Summary
מאמר זה מתאר זרימה מבוססת-סריג cy, מבוסס הפרוטוקול כדי לכמת הרכבה עצמית חלבון בשני S. cerevisiae ס ו HEK293T תאים.
Abstract
הרכבה עצמית חלבון שולטת בתפקוד החלבונים וממדר תהליכים סלולאריים בחלל ובזמן. שיטות נוכחיות ללימוד המידע סובלות מרגישות נמוכה, הפרדה עקיפה, תפוקה מוגבלת ו/או רמת אוכלוסיה במקום רזולוציה של תא בודד. עיצבנו את הזרימה cy, מבוססי מתודולוגיה אחת המטפלת בכל המגבלות האלה: להפיץ את החלק האחר של המגבלות. DAmFRET מזהה וכימות חלבון הרכבות עצמית על ידי הפליטה רגישות לvivo, מאפשר פריסה על פני מערכות דגם-מ שמרים לתאים אנושיים-ומשיגה רגיש, תא יחיד, התפוקה הגבוהה לקרוא-outs ללא קשר לחלבון לוקליזציה או מסיסות.
Introduction
Assays ללמוד אינטראקציות חלבון הומוטיפקס, או "הרכבה עצמית" הם חשובים משום המדינה oligomeric מסיסות של חלבונים להכתיב את תפקידם. הפרוטדום שופעת עם הומו-מוטיימרים1,2,3,4, ואילו חלבונים מעטים יחסית לתפקד monomers. חלבונים יכולים גם להרכיב סטיות בשל מתח, גיל, או misregulation, המוביל שינויים פתולוגיים בפעילות. זיהוי הגורמים לווסת אירועים כאלה, או אפילו את טבעו הפיזי של ההרכבות, הוא לעתים קרובות מאתגר במיוחד.
מספר גדל והולך של חלבונים מזוהים כעת כדי להרכיב את עצמו עם הקופרקטיביות יוצאת דופן ו stoichiometry לא מזוהה, וכתוצאה מכך הם מחדירים שלהם ממרכיבים סלולריים אחרים, כמו חלבון-שלבים צפופים. אלה לוקחים את הצורה של מעבים מסודר, כגון טיפות ג ' לים, או חוטים מסודרים מאוד, כגון סיבי עמילואיד. התנודות הכרוכות בקשר עם האחרון מייכבות את הקמתה הראשונית, או התגררות, באופן מיסודו במישור המולקולרי,5,6. בגלל ההסתברות של התגררות קשקשים עם נפח, היווצרות של מכלולים כאלה יכול להיות סטוכסטי מאוד בתחומי המרחבי של תאים חיים7,8. בקיצוניות של הפרדה סטוכסטית-שלב מוגבל הם prions, מכלולי חלבון מסודרים מאוד, שרק לעתים רחוקות נוקלאוונים באופן ספונטני, אך לאחר שנוצרו, תבנית הצמיחה שלהם ללא הגבלת זמן. אחד כזה חלבון, המכונה עולה, מבצע מתג מסוג prion הדיגיטלי בפעילות של תאים חיסוניים מולדים היונקים. הרכבה עצמית עולה הוא התגרדת על ידי האינטראקציה שלה עם חלבונים ספציפיים כי יש לעצמם oligomerized על הפתוגן מחייב-או הקשורות לסכנות דפוסי מולקולרי. ההרכבות עולה בתורו את הנוקלאואטה procaspase-1 כדי להרכיב את עצמו ולהפעיל, המוביל התבגרות cy, ו פירוציטוזה של התא9,10. האזור של עולה אחראי על ההרכבה שלו שייך לתחום המוות של משפחה, אשר מורכב מעל 100 חברים בפרוטאום אנושי. למרות התפקידים הבולטים של תחומי המוות בחסינות הטבועה ומוות התאים המתוכנת, רובם עדיין לא האופיינים ביחס להתכנסות עצמית. גילוי ואפיון של חלבונים נוספים עם התנהגות כזו יהיה מאוד הקלה על ידי ישיר, תא יחיד הבדיקה של הרכבה עצמית חלבון.
