Berikelse av Native lipoprotein partikler med microRNA og påfølgende fastsettelse av deres Absolute/relative microRNA innhold og deres Cellular overføringshastighet

Summary

Her presenteres en kvantitativ sann tids polymerase kjede reaksjons BAS ert protokoll for fastsettelse av det opprinnelige mikro-RNA-innholdet (absolutt/relativ) av lipoprotein-partikler. I tillegg er en metode for å øke Micro-RNA nivå, samt en metode for å bestemme den cellulære opptaket rate av lipoprotein partikler, demonstrert.

Abstract

Lipoprotein partikler er hovedsakelig transportører av lipider og kolesterol i blodet. Videre inneholder de små mengder av tråder av Noncoding microRNA (miRNA). Generelt endrer miRNA protein uttrykks profilen på grunn av interaksjoner med Messenger-RNA (mRNA). Således, kunnskap av det slektning og absolutt miRNA innhold av lipoprotein partikler er vesentlige å anslå den Biological bevirke av Cellular partikkel opptak. Her er en kvantitativ sanntids polymerase kjedere reaksjon (qPCR)-basert protokoll presentert for å bestemme den absolutte miRNA innholdet av lipoprotein partikler-et eksempel vist for innfødte og miRNA-beriket lipoprotein partikler. Den relative miRNA innholdet er kvantifisert bruker multiwell mikrovæskebasert array kort. Videre denne protokollen tillater forskere å anslå mobilnettet miRNA og dermed lipoprotein partikkel opptak rate. En betydelig økning av mobilnettet miRNA nivå er Observer når du bruker high-density lipoprotein (HDL) partikler kunstig lastet med miRNA, mens inkubasjons med innfødte HDL partikler gir ingen signifikant effekt på grunn av deres ganske lav miRNA innhold. I kontrast, mobilnettet opptaket av lav tetthet lipoprotein (LDL) partikler-verken med innfødte miRNA eller kunstig lastet med det-ikke endre mobilnettet miRNA nivå.

Introduction

Lipoprotein partikler er sammensatt av en monolag av amfifile lipider og kolesterol omslutter en kjerne av cholesteryl estere og triglyserider fett. Hele partikkel er stabilisert av membran-embedded Apolipoproteins, som definerer partikkel biologiske funksjonalitet. Lipoprotein partikler kan skilles i henhold til deres respektive økende tetthet og dermed synkende størrelse, nemlig som svært lav tetthet lipoprotein (VLDL), middels-density lipoprotein (IDL), LDL, og HDL-partikler. Til tross for transport av vann-uløselig komponenter i blodet, det har blitt demonstrert at HDL partikler bære Noncoding tråder av miRNA^1,2. Mikro-RNAs er en klasse av korte (vanligvis to dusin nukleotider) RNA tråder, som brytes ned intracellulært komplementære mRNA tråder og dermed endre uttrykket profilen til visse proteiner^{3,4,5, 6}i den. Videre endringer av miRNA profilen har blitt funnet i en rekke sykdommer og dermed profilen er aktuelt som en biomarkør for diagnostisering og prognose. Den ekstracellulære transport av miRNAs mellom celler via lipoprotein partikler kan tjene som en ekstra mekanisme for intercellulære mRNA nivå moduleringshjul. Å kvantitativt anslå biologisk effekt, kunnskap om den absolutte og relative miRNA innholdet av lipoprotein partikler er nødvendig.

Kvantitativ sann tids PCR er en passende og relativt rask metode for å få denne informasjonen. Således, det slektning kvantifisering (RQ) salgsverdi kan beregnet, og slektning forskjellene imellom annerledes eksemplar og lipoprotein brøk er estimable. Multiwell mikrovæskebasert array kort er en rask og enkel å bruke metode for å bestemme den relative tilstedeværelsen (tilsvarer RQ verdi) av miRNAs i en prøve. Multiwell mikrovæskebasert array-kort består av 96 eller 384 individuelle reaksjons kamre for individuelle qPCR-reaksjoner som er innebygd i en mikrovæskebasert enhet. Hvert kammer inneholder den nødvendige hydrolyse sonden og spesifikke qPCR primere for en individuell miRNA. Fordelene er en kort håndteringstid på grunn av standardisering, en enkel arbeidsflyt, og et redusert antall pipettering trinn. Videre er det nødvendige prøvevolumet minimert. I motsetning til den relative kvantifisering, den absolutte miRNA innholdet krever en sammenligning av qPCR sample resultater med standard kurver av kjente absolutte antall miRNA tråder. Det bør bemerkes at, på grunn av deres relativt lave miRNA innhold, standard og dessuten selv enkelt-molekylet sensitive Imaging teknikker er ikke gjennomførbart-den kunstige berikelse av lipoprotein partikler med miRNA er uunngåelig å studere mobilnettet lipoprotein partikkel interaksjon og miRNA overføring. Når det gjelder dette, delipidation av HDL-partikkel etterfulgt med påfølgende relipidation⁷ tillater inkorporering av og dermed berikelse med miRNA tråder. Lignende berikelse av LDL-partikler med miRNA er ikke gjennomførbart på grunn av hydrofobisiteten av apoB-100 protein, som er den viktigste bestanddel av LDL partikkel. Men, ved tilsetning av Polar løsemiddel dimethyl sulfoxide (DMSO), som er i stand til å trenge lipid membraner, kan LDL partikler være kunstig lastet med miRNA tråder også.

High-Speed Atomic Force mikroskopi (HS-AFM) er et kraftig verktøy for karakterisering av biologiske prøver som tilbyr subnanometer romlig og subsecond Temporal oppløsning⁸. Derfor er det en godt egnet teknikk for kvalitetskontroll av modifiserte lipoprotein partikler som innfødt/rekonstituert/merket lipoprotein partikler kan bli avbildet under en nær fysiologiske miljø.

Her, en qPCR-basert protokoll presenteres steg-for-trinn for å bestemme absolutt/relativ miRNA innholdet i lipoprotein partikler og celleprøver, som tillater en estimering av mobilnettet lipoprotein partikkel opptak rate. Videre er en metode for berikelse av lipoprotein partikler med miRNA demonstrert. Denne metoden kan tilpasses for den generelle manipulering av lipoprotein innhold og dermed demonstrerer anvendelsen av lipoprotein partikler som mål for narkotika levering.

Protocol

Blod donasjoner er godkjent av etikk komitéen, Medical University of Vienna (EK-nr. 511/2007, EK-nr. 1414/2016). Nomenklatur er i henhold til minimum informasjon for publisering av kvantitative Real-Time PCR eksperimenter (MIQE)⁹ retningslinjer.

1. lipoprotein partikkel isolering fra humant blod

1. Forkjøle en ultracentrifuge til 4 ° c. Tegn blod fra friske frivillige etter over natten faste.
   Merk: vanligvis kreves er tre givere, donerer 80 mL hver, og blodprøvetakingsrør som inneholder ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) som antikoagulerende.
2. Sentrifuger på 2 000 x g for 20 min ved 4 ° c og høste plasma (øvre fase); unngå skjærkraft. Bestem det totale volumet V og Juster, om nødvendig, til et multiplum av sentrifugering tube volum ved hjelp av fosfat-bufret saltvann (PBS). Mål massen av 1 mL 3x og beregne gjennomsnittlig tetthet ρ.
3. Beregn den nødvendige mengden av kalium bromide (KBr) for tetthet justering med følgende ligningen¹⁰ (for ønsket tetthet i gram/milliliter, bruk A = 1,019, og for det spesifikke volumet av KBr, bruk = 0,364 ml/g). Legg KBr til plasma og rør forsiktig for å unngå skjærkrefter før KBr er helt oppløst.
   
