻度取决于样品数量;在这里, 它是为10反应计算。 - 相应地标记 0.2 mL 管, 并将 cDNA 样品的2Μl 添加到主混合物的13Μl 中, 然后轻轻混合。一般情况下, 测量每个样本2倍。
注: 另外至少需要两个负对照样品--使用无 rnase 的水作为样品。如果校准曲线不是在与样品相同的运行中确定的, 则还需要校准曲线测量的一个样本。它用于将每个运行的过程校准到相同的反应效率。 - 将试管放入 PCR 机器中, 然后启动以下程序: 50°c 时 2分钟, 95°c 时 10分钟, 95°c 时 15秒, 60°c 时60秒。重复程序的最后两个步骤, 最多 50 x。
- 为了使用 PCR 机器的软件包分析 cq值, 请激活动态管归一化 (用于使用每个样本跟踪的二阶导数补偿不同的背景级别) 和噪声斜率校正(噪声级别的规范化)。
注: 负控件的 cq值应高于最高样本 cq 值的几个周期。- 对于校准曲线分析, 请使用软件包的自动查找阈值函数, 分别从每个 mirna 的标准曲线中确定每个 mirna的 c q 的计算阈值, 并使其保持不变对于每个特定的 miRNA。
- 对于样品分析, 如有必要, 可以使用校准曲线样品中的数据点补偿样品运行的不同反应效率。该软件从各自校准曲线测量的阈值级别计算样品的 cq 值。
10. miRNA 含量的计算
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校准曲线
- 从每个 Aliquot 的 miRNA 链的初始数量 (100μl 为 10μm miRNA, 数据表中的分子量) 和随后的串行稀释步骤中计算样品体积中的 miRNA 链数 (步骤8.3 中的5μl 样品体积)。
注: 假设逆转录酶效率为 1, 则此数字等于 cDNA 链的数量。 - 计算步骤9.3 中2Μl 样本体积中 cDNA 链的数量。考虑从而另外的稀释系数 7.5 (2μl 样品容量从步骤9.4 从15μl 样品容量从步骤 8.4)。
- 根据在基-9.5.1 10 半对数图中10.1.2 的阶跃计算的链 n 链数绘制步骤中的 c q 值, 并将数据点与下面的回归曲线 (m = 线性的斜率) 相匹配回归曲线, b = 偏移)。
确认线路的相关系数 (R2) 为 & gt;0.99。
- 从每个 Aliquot 的 miRNA 链的初始数量 (100μl 为 10μm miRNA, 数据表中的分子量) 和随后的串行稀释步骤中计算样品体积中的 miRNA 链数 (步骤8.3 中的5μl 样品体积)。
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脂蛋白颗粒
- 使用测量样本 c q 值 (步骤 9.5.2)和以下公式 (m 和b是特定 mirna 的校准曲线参数) 计算每个样本体积的 mirna 链数。
- 计算样品体积中脂蛋白颗粒的相应数量, 从步骤 7.2.1 (100μl) 的体积、已知浓度以及随后的稀释步骤 (100μl-> 30Μl 样品体积-7.1.10 5μl [稀释 1: 6]在步骤8.4 中的样品总体积为 0.4-2Μl > [稀释 1:7.5] 在步骤9.4 中)。假设 HDL 颗粒的分子量为 250 kDa, 低密度脂蛋白颗粒的分子量为 3 mda, 并且在 miRNA 提取步骤中100% 恢复 miRNA (忽略任何脂质对分子量的贡献, 就会对每个 Mrna 链的数量略有高估脂蛋白颗粒)。
- 将 Mrna 链的数量从步骤10.2.1 上一步计算的粒子数除以每个脂蛋白颗粒的 miRNA 链数。
- 使用测量样本 c q 值 (步骤 9.5.2)和以下公式 (m 和b是特定 mirna 的校准曲线参数) 计算每个样本体积的 mirna 链数。
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细胞
- 根据步骤10.2.1 计算每个样本体积的 miRNA 链数。
