Summary
Cet article décrit un protocole de cytométrie de flux basé sur FRET pour quantifier l'auto-assemblage de protéine dans les deux cellules de S. cerevisiae et de HEK293T.
Abstract
L'auto-assemblage des protéines régit la fonction protéique et compartimente les processus cellulaires dans l'espace et le temps. Les méthodes actuelles pour l'étudier souffrent d'une faible sensibilité, de lectures indirectes, d'un débit limité et/ou d'une résolution à un seul cellule. Nous avons conçu une méthodologie unique basée sur la cytométrie du flux qui répond à toutes ces limitations : FRET amphifluorique distribué ou DAmFRET. DAmFRET détecte et quantifie les auto-assemblages de protéines par émission sensibilisée FRET in vivo, permet le déploiement à travers les systèmes modèles - de la levure aux cellules humaines - et réalise des lectures sensibles, unicellulaires et à haut débit indépendamment des protéines localisation ou solubilité.
Introduction
Les essais pour étudier les interactions protéiques homotypiques, ou « auto-assemblage » sont importants parce que l'état oligomeric et la solubilité des protéines dictent leur fonction. Le protéome regorge d'homo-multimers1,2,3,4, tandis que relativement peu de protéines fonctionnent comme des monomères. Les protéines peuvent également s'assembler de façon aberrante en raison du stress, de l'âge ou de la mauvaise régulation, ce qui entraîne des changements pathologiques dans l'activité. Identifier les facteurs qui modulent de tels événements, ou même la nature physique des assemblées, est souvent exceptionnellement difficile.
Un nombre croissant de protéines sont maintenant reconnus pour s'auto-assembler avec la cocoagulativité extraordinaire et la stoichiométrie indéterminée, ayant pour résultat leur démélangedage d'autres constituants cellulaires, comme phases protéine-denses. Ceux-ci prennent la forme de condensats désordonnés, tels que des gouttelettes et des gels, ou des filaments très ordonnés, tels que les fibres amyloïdes. Les fluctuations conformationnelles associées à ce dernier rendent sa formation initiale, ou nucléation, intrinsèquement probabiliste au niveau moléculaire5,6. Parce que la probabilité d'échelles de nucléation avec le volume, la formation de tels assemblages peut être très stochastique dans les confins spatiaux des cellules vivantes7,8. À l'extrême de la séparation de phase stochastique nucléation-limitée sont des prions, des assemblages de protéines fortement ordonnés qui seulement rarement nucléate spontanément, mais une fois formé, modèleleur leur propre croissance indéfiniment. Une telle protéine, connue sous le nom d'ASC, exécute un commutateur numérique prion-like dans l'activité des cellules immunitaires innées de mammifères. L'auto-assemblage d'ASC est nucléé par son interaction avec des protéines spécifiques qui ont elles-mêmes oligomerized sur des modèles moléculaires pathogènes ou danger-associés liants. Les assemblages ASC à leur tour nucléate procaspase-1 à l'auto-assemblage et activer, conduisant à la maturation cytokine et la pyroptose de la cellule9,10. La région de l'ASC responsable de son assemblage appartient à la superfamille du domaine de la mort, qui se compose de plus d'une centaine de membres dans le protéome humain. Malgré les rôles essentiels des domaines de la mort dans l'immunité innée et la mort cellulaire programmée, la plupart d'entre eux n'ont pas encore été caractérisés en ce qui concerne l'auto-assemblage. La découverte et la caractérisation de protéines supplémentaires avec un tel comportement seront grandement facilitées par une lecture directe à cellule unique de l'auto-assemblage des protéines.
Les approches classiques de biochimie des protéines pour étudier l'auto-assemblage des protéines, comme la chromatographie à exclusion de taille et l'ultracentrifugation, se limitent en grande partie aux évaluations au niveau de la population. Cependant, l'hétérogénéité de cellule à cellule résultant des transitions de phase nucléation-limitées ne peut pas être modélisée avec ce niveau de détail. Les approches unicellulaires basées sur la microscopie fluorescence retrouvent cette capacité, mais n'ont pas le débit nécessaire pour quantifier avec précision la nucléation ou pour détecter des assemblages rares. En outre, les auto-assemblages solubles tels que la plupart des enzymes et des oligomères pré-amyloïdes, sont trop petits et mobiles pour être résolus par microscopie lumineuse standard. Ils peuvent être détectés par des approches plus sophistiquées telles que la spectroscopie de corrélation de fluorescence, mais celles-ci sont très limitées dans le nombre de cellules et le débit.