4. Måle tettheten som beskrevet i trinn 1,2 og justere igjen, om nødvendig, ved å legge til flere KBr. fyll og forsegle sentrifugerør egnet for ultracentrifugation med plasma. Unngå eventuelle luftbobler; ellers kan slangen kollapse. Plasser rørene i rotoren i henhold til produsentens anvisninger og sentrifuger ved 214 000 x g i 20 timer ved 4 ° c.
5. Åpne rørene i henhold til produsentens anvisninger, og kast den øvre fasen som inneholder VLDL og IDL. Bestem det totale volumet V og Juster, om nødvendig, til et multiplum av sentrifugering tube volum bruker PBS.
6. Bestem tettheten ρ av den nederste fraksjonen. Beregn den nødvendige mengden av KBr for justering av tetthet (Bruk A = 1,063). Rør forsiktig for å unngå skjærkrefter før KBr er oppløst. Gjenta trinn 1,4.
7. Fjern og samle den øvre fasen som inneholder LDL-partikler. Oppbevar LDL partikkel løsningen under en inert gass atmosfære ved 4 ° c. Bestem det totale volumet V og Juster, om nødvendig, til et multiplum av sentrifugering tube volum bruker PBS. Bestem tettheten ρ for den nederste fraksjonen som beskrevet i trinn 1,2.
8. Beregn den nødvendige mengden av KBr for justering av tetthet (Bruk A = 1,220) og legg den til. Rør forsiktig for å unngå skjærkrefter før KBr er oppløst. Gjenta trinn 1,4.
9. Fjern og samle den øvre fasen som inneholder HDL-partikler. Bestem dens totale volum V og Juster, om nødvendig, til et multiplum av sentrifugering tube volum bruker PBS. Bestem tettheten ρ. Et annet sentrifugering trinn i den øvre fasen ved 214 000 x g for 20 timer ved 4 ° c anbefales å fjerne albumin. Gjenta trinn 1,8 om nødvendig. Fjern og samle den øvre fasen som inneholder HDL-partikler.
10. Forbered og forkjøle minst 20 L av dialyse buffer (0,9% NaCl, 0,1% EDTA [pH 7,4]) til 4 ° c. Prewet dialyse rør (molekylær vekt cut-off: 12 – 14 kDa) og tilsett LDL og HDL partikkel oppløsning i henhold til produsentens instruksjoner. Dialyze mot 5 liter dialyse buffer ved 4 ° c og endre buffer etter 1, 2 og 4 h.
11. Etter 24 h, gjenopprette lipoprotein partikkel løsninger fra dialyse rørene og bestemme proteinkonsentrasjon ved hjelp av Bradford analysen¹¹ eller en annen passende en. Oppbevar HDL og LDL partikkel løsninger under inert gass atmosfære ved 4 ° c.

2. syntetisk miRNA alikvoter

Merk: Når du håndterer RNA-oligonukleotider, arbeid RNase-Free. Fungerer bare med friske, engangsplast forbruksvarer og alltid bruke hansker, som bør endres ofte. Bruk bare nuklease-frie løsninger. Alltid arbeid på isen.

1. Snurr ned hetteglasset ervervet fra produsenten ved maksimal kraft for å danne en pellet av lyofilisert syntetiske miRNA. Legg til et passende volum på 10 mM Tris (hydroksymetyl) aminometan (TRIS) buffer, pH 7,5, for en endelig konsentrasjon på 10 μM (lager konsentrasjon) miRNA.
2. Pipetter forsiktig opp og ned et par ganger for blanding. Forbered alikvoter på 100 μL hver i sterile rør. Oppbevar dem ved-20 ° c Hvis det ikke brukes umiddelbart. Unngå gjentatt tine og frysing.

3. rekonstituering av HDL-partikler

1. Delipidation
   1. Klargjør buffer A (150 mM NaCl, 0,01% EDTA, 10 mM Tris/HCl [pH 8,0]). Forkjøle sentrifuger til-10 ° c. Forkjøle 100 mL av en blanding av etanol: dietyl Eter (3:2) ved-20 ° c.
      FORSIKTIG: Bruk egnet personlig verneutstyr og arbeid i en avtrekksvifte mens du håndterer dietyl Eter da det er ekstremt brannfarlig og skadelig for huden.
   2. Bland et volum tilsvarende 5 mg HDL partikler med 50 mL av forkjøles etanol: dietyl Eter (3:2) blanding og ruge for 2 h ved-20 ° c. Sentrifuger på 2 500 x g for 10 min ved-10 ° c.
   3. Kast supernatanten, resuspend pellet i 50 mL forkjøles etanol: dietyl Eter blanding av virvlingen, og ruge en gang for 2 h ved-20 ° c. Sentrifuger igjen ved 2 500 x g for 10 min ved-10 ° c.
      Merk: Hvis ønskelig, lyophilize supernatanten for en analyse av miRNA innholdet i lipid brøkdel av HDL-partikler.
   4. Tørk pellet under N₂ gass strømning og resuspend det i 250 til og med μL av buffer A (se trinn 3.1.1). Bestem protein konsentrasjonen ved hjelp av Bradford protein analysen eller en annen hensiktsmessig og fortynnet til en endelig konsentrasjon på 1 mg protein/250 μL av buffer A.
      Merk: protokollen kan stanses midlertidig her. Oppbevar løsningen over natten ved 4 ° c i henhold til nøytral gass atmosfære.
2. Rekonstituering
   1. Forbered en phosphatidylcholine (PC) lagerløsning ved hjelp av en blanding av kloroform: metanol (2:1) ved en konsentrasjon på 5,6 mg PC/mL. Tilsvarende forberede lager løsninger av cholesteryl oleat (5 mg CO/mL) og kolesterol (5 mg C/mL). Oppbevar alle løsninger ved-20 ° c.
   2. Bland 500 μL av PC, 100 μL av CO og 13,5 μL av C i et rent glass rør. Disse volumene tilsvarer en omtrentlig molar ratio på 100 PC: 22 CO: 4.8 C. Tørk blandingen under N₂ Gas flow mens roterende røret for å gi en homogen overflatelag.
      Merk: protokollen kan stanses midlertidig her. Oppbevar glass flasken (hvis ønskelig, lagring er mulig) under inert gass atmosfære ved-20 ° c.
   3. Forbered en frisk 30 mM spermin løsning i buffer A. Bland en alikvot (100 μL, 10 μM) av syntetiske miRNA (se trinn 2,2) med 100 μL av spermin oppløsning og ruge i 30 min ved 30 ° c.
      Merk: for negative kontroll eksperimenter, erstatte den miRNA og/eller spermin løsning med samme volum av buffer A.
   4. Løs opp en PC/CO/C Master Mix alikvot i blandingen fra trinn 3.2.3.
   5. Forbered en løsning på 30 mg/mL natrium natriumdeoksykolat i buffer A og tilsett 50 μL i løsningen fra trinn 3.2.4. Rør ved 4 ° c for 2 timer.
   6. Tilsett 250 μL av delipidated HDL-løsning fra trinn 3.1.4. Dette volumet tilsvarer en omtrentlig molar ratio på 100 PC: 22 CO: 4.8 C:1 delipidated HDL proteiner. Rør på 4 ° c over natten.
3. Dialyse
   1. Forkjøle minst 15 L av PBS ved 4 ° c. Tilsett 50 g adsorbent perler til 800 mL dobbelt destillert vann (ddH₂O) og rør i 1 min. Vent 15 min, Dekanter supernatanten, og gjenta prosedyren med PBS.
   2. Prewet dialyse kassetter (molekylær vekt cut-off: 20 kDa) eller egnede dialyse rør og tilsett løsningen fra trinn 3.2.6 ved hjelp av en sprøyte i henhold til produsentens anvisninger.
   3. Tilsett adsorbent perler fra trinn 3.3.1 til 3 L av PBS og dialyze ved 4 ° c. Endre buffer og perler etter 1 t og 2 t.
   4. Etter 24 timer, gjenopprette rekonstituert HDL (rHDL) partikkel oppløsning og bestemme proteinkonsentrasjon ved hjelp av Bradford analysen. Oppbevar rHDL partikkel oppløsning under nøytral gass atmosfære ved 4 ° c.