- 根据步骤10.2.2 计算样品体积中相应的细胞数, 从步骤6.4 中测量的初始细胞数浓度开始。
- 将 miRNA 链的数量与10.3.1 除以上一步计算的细胞数, 以产生每个细胞的 miRNA 链数。
- 通过用 mirn·粒子比 (步骤10.2.3 修正从负对照实验中获得的细胞的背景 miRNA 水平后, 将前一步的 miRNA 链总量除以, 计算脂蛋白颗粒的吸收率) 和孵化时间 (16小时, 见步骤 6.2)。
11. 多井微流体阵列
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miRNA 萃取
- 按照步骤7中的说明执行 miRNA 提取。
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逆转录酶
- 在冰上解冻逆转录酶引物、逆转录酶试剂盒成分和 MgCl2 (25 mm)。对于8个样本, 混合8μl 的逆转录引物 (10倍), 2.25μl Dntp 与 DNTPs (100 mM), 16.88 微米的逆转录酶 (50 U/μL), 9.00μl 的10倍逆转录酶缓冲液, 10.12 微米的 MgCl2, 1.12Μl 的 rnase 抑制剂 (20 usl)和1μl 的无核酸水。
- 轻轻混合, 离心机短暂。将4.3μl 的逆转录酶反应混合到管中的3.5Μl 中提取的 miRNA 中, 在冰上混合, 旋转 5分钟, 并在冰上孵育 5分钟. 将试管放入热囊机中, 启动以下程序: 16°c 2分钟, 42°c 1分钟, 和50°c 为1秒重复的 40x, 然后, 作为停止反应, 85°c 5分钟, 并保持在 4°c, 直到停止。
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预放大
- 在冰上、反演和离心机上短暂解冻底漆。通过旋转瓶子, 将前置放大主混合物 (2倍) 混合。根据以下指令为8个样品准备预放大反应混合物: 112.5μl 的前放大主混合物 (2x)、22.5μl 的前扩引物和685μl 的无核酸酶水。短暂反转和离心机。
- 将逆转录酶反应产物从步骤11.2.2 与前一步的22.5μl 预放大反应混合物混合, 并短暂反转和离心。将样品在冰上加层5分钟。
- 将管材放入热循环机中, 在以下设置下孵育: 在95°c 下激活 10分钟, 在55°c 退火 2分钟, 在72°c 下延长 2分钟, 在95°c 下重复 12x:变性 15秒, 在60°c 下退火4分钟, 酶在99.9°c 时失活 10分钟, 4°c 保持。
- 向下旋转, 加入7.5μl 的 1x te (pH 值 8.0) 和605μl 的无核酸酶水, 反转, 并离心机。样品可在-20°c 下保存长达1周。
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奇pcr
- 通过旋转瓶子混合主混。为一张卡准备 PCR 反应混合物: 主混料450Μl、无核酸酶水441Μl 和步骤11.3.4 的预扩样品9Μl。短暂反转和离心机。
- 根据制造商的说明, 用100μl 制备的 PCR 反应混合物, 将多井微流体阵列卡的每个填充库加载 1秒, 每次 3分钟. 两个连续离心步骤中的加速度对于正确填充卡非常重要。根据制造商的说明密封卡。
- 使用 PCR 系统与以下程序: 酶激活在 95°c 10分钟, 然后, 重复 40x: 变性在 95°c 15秒, 退火在60°c 延长1分钟。
- 从 PCR 系统导入结果文件, 并使用系统的软件包计算 RQ 值, 其中具有以下分析设置: 最大允许的 cq 值为 40.0, 包含的计算中的最大 cq值和异常值在被排除的复制之间。激活 Benjamini–hochberg 假发现率作为p-值调整选项 (纠正假阳性14 的发生) 和全局归一化作为归一化方法 (使用所有样本的中值阈值)15).