Les essais basés sur la proximité de l'assemblage des protéines, tels que fret et la complémentation du fluorophore fendu, offrent une solution potentielle à ces problèmes. Cependant, ils exigent généralement l'utilisation de deux constructions différentes exprimant la protéine d'intérêt fusionnée à des étiquettes complémentaires-le donneur et les fluorophores accepteurs dans le cas de FRET. Cela compromet le débit expérimental et réduit également la sensibilité due à la variation de cellule à cellule dans les niveaux relatifs de donneur et d'accepteur. Pour contourner cela, nous avons conçu un essai qui emploie un fluorophore photoconvertible, mEos3.111, qui permet une construction unique pour exprimer à la fois le donneur et l'accepteur marqué protéine. Le spectre d'émission de mEos3.1 non converti (donneur de type GFP) chevauche suffisamment le spectre d'excitation des mEos3.1 photoconvertis (accepteur de type dsRed) pour permettre à fret de se produire lorsque les molécules sont à proximité (lt;10 nm). Ainsi, en exposant les cellules à une dose empiriquement déterminée de 405 nm de lumière, qui photoconvertit une fraction optimale de la forme totale mEos3.1 dans la forme d'accepteur, nous atteignons des niveaux relatifs cohérents et reproductibles de donneur et d'accepteur à travers plusieurs échantillons, niveaux d'expression et des expériences. Nous mesurons la fluorescence acceptor lorsqu'elle est excitée soit directement avec 561 nm de lumière, soit indirectement (par transfert d'énergie du donateur) avec 488 nm de lumière (c.-à-d., émission sensibilisée FRET). Nous rapportons l'assemblage de protéine comme rapport de ces deux valeurs et le terme fret amphifluorique ou AmFRET.
Afin de calculer la concentration de protéines par cytométrie de flux, nous calculons d'abord l'intensité moyenne de fluorescence de Spc42 étiquetée avec mEos3.1. Puisque les cellules de levure contiennent approximativement 1000 molécules de Spc42, nous calculons alors l'intensité de fluorescence d'une molécule verte fluorescente simple mEos3.1. En tirant parti de la photoconversion uniforme à toutes les concentrations cellulaires (Figure 1E), nous corrélions ensuite les valeurs totales de fluorescence mEos3.1 pour toutes les intensités d'accepteurs suivant la photoconversion. Nous sommes alors en mesure de diviser le nombre total de grains de beauté de protéines fluorescentes par le volume cytosolique approximatif (tel que déterminé à l'aide de la cytométrie du flux d'imagerie) pour obtenir la concentration cytosolique totale de la protéine d'intérêt. Pour les calculs exacts, s'il vous plaît voir le manuscrit original8.
En exprimant la protéine mEos3.1-fusionnée à partir d'un plasmide de 2 degrés dans la levure, nous sondons une gamme d'environ mille fois de concentration de protéines dans chaque échantillon8. Nous obtenons la même chose dans les cellules HEK293T en vertu de la variation de l'apport plasmide pendant la transfection, et donc le nombre de copie variable.
La distribution résultante d'AmFRET, ou DAmFRET, pour plusieurs milliers de cellules révèle la concentration-dépendance de l'auto-assemblage dans le cytosol pour toute protéine d'intérêt. Dans l'ensemble, DAmFRET représente une méthodologie habilitante pour découvrir et caractériser l'auto-assemblage des protéines avec une combinaison sans précédent de sensibilité, de débit et de reproductibilité.
Bien que l'utilisation d'un cytomètre d'imagerie nous permette d'obtenir des mesures de concentration de protéines in vivo, ces cytomètres ne sont pas encore disponibles dans la plupart des établissements de recherche. Néanmoins, DAmFRET peut être exécuté même dans un cytomètre typique de non-imagerie pour obtenir des distributions de l'assemblage de protéine sur la gamme de l'expression de protéine.
Protocol
1. Préparation de Saccharomyces cerevisiae pour l'essai DAmFRET
- Transformez les souches de levure séquençantes expérimentalement pertinentes à l'aide d'un plasmide inductible de 2 degrés de galactose qui exprime la protéine d'intérêt8 marquée au terminus C ou N avec mEos3.1 à l'aide d'un protocole standard d'acétate de lithium12 .