4. merking av LDL-partikler

1. Forbered 10x LDL buffer (1,5 M NaCl, 3 mM EDTA, 1 mM etylen glykol-BIS (β-aminoethyl Eter)-N, N, N ', N'-Tetraacetic acid [EGTA, pH 7,4]) og oppbevar den ved romtemperatur.
2. Forbered en frisk 30 mM spermin-løsning i RNase-fritt vann. Bland en alikvot (100 μL, 10 μM) av syntetiske miRNA (se trinn 2,2) med 100 μL av spermin oppløsning og ruge i 30 min ved 30 ° c.
   Merk: for negative kontroll eksperimenter, Erstatt miRNA og/eller den spermin løsningen med samme volum av 1x LDL buffer.
3. Tilsett 100 μL av DMSO til miRNA/spermin-løsningen fra trinn 4,2 og fortynne den videre med 1,2 mL 1x LDL buffer.
4. Fortynne oppløsningen av LDL-partikkel til en endelig konsentrasjon på ca. 4 mg/mL med PBS og bland 450 μL med 50 μL av 10x LDL buffer. Ruge den for 10 min på isen.
5. Kombiner LDL partikkel løsningen fra forrige trinn og miRNA/spermin/DMSO-løsningen (fra trinn 4,3) og ruge den for 2 timer ved 40 ° c.
6. Utfør dialyse lignende som beskrevet i Seksjon 3,3 og oppbevar den merkede LDL partikkel løsningen tilsvarende.

5. kvalitetskontroll av rekonstituert/merkede lipoprotein partikler

Merk: for kvalitetskontroll, diameteren og generell form av lipoprotein partikler kan bestemmes ved hjelp, for eksempel, AFM eller elektron mikroskopi (EM). Her, HS-AFM brukes til å måle størrelsesfordelingen av Native/rekonstituert/merket lipoprotein partikler.

1. Fortynne HDL/LDL partikkel oppløsning i PBS (1:100 – 1:1000) og ruge det på fersk kløyvde glimmer i 5 min. For spalte av glimmer¹², trykk tape mot underlaget og fjerne øvre glimmer lag ved å trekke tapen av.
   Merk: avhengig av det bestemte AFM-instrumentet, observasjons området og den første konsentrasjonen av partikler, må fortynningsfaktoren justeres for å observere individuelle partikler.
2. Etter inkubasjons, skyll prøven med PBS og utføre HS-AFM Imaging i PBS og i tappe modus med utkragning å ha våren konstanter av k_cant ≪ 0,2 N/m. Det anbefales å bruke skanne størrelser < 1 μm² og holde bilde styrkene så lave som mulig.
3. Bestem høyden på avbildet partikler med hensyn til glimmer overflate med egnet programvare.
   1. Last inn data i Gwyddion (Freeware), oppdage partikler via korn analyse (Merk korn av terskelen) og sette terskelen over underlaget bakgrunnen. Slå sammen bildet (Fjern polynom bakgrunn) ved å velge alternativet Ekskluder maskerte områder .
   2. Eksporter høydeverdiene for de oppdagede partiklene (distribusjon av ulike egenskaper for korn), og Gjenta disse trinnene for alle innspilte bilder. Utføre statistisk analyse ved enten å opprette histogrammer eller beregne sannsynlighet tetthet funksjoner av oppnådde partikkel høyder.
4. Gjenta trinn 5.1 – 5.3 med innfødte så vel som rekonstituert/merket lipoprotein partikler og sammenligne oppnådde resultater for å verifisere partikkel kvalitet. Hvis du observerer rusk og/eller konglomerater, kast prøven.

6. cellekultur

1. Grow tilhenger celler i henhold til en etablert protokoll (f. eks ldlA7-SRBI¹³) til nå confluency.
   Merk: flere uavhengige kamre avhengig av antall eksperimenter (anbefalt er to kamre per eksperimentell innstilling) og negativ kontroll eksperimenter (anbefales er to kamre uten tilsetning av lipoprotein partikler) er nødvendig. I tillegg kreves to kamre for fastsettelse av celle nummer.
2. Vask cellene forsiktig med prewarmed Hank ' s balanserte saltløsning (HBSS) for å fjerne celle rusk og dekke celle laget med et passende volum av serum fri vekstmedium. Legg til et passende volum av lipoprotein partikkel løsning for å nå en endelig konsentrasjon på 50 mikrogram/mL lipoprotein partikler. Ruge ved 37 ° c og 5% CO₂ for 16 h.
   Merk: avhengig av eksperimentell design og cellelinje, inkubasjonstid må tilpasses for å oppnå en tilstrekkelig (dvs. målbar) økning i mobilnettet miRNA nivå.
3. Vask forsiktig cellene 3x med prewarmed (37 ° c) HBSS for å fjerne celle rusk/lipoprotein partikler og dekke celle laget med et passende volum av serum fritt medium.
4. Bestem celle tettheten ved hjelp av en passende metode (f.eks. hemocytometer, automatisert celle teller) i minst to uavhengige kamre for å beregne antall celler i prøvevolumet fra trinn 6,3. Dette nummeret brukes til normalisering.

7. miRNA ekstraksjon fra celle og lipoprotein partikkel prøver

Merk: ekstraksjon av miRNA fra celler er utført ved hjelp av miRNA Extraction Kit med følgende modifikasjoner.

1. Celleprøver
   1. Forkjøle sentrifuge til 4 ° c. Tilsett 350 μL av lyse Rings reagens hver til to kamre som inneholder celler. Som en negativ kontroll eksperiment, bruke et kammer uten celler.
      FORSIKTIG: Bruk egnet personlig verneutstyr og arbeid i en avtrekksvifte mens du håndterer lyse Rings reagens, da det inneholder fenol og ammoniumthiocyanat.
   2. Vent 3 – 5 min (avhengig av cellelinjen) for celle avløsning. Hvis nødvendig, sjekk for celle avløsning med brightfield mikroskopi. Pool innholdet av de to kamrene i en 1,5 mL tube.
   3. Bruk en 20 G nål og en 5 mL sprøyte, homogenisere/forstyrre prøven 5x – 10x ved aspirasjon og ruge i 5 min. Tilsett 140 μL av kloroform (CHCl₃), rist kraftig i 15 s, og ruge i 3 min.
   4. Sentrifuger ved 12 000 x g for 15 min ved 4 ° c. Etterpå, stopp kjøling av sentrifuger.
   5. Overfør den øvre vandige fasen til en ny 1,5 mL slange; unngå fase miksing/forurensning som Interphase inneholder DNA og den nedre fasen inneholder proteiner. Tilsett 1.5 x volumet av 100% etanol og bland godt av pipettering.
   6. Plasser en spin-kolonne i et 2 mL oppsamlings rør og tilsett 700 μL av blandingen fra trinn 7.1.5. Sentrifuger ved 8 000 x g for 15 s ved romtemperatur. Forkast flyt gjennom og gjenta dette trinnet med det gjenværende prøvevolumet.
   7. Kast strømmen gjennom og tilsett 700 μL av den første vaske bufferen til Spin-kolonnen. Sentrifuger den på 8 000 x g for 15 s ved romtemperatur.
   8. Kast flyten gjennom og tilsett 500 μL av den andre vaske bufferen til Spin-kolonnen. Sentrifuger den på 8 000 x g for 15 s ved romtemperatur. Gjenta hele dette steget en gang til med 2 min av sentrifugering tid.
   9. Plasser spin kolonnen inn i en ny 2 mL samling tube og sentrifuger den i full fart i 1 min for å tørke membranen.
   10. Plasser spin-kolonnen i et 1,5 mL oppsamlings rør. Tilsett 30 μL av RNase-fritt vann i midten av membranen for eluering og sentrifuger det på 8 000 x g i 1 min. Gjenta dette hele steget en gang med den første flyten gjennom som eluering løsning. Den omvendte transkripsjon trinnet er gjort umiddelbart etter ekstraksjon; Hvis ikke, Oppbevar de utpakkede miRNA prøvene ved-20 ° c.
2. Lipoprotein partikler
   1. Sett volumet av prøven med lavest proteinkonsentrasjon til 100 μL (= maksimalt prøvevolum). Beregn prøven volumer av de andre prøvene i henhold til denne normalisering, omvendt til deres konsentrasjon. For negative kontroll eksperimenter, bruk 100 μL av RNase-fritt vann.
      Merk: normalisering er ikke nødvendig, men forenkler direkte sammenligning av resultater under qPCR trinn og analyse.
   2. Forkjøle sentrifuge til 4 ° c. Tilsett 700 μL av lyse Rings reagens i prøvevolumet på trinn 7.2.1.
   3. Utfør miRNA ekstraksjon i henhold til trinn 7.1.3-7.1.10.