Representative Results
脂蛋白颗粒分离的总体方案
图 1显示了从全血开始的脂蛋白颗粒分离的一般方案, 使用顺序浮选超离心 16.如果需要, 在本协议中可以采集其他脂蛋白颗粒分数, 如 VLDL 和 IDL 粒子。固定角度钛转子与聚丙烯快速密封管相结合, 适用于承受离心力。为了避免管倒塌, 重要的是要避免气泡在管。离心在4°c 下进行, 以最大限度地减少蛋白质降解。通常从三个志愿者的集合献血的血浆 (每个捐献者60-80 毫升) 开始, LDL 和 HDL 颗粒溶液体积为3毫升, 浓度在 1-3 Mg/ml 的范围内可以预期。从献血开始的整个过程大约用了7天。
图 1:脂蛋白分离流程图.在真空容器管中离心健康志愿者的血液并收集血浆 (上相)。在其密度调整为 = 1.019 G/ml 后, 使用 kbr, 离心溶液在 214,000, 000 x g的温度下, 在4°c 下为20小时。在使用 KBr 将底部分数的密度调整为 = 1.03 gml 后, 在4°c 下, 以 214,000, 000 x克的速度再次离心溶液, 为20小时。将含有低密度脂蛋白颗粒的上一部分临时存放在4°c。在使用 KBr 将底部分数的密度调整为 = 1.220 G/ml 后, 在4°c 下, 以 214,000, 000 x克的速度将溶液两次离心, 为20小时。收集含有 HDL 颗粒的上一部分, 透析 HDL 和 LDL 颗粒溶液, 并在1、2和4小时后交换缓冲液。24小时后, 测定蛋白质浓度, 并将样品储存在4°c 的惰性气体下。请点击这里查看此图的较大版本.
HDL 颗粒的重构
HDL 粒子的重组是根据乔纳斯7号先前公布的协议进行的。第一步是对 HDL 颗粒进行解除, 如图 2 a所示, 其次是第二步的缓解 (即重组), 如图 2A所示, 除了使用 mirna 和精胺的混合物外, 还使用了脂质 Pc、co 和 c。我们选择人类成熟的 Mir-223 和 Mir-155, 因为 mir-223 显示出高丰度和 Mir-155 是罕见的脂蛋白颗粒17。通常, 这两个步骤在两个连续的天内执行。在重建过程中, 可以根据需要添加其他亲脂性和两亲性成分。PC、CO、C 的乙醇/乙醚和甲醇/氯仿溶剂的完全蒸发是至关重要的。最后一步-如图 2C所示--是将重组后的高密度脂蛋白颗粒 (rHDL) 与游离脂质/吡 n/洗涤剂分离的透析程序。这需要额外的1-2天。在透析溶液中加入吸收性微珠, 使透析膜的密度梯度保持不变。预计 rHDL 颗粒的产率为50%。
图 2:HDL 粒子重组流程图.(A) 脱脂: 将 hdl 颗粒溶液与预浸乙醇/乙醚混合, 在-20°c 孵育2小时。丢弃上清液后, 重新悬浮颗粒并重复此过程。用 n2 气体干燥颗粒 , 并在缓冲液 a 中重新悬浮。测定浓度后, 将缺失的 HDL 存放在惰性气体气氛中4°c。(B) 重组: 将磷脂酰胆碱 (pc)、胆固醇油酸盐 (co) 和胆固醇 (c) 混合后, 在旋转管时使用 n2 气体蒸发溶剂.在30°c 条件下, 用精矿溶液培养 miRNA 脂肪 30分钟, 加入脱氧胆酸钠, 重新悬浮干脂膜。在4°C 下搅拌样品 2小时, 加入成熟的 HDL 溶液, 并再次搅拌样品, 这一次在惰性气体气氛下的4°C 过夜。(C) 透析: 将含有重组 Hdl (rhdl) 颗粒的b组的溶液转移到透析膜室 (分子量截止: 20kda), 并在4°C 时对 pbs 和吸收剂珠进行透析。在1小时和2小时后交换缓冲液和珠子, 在24小时后回收 rHDL 颗粒溶液, 确定浓度, 并将样品储存在4°C 的惰性气体气氛中。请点击这里查看此图的较大版本.