- Cultivez la levure dans la culture liquide.
- Pour chaque protéine requête, inoculer les colonies de levure (transformées), en triple, chacune en 200 l de milieux de croissance appropriés non induisants (c.-à-d., des milieux contenant 2 % de dextrose, de la base d'azote de levure et des acides aminés pour la sélection du plasmide) dans une plaque de 96 puits ( Figure 1C).
- Incuber les cellules en secouant sur un shaker de plaque (voir le tableau des matériaux)avec une orbite de 1,5 mm à 1200 tr/min à 30 oC pendant 16 h.
- Induire l'expression du gène d'intérêt (protocole représentatif pour 16 protéines h-certains peut prendre plus ou moins de temps).
- Après 16 h d'induction, faire tourner la plaque à 2200 x g pendant 2 min à température ambiante (RT0 pour granuler les échantillons.
- Retirez les médias par inversion énergique. Resuspendre les cellules avec 200 l de milieux d'induction appropriés (c.-à-d. des milieux contenant 2 % de galactose, une base d'azote de levure et des acides aminés pour la sélection du plasmide). Voir Figure 1C.
- Incuber les cellules en secouant à 30 oC pendant 12 h.
- Centrifugeuse (voir le Tableau des Matériaux)la plaque à 2200 x g pendant 2 min à RT pour granuler les échantillons. Retirez les médias par inversion énergique. Resuspendre les cellules avec 200 l du support d'induction.
- Incuber les cellules en secouant à 1200 tr/min à 30 oC pendant 4 h. Cette résuspension dans les médias frais devrait se produire 4 h avant d'exécuter DAmFRET, afin de réduire l'autofluorescence.
2. Création plasmide mammifère
- Construire un vecteur de mammifères qui a un promoteur constitutif et mEos3.1 avec un placeholder pour insérer le gène d'intérêt et un lien entre eux.
REMARQUE: Nous avons construit un vecteur compatible porte d'or, M1, à partir d'un plasmide accessible au public (voir le tableau des matériaux) avec les modifications suivantes: un site BsaI existant a été supprimé par une mutation point G à A (à la position 3719 selon le déposé séquence). mEos3.1 a été obtenu en utilisant la mutagénèse dirigée par le site du fluorophore à I157V. Des sites BsaI inversés suivis d'un lien 4x (EAAAR) ont été insérés, par l'assemblage Gibson, dans le cadre entre le promoteur CMV et le mEos3.1 pour produire le vecteur M1 final. L'expression protéique est pilotée par l'exhausteur et promoteur de CMV ; et la terminaison de transcription par le signal de polyadenylation SV40. - Créez une bibliothèque d'inserts, compatible s'il y a un vecteur construit.
REMARQUE: Nous commandons nos inserts pour l'assemblage Golden Gate comme fragments linéaires synthétiques (voir tableau des matériaux) flanqués de sites BsaI pour la ligature en M1 entre le promoteur CMV et 4x(EAAAR)-mEos3.1.
3. Culture et transfection des cellules mammifères
- Culture HEK293T cellules dans DMEM - 10% FBS - 1x PenStrep media à 37 oC à 5% CO2.
- Le jour précédant la transfection, graines 5 x 105 cellules dans une plaque de 6 puits avec 2 ml de support.
- Cellules transfect avec 2 g d'ADN plasmide à l'aide d'un réactif de transfection (voir le tableau des matériaux) à un rapport de 3:1 (réactif de transfection : ADN). Mélanger les composants dans 150 oL de sérique réduite (voir le tableau des matériaux)et les incuber à RT pendant 15 min, ajouter le mélange à chaque puits et couver pendant 48 h pour l'expression des protéines.
- Confirmer l'expression des protéines après 24 h par microscopie épifluorescence (488 nm excitation, 515 nm émission).
4. Préparation des cellules de mammifères pour l'essai d'AmFRET
- Après 48 h d'expression protéique, retirer les supports de chaque puits et laver soigneusement les cellules avec 1 ml de saline tamponnée par phosphate de 37 oC (PBS). Après le lavage, aspirer le PBS.
- Ajouter 0,5 mL d'acide trypsin-éthylènediaminetetratratraacetic (EDTA) (0,25%) et incuber pendant 5 min à 37 oC.