8. omvendt transkripsjon

Merk: omvendt transkripsjon av miRNA utføres ved hjelp av en omvendt transkripsjon Kit med følgende modifikasjoner.

1. Tin Kit reagenser og omvendt transkripsjon primere på isen. Forbered følgende Master mix i et reaksjons rør på isen: 45,7 μL av RNase-Free H₂O, 16,5 μL av 10x omvendt transkripsjon buffer, 11 μL av omvendt transkripsjon enzym, 2,1 ΜL av RNase inhibitor, og 1,7 ΜL av dNTP mix. Bland forsiktig, ikke Vortex.
   Merk: skalaen avhenger av prøveantallet. her, er det beregnet for 10 reaksjoner.
2. Label 0,2 mL rør følgelig og bland 7 μL av Master Mix fra trinn 8,1 med 5 μL av den utpakkede prøven fra trinn 7.1.10 og 3 μL av omvendt transkripsjon primer. Bland forsiktig, sentrifuge kort, og lagre blandingen på isen.
3. For å kunne bruke samme celle nummer for hver cellelinje, reduserer du prøvevolumet på cellelinjen med et høyere samlet celle tall. bruke dette som restvolum for å nå det totale prøvevolumet på 5 μL av RNase vann.
   Merk: lipoprotein partikkel prøvene er allerede normalisert i trinn 7.2.1. For standard kurve forberedelse, fortynne en alikvot av miRNA sekvensielt i RNase-fritt vann og beregne antall tråder per sample volum. Nødvendig er minst fem datapunkter innenfor rekkevidden av den resulterende prøven kvantifisering syklus (c_q) verdier. Vanligvis er total fortynning faktorer som spenner fra 10² til 10⁶ egnet.
4. Plasser rørene i thermocycler maskinen og start følgende program: 30 min ved 16 ° c (annealing trinn), 30 min ved 42 ° c (omvendt transkripsjon), 5 min ved 85 ° c (smelte trinn), og pause ved 4 ° c (lagring). Utfør qPCR trinnet umiddelbart etter omvendt transkripsjon; ellers, oppbevar det komplementære DNA (cDNA) syntetisert fra miRNA prøvene ved-20 ° c.

9. qPCR

1. Utfør en qPCR av cDNA (reverse transkribere fra miRNA) ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig analysen (se tabell over materialer) med følgende modifikasjoner.
2. Tin alle reagenser (Supermix, RNase-Free H₂O), cDNA prøver (fra trinn 8,4), og primere på isen. Forbered følgende Master mix i et reaksjons rør på is: 75 μL av Supermix, 47,5 μL av RNase-Free H₂O, 7,56 μL av primer. Bland forsiktig, ikke Vortex.
   Merk: skalaen avhenger av prøveantallet. her, er det beregnet for 10 reaksjoner.
3. Label 0,2 mL rør følgelig og tilsett 2 μL av cDNA-prøven til 13 μL av Master mix og bland forsiktig. Generelt måler du hver prøve 2x.
   Merk: det kreves minst to negative kontroll prøver i tillegg – bruk RNase-fritt vann som en prøve. Hvis kalibreringskurven ikke bestemmes i samme løp som prøven, er det også nødvendig med en prøve fra kalibrerings kurve målingen. Den brukes til å kalibrere hver enkelt kjøre til samme reaksjons effektivitet.
4. Plasser rørene i PCR-maskinen og start følgende program: 2 min ved 50 ° c, 10 min ved 95 ° c, 15 s ved 95 ° c, og 60 s ved 60 ° c. Gjenta de to siste trinnene i programmet opp til 50x.
5. For en analyse av c_q verdier med PCR maskinens programvarepakke, aktivere DynamicTube normalisering (for kompensasjon av ulike bakgrunns nivåer ved hjelp av den andre deriverte av hver prøve spor) og støy Slope Korreksjon (normalisering til støynivå).
   Merk: c_q -verdien for den negative kontrollen bør være flere sykluser høyere enn den høyeste prøven c_q verdi.
   1. For en kalibrering kurve analyse, bestemme terskelen for beregning av c_q for hver Mirna fra standard kurvene for hver Mirna individuelt, ved hjelp av Auto-Finn terskel funksjon av programvarepakken, og holde den konstant for hver spesifikke miRNA.
   2. For eksempel analyse kan du om nødvendig kompensere for ulik reaksjons effektivitet for prøven som kjøres med datapunktet fra eksempelet på kalibreringskurven. Programvaren beregner c_q verdier av prøvene fra terskelen nivå av den respektive kalibrering kurve måling.

10. beregning av miRNA innhold

1. Kalibrerings kurve
   1. Beregn, fra det opprinnelige antallet av miRNA tråder per alikvot (100 μL av 10 μM miRNA, molekylvekt fra dataark) og påfølgende serie fortynning trinn, antall miRNA tråder i prøvevolumet (5 μL prøvevolum fra trinn 8,3).
      Merk: forutsatt en omvendt transkripsjon effektiviteten av 1, er dette tallet lik antall cDNA tråder.
   2. Beregn antall cDNA-tråder i prøvevolumet på 2 μL fra trinn 9,3. Vurder derved den ekstra fortynningsfaktoren 7,5 (2 μL prøvevolum fra trinn 9,4 fra 15 μL prøvevolum fra trinn 8,4).
   3. Plot c_q verdi fra trinn 9.5.1 mot antall tråder n_tråder beregnet i trinn 10.1.2 i en base-10 semilogarithmic plot, og passe datapunktene med følgende regresjon kurve (M = skråningen av den lineære regresjon kurve, B = forskyvning).
      
      Bekreft at korrelasjonskoeffisienten (R²) for linjen er > 0.99.
2. Lipoprotein partikler
   1. Beregn antall miRNA tråder per prøvevolum ved hjelp av den målte prøven c_q verdi (trinn 9.5.2) og følgende ligning (M og B er kalibreringskurven parametrene av de spesifikke miRNA).
      
   2. Beregn tilsvarende antall lipoprotein partikler i prøvevolumet, fra volumet i trinn 7.2.1 (100 μL), dens kjente konsentrasjon, og påfølgende fortynning trinn (100 μL-> 30 μL prøvevolum i trinn 7.1.10-> 5 μL [fortynning 1:6] prøve på 15 μL total volum i trinn 8,4-> 2 μL [fortynning 1:7.5] i trinn 9,4). Anta en molekylvekt på 250 kDa for HDL-partikler og 3 MDa for LDL-partikler og en 100% gjenvinning av miRNA under miRNA utvinning trinn (ignorerer noen lipid bidrag til molekylvekt gir en liten overvurdering av antall miRNA tråder per lipoprotein partikkel).
   3. Del antall miRNA tråder fra trinn 10.2.1 med antall partikler beregnet i forrige trinn for å gi antall miRNA tråder per lipoprotein partikkel.
3. Celler
   1. Beregn antall miRNA tråder per sample volum i henhold til trinn 10.2.1.
   2. Beregn tilsvarende antall celler i prøvevolumet i henhold til trinn 10.2.2, og start med den opprinnelige celle tall konsentrasjonen målt i trinn 6,4.
   3. Dividere antall miRNA tråder fra 10.3.1 av antall celler som er beregnet i forrige trinn for å gi antall miRNA tråder per celle.
   4. Beregn opptaket rate av lipoprotein partikler ved å dele den totale mengden av miRNA tråder fra forrige trinn etter korreksjon for bakgrunnen miRNA nivå av cellene innhentet fra en negativ kontroll eksperiment av miRNA/partikkel-forhold (trinn 10.2.3 ) og inkubasjonstiden (16 timer, se trinn 6,2).