低密度脂蛋白颗粒的标签
在 Hdl 颗粒中, 用 miRNA 标记低密度脂蛋白颗粒 (图 3) 是不可行的, 因为作为低密度脂蛋白颗粒主要成分的 apoB-蛋白具有疏水性。DMSO 用于低密度脂蛋白颗粒脂质单层的渗透, 从而介导 miRNA 的关联。整个过程用了 1-2天, 产量接近100%。
图 3:低密度脂蛋白颗粒标记流程图.在30°c 条件下, 用精矿溶液培养 miRNA aliquot 30分钟, 并加入 DMSO 和 LDL 缓冲液。用低密度脂蛋白缓冲液在冰上培养 ldl 样品 10分钟, 并加入 Mirnaseminmini/dmso 混合物。在40°c 孵育2小时后, 将溶液转移到透析膜室 (分子量截止:20 kDa), 并在 + 4°c 下对 PBS 和吸收性珠子进行透析。1 & 2 h 后交换缓冲液和珠子, 在24小时后回收标记的低密度脂蛋白颗粒溶液, 确定浓度, 并在 + 4°c 下在惰性气体气氛下储存。请点击这里查看此图的较大版本.
脂蛋白颗粒的质量控制
HS-AFM 可用于检测云母上原生和重组的脂蛋白颗粒的大小和形状。就在使用前, 云母必须是新鲜的切割 (使用胶带去除上层), 以提供一个干净和平坦的表面。在云母上孵育 hdl 颗粒时, 需要调整稀释因子 (和孵育时间) 以观察单个颗粒。聚类不允许确定粒子尺寸。HDL 粒子在云母上是可移动的。在使用常规 AFM 而不是 HS-AFM 时, 需要相应地调整固定化协议 (缓冲液、表面涂层), 以减少颗粒的横向移动性。在扫描样品时, 成像力必须保持在较低的 (攻丝模式), 以避免颗粒的任何变形, 从而影响测量值。为了进行数据分析, 通过阈值算法检测粒子 (例如, 在 Gwyddion:谷物>按阈值标记), 并根据云母表面确定其高度。测量颗粒高度是确定颗粒大小的最精确方法, 因为尖端形状扩大了表观侧向尺寸 (参见图 4中的示例性图像)。计算了粒子高度的概率密度函数 (pdfs), 对各种脂蛋白颗粒的大小分布进行了统计评价和比较。通过对原生和 mirna 标记的 LDL 粒子进行比较, 如图4所示, 可以验证标记的和非标记的 (即本机) 脂蛋白颗粒 (标记为 ldl 颗粒而不添加 mirna依) 之间的主要相似性精矿混合物显示为标签程序本身的控制)。整个过程大约用了1天。
图 4: HS-AFM 测量的流程图和代表性结果.在 PBS (1:10 2-1:103)中稀释 hdll 颗粒样品,并将其孵育 5分钟, 然后用 pbs 仔细冲洗, 去除游离 (非静电吸附) 颗粒。执行 HS-AFM 成像并检查表面上的颗粒密度。在室温下在 PBS 中进行测量。此图的上图显示了过高的粒子密度;底部图像适合进行分析。在统计评价中, 对单粒的高度进行了阈值分析和原生 (黑色曲线) 和重构标记 (红色和绿色曲线) 颗粒的分析。刻度条 = 100 纳米。这一数字已从 Axmann 等人19 人的报告中修改。请点击这里查看此图的较大版本.