- Ajoutez 0,5 ml de support DMEM complet à chaque puits, resuspendez les cellules et assurez-vous qu'aucune grosse amtude n'est visible.
- Transférer le volume entier de chaque puits dans des tubes de 1,5 ml.
- Spin cellules pendant 5 min à 1000 x g à température ambiante (RT).
- Retirez le supernatant et resuspendez le granule cellulaire dans 1 ml de PBS et 10 mM EDTA.
- Faites tourner les cellules pendant 5 min à 1000 x g à RT.
- Retirez le supernatant et suspendez la pastille cellulaire dans 1 mL 4% de paraformaldéhyde (PFA) et 10 mM EDTA dans PBS.
- Fixer les cellules pendant 5 min sur une table à secouer avec un mouvement constant.
- Spin cellules pendant 5 min à 1000 x g à RT.
- Retirez le supernatant et suspendez la pastille cellulaire dans 1 ml de PBS et 10 mM EDTA.
- Spin cellules pendant 5 min à 1000 x g à RT.
- Retirez le supernatant et suspendez les cellules en volume adéquat de tampon pour la course de cytométrie (pour 1 puits d'une plaque de 96 puits, utilisez 200 L de PBS et 10 mM EDTA).
- Transférer les cellules resuspension nées dans un puits d'une plaque ronde de 96 puits.
5. Photoconversion de levures et de cellules de mammifères pour l'essai
- Échantillons photoconvertis dans une microplaque sans couvercle à l'aide d'une lampe UV (voir le tableau des matériaux) muni d'un filtre de 320 à 500 nm (violet) et d'un collimateur de faisceau, positionné à 45 cm au-dessus de la plaque, pour une durée de 25 min en secouant. Ces conditions sont appropriées lorsque la puissance du faisceau à la plaque est de 11,25 mW/cm2, avec environ 17 000 mJ/cm2 de la dose totale de photon8.
6. Collecte de données DAmFRET
- Cellules d'astodonte utilisant un cytomètre avec les lasers 488/561 non-collinear. Les données suivantes sont les exigences minimales pour le calcul de FRET.
- Utilisez un canal d'émission de 488 nm excitation/515 nm pour la collecte de la fluorescence des donneurs.
- Utilisez un canal d'émission de 488 nm excitation/595 nm pour la collecte de la fluorescence du signal FRET.
- Utilisez un canal d'émission de 561 nm excitation/595 nm (non-collinear avec le canal 488/595) pour la collecte de la fluorescence acceptor.
- Utilisez un canal d'émission 405 nm excitation/ 457 nm pour la collecte de l'autofluorescence8.
- Utiliser un canal d'image brightfield pour le calcul du volume.
REMARQUE : Les paramètres cytomètres d'imagerie pour S. cerevisiae sont comme suit : objectif de 60x à faible débit et sensibilité élevée ; les puissances laser fixées à 405 nm à 15 mW, 488 nm à 15 mW, 561 nm à 20 mW.Imaging paramètres cytomètre pour les cellules HEK293T sont comme suit:40x objectif à faible débit et une sensibilité élevée; puissances laser fixées à 405 nm à 15 mW, 488 nm à 15 mW, 561 nm à 20 mW.A noter également que, notre cytomètre d'imagerie a été conçu sur mesure pour avoir séparé spatialement 488 nm et 561 nm lasers (c.-à-d., sur différentes caméras) afin d'obtenir une résolution claire de FRET de l'acceptorfluescen ce.
- Recueillir des données pour 20 000 à 50 000 cellules individuelles par échantillon à l'intérieur d'une porte positive à la fluorescence.
- Portez les cellules simples par un rapport d'aspect élevé et une petite zone cellulaire par opposition aux cellules ou débris agglomérés qui auraient un faible rapport d'aspect et de grandes ou très petites zones cellulaires respectivement.
REMARQUE : Les paramètres équivalents d'un cytomètre non-imagerie sont FSC (diffusion vers l'avant) pour la taille approximative des cellules et SSC (diffusion latérale) pour la granularité cellulaire. En outre, utilisez la hauteur d'impulsion FSC par rapport à la largeur des impulsions comme un proxy pour le gating à cellule unique. En outre, il est crucial de ne pas recueillir les événements qui ont des valeurs de fluorescence au-delà de la limite supérieure de sensibilité du cytomètre. Dans notre cytomètre d'imagerie, nous limitons la collecte d'événements à une valeur de pixel maximale brute d'un de moins que la limite de saturation pour chaque canal fluorescent que nous recueillons. De même, pour les cytomètres de débit conventionnels, les points de données dans le bac à intensité maximale (qui comprend les événements qui sont au-delà de la plage dynamique de détection) ne doivent pas être analysés.