11. Multiwell mikrovæskebasert arrays

1. miRNA utvinning
   1. Utfør miRNA-ekstraksjon som beskrevet i trinn 7.
2. Omvendt transkripsjon
   1. Tine omvendt transkripsjon primere, omvendt transkripsjon Kit komponenter, og MgCl₂ (25 mm) på isen. For åtte prøver, bland 8 μL av omvendt transkripsjon primere (10x), 2,25 μL av dNTPs med dTTP (100 mM), 16,88 μL av revers transkriptase (50 U/μL), 9,00 μL av 10x revers transkripsjon buffer, 10,12 μL av MgCl₂, 1,12 μL av RNase inhibitor (20 U/μL) og 1 μL av nuklease vann.
   2. Bland forsiktig og sentrifuger kort. Tilsett 4,3 μL av omvendt transkripsjon reaksjon Mix til 3,5 μL av utpakkede miRNA i et rør og bland, spinne ned, og ruge på isen i 5 min. Plasser rørene i en thermocycler maskin og start følgende program: 16 ° c i 2 min, 42 ° c i 1 min og 50 ° c i 1 s gjentatte 40x totalt, og deretter, som en stopp reaksjon, 85 ° c i 5 min og hold ved 4 ° c til den stoppes.
3. Preamplification
   1. Tin primere på isen og Inverter og sentrifuger kort. Bland den preamplification Master mix (2x) ved å virvler flasken. Forbered den preamplification reaksjonsblandingen i henhold til følgende instruksjon for åtte prøver: 112,5 μL av preamplification Master mix (2x), 22,5 μL av preamplification primere og 67,5 μL av nuklease vann. Inverter og sentrifuger kort.
   2. Bland 2,5 μL av det omvendte transkripsjon reaksjons produktet fra trinn 11.2.2 med 22,5 μL av preamplification reaksjons miks fra forrige trinn og Inverter og sentrifuger kort. Ruge prøvene på isen i 5 min.
   3. Plasser rørene i en thermocycler maskin og ruge på følgende innstillinger: enzym aktivering ved 95 ° c i 10 min, annealing ved 55 ° c i 2 min, som strekker seg ved 72 ° c i 2 min, gjentatt 12x: denaturering ved 95 ° c for 15 s og annealing/forlengelse ved 60 ° c i 4 min , kan deaktivering av enzym ved 99,9 ° c i 10 min, og 4 ° c på vent.
   4. Snurr ned, tilsett 7,5 μL av 1x TE (pH 8,0) og 67,5 μL av nuklease vann, inverter og sentrifuger kort. Prøvene kan oppbevares ved-20 ° c i opp til 1 uke.
4. qPCR
   1. Bland Master Mix ved å virvlende flasken. Klargjør PCR-reaksjonen for ett kort: 450 μL av Master mix, 441 μL av nuklease vann og 9 μL av preamplification prøven fra trinn 11.3.4. Inverter og sentrifuger kort.
   2. Legg hvert fyll reservoar av multiwell mikrovæskebasert med 100 μL av forberedt PCR reaksjons miks i henhold til produsentens anvisninger og sentrifuge 2x i 1 min ved 3 000 x g. Akselerasjonen under de to påfølgende sentrifugering trinnene er viktig for riktig fylling av kortet. Forsegle kortet i henhold til produsentens instruksjoner.
   3. Bruk et PCR-system med følgende program: enzym aktivering ved 95 ° c i 10 min og deretter gjentatt 40x: denaturering ved 95 ° c i 15 s og annealing/forlenget ved 60 ° c i 1 min.
   4. Importer resultatfilen fra PCR-systemet og Beregn RQ-verdiene ved hjelp av systemets programvarepakke med følgende analyse innstillinger: en maksimum tillatte c_q -verdi på 40,0, maksimalt c_q -verdier i beregninger inkludert, og outliers blant replikerer ekskludert. Aktiver Benjamini – Hochberg false Discovery rate som alternativ for p-verdijustering (korrigering av forekomsten av falske positiver¹⁴) og global normalisering som normalisering metode (ved hjelp av en median terskelverdi for alle prøvene ¹⁵).

Representative Results

En generell ordning av lipoprotein partikkel isolering
Figur 1 viser den generelle ordningen med lipoprotein partikkel isolasjon fra hele blod, ved hjelp av sekvensiell flyte ultracentrifugation¹⁶. Hvis ønskelig, kan andre lipoprotein partikkel fraksjoner som VLDL og IDL partikler høstes under denne protokollen. Den faste vinkelen Titan rotoren i kombinasjon med polypropylen hurtig Forseglings rør er egnet til å tåle de sentrifugering kreftene. For å unngå rør kollaps, er det viktig å unngå luftbobler i røret. Sentrifugering utføres ved 4 ° c for å minimere protein forringelse. Vanligvis starter fra plasma (60-80 mL per giver) av samlede blod donasjoner av tre frivillige, en avkastning av LDL og HDL partikkel oppløsning volumer på 3 mL hver med konsentrasjoner i området 1-3 mg/mL kan forventes. Hele prosedyren, som starter fra blod donasjon, tok rundt 7 dager.

Figur 1: Flytdiagram av lipoprotein isolasjon. Sentrifuger blod fra friske frivillige i vakuum container rør og samle plasma (øvre fase). Etter justeringen av tettheten til ρ = 1,019 g/ml med KBr, sentrifuger oppløsningen ved 214 000 x g i 20 timer ved 4 ° c. Etter justering av tettheten av den nederste Brøkdelen til ρ = 1,063 g/ml ved hjelp av KBr, sentrifuger oppløsningen på nytt ved 214 000 x g for 20 timer ved 4 ° c. Oppbevar den øvre fraksjonen med LDL-partikler midlertidig ved 4 ° c. Etter justeringen av tettheten av den nederste Brøkdelen til ρ = 1,220 g/ml ved hjelp av KBr, sentrifuger oppløsningen to ganger ved 214 000 x g for 20 timer ved 4 ° c. Samle den øvre fraksjonen som inneholder HDL-partikler, dialyze både HDL og LDL partikkel løsninger og utveksle buffer etter 1, 2 og 4 h. Etter 24 timer, Bestem protein konsentrasjonen og oppbevar prøvene under inert gass ved 4 ° c. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Rekonstituering av HDL-partikler
Rekonstituering av HDL-partikler ble utført i henhold til en protokoll tidligere utgitt av Jonas⁷. Det første trinnet var delipidation av HDL-partikler som vist i figur 2a, etterfulgt av det andre trinnet i relipidation (dvs. rekonstituering) som vist i figur 2b, ved hjelp av lipid PC, co, og C i tillegg til en blanding av miRNA og spermin. Vi valgte Human modne miR-223 og miR-155 fordi miR-223 viser en høy overflod og miR-155 er sjelden i lipoprotein partikler¹⁷. Vanligvis utføres begge trinnene på to sekvensielle dager. Under rekonstituering kan andre lipofile og/eller amfifile komponenter legges til etter ønske. Den komplette fordampning av etanol/dietyl Eter og metanol/kloroform løsemiddel av PC, CO, og C var kritisk. Det siste trinnet-som vist i figur 2C-var dialyse prosedyren for å SKILLE rekonstituert HDL partikler (rHDL) fra fri lipider/miRNA/vaskemiddel. Dette tok ytterligere 1-2 dager. Tilsetning av absorberende perler til dialyse løsningen holdt tettheten gradient langs dialyse membranen konstant. En avkastning på 50% av rHDL-partikler kan forventes.