miRNA 提取、逆转录酶和 qPCR
使用 mirna 提取试剂盒从人工浓缩的脂蛋白或细胞样本中提取 miRNA, 如图5A 所示。在此, 一个没有 rnase 的环境至关重要。这一步大约采取了 1 h. 提取的 miRNA 样品 (图 5b) 的逆转录酶是使用制造商描述的标准生化程序进行的。这一步大约需要1.5 小时。最后, 利用 qPCR 确定了最后一步获得的 cDNA 量 (图 5C)。一个标准曲线, 将得到的 cq值与绝对 mirna 链数联系起来, 得到了初始样本的绝对 mirna 含量。这大约花费了 2.5 h。
图 5: miRNA 提取、逆转录酶和 qPCR 的流程图.(A) mirna 萃取: 将样品与裂解试剂混合, 然后用注射器抽吸裂解。孵化 5分钟, 加入 CHCl3。用力摇晃 15秒, 孵育3分钟。在4°c 下, 在 1200 x 克离心15分钟后, 收集顶部相, 并与乙醇混合。将溶液转移到自旋柱 (最大体积和 lt;700 μL), 并以 8, 000 x g的速度离心 15秒. 放弃洗脱液, 并与溶液的其余部分重复最后一步。在 8, 000 x克的时候加入第一台洗涤缓冲液和离心机, 在15秒内丢弃洗脱液, 加入第二洗液缓冲液, 以 8, 000 x克的离心机加入 15 s. 重复最后一步, 离心时间为2分钟。以最大速度离心1分钟进一步干燥膜, 用 H2o 和离心机以 80, 000 xg 的速度使膜干燥 1分钟, 将提取的 mirna 样品储存在-20°c。(B) 逆转录酶: 在冰上解冻10倍缓冲液、h2o、dNTP 混合物、抑制剂和酶, 并制备主混合物.将从 a 面板中提取的 mirna 添加到主混合物和逆转录酶引物中, 并使用热环机进行逆转录酶转录。将 cDNA 样本存放在-20°c。(C) qpcr: 在冰上解冻超混合物 h2o 和底漆, 并制备主混合物。将 b 组中的 cdna 添加到主混合物中, 并执行 qPCR。分析数据以获取 cq值并计算样本的绝对 mirna 含量 (详见图 6和具有代表性的结果)。请点击这里查看此图的较大版本.
绝对 miRNA 含量和传输速率
根据样品的 cq值和各自 mirna 的标准曲线计算了原生和人工富集的 hdl 和 LDL 颗粒的绝对 mirna 含量, 如图 6所示。图 6a显示了分析软件计算的数据 (激活了动力管归一化 [用于使用每个样本轨迹的二阶导数补偿不同背景级别] 和噪声斜率校正[噪声级别的规范化])。利用软件包的自动查找阈值函数, 在 qPCR 机测量的归一化荧光信号上确定了标准曲线的 cq值。在此, 软件最大限度地提高了标准曲线拟合的 r 值。每个特定 miRNA 样本分析的阈值水平保持不变。随后, 绘制了 cq值作为 mirna 链数的函数, 并计算了回归线。示例 cq 值是用相同的阈值水平确定的, 如图6b 所示;软件使用每个运行中包含的附加校准曲线样本自动补偿不同 qPCR 运行之间的反应效率差异。利用回归线方程, 可以计算出样品中未知的 miRNA 量。从初始蛋白质浓度和平均分子量 (MWHdl ~ 250 kda) 来估计脂蛋白颗粒数。因此, 没有脂质对分子量的贡献--因此, 每个脂蛋白颗粒的 miRNA 链数量被稍微高估了。此外, 还假定在 miRNA 提取步骤中, miRNA 的回收率为100%。此外, 还测定了 HDL 颗粒孵育前后细胞的 miRNA 含量, 并计算了 miRNA 转移率, 如图6C 所示。
图 6: 计算绝对 mirna 含量和传输速率的流程图.Mir155:mir155 的标准曲线是用无 rna 的水连续稀释的.qPCR 使用软件包的自动查找阈值函数, 为每个序列稀释样品 (测量两次) 得出 cq值。负控制实验 (不添加 miRNA) 产生了 cq值 & gt;35。Cq值的数据点作为每个样本体积的 mirna 链数的函数 (根据初始浓度和串行稀释量计算), 并安装了所提出的方程 (红线, 右图像), 生成 m =-3.36 和B = 42.12。测定 PCR 效率为0.98。误差线是根据实验重复的结果计算的, 小于数据点圆的直径。(B) c q 值的人工浓缩高密度脂蛋白颗粒是用与a 组确定的阈值水平相同的阈值确定的, 并转换为 Qpcr 样本体积中的 mirna 链数。原始样品的 miRNA 的绝对比是根据样品体积中 HDL 颗粒的数量 (浓度) 计算的 (3.2 x10 11个颗粒)。(C) 用人工浓缩的 hdl 颗粒 (50μg/ml) 对细胞样本 (细胞系 Ldla7-srbi) 进行了16小时的培养, 并进行了类似的分析。测定的 cq 值分别为22.5、22.5 和 19.3, 仅适用于细胞, 适用于原生 hdl 培养的细胞, 或用于用 rHDL 颗粒溶液 (均为 50μgml) 培养的细胞。这些值被转换为在面板b中所做的 mirna 链的数量。通过减孵育前的 miRNA 链数量 (8.6 x10 5), 纠正了孵育后的 mirna 链数 (7.3 x 10 6).结果除以样本体积 (3, 100) 中的细胞数 (3, 100)、mirna-粒子比 (1.5 x 10-4) 和潜伏期 (16h)。这通过 miRNA 吸收产生了脂蛋白颗粒的转移率 (每个细胞 240个 HDL 粒子吸收事件, 第二个)。这一数字已从 Axmann 等人19 人的报告中修改。请点击这里查看此图的较大版本.