ביוכימיה קלאסית בביוכימיה גישות לחקר הרכבה עצמית חלבון, כגון כרומטוגרפיה להדרה בגודל והסתבכות, מוגבלים במידה רבה להערכות ברמת האוכלוסייה. עם זאת, הטרוגניות תא לתאים הנובע ממעברים מוגבלים בפאזה מוגבלת, לא ניתן למודל ברמת פירוט זו. גישות תא יחיד המבוססות על מיקרוסקופ הקרינה מחדש את היכולת הזאת, אבל חסר את התפוקה הנחוצה כדי לכמת במדויק בודד או לזהות מכלולים נדירים. יתרה מזאת, מכלולים עצמיים מסיסים כמו רוב האנזימים והטרום-עמילואיד, הם קטנים מדי וניידים כדי להיפתר על-ידי מיקרוסקופ אור רגיל. הם יכולים להיות מזוהה על ידי גישות מתוחכמות יותר כגון ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטית, אבל אלה מוגבלים מאוד מספר התא ותפוקה.
מבוסס קרבה מבוססת על הרכבה חלבון, כגון לפצל ומפוצל fluorophore משלימה, מציעים פתרון פוטנציאלי לבעיות אלה. עם זאת, הם בדרך כלל דורשים שימוש בשני מבנים שונים המבטאים את החלבון של עניין התמזגו תגים משלימים-התורם וקבלה fluorophores במקרה של לדאוג. פעולה זו פוגעת בתפוקה הניסיונית וגם מפחיתה את הרגישות עקב וריאציה של תא לתאים ברמות היחסיות של התורם והקבלה. כדי לעקוף את זה, עיצבנו שיטת הפעלה של פוטולופור, mEos 3.111, אשר מאפשר לבנות בודד לבטא גם תורם וגם לקבלה-מתויג חלבון. ספקטרום הפליטה של mEos בלתי מומרים 3.1 (תורם כמו GFP) חופף מספיק עם הספקטרום עירור של המרת mEos 3.1 (dsRed-כמו הקבלה) כדי לאפשר לדאוג להתרחש כאשר המולקולות נמצאים בסמיכות (< 10 ננומטר). כך, על ידי חשיפת התאים למינון מדומה של האור 405 ננומטר, אשר ממיר את החלק האופטימלי של mEos 3.1 הכולל לתוך טופס הקבלה, אנו משיגים רמות יחסיות של התורם והקבלה על פני דגימות מרובות, רמות ביטויים וניסויים. אנו מודדים את האפשרות הפלואורסצנטית בעת התרגשות גם ישירות עם 561 ננומטר אור, או בעקיפין (על ידי העברת אנרגיה מן התורם) עם 488 האור ננומטר (כלומר, פליטה רגישות מועבר). אנו מדווחים על הרכבת החלבונים כיחס של שני ערכים אלה ומונח זה האמפילוגית או AmFRET.
על מנת לחשב ריכוז חלבונים על ידי הזרמת cy, אנו מחשבים תחילה את עוצמת הזריחה הממוצע של Spc42 מתויג עם mEos 3.1. מכיוון שתאי שמרים מכילים כ 1000 מולקולות של Spc42, לאחר מכן אנו מחשבים את עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית של המולקולה הירוקה בודדת של mEos 3.1. על-ידי מינוף צילום ההמרה אפילו בכל הריכוזים הסלולריים (איור 1E), לאחר מכן להתאים את הסכום הכולל של meos 3.1 ערכי הזריחה עבור כל הכוונות לקבלה בעקבות photoconversion. אנחנו אז מסוגלים לחלק את המספר הכולל של שומות של חלבונים פלורסנט על ידי נפח cytosolic משוער (כפי שנקבע באמצעות זרימת הדמיה cy, מנסה) כדי להשיג את הריכוז הכולל ציטוסולמיות של חלבון הריבית. לחישובים מדויקים, אנא ראו את כתב היד המקורי8.
על ידי ביטוי חלבון mEos 3.1-מותך מתוך שמרים, אנו לחקור מגוון של כ-1000 קיפול של ריכוז חלבונים בכל מדגם8. אנו להשיג אותו בתאי HEK293T על ידי המוסריות של הווריאציה ספיגה פלמיד במהלך הזיהום, ומכאן מספר עותק משתנה.
ההתפלגות המתקבלת של AmFRET או DAmFRET עבור אלפי תאים רבים חושף את התלות הריכוז של הרכבה עצמית ב ציטוסול עבור כל חלבון של עניין. באופן כללי, DAmFRET מייצגת מתודולוגיה מאפשרת לגלות ולאפיין את ההרכבה העצמית של החלבון עם שילוב חסר תקדים של רגישות, תפוקה והפיכת שינויים.
בעוד שימוש בסייטומטר הדמיה מאפשר לנו להשיג במידות ריכוז vivo חלבונים, ציטוטומטרים כאלה אינם זמינים עדיין ברוב מוסדות המחקר. עם זאת, DAmFRET ניתן להפעיל גם cytometer אופייני לא הדמיה כדי לקבל הפצות של הרכבת חלבון על מגוון של ביטוי חלבון.
Protocol
1. הכנת סכביחויות לקבלת שיטת דמופרט
- לשנות את הזנים הרלוונטיים שמרים הרלוונטיות עם 2μ-inducible פלבאמצע המבטא את חלבון הריבית8 מתויג גם ב C או N הטרמינוס עם meos 3.1 באמצעות פרוטוקול ליתיום אצטט סטנדרטי12 .
- לגדל את השמרים בתרבות הנוזלית.
- עבור כל חלבון שאילתה, מושבות שמרים (השתנה), ב טרילקאט, כל אחד לתוך 200 μL של מדיה צמיחה מתאימה ללא הגורם (כלומר, מדיה המכילה 2% דקסטרוז, בסיס חנקן שמרים וחומצות אמינו לבחירה של הפלבאמצע) בצלחת 96-באר ( איור 1C).
- התאים דגירה תוך כדי טלטול על צלחת שייקר (לראות את הטבלה של חומרים) עם 1.5 מ"מ מסלול ב 1200 rpm ב 30 ° צ' עבור 16 h.
- לגרום לביטוי של גן העניין (פרוטוקול מייצג עבור 16 h-כמה חלבונים עשוי להימשך זמן או פחות).
- לאחר 16 h של אינדוקציה, ספין הצלחת ב 2200 x g עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר (RT0 כדי לחלק את הדגימות.
- הסר מדיה על-ידי היפוך בעוצמה. השהה מחדש תאים עם 200 μL של מדיה השראה מתאימה (כלומר, מדיה המכילה 2% גלקטוז, בסיס חנקן שמרים וחומצות אמינו לבחירה של הפלסמיד). ראה איור 1C.
- התאים מודדים בעת טלטול 30 ° צ' עבור 12 h.
- צנטריפוגה (לראות את הטבלה של חומרים) את הצלחת ב 2200 x g עבור 2 דקות ב RT כדי גלולה הדגימות. הסר מדיה על-ידי היפוך בעוצמה. השהה תאים מחדש עם 200 μL של מדיית האינדוקציה.
- התאים המדגירה תוך כדי טלטול ב 1200 סל ד ב 30 ° צ' עבור עוד 4 h. זה השעיה מחדש במדיה טרייה צריך לקרות 4 h לפני הפעלת DAmFRET כדי להפחית את הקרינה האוטומטית.
2. הבריאה המגלית
- בנו וקטור היונקים בעל מיזם מכונן וmeos 3.1 עם מציין מיקום להכנסת גן הריבית ומקשר ביניהם.
הערה: בנינו את שער הזהב תואם וקטור, M1, מתוך פלבינה בציבור זמין (לראות את הטבלה של חומרים) עם השינויים הבאים: אתר bsai קיים הוסר על ידי מוטציה נקודה G (במיקום 3719 לפי הפקיד הופקד רצף). mEos 3.1 הושג באמצעות מוטסיס בימוי האתר של fluorophore ב I157V. אתרים הפוכים BsaI ואחריו 4x (EAAAR) המקשר נוספו, על ידי האסיפה גיבסון, in-המסגרת בין היזם CMV ו mEos 3.1 כדי לייצר את וקטור M1 הסופי. ביטוי החלבון מונע על ידי שיפור ומקדם CMV; ופיטורים מSV40. של אות פוליאדלציה - צור ספריה של הוספות, התואמת לווקטור הבנוי.
הערה: אנו מסדר את התוספות שלנו להרכבת שער הזהב כקטעים ליניאריים סינתטיים (ראו טבלת חומרים) מוקף באתרי BsaI לצורך הארכה ל-M1 בין היזם CMV ו-4x (EAAAR)-mEos 3.1.
3. התרבות והעיבוד של תאים ממגלית
- תרבות HEK293T תאים ב-DMEM + 10% FBS + 1x PenStrep מדיה ב 37 ° c ב 5% CO2.
- ביום שלפני החצייה, הזרע 5 x 105 תאים בצלחת 6-היטב עם 2 מ ל של מדיה.
- תאים transfect עם 2 μg של דנ א פלמיד באמצעות מגיב החצייה (לראות את הטבלה של חומרים) ביחס של 3:1 (העברה מגיב: DNA). מערבבים את הרכיבים ב-150 μL של מדיה סרום מופחת (לראות את הטבלה של חומרים) ו-דגירה אותו ב-RT עבור 15 דקות, להוסיף את התערובת לכל היטב, מודדת עבור 48 h עבור הביטוי חלבון.
- אשר ביטוי חלבון לאחר 24 שעות על ידי מיקרוסקופ אפיפקרינה (488 ננומטר, 515 פליטת nm).
4. הכנת תאי המגלית
- לאחר 48 h של ביטוי חלבון, להסיר את המדיה מכל אחד היטב ולשטוף בזהירות תאים עם 1 מ ל של 37 ° c באגירה מלוחים (PBS). , בעקבות הכביסה. הוא מנקה את הערוץ
- הוסף 0.5 מ ל טריפסין-אתליליאדאמטמטטהחומצה (EDTA) (0.25%) ו הדגירה עבור 5 דקות ב 37 ° c.
- הוסף 0.5 mL של מדיית DMEM מלאה לכל היותר, השהה תאים מחדש וודא שאין גושים גדולים גלויים.
- העבר את כל הנפח של כל באר לתוך 1.5 mL.
- תאים ספין עבור 5 דקות ב 1000 x g בטמפרטורת החדר (RT).
- הסר את ה-supernatant והשהה מחדש את הגלולה בתא 1 מ ל של PBS + 10 מ"מ EDTA.
- ספין התאים עבור 5 דקות ב 1000 x g ב RT.
- הסר את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה ב-1 mL 4% פאראפורמלדהיד (בליגת העל) + 10 מ"מ EDTA ב PBS.
- תקן תאים עבור 5 דקות על שולחן מילקשייק עם תנועה מתמדת.
- התאים ספין עבור 5 דקות ב 1000 x g ב RT.
- הסר את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה ב-1 מ ל של PBS + 10 מ"מ EDTA.
- התאים ספין עבור 5 דקות ב 1000 x g ב RT.
- הסר את supernatant ולהשעות מחדש את התאים בנפח הולם של המאגר עבור cy, try לרוץ (עבור 1 גם של 96-הבאר להשתמש בצלחת 200 μL של PBS + 10 מ"מ EDTA).
- העבר את התאים שהושעו מחדש לבאר אחת של התחתונה העגולה 96-צלחת הבאר.
5. המרת תאים של שמרים ומיונקים לצורך שיטת המידע
- המרת דגימות פוטולוחית ללא כיסוי באמצעות מנורת UV (לראות את הטבלה של חומרים) מצויד עם 320-500 ננומטר (סגול) מסנן קרן מפוצץ, ממוקם 45 ס מ מעל הצלחת, למשך 25 דקות תוך כדי טלטול. תנאים אלה מתאימים כאשר כוח הקרן על הצלחת הוא 11.25 mW/cm2, עם כ 17,000 mJ/cm2 של מינון פוטון סך8.
6. אוסף נתונים של דאמפרט
- שיטת התאים באמצעות cytometer עם לייזרים שאינם קוליניאריים 488/561. הנתונים הבאים הם הדרישות המינימליות לחישוב של מפרט.
- השתמש בעירור 488 ננומטר/515 ערוץ הפליטה ננומטר עבור אוסף הקרינה הפלואורסצנטית של התורם.
- השתמש בעירור 488 ננומטר/595 ערוץ הפליטה ננומטר לאוסף של הקרינה הפלואורסצנטית של האות.
- השתמש בעירור 561 ננומטר/595 ננומטר לערוץ (לא-קולינארי עם ערוץ 488/595) לאיסוף הקרינה הפלואורסצנטית.
- השתמש ב 405 ננומטר לשעה/457 ערוץ הפליטה ננומטר לאוסף של הקרינה האוטומטית8.
- להשתמש בערוץ תמונה ברייטפילד לחישוב נפח.
הערה: הגדרות cytometer הדמיה עבור S. cerevisiae ס הם כדלקמן: 60x המטרה בקצב הזרימה נמוכה ורגישות גבוהה; כוחות לייזר להגדיר 405 nm ב 15 mW, 488 nm ב 15 mW, 561 nm ב 20 mW. הגדרות cytometer הדמיה עבור תאים HEK293T הם כדלקמן: 40x המטרה בקצב זרימה נמוכה רגישות גבוהה; כוחות לייזר להגדיר 405 nm ב 15 mW, 488 nm ב 15 mW, 561 nm ב 20 mW. גם לשים לב כי, cytometer הדמיה שלנו היה מותאם אישית-מתוכנן להיות מ488 ופרדים באופן מושלם ובהתאם לייזרים ננומטר 561 (כלומר, במצלמות שונות), כדי לקבל רזולוציה ברורה של התמונה לייזר ce.
- איסוף נתונים עבור 20000-50,000 תאים בודדים לכל מדגם בתוך השער החיובי של הזריחה.
- שער תאים בודדים ביחס רוחב-גובה גבוה ואזור תא קטן בניגוד לתאים או לפסולת שהיו בעלי יחס גובה-רוחב נמוך ואזורי תא גדולים או קטנים מאוד בהתאמה.
הערה: הפרמטרים המקבילים ב-cytometer שאינם הדמיה, הם FSC (פיזור קדמי) עבור גודל תא משוער ו-אס. אס. אס (פיזור צד) עבור צפיפות התא. בנוסף, השתמש בגובה פולס FSC לעומת רוחב הפולס כפרוקסי עבור האחד התאים. בנוסף, זה חיוני לא לאסוף אירועים בעלי ערכי הזריחה מעבר לגבול העליון של רגישות של cytometer. ב cytometer הדמיה שלנו, אנו מגבילים אוסף של אירועים לערך הפיקסל המרבי raw של אחד פחות ממגבלת הרוויה עבור כל ערוץ פלורסנט אנו אוספים. באופן דומה, עבור cytomטומטריים של זרימה קונבנציונאלית, נקודות נתונים בסל האינטנסיביות הגבוה ביותר (הכולל אירועים הנמצאים מעבר לטווח הזיהוי הדינאמי) אין לנתח.
- שער תאים בודדים ביחס רוחב-גובה גבוה ואזור תא קטן בניגוד לתאים או לפסולת שהיו בעלי יחס גובה-רוחב נמוך ואזורי תא גדולים או קטנים מאוד בהתאמה.
7. ניתוח נתונים
- בצע פיצוי באמצעות מדגם מערכת הפעלה של mEos 3.1 שאינם מומרים לאות התורם הטהור ו-monomeric DsRed2, הכולל ספקטרום דומה לצורה האדומה של mEos 3.1, לקבלת האות הטהורה של סימן13. לקבלת רגישות רבה יותר, ודא שערוץ הגלאי של המערכת נחשב גם כיעד גולש, בתוכנית הניתוח.
- דגימות שער לבחירת תאים בודדים בלבד (כמו באיור 2).
- לחשב את הפרמטר AmFRET כיחס של האות הכוללת של ה-סריג (488ex/595em) מחולק על-ידי האות הכוללת של מזהה המסך (561ex/595em).
- המחש נתונים באמצעות התוכנה cy, הזרמת תוכנות (עיין ברשימת החומרים).
הערה: ריכוזי ציטוסולות עבור ס' cerevisiae ס במחקר זה חושבו עם ההגדרות להלן כמו בחאן ואח '8. ניתוח נתונים בוצע באמצעות תוכנת הזרמת cy, התוכנה (ראה טבלת חומרים).
Representative Results
זיהוי של oligomers שאינם מטפסים בצורה דקדטה
יש לנו להחיל בעבר DAmFRET על האפיון של הפרדת שלב החלבון, אשר בדרך כלל התוצאה היווצרות של הרכבות חלבון גדול שניתן לאתרם גם על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטית. כדי להדגים את תחולתה של DAmFRET כדי לצמצם את הרכבות החלבון המוגבלות, ניתחנו חלבון ביולוגי המאופיין בצורה ביולוגית שיוצרת הומו-מותמים בדידים שאינם קטנים מכדי להיות מנותחים על ידי מיקרוסקופ אור: האדם שותפה לוויה, HSPE114. השוונו את הפרופילים DAmFRET של תאים שמרים ביטוי mEos 3.1 לבד, או HSPE1-mEos 3.1. האחרון הציגו מדים חיוביים ערכי amfret בעוד הציג לשעבר זניח AmFRET (איור 3A). התמונות של תאים שנרכשו על ידי הדמיה של זרימת ההדמיה (לראות את הטבלה של חומרים) חשף זריחה מפוזר בכל הערוצים-תורם, לדאוג וקבלה, הן meos 3.1-ו HSPE1-meos 3.1-הבעת תאים (איור 3b). כדי לאשר את הממצא ברזולוציה אופטית גבוהה יותר, השתמשנו במיקרוסקופיה מיקרוסקופית כדי ללכוד z-ערימות עבור שדות מרובים של תאים. אכן, הזריחה הופצה באופן אחיד בכל הציטוסול, ללא אפשרות לזיהוי, בין אם התאים הביעו HSPE1-mEos 3.1 או fluorophore לבדו (איור 3C). שימו לב כי המאפיין Kd של HSPE1 הוא סביב 3 μm אשר מעט מתחת לרגישות של המערכת שלנו, ולכן אנחנו לא לצפות את הקשר הסיגמואני של הדאגה לריכוז זה צפוי עבור הומו הדיסקרטית הזה-oligomer. עם זאת, אנו מסיקים כי damfret מכבש מזהה הומו מסיסים-oligomerization ב vivo ברזולוציה תא יחיד.
איתור מכלולים מוגבלים בנוקלאוגנציה
כדי להציג את היכולת של DAmFRET להבחין הומו בנפרד-oligomers מהרכבות מוגבלות כגון prions, ניתחנו את הגוף האנושי החלבון עולה. הואיל והוא מבצע הvivo בצורהמעשית, המוטציה הבלתי פעילה R41E של הפיברה אינה מהווה9,10. אנו הביע בתאי שמרים או mEos 3.1 לבד, או mEos 3.1 התמזגו או WT או R41E עולהPyd. תאים שמרים מבטאים את fluorophore לבד או את הצורה המוטציה של הציגPyd הציגו זניח amfret על פני טווח הריכוז כולו, המציין חוסר יכולת אינטראקציה עצמית. לעומת זאת, הציג את הפרופיל הגדול ביותר בשתי אוכלוסיות: אחד עם האמפרט זניח והשני עם AmFRET גבוה (איור 4A). כפי שאושר על ידי תמונות הזריחה (איור 4B), אוכלוסיות אלה מייצגות תאים המכילים רק חלבון מסיס או במקום זאת מכילים בעיקר חלבון מורכב, בהתאמה. הקשר הרצוף בין האוכלוסיות, לבין העובדה שהם מתרחשים בריכוזים חופפים, מעיד על כך שמכשול הנוקלאוציה מייצב את הצורה של החלבון ויכול למנוע ממנו להרכיב במשך הניסוי 8. הפער באמפרט בין שתי האוכלוסיות מעיד על כך, שברגע שמתרחשת התגרשות, היא קרובה לתבניות מונמרים אחרות לצורה המורכבת ומשיגה רמת מצב יציבה חדשה של amfret. DAmFRET אימת מידע מבניים קודם כי הנקודה מוטציה עולהPyd R41E שיבש התגררות ברחבי הריכוזים השגה על ידי מערכת ביטוי זו (איור 4a).
תחולתה בתאי יונקים
למרות תאים שמרים הם תאים מארחים אידיאליים עבור DAmFRET אנו מתבקשים להאריך את תחולתה של DAmFRET לתאי מיונקים. על מנת למנוע מוות של תאים שנגרמו על ידי פולימרים שאינם תקינים, בדקנו את DAmFRET תאים שחסרים ביטוי caspase-1. אנו הביע את אותם חלבונים בתאים HEK293T כפי שעשינו בתאי שמרים באיור 4A. הפרופילים שנוצרו על ידי DAmFRET בתאים בעלי איכות דומה לאלה שבתאי שמרים (איורים 4A,C). DAmFRET לכן, משמש בשיטה המגוונת ביותר בשיטת vivo כדי לזהות ולכמת את ההרכבות העצמיות החלבונים ברזולוציה של תא בודד עם תפוקה גבוהה ללא קשר לנוכחותם של שניהם הנראים מיקרווניים, כמו גם את סוג התא.
איור 1 : סקירה של תכנון ניסיוני עבור ס' סרביסיאה. דמות זו הותאמה מחאן ואח '8 באישור. (A) מיפוי מראה של מסגרת הקריאה הפתוחה לחלבון הריבית, המתויג עם פוטוקבריולה 3.1 ומונע על ידי מקדם inducible. (ב) כאשר הופכים לתאי שמרים, מערכת השכפול של 2μ מובילה לשינוי מספרי העתקה גבוה בין תאים. וריאציה זו, בשילוב עם רעש ההמרה של היזם GAL1, מביא להפצה רחבה של ביטוי חלבון באוכלוסיה של תאים. (ג) הניסוי הניסיוני של שמרים damfret. כדי להבטיח תאים בריאים עבור הצורך, מושבות מחוסנת תחילה עבור התפשטות מעל 16 h במדיה סינתטית המכילה את מקור הפחמן שאינו ממריץ, דקסטרוז. בעקבות התפשטות, התאים מועברים למדיה סינתטית המכילה את מקור הפחמן הגורם לגרימת, גלקטוז, במשך 16 שעות. בעקבות האינדוקציה, התאים מומרים באופן חלקי ואחיד על ידי חשיפה לאור 405 ננומטר. (ד) דגימות נותחו לאחר מכן באמצעות שימוש בזרימת הדמיה cy, לנסות. הספקטרום והעוצמות של mEos הירוק והאדום 3.1 להפוך אותם מתאימים היטב לתורם וקבלת הקבלה, בהתאמה. כאשר בסמיכות אחד לשני, כפי שקורה פולימר מתואר בתא התחתון, המולקולות האדומות יהיה זריחה עם עירור של מולקולות ירוקות (לדאוג). (ה) מגרש של תורם לעומת הכוונות לקבלה מראה קשר ליניארי הדוק על photoconversion, מראה כי היעילות של המרת התמונה אינה מושפעת מרמת הביטוי. (ו) פיזור העלילה של הקבלה מתכוון לעומת עוצמות התורם מאוכלוסיות של תאים המבטא מגוון של meos-מתויג חלבונים, בצורות מסיסים ו עמילואיד, מראה כי היעילות של המרת photoconversion מושפע היתוך שותף או מסיסות (שורות שגיאה מציינות סטיית תקן של מטריליטים ביולוגיים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : מידע על האסטרטגיה לזרימת הדמיה cy, הדמיית נתונים. שימוש באסטרטגיה המשמשת לניתוח רק תאים בודדים ממוקדים, בלתי-מודגשים, בעלי מיון אוטומטי נמוך ומבטאים את חלבון הפלורסנט. (א) היררכיה של שערים כדי להשיג ממוקדת, לחיות, תאים בודדים לניתוח. (ב) היסטוגרמה של RMS מעבר צבע של ערוץ ברייטפילד. מדידה זו מאפשרת בחירת תאים המתמקדים כראוי תחת אור משודר. (ג) מגרש בצפיפות של מעגליות לעומת השטח המציג אוכלוסייה בלתי מגודרת של תאים בודדים כדורית. (ד) העלילה הצפיפות מראה Autoפלואורסצנטית (Ch07) לעומת זריחה תורם (Ch02) העוצמה מראה אוכלוסיות נפרדות של ביטוי תאים (מגודרת) ותאים כהים. (ה) פיזור מגרש של תורם לעומת הכוונות מראה ירידה ברורה באור הזריחה של התורם במערכת משנה של תאים, כתוצאה מהסריג בין התורם לקבלה fluorophores. (ו) העלילה הסופית דפרט. תאים המכילים חלבון שאינו מורכב ממורכזים בסביבות האפס AmFRET, בעוד תאים המכילים חלבון מורכב התצוגה ערך AmFRET חיובי. שתי אוכלוסיות חופפות בעלילה מעידה על מכשול מוגבל כדי לנוקלאואת החלבון לתוך הרכבות בסדר גבוה יותר כגון amyloids. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : נתוני מייצגים של חלבונים monomeric ו הפטוניים על ידי זרימה cy, ומיקרוסקופ. (A) דמופרט פרופיל של monomeric meos 3.1 חלבון (משמאל) ו-הheptameric HSPE1 עם meos 3.1 (מימין) מראה מוגברת לתוך הרכבה הומומטריות הגדלת. (ב) תמונות של cytometer של תאים המבטאים meos 3.1 (משמאל) ו HSPE1 (מימין) המוצג בכל הערוצים שנתפסו. (ג) דמויות מייצגות של תאים שמרים ביטוי monomeric meos 3.1 (משמאל) ו HSPE1 (מימין). התמונות הן התחזיות הסכום של פרוסות מיקוד. לפחות 50 תאים התעברו בתמונה כדי לאמת את ההתבוננות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4 : פרופילי Damfret מציגים התנהגות דומה של הרכבה עצמית שלpyd האדם חלבון ב ס. cerevisiae ס ו HEK293T תאים. (A) מגרשים בצפיפות המראים amfret לעומת הריכוז ציטוסולג (ב-μm) של meos 3.1 (משמאל), או meos 3.1 התמזגו ל WT (מרכז) או monomerizing המוטציות של עולהpyd (ימין) ב S. cerevisiae ס. (ב) תמונות מן הציטוטומטר, של תאים מן השערים הנמוכים והעליונים (לוחות שמאל ומרכז, בהתאמה) המבטא WT עולהpyd; והתאים המבטאים את הR41E עולהPyd של השער המצוין (הלוח הימני). (ג) מגרשים בצפיפות מראה amfret לעומת קבלת עוצמה לאותה סדרה של חלבונים כמו ב (א) אך מבוטא בתאי HEK293T. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
DAmFRET היא השיטה המקיפה ביותר לזיהוי הרכבה עצמית של חלבון בvivo. DAmFRET משלבת לקריאה ישירה של אינטראקציות חלבונים בחלבון הומוטיפקס על מגוון רחב של ריכוז, עם רזולוציית תא בודדת ותפוקה גבוהה. הקריאה הישירה של DAmFRET והעובדה כי חלבונים התמזגו אינם דורשים לוקליזציה מסוימים subcellular או מדינה מפוסל מבטלת תוצאות חיוביות שווא ומרחיב את הישימות שלה למגוון רחב של חלבונים במיקומים שלהם subcellular. בעיקר, על-ידי תיוג אורגלים עם fluorophores התואמים ביותר עם mEos 3.1, כגון T-ספיר ו Mקרדינאל, לוקליזציה subcellular של צורות מסיסים ומורכבים של חלבונים ניתן לקבוע לצד DAmFRET.
באמצעות ההדמיה זרימת cytometer כפי שמתואר כאן, זה לוקח 8 h כדי לנתח צלחת 96-באר עם כ 20,000 תאים מגודרת בכל טוב. עם זאת, אנו גם לבצע באופן שגרתי DAmFRET עם תקן (ללא הדמיה) cytomטומטריים המשיגים תפוקה גבוהה יותר (עד 20 דגימות לדקה). למעשה, כל הזרם cytometer עם מופרדים מ488 ו 561 לייזרים nm כי הוא בחינם מחפצים יומן הרישום יש PMTs המתאים ומסננים לזיהוי תורם, לדאוג, ואותות לקבלה הוא מספיק כדי לבצע DAmFRET. כיום, רווח