- Portez les cellules simples par un rapport d'aspect élevé et une petite zone cellulaire par opposition aux cellules ou débris agglomérés qui auraient un faible rapport d'aspect et de grandes ou très petites zones cellulaires respectivement.
7. Analyse des données
- Effectuer une compensation à l'aide d'un échantillon mEos3.1 non photoconverti pour le signal donneur pur et monomeric DsRed2, qui a un spectre similaire à la forme rouge de mEos3.1, pour le signal d'accepteur pur13. Pour plus de sensibilité, assurez-vous que le canal de détection FRET est également considéré comme une cible de débordement, dans le programme d'analyse.
- Échantillons de porte pour sélectionner seulement les cellules simples qui sont fluorescence positive (comme dans la figure 2).
- Calculez le paramètre AmFRET comme le rapport total du signal FRET (488ex/595em) divisé par le signal total de l'accepteur FRET (561ex/595em).
- Visualiser les données à l'aide d'un logiciel de cytométrie des flux (voir le Tableau des matériaux).
REMARQUE : Les concentrations cytosoliques de S. cerevisiae dans cette étude ont été calculées avec les paramètres ci-dessous comme dans Khan et al.8. L'analyse des données a été effectuée à l'aide d'un logiciel de cytométrie des flux (voir Tableau des matériaux).
Representative Results
Détection des oligomères qui ne forment pas la ponctua
Nous avons précédemment appliqué DAmFRET pour la caractérisation de la séparation de phase de protéine, qui a typiquement comme conséquence la formation de grands assemblages de protéine qui peuvent également être détectés par microscopie de fluorescence. Pour démontrer l'applicabilité de DAmFRET aux assemblages de protéines diffraction-limités, nous avons analysé une protéine biochimiquement bien caractérisée qui forme des homo-heptamers discrets qui sont beaucoup trop petits pour être visualisés par microscopie légère : l'humain co-chaperonine, HSPE114. Nous avons comparé les profils DAmFRET des cellules de levure exprimant mEos3.1 seul, ou HSPE1-mEos3.1. Ce dernier affichait des valeurs amFRET positives uniformes, tandis que le premier présentait des AmFRET négligeables (figure3A). Les images de cellules acquises par le cytomètre de flux d'imagerie (voir le tableau des matériaux) ont révélé une fluorescence diffuse dans tous les canaux-donneur, FRET et accepteur, pour les deux cellules mEos3.1- et HSPE1-mEos3.1 (figure3B). Pour confirmer cette découverte à une résolution optique plus élevée, nous avons utilisé la microscopie confocale pour capturer des z-stacks pour plusieurs champs de cellules. En effet, la fluorescence a été uniformément répartie dans tout le cytosol, sans poncte détectable, que les cellules aient exprimé HSPE1-mEos3.1 ou le fluorophore seul (figure 3C). Notez que le Kd caractérisé de HSPE1 est d'environ 3 M, ce qui est légèrement inférieur à la sensibilité de notre système, et donc nous n'observons pas la relation sigmoïdale de FRET à la concentration qui serait attendue pour cet homo-oligomer discret. Néanmoins, nous concluons que DAmFRET détecte robustement l'homo-oligomerization soluble in vivo à la résolution de cellules simples.