多井微流体阵列
由于 miRNA 提取的产量较小, 提取的 miRNA 的逆转录酶随后采取了预扩步骤。最后, 执行了 qPCR, 如图 6所示。对于所有步骤, 都使用了制造商描述的标准生化程序。在这里, 为研究 crf 对巨噬细胞18的胆固醇外排的影响而招募的尿毒症患者的 Hdl 颗粒的全球 miRNA 谱的一部分如下 。本研究测量了 HDL 或血清的胆固醇受体容量, 以及 others—17年轻成人尿毒症患者 (CKD 阶段 3-5) 和14名没有相关疾病和匹配对照的青年成人血液透析患者的胆固醇受体。若要分析数据, 使用了默认设置 (最大允许 CT 值: 40.0, 包括计算中的最大 CT 值, 并不包括复制项中的异常值)。P值使用Benjamini-hochberg 假发现率(纠正假阳性的发生) 进行了调整, 并作为归一化方法, 选择了全局归一化, 在所有情况下都找到了常见的检测方法样本, 以使用其中值 c t 进行归一化。在有代表性的结果中, 描述了从尿毒症患者的 Hdl 中分离出的 mirna 的一些 Rna (对照组的 Rq 为 1)。显然, Mir-122 和 Mir-224 在尿毒症患者的 Hdl 中得到了高度表达。整个步骤大约用了1天。
图 7: 多井微流体阵列的流程图和代表性结果.如图 5a所示, 在 mirna 提取后, 将 mirna 样品与逆转录酶引物和含有10倍缓冲液、h2o、dNTP 混合、抑制剂、MgCl2和酶的主混合物混合。在冰上孵育5分钟后, 使用热环机进行逆转录酶。加入前置放大体混合物, 在冰上孵育 5分钟, 并使用热环机进行预放大。加入 0.1 x TE (pH 8.0), 将一个 aliquot 与 PCR 主混合和h2o. 移液剂混合到多井微流体阵列的填充端口中, 以 3, 000 x g 的速度旋转两次, 每次1分钟。使用 PCR 系统执行 qPCR 并分析数据以获得 RQ 值 (此处, 图显示了尿毒症患者 HDL 颗粒的 RQ 值与健康对照组18的比较)。 请点击这里查看此图的较大版本.