Figur 2: Flytskjema av HDL partikkel rekonstituering. (A) Delipidation: Bland HDL partikkel oppløsning med forkjøles etanol/dietyl Eter og ruge ved-20 ° c for 2 h. Etter å kaste supernatanten, resuspend pellet og gjenta prosedyren. Tørk pellet med N₂ gass og resuspend den i buffer A. Etter fastsettelse av konsentrasjonen, lagre delipidated HDL under inert gass atmosfære ved 4 ° c. (B) rekonstituering: etter blanding fosfatidyl-kolin (PC), cholesteryl OLEAT (co), og kolesterol (C), fordamper løsningsmidlet ved hjelp av N₂ gass mens du roterer røret. Ruge den miRNA alikvot med spermin løsning for 30 min ved 30 ° c, tilsett natrium natriumdeoksykolat og resuspend tørket lipid film. Rør prøven for 2 t ved 4 ° c, tilsett delipidated HDL-løsning, og rør prøven igjen, denne gangen over natten ved 4 ° c under nøytral gass atmosfære. (C) dialyse: Overfør oppløsningen fra panel B som inneholder rekonstituerte HDL-partikler (rHDL) til et membran kammer med dialyse (molekylvekt cut-off: 20 KDA) og dialyze mot PBS og absorberende perler ved 4 ° c. Utveksle buffer og perler etter 1 h og 2 h. Gjenopprett rHDL partikkel oppløsning etter 24 timer, Bestem konsentrasjonen og oppbevar prøven under inert gass atmosfære ved 4 ° c. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Merking av LDL-partikler
Merkingen av LDL-partikler med miRNA (Figur 3) som DEMONSTRERT for HDL-partikler var ikke gjennomførbart på grunn av Hydrofobisiteten av apoB-100 protein, som er den viktigste bestanddel av LDL partikkel. DMSO ble brukt for inntrengning av lipid monolag av LDL partikkel og dermed mediert av miRNA foreningen. Hele prosedyren tok 1-2 dager med en yield nær 100%.

Figur 3: Flytskjema av LDL partikkel merking. Ruge den miRNA alikvot med spermin løsning for 30 min ved 30 ° c og tilsett DMSO og LDL buffer. Ruge LDL sample vidd LDL buffer for 10 min på isen og legge miRNA/spermin/DMSO blanding. Etter inkubasjons ved 40 ° c i 2 timer, Overfør løsningen til et membran kammer med dialyse (molekylvekt cut-off: 20 kDa) og dialyze mot PBS og absorberende perler ved + 4 ° c. Exchange buffer og perler etter 1 & 2 h. gjenopprette merket LDL partikkel oppløsning etter 24 timer, bestemme konsentrasjonen og oppbevares under inert gass atmosfære ved + 4 ° c. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Kvalitetskontroll av lipoprotein partikler
HS-AFM kan brukes til å undersøke størrelsen og formen på innfødte og rekonstituert/merket lipoprotein partikler på glimmer. Like før bruk, glimmer må være fersk kløyvde (bruk selvklebende tape for å fjerne det øvre laget [s]) for å gi en ren og flat overflate. Når incubating HDL/LDL partikler på glimmer, den fortynning faktor (og/eller inkubasjonstid) må justeres for å observere individuelle partikler. Klynger tillater ikke en bestemmelse av partikkel dimensjoner. HDL partikler er mobile på glimmer. Når du bruker konvensjonelle AFM i stedet for HS-AFM, den immobilisering protokollen må tilpasses tilsvarende (buffer, overflatebelegg) for å redusere lateral partikkel mobilitet. Når prøven skannes, må bilde styrken holdes lav (tappe modus) for å unngå deformasjon av partiklene, noe som følgelig vil påvirke de målte verdiene. For dataanalyse ble partikler oppdaget via en terskel algoritme (f. eks, i Gwyddion: korn > merke av terskel) og deres høyde ble bestemt med hensyn til glimmer overflaten. Måle partikler ' høyde er den mest presise måten å bestemme partikkelstørrelser, som den tilsynelatende laterale dimensjonene er utvidet med spissen form (se eksemplarisk bilder i Figur 4). Sannsynlighet tetthet funksjoner (PDF-filer) av partikkel høyder ble beregnet for statistisk evaluering og sammenligning av størrelse distribusjoner av de ulike lipoprotein partikler. En sammenligning av innfødte og miRNA-merket LDL partikler som vist i Figur 4 gjør det mulig verifisere rektor likheten mellom merket og nonlabeled (dvs. native) lipoprotein partikler (merket LDL partikler uten tillegg av miRNA/ spermin blandinger vises som en kontroll for selve merkings prosedyren). Hele prosedyren tok ca 1 dag.

Figur 4: flytdiagram og representative resultater av HS-AFM målinger. Fortynne HDL/LDL partikkel prøven i PBS (1:10²-1:10³) og ruge det på fersk kløyvde glimmer i 5 min, etterfulgt av en forsiktig skylling med PBS å fjerne gratis (not elektrostatisk adsorberes) partikler. Utføre HS-AFM Imaging og sjekke partikkel tettheten på overflaten. Utfør målingene i PBS ved romtemperatur. Det øverste bildet av denne figuren viser en for høy partikkel tetthet; det nederste bildet er egnet for analyse. Høyden på enkeltpartikler ble analysert etter terskelverdi og innfødt (svart kurve) og rekonstituert/merket (rød og grønn kurve) partikler ble sammenlignet i en statistisk evaluering. Skalaen bar = 100 NM. Dette tallet har blitt modifisert fra Axmann et al.¹⁹. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

miRNA utvinning, omvendt transkripsjon, og qPCR
Ekstraksjon av miRNA fra native/kunstig beriket lipoprotein eller celleprøver ble utført ved hjelp av en miRNA Extraction kit som vist i figur 5a. Et RNase-fritt miljø var herved kritisk. Dette trinnet tok ca 1 t. Reverse transkripsjon av utdraget miRNA prøven (figur 5B) ble utført ved hjelp av standard biokjemiske prosedyrer som beskrevet av produsenten. Dette trinnet tok ca 1,5 h. Til slutt ble mengden cDNA innhentet i løpet av det siste trinnet bestemt ved hjelp av qPCR (figur 5c). En standard kurve, som knytter de oppnådde c_q verdier til den absolutte Mirna strand nummer, gitt den absolutte Mirna innholdet i den første prøven. Dette tok ca 2,5 h.