Détection d'assemblages limités par la nucléation
Pour mettre en valeur la capacité de DAmFRET à distinguer les homo-oligomères discrets des assemblages limités par la nucléation tels que les prions, nous avons analysé la protéine inflammasome humaine ASC. Alors que WT ASCPYD forme des filaments in vivo, le mutant Inactif R41E de ASCPYD ne9,10. Nous avons exprimé dans les cellules de levure soit mEos3.1 seul, ou mEos3.1 fusionné à WT ou R41E ASCPYD. Les cellules de levure exprimant le fluorophore seul ou la forme mutante dePYD d'ASC ont exhibé AmFRET négligeable sur toute la gamme de concentration, indiquant une incapacité à l'auto-interaction. En revanche, WT ASCPYD a montré un profil DAmFRET avec deux populations: l'une avec AmFRET négligeable et l'autre avec AmFRET élevé (Figure 4A). Comme le confirment les images de fluorescence (Figure 4B), ces populations représentent des cellules qui ne contiennent que des protéines solubles ou qui contiennent principalement des protéines auto-assemblées, respectivement. La relation discontinue entre les populations et le fait qu'elles se produisent à des concentrations qui se chevauchent indique qu'une barrière de nucléation stabilise la forme monomérique de la protéine et peut l'empêcher de s'assembler pendant toute la durée de l'expérience. 8. L'écart dans AmFRET entre les deux populations indique que, une fois que la nucléation se produit, il modèle presque instantanément d'autres monomères à la forme assemblée et atteint un nouveau niveau d'état stable d'AmFRET. DAmFRET a corroboré des données structurelles antérieures selon lesquelles le point mutant ASCPYD R41E a perturbé la nucléation à travers les concentrations réalisables par ce système d'expression (Figure 4A).
Applicabilité de DAmFRET dans les cellules de mammifères
Bien que les cellules de levure soient des cellules hôtes idéales pour DAmFRET, nous avons souhaité étendre l'applicabilité de DAmFRET aux cellules de mammifères. Afin d'éviter la mort cellulaire causée par les polymères ASC fonctionnels, nous avons testé DAmFRET dans les cellules HEK293T qui n'ont pas d'expression caspase-1. Nous avons exprimé les mêmes protéines dans les cellules HEK293T que dans les cellules de levure dans la figure 4A. Les profils DAmFRET qui en résultent dans les cellules HEK293T ressemblent qualitativement à ceux des cellules de levure (figures4A,C). DAmFRET, ainsi, sert comme méthode in vivo la plus polyvalente pour détecter et quantifier les auto-assemblages de protéines nucléées à résolution de cellules uniques avec un débit élevé indépendamment de la présence de puncta microscopiquement visible ainsi que le type de cellule.
Figure 1 : Aperçu de la conception expérimentale pour S. cerevisiae. Ce chiffre a été adapté de Khan et coll.8 avec la permission. (A) 2 ' plasmide carte montrant le cadre de lecture ouvert pour la protéine d'intérêt, marqué avec mEos3.1 photoconvertible et conduit par un promoteur inductible. (B) Lorsqu'il est transformé en cellules de levure, le système de réplication de 2 degrés conduit à une variabilité élevée du nombre de copies entre les cellules. Cette variation, combinée au bruit transcriptionnel du promoteur GAL1, entraîne une large distribution de l'expression des protéines dans une population de cellules. (C) Aperçu expérimental pour l'assay d'AmFRET de levure. Pour assurer la santé des cellules pour l'analyse, les colonies sont d'abord inoculées pour la prolifération de plus de 16 h dans les médias synthétiques contenant la source de carbone non induisant, dextrose. Après la prolifération, les cellules sont transférées sur des supports synthétiques contenant la source de carbone induisant, le galactose, pendant 16 h. Après l'induction, les cellules sont partiellement et uniformément photoconverties par l'exposition à la lumière de 405 nm. (D) Les échantillons sont ensuite analysés à l'aide de la cytométrie du flux d'imagerie. Les spectres et les intensités du mEos3.1 vert et rouge les rendent bien adaptés pour un donneur et un accepteur fret, respectivement. Lorsqu'elles sont à proximité les unes des autres, comme c'est le cas dans le polymère représenté dans la cellule inférieure, les molécules rouges fluorescencent à l'excitation des molécules vertes (FRET). (E) Terrain d'intensité s'il s'agit d'un donneur par rapport à l'accepteur montrant une relation linéaire étroite lors de la photoconversion, ce qui montre que l'efficacité de la photoconversion n'est pas influencée par le niveau d'expression. (F) Scatter plot of mean acceptor versus donor intensities from populations of cells expressing a variety of mEos-tagged proteins, in both soluble and amyloid forms, showing that the efficiency of photoconversion is not influenced by the fusion partenaire ou solubilité (les barres d'erreur indiquent l'écart standard des triplicats biologiques). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Stratégie de gating DAmFRET pour l'imagerie des données de cytométrie du flux. Stratégie de gating utilisée pour analyser uniquement les cellules individuelles ciblées et non bourgeonnées qui ont une faible autofluorescence et expriment la protéine fluorescente. (A) Hiérarchie des portes pour obtenir des cellules individuelles bien ciblées, vivantes et pour l'analyse. (B) Histogramme de gradient RMS du canal brightfield. Cette mesure permet de sélectionner les cellules qui sont correctement focalisés sous la lumière transmise. (C) Parcelle de densité de circularité par rapport à la zone montrant la population fermée des cellules simples sphériques non budded. (D) Diagramme de densité montrant l'autofluorescence (Ch07) contre l'intensité de fluorescence de distributeur (Ch02) montrant des populations séparées des cellules exprimantes (fermées) et des cellules foncées. (E) Scatter trace de donneur contre des intensités acceptrices montrant une perte claire de fluorescence du donneur dans un sous-ensemble de cellules, résultant du FRET entre le donneur et les fluorophores accepteurs. (F) Terrain final DAmFRET. Les cellules contenant des protéines non assemblées sont centrées autour de zéro AmFRET, tandis que les cellules contenant des protéines auto-assemblées présentent une valeur AmFRET positive. Deux populations qui se chevauchent dans la parcelle est révélatrice d'une barrière finie pour nucléer cette protéine dans des assemblages d'ordre supérieur tels que les amyloïdes. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Données représentatives des protéines monomériques et héptamériques par cytométrie et microscopie de flux. (A) Profil DAmFRET de la protéine monomeric mEos3.1 (gauche) et heptameric HSPE1 marqué avec mEos3.1 (droite) montrant fret ratiométrique accru résultant de l'assemblage homotypique. (B) Images du cytomètre, de cellules exprimant mEos3.1 (gauche) et HSPE1 (droite) montrées dans tous les canaux capturés. (C) Images représentatives de cellules de levure exprimant mEos3.1 monomeric (gauche) et HSPE1 (droite). Les images sont des projections de somme de tranches confocales. Au moins cinquante cellules ont été imaged pour corroborer cette observation. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Les profils DAmFRET montrent un comportement d'auto-assemblage similaire de l'ASCPYD humain protéines dans S. cerevisiae et HEK293T. (A) Parcelles de densité montrant AmFRET versus concentration cytosolique (en M) de mEos3.1 (gauche), ou mEos3.1 fusionné à WT (au centre) ou mutant monomérissant de L'ASCPYD (à droite) dans S. cerevisiae. (B) Images du cytomètre, des cellules des portes inférieures et supérieures (panneaux gauche et centre, respectivement) exprimant WT ASCPYD; et des cellules exprimant ASCPYD R41E de la porte indiquée (panneau droit). (C) Parcelles de densité montrant l'intensité AmFRET contre accepteur pour la même série de protéines que dans (A) mais exprimées dans les cellules HEK293T. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Discussion
DAmFRET est la méthode la plus complète pour détecter l'auto-assemblage des protéines in vivo. DAmFRET combine la lecture directe des interactions protéines-protéines homotypiques sur un large éventail de concentration, avec une résolution cellulaire unique et un débit élevé. La lecture directe de DAmFRET et le fait que les protéines fusionnées ne nécessitent pas une localisation sous-cellulaire spécifique ou un état insoluble élimine les faux positifs et étend son applicabilité à un large éventail de protéines à leurs emplacements subcellulaires indigènes. Notamment, en étiquetant des organites avec des fluorophores qui sont spectrally compatibles avec mEos3.1, tels que T-Sapphire et mCardinal, la localisation subcellulaire des formes solubles et assemblées de protéines peut être déterminée aux côtés de DAmFRET.
En utilisant le cytomètre de flux d'imagerie tel que décrit ici, il faut 8 h pour analyser une plaque de 96 puits avec environ 20 000 cellules fermées par puits. Cependant, nous effectuons également régulièrement DAmFRET avec des cytomètres standard (non-imagerie) qui atteignent un débit beaucoup plus élevé (jusqu'à 20 échantillons par minute). En fait, tout cytomètre d'écoulement avec des lasers 488 et 561 nm séparés spatialement qui est exempt d'artefacts d'ampli de journal et a les PMT et les filtres appropriés pour détecter des signaux de distributeur, de FRET, et d'accepteur est suffisant pour exécuter DAmFRET. À l'heure actuelle, ce gain de débit se fait au détriment de l'information de localisation et de la détermination du volume, de sorte que l'auto-assemblage doit ensuite être analysé en fonction de l'expression des protéines plutôt que de la concentration. Ce n'est pas un problème pour les analyses qualitatives. En outre, il peut être possible d'estimer le volume cytosolique en fusionnant un fluorophore spectalement distinct à une protéine endogène de « ménage » dont l'expression est étroitement corrélée avec le volume cytosolique.