Discussion
在这里, 从人类血液中分离脂蛋白颗粒组分和测定其个体 miRNA 含量的情况是逐步描述的。在无 rnase 的环境中工作是至关重要的, 同时处理分离和合成的 Mirn--颗粒嵌入 miRNA 显然可以避免酶降解。由于原生脂蛋白颗粒的 mirna-颗粒比较低, 因此需要用 miRNA 人工富集, 以研究细胞的全息颗粒吸收。因此, 如前面所述的 HDL 粒子的重组, 如前面所述, 被修改为合并 mirna 链。此外, 在这一过程中, 脂质和蛋白质分数的分离使科学家能够检查脂蛋白颗粒19的脂和蛋白质相关成分。以类似的方式, LDL 粒子的标记过程被调整。有趣的是, 精胺--核苷酸的天然稳定剂--的加入并没有影响 mirn·粒子比。需要指出的是, 原则上, 该方法允许在脂蛋白颗粒中注入 miRNA 以外的其他物质。当然, 根据 HDL (直径: 5-12 nm) 和低密度脂蛋白颗粒 (直径: 18-25 nm) 的整体尺寸, 该物质的物理尺寸是有限制的。
在重组/标记脂蛋白颗粒的质量控制方面, HS-AFM 是在单颗粒水平上表征高密度脂蛋白颗粒的一种适用方法。与 EM 相比, 它可以缩短制备时间和近生理条件 (潮湿、室温)。
由于其固有的灵敏度和扩增性, qPCR 是检测低 miRNA 浓度的首选方法。或者, 单分子敏感荧光显微镜, 甚至能够检测到单个分子, 将不适合, 因为低浓度, 例如, 荧光标记 miRNA 链每个粒子。因此, miRNA 链在每个原生脂蛋白颗粒中的比例被发现为10-8。人工浓缩使比率增加了 10, 000倍, 这有助于估计细胞脂蛋白吸收率 (使用本地脂蛋白颗粒19没有发现显著差异)。QPCR 的高灵敏度使我们能够通过测量孵育后 miRNA 链的数量和 mirna 粒子比来确定这种吸收率。应当指出的是, 计算值忽略了细胞降解和 miRNA 的释放, 因此, 至少代表了脂蛋白颗粒吸收率的下限。
在未来, 该方法可以适应转移药物物质 (特别是亲脂性物质) 在细胞中, 并将其生物效应与细胞内浓度 (通过脂蛋白颗粒的吸收率确定) 联系起来。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了奥地利科学基金项目 P29110-b21 的支持, "Hochschulshulbiläumsstiftung der Stadt Wien zur Förderung der Wissenschaft" 项目 H-3065/, 欧洲区域发展基金 (EFRE, IWB2020), 上联邦政府奥地利和 "巴西菲尼齐龙地"。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima L-100 XP | Lipoprotein isolation |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman | TI 55.2 | Lipoprotein isolation |
| Vacutainer (EDTA) | Becton Dickinson | 366643 | Lipoprotein isolation |
| Kaliumbromid | Sigma Aldrich | 2110 | Lipoprotein isolation |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | 342414 | Lipoprotein isolation |
| Ultracentrifuge tube sealer | Beckman | 342428 | Lipoprotein isolation |
| Sodiumchlorid | Carl Roth GmbH | P029.2 | Lipoprotein isolation |
| EDTA | Fisher Scientific | D/0650/50 | Lipoprotein isolation |
| Dialysis tubes, MWCO 12 - 14k | Spectra | 132700 | Lipoprotein isolation |
| synthetic miRNA | microSynth | - | synthetic miRNA |
| TRIS buffer pH 7 | Ambion | AM9850G | synthetic miRNA |
| TRIS buffer pH 8 | Ambion | AM9855G | synthetic miRNA |
| sterile tubes | Carl Roth GmbH | ENE8.1 | synthetic miRNA |
| Photometer | Eppendorf | Eppendorf Biophotometer | Bradford assay |
| Cuvette | Carl Roth GmbH | XK20 | Bradford assay |
| Coomassie G-250 Stain | BioRad GmbH | 161-0786 | Bradford assay |
| Sodiumchlorid | Carl Roth GmbH | 3957.1 | Delipitation |
| EDTA | Fluka Analytical | 03690-100ML | Delipitation |
| TRIS buffer pH 8.0 | Ambion | AM9855G | Delipitation |
| Ethanol 100% | AustrAlco | Ethanol Absolut 99.9% | Delipitation |
| Diethyl ether | Carl Roth GmbH | 3942.1 | Delipitation |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Multifuge X3R | Delipitation |
| Chloroform | Carl Roth GmbH | 3313.1 | Reconstitution |
| Methanol | Carl Roth GmbH | 4627.1 | Reconstitution |
| Phosphatidylcholine | Sigma Aldrich GmbH | P3556-25mg | Reconstitution |
| Cholesterol oleate | Sigma Aldrich GmbH | C-9253-250mg | Reconstitution |
| cholesterol | Sigma Aldrich GmbH | C8667-500mg | Reconstitution |
| glass tubes | Carl Roth GmbH | K226.1 | Reconstitution |
| spermine | Sigma Aldrich GmbH | S3256-1G | Reconstitution |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer comfort | Reconstitution |