Figur 5: flytdiagram av miRNA utvinning, revers transkripsjon, og qPCR. (A) miRNA ekstraksjon: Bland prøven med lyse Rings reagens og lyse den via aspirasjon ved hjelp av en sprøyte. Ruge i 5 min og legge CHCl₃. Rist kraftig i 15 s og ruge i 3 min. Etter sentrifugering ved 1 200 x g i 15 min ved 4 ° c, samle den øverste fasen og bland den med etanol. Overfør løsningen til en spin-kolonne (maksimalt volum < 700 μL) og sentrifuger den ved 8 000 x g for 15 s. kast eluent og gjenta det siste trinnet med resten av løsningen. Tilsett den første vaske bufferen og sentrifuger på 8 000 x g for 15 s. kast eluent, tilsett den andre vaske bufferen, og sentrifuger ved 8 000 x g i 15 s. gjenta det siste trinnet med en sentrifugering tid på 2 min. Videre tørr membranen via sentrifugering med maksimal hastighet i 1 min. Eluere den miRNA med H₂O og sentrifuger på 80 000 x g for 1 min. lagre den utpakkede miRNA prøven ved-20 ° c. (B) omvendt transkripsjon: tine den 10x buffer, H₂O, dNTP mix, inhibitor, og enzymet på is og forberede Master mix. Legg til utdraget miRNA fra panel A til Master mix og omvendt transkripsjon primer og utføre omvendt transkripsjon ved hjelp av en thermocycler maskin. Oppbevar cDNA-prøven ved-20 ° c. (C) QPCR: Tin Supermix, H₂O, og primer på isen og forberede Master mix. Legg til cDNA fra panel B til Master mix og utfør qPCR. Analysere data for å få c_q verdier og beregne absolutt miRNA innholdet i utvalget (se figur 6 og representative resultater for detaljer). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Absolute miRNA innhold og overføringshastighet
Den absolutte miRNA innhold av innfødte og kunstig beriket HDL og LDL-partikler ble beregnet fra c_q verdier av prøvene og en standard kurve av de respektive miRNA som vist i figur 6. Figur 6a viser data som beregnet av analyseprogramvaren (med aktivert DynamicTube normalisering [for kompensasjon av ulike bakgrunns nivåer ved hjelp av den andre deriverte av hver prøve spor] og støy skråningen korreksjon [normalisering til støynivå]). c_q verdier av standard kurver ble bestemt ved hjelp av Auto-Finn terskel funksjon av programvarepakken på normalisert fluorescens signal målt ved qPCR maskinen. Programvaren har herved maksimert R-verdien for tilpasning av standardkurven. Terskel nivået ble holdt konstant for hver spesifikke miRNA prøveanalyse. Deretter ble c_q verdiene plottet som en funksjon av antall miRNA tråder, og en regresjon linje ble beregnet. Eksempel c_q verdier ble bestemt med samme terskel nivå som vist i figur 6b; reaksjons effektivitet forskjellene mellom ulike qPCR kjører ble kompensert automatisk av programvaren ved hjelp av en ekstra kalibrering kurve prøve inkludert i hver kjøring. Hvis du bruker formelen for regresjon, kan den ukjente mengden av miRNA i eksemplet beregnes. Den lipoprotein partikkel tall ble anslått fra den første proteinkonsentrasjon og gjennomsnittlig molekylvekt (MW_HDL ~ 250 KDA). Derved ble ingen lipid bidrag til Molekylvekten antatt-dermed antall miRNA tråder per lipoprotein partikkel var litt overvurdert. Videre ble en 100% utvinningsgrad av miRNA under miRNA utvinnings trinnet antatt. Videre, den miRNA innholdet i cellene før og etter inkubasjons med HDL-partikler ble bestemt og miRNA overføringshastighet ble beregnet som vist i figur 6C.

Figur 6: flytdiagram for beregning av absolutt miRNA innhold og overføringshastighet. (A) standard kurve for miR-155: en mir-155-alikvot (100 μL, 10 μM) ble serielt FORTYNNET med RNA-fritt vann som indikert. qPCR gitt c_q verdier for hver seriell fortynning prøve (målt to ganger) ved hjelp av Auto-Finn terskel funksjon av programvarepakken. Negativ kontroll eksperimenter (uten tillegg av miRNA) gitt c_q verdier på > 35. Data punkter av c_q verdier som funksjon av antall miRNA tråder per sample volum (beregnet fra den innledende konsentrasjon og seriell fortynninger) ble utstyrt med den presenterte ligningen (rød linje, høyre bilde), noe som gir M =-3,36 og B = 42,12. Den fastsatte PCR-effektiviteten var 0,98. Feilfeltene ble beregnet ut fra resultatene av eksperimentelle repetisjoner og var mindre enn diameteren av datapunkt sirkelen. (B) c_q verdier av Native/kunstig beriket HDL partikler ble bestemt med samme terskel nivå som bestemmes i panel A og konvertert til antall miRNA tråder i qPCR sample volum. Den absolutte forholdet mellom miRNA av den opprinnelige prøven ble beregnet fra antall (konsentrasjon) av HDL-partikler i prøvevolumet (3,2 x 10¹¹ partikler). (C) celleprøver (cellelinje LDLA7-SRBI) ble inkubert for 16 timer med kunstig beriket HDL-partikler (50 μg/ml) og analyseres på samme måte. De bestemte c_q verdiene var 22,5, 22,5, og 19,3 for celler bare, for celler inkubert med native HDL, eller for celler inkubert med rHDL partikkel oppløsning (både 50 μg/ml), henholdsvis. Disse verdiene ble konvertert til antall miRNA tråder som gjøres i panel B. Antall miRNA tråder etter inkubasjons (7,3 x 10⁶) ble korrigert ved subtraksjon av antall miRNA tråder før inkubasjons (8,6 x 10⁵). Resultatet ble delt på antall celler i prøvevolumet (3 100), den miRNA-partikkel-ratio (1,5 x 10^-4), og inkubasjons tidsperiode (16 h). Dette ga overføringshastigheten til lipoprotein partikler via miRNA opptak (240 HDL partikkel opptak hendelser per celle og andre). Dette tallet har blitt modifisert fra Axmann et al.¹⁹. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Multiwell mikrovæskebasert array
På grunn av små rentene av miRNA utvinning, omvendt transkripsjon av utdraget miRNA ble etterfulgt av en preamplification trinn. Til slutt, qPCR, som vist i figur 6, ble utført. For alle trinn, standard biokjemiske prosedyrer ble brukt som beskrevet av produsenten. Her, en del av den globale miRNA profilen på HDL partikler av uremisk pasienter rekruttert for en studie på påvirkning av CRF på kolesterol utstrømming fra makrofager¹⁸ vises. I denne studien, kolesterol Acceptor kapasitet av HDL eller serum i-foruten andre-17 unge voksne uremisk pasienter (CKD stadier 3-5) og 14 unge voksne hemodialyse pasienter uten tilknyttede sykdommer og matchet kontroller ble målt. For å analysere dataene ble standardinnstillingene brukt (maksimalt tillatt CT-verdi: 40,0, inkludert maksimale CT-verdier i beregninger og ekskludert outliers blant replikerer). P-verdier ble justert ved hjelp av Benjamini-Hochberg false Discovery rate (korrigering av forekomsten av falske positiver), og som normalisering metoden, global normalisering ble valgt, som finner felles analyser blant alle prøver å bruke sin median C_T for normalisering. I representative resultatene er noen RQs av miRNAs isolert fra HDL av uremisk pasienter avbildet (RQs av kontroller er 1). Selvfølgelig, miR-122 og miR-224 er svært uttrykt i HDL av uremisk pasienter. Hele dette trinnet tok ca 1 dag.

Figur 7: flytdiagram og representative resultater av multiwell mikrovæskebasert array. Etter miRNA ekstraksjon som vist i figur 5a, bland den miRNA prøve med omvendt transkripsjon primer og en Master Mix som inneholder 10x buffer, H₂O, dNTP mix, inhibitor, MgCl₂, og enzym. Etter inkubasjons på isen i 5 min, utføre omvendt transkripsjon ved hjelp av en thermocycler maskin. Sammenlegge det preamplification kontroll blande, ruge for 5 min opp på isen, og utføre preamplification benytter en thermocycler apparat. Tilsett 0,1 x TE (pH 8,0) og bland en alikvot med PCR Master mix og H₂O. Pipetter PCR-reaksjonen blandes inn i fyll porten på multiwell mikrovæskebasert array og spinn to ganger ved 3 000 x g for 1 min hver. Utfør qPCR ved hjelp av et PCR-system og analyser dataene for å gi RQ-verdier (her viser figuren RQ-verdier for HDL-partikler av uremia pasienter sammenlignet med en sunn kontrollgruppe¹⁸).  Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Her beskrives isolasjonen av lipoprotein partikkel fraksjoner fra humant blod og fastsettelse av deres individuelle miRNA innhold trinn for trinn. Det er viktig å arbeide i et RNase-fritt miljø mens håndtering isolert og syntetisert miRNA-partikkel-embedded miRNA er åpenbart skjermet fra enzymatisk degradering. Som miRNA/partikkel ratio av innfødte lipoprotein partikler er ganske lav, kunstig berikelse med miRNA er nødvendig for å studere Holo partikkel opptaket av celler. Derved er rekonstituering av HDL-partikler som beskrevet tidligere⁷ modifisert til å innlemme miRNA tråder. I tillegg separasjon av lipid og protein brøkdel i denne prosedyren gjør det mulig for forskere å undersøke lipid-og protein-tilknyttede komponenter i lipoprotein partikkel¹⁹. På en lignende måte, er merkings prosedyren av LDL-partikler tilpasset. Interessant, tillegg av spermin-en naturlig stabilisator av nukleotider-ikke påvirke den miRNA/partikkel ratio. Det bør bemerkes at, i prinsippet, tillater metoden infolding av andre stoffer enn miRNA innenfor en lipoprotein partikkel. Selvfølgelig, det er en grense med hensyn til den fysiske størrelsen på stoffet basert på den totale størrelsen på HDL (diameter: 5-12 NM) og LDL partikler (diameter: 18-25 NM).

Når det gjelder kvalitetskontroll av rekonstituert/merket lipoprotein partikler, HS-AFM er en anvendelig metode for å karakterisere HDL/LDL partikler på enkelt partikkel nivå. I forhold til EM, gir det for kortere Forberedelses tider og nær fysiologiske forhold (våt, romtemperatur).

På grunn av sin iboende følsomhet og forsterkning, er qPCR metoden for valg for å oppdage lav miRNA konsentrasjoner. Alternativt, enkelt-molekyl følsom fluorescens mikroskopi, som er i stand til å oppdage selv individuelle molekyler, ville ikke være egnet på grunn av den lave konsentrasjoner av for eksempel fluorescensmerkete merket miRNA tråder per partikkel. Dermed forholdet mellom miRNA tråder per native lipoprotein partikkel er funnet å være 10^-8. Kunstig berikelse øker forholdet med en faktor på 10 000, som forenkler estimering av Cellular lipoprotein opptaket rate (ingen signifikant forskjell oppdages ved hjelp native lipoprotein partikler ¹⁹). Den høye følsomheten til qPCR gjør det mulig å fastslå dette opptaket rate ved å måle antall miRNA tråder etter inkubasjonstid og miRNA/partikkel ratio. Det bør bemerkes at den beregnede verdien ignorerer cellulær degradering og frigjøring av miRNA og dermed representerer minst en nedre grense for lipoprotein partikkel opptak ratio.

I fremtiden kan metoden tilpasses til å overføre farmasøytiske stoffer (spesielt også lipofile seg) i celler og relatere deres biologiske effekten til intracellulære konsentrasjon (bestemmes via opptaket rate av lipoprotein partikler).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ultracentrifuge	Beckman	Optima L-100 XP	Lipoprotein isolation
Ultracentrifuge rotor	Beckman	TI 55.2	Lipoprotein isolation
Vacutainer (EDTA)	Becton Dickinson	366643	Lipoprotein isolation
Kaliumbromid	Sigma Aldrich	2110	Lipoprotein isolation
Ultracentrifuge tubes	Beckman	342414	Lipoprotein isolation
Ultracentrifuge tube sealer	Beckman	342428	Lipoprotein isolation
Sodiumchlorid	Carl Roth GmbH	P029.2	Lipoprotein isolation
EDTA	Fisher Scientific	D/0650/50	Lipoprotein isolation
Dialysis tubes, MWCO 12 - 14k	Spectra	132700	Lipoprotein isolation
synthetic miRNA	microSynth	-	synthetic miRNA
TRIS buffer pH 7	Ambion	AM9850G	synthetic miRNA
TRIS buffer pH 8	Ambion	AM9855G	synthetic miRNA
sterile tubes	Carl Roth GmbH	ENE8.1	synthetic miRNA
Photometer	Eppendorf	Eppendorf Biophotometer	Bradford assay
Cuvette	Carl Roth GmbH	XK20	Bradford assay
Coomassie G-250 Stain	BioRad GmbH	161-0786	Bradford assay
Sodiumchlorid	Carl Roth GmbH	3957.1	Delipitation
EDTA	Fluka Analytical	03690-100ML	Delipitation
TRIS buffer pH 8.0	Ambion	AM9855G	Delipitation
Ethanol 100%	AustrAlco	Ethanol Absolut 99.9%	Delipitation
Diethyl ether	Carl Roth GmbH	3942.1	Delipitation
Centrifuge	Thermo Scientific	Multifuge X3R	Delipitation
Chloroform	Carl Roth GmbH	3313.1	Reconstitution
Methanol	Carl Roth GmbH	4627.1	Reconstitution
Phosphatidylcholine	Sigma Aldrich GmbH	P3556-25mg	Reconstitution
Cholesterol oleate	Sigma Aldrich GmbH	C-9253-250mg	Reconstitution
cholesterol	Sigma Aldrich GmbH	C8667-500mg	Reconstitution
glass tubes	Carl Roth GmbH	K226.1	Reconstitution
spermine	Sigma Aldrich GmbH	S3256-1G	Reconstitution
Thermomixer	Eppendorf	Thermomixer comfort	Reconstitution
Sodium deoxycholate	Sigma Aldrich GmbH	3097-25G	Reconstitution
Magnetic stir bar	Carl Roth GmbH	0955.2	Reconstitution
100µL micropipettes	Carl Roth GmbH	A762.1	Reconstitution
PBS	Carl Roth GmbH	9143.2	Dialysis
Amberlite XAD-2 beads	Sigma Aldrich GmbH	10357	Dialysis
Slide-A-Lyzer casette (cut-off 20 kDa)	Thermo Scientific	66003	Dialysis
Syringe	Braun	9161406V	Dialysis
Syringe needle	Braun	465 76 83	Dialysis
EGTA	Carl Roth GmbH	3054.2	Labeling of LDL particles
DMSO	life technologies	D12345	Labeling of LDL particles
Atomic Force Microscope	RIBM	SS-NEX	Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles
Muscovite Mica (V-1 Grade)	Christine Gröpl	G250-1/V1	Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles
AFM Cantilever	Nanoworld	USC-F1.2-k0.15	Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles
Gwyddion 2.49	Czech Metrology Institute	http://gwyddion.net	Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles
Chamber slides, Nunc Lab-Tek	VWR	734-2122	Cell culture
HBSS	Carl Roth GmbH	9117.1	Cell culture
Cell counter	Omni Life Science GmbH	Casy	Cell culture
miRNeasy Mini Kit	QIAGEN	217004	miRNA extraction
Centrifuge	Eppendorf	5415R	miRNA extraction
20G needle	Braun	Sterican 465 75 19	miRNA extraction
5ml syringe	Becton Dickinson	309050	miRNA extraction
PCR cabinet	Esco	PCR-3A1	Reverse Transcription
TaqMan Reverse Transcription Kit	Thermo Scientific	4366596	Reverse Transcription
Rnase-free water	Carl Roth GmbH	T143	Reverse Transcription
0.2 ml tubes	Brand	781305	Reverse Transcription
Centrifuge	Carl Roth GmbH	Microcentrifuge AL	Reverse Transcription
Thermocycler	Sensoquest	Labcycler	Reverse Transcription
TaqMan Primer	Thermo Scientific	-	qPCR
iTaq Universal probe supermix	BioRad GmbH	1725131	qPCR
PCR machine	Corbett	Rotor-Gene RG-6000	qPCR
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems	4366596	TaqMan Array
Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1	Applied Biosystems	4399966	TaqMan Array
TaqMan PreAmp Master Mix	Applied Biosystems	4391128	TaqMan Array
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1	Applied Biosystems	4399933	TaqMan Array
TaqMan Universal Master Mix II, no UNG	Applied Biosystems	4440040	TaqMan Array
TaqMan Advanced miRNA Human A Cards	Applied Biosystems	A31805	TaqMan Array
Nuclease-free water	Thermo Scientific	R0581	TaqMan Array
MgCl2 (25mM)	Thermo Scientific	R0971	TaqMan Array
TE, pH 8.0	Invitrogen	AM9849	TaqMan Array
7900HT Fast Real-Time PCR System	Applied Biosystems	4351405	TaqMan Array
TaqMan Array Card Sealer	Applied Biosystems	-	TaqMan Array