Comme nous l'avons démontré grâce à notre déploiement de DAmFRET dans les cellules de levure et de mammifères, DAmFRET peut être facilement adapté à différents systèmes d'expression. Cela permet d'étudier l'auto-assemblage des protéines dans leur contexte cellulaire natif. En outre, il offre la possibilité de comparer l'assemblage de protéines à travers des modèles de culture cellulaire très divergents pour étudier la conservation des mécanismes qui régissent l'auto-assemblage des protéines.
Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Jeff Lange, Jay Unruh, Jianzheng Wu, Tarique Khan et Ellen Ketter pour leur travail en vue de développer l'exemple. Ce travail a été fait pour répondre, en partie, aux exigences pour la recherche de thèse de doctorat pour T.S.K. et A.R.G en tant qu'étudiants inscrits à l'Open University, Royaume-Uni, et le Stowers Institute for Medical Research Graduate School, Etats-Unis, respectivement. Vous trouverez d'autres informations sur les résultats d'analyse à https://doi.org/10.1016/j.molcel.2018.06.016. Les données originales sous-jacentes à ce manuscrit peuvent être consultées à partir du dépôt de données d'origine Stowers à http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1372. Ce travail a été financé par le Prix d'indépendance précoce du directeur des NIH DP5-OD009152, la subvention de la Fondation March of Dimes no 5-FY17-32 et le Stowers Institute for Medical Research.
Les contributions des auteurs sont les suivantes. Conceptualisation : T.S.K., S.V. et R.H.; Méthodologie : T.S.K., S.V., A.R.G., et A.B; Enquête : S.V., T.S.K. et A.R.G.; Analyse formelle : S.V. et T.S.K. ; Curation de données : T.S.K.; Visualisation: T.S.K, et S.V., Writing (Original Draft): S.V., et T.S.K.; Rédaction (Review, Editing): R.H., S.V., et T.S.K.; et acquisition de financement : R.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Plate | Axygen | P96-450R-C-S | |
| ASC 2-92 (mammalian plasmid) | rhm1.0095 | Available on request | |
| ASC 2-92 (R41E) (mammalian plasmid) | rhm1.0096 | Available on request | |
| ASC 2-92 (R41E) (yeast plasmid) | rhx2432 | Available on request | |
| ASC 2-92 (yeast plasmid) | rhx2431 | Available on request | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | "centrifuge" in text |
| CSM -Ura | Sunrise Science Products | 1004-100 | |
| Dextrose | EMD Millipore | DX0145-5 | |
| DMEM | Gibco | 11966025 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS-500G | |
| FCS Express 6 | DeNovo | FCS Express 6 Flow | "flow cytometry software" in text |
| Fetal Bovine Serum | VWR Life Science | 45001-108 | |
| Flow Cytometer | BioRad | ZE5 | Non-imaging flow cytometer |
| FUGENE HD | Promega | E2311 | "transfection reagent" in text |
| Galactose | VWR Life Science | 0637-500g | |
| HSPE1 (yeast plasmid) | rhx1531 | Available on request | |
| Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ImageStream X Mark II | "imaging flow cytometer" in text |
| Mammalian Cells | HEK293T | ||
| mEos3.1 (mammalian plasmid) | rhm1 | Available on request | |
| mEos3.1 (yeast plasmid) | rhx0935 | Available on request | |
| optiMEM | Gibco | 31985062 | "reduced serum media" in text |
| PBS | VWR Life Science | 45000-446 | |
| PenStrep | Gibco | 15070063 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
| Photoconversion Lamp | OmniCure | S1000 | |
| Plasmid #54525 | Addgene | #54525 | "publicly available plasmid" in text |
| Titramax 1000 Plate Shaker | Heidolph Instruments | 1000 | "plate shaker" in text |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| Yeast Strain | rhy1713 | Available on request- S288c (MATα lyp1Δ can1Δ::STE2pr_SpHIS5 his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 cln3Δ0::GAL1pr_WHI5_hphMX) |
References
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