| Sodium deoxycholate | Sigma Aldrich GmbH | 3097-25G | Reconstitution |
| Magnetic stir bar | Carl Roth GmbH | 0955.2 | Reconstitution |
| 100µL micropipettes | Carl Roth GmbH | A762.1 | Reconstitution |
| PBS | Carl Roth GmbH | 9143.2 | Dialysis |
| Amberlite XAD-2 beads | Sigma Aldrich GmbH | 10357 | Dialysis |
| Slide-A-Lyzer casette (cut-off 20 kDa) | Thermo Scientific | 66003 | Dialysis |
| Syringe | Braun | 9161406V | Dialysis |
| Syringe needle | Braun | 465 76 83 | Dialysis |
| EGTA | Carl Roth GmbH | 3054.2 | Labeling of LDL particles |
| DMSO | life technologies | D12345 | Labeling of LDL particles |
| Atomic Force Microscope | RIBM | SS-NEX | Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles |
| Muscovite Mica (V-1 Grade) | Christine Gröpl | G250-1/V1 | Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles |
| AFM Cantilever | Nanoworld | USC-F1.2-k0.15 | Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles |
| Gwyddion 2.49 | Czech Metrology Institute | http://gwyddion.net | Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles |
| Chamber slides, Nunc Lab-Tek | VWR | 734-2122 | Cell culture |
| HBSS | Carl Roth GmbH | 9117.1 | Cell culture |
| Cell counter | Omni Life Science GmbH | Casy | Cell culture |
| miRNeasy Mini Kit | QIAGEN | 217004 | miRNA extraction |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | miRNA extraction |
| 20G needle | Braun | Sterican 465 75 19 | miRNA extraction |
| 5ml syringe | Becton Dickinson | 309050 | miRNA extraction |
| PCR cabinet | Esco | PCR-3A1 | Reverse Transcription |
| TaqMan Reverse Transcription Kit | Thermo Scientific | 4366596 | Reverse Transcription |
| Rnase-free water | Carl Roth GmbH | T143 | Reverse Transcription |
| 0.2 ml tubes | Brand | 781305 | Reverse Transcription |
| Centrifuge | Carl Roth GmbH | Microcentrifuge AL | Reverse Transcription |
| Thermocycler | Sensoquest | Labcycler | Reverse Transcription |
| TaqMan Primer | Thermo Scientific | - | qPCR |
| iTaq Universal probe supermix | BioRad GmbH | 1725131 | qPCR |
| PCR machine | Corbett | Rotor-Gene RG-6000 | qPCR |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4366596 | TaqMan Array |
| Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 | Applied Biosystems | 4399966 | TaqMan Array |
| TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems | 4391128 | TaqMan Array |
| Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 | Applied Biosystems | 4399933 | TaqMan Array |
| TaqMan Universal Master Mix II, no UNG | Applied Biosystems | 4440040 | TaqMan Array |
| TaqMan Advanced miRNA Human A Cards | Applied Biosystems | A31805 | TaqMan Array |
| Nuclease-free water | Thermo Scientific | R0581 | TaqMan Array |
| MgCl2 (25mM) | Thermo Scientific | R0971 | TaqMan Array |
| TE, pH 8.0 | Invitrogen | AM9849 | TaqMan Array |
| 7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4351405 | TaqMan Array |
| TaqMan Array Card Sealer | Applied Biosystems | - | TaqMan Array |
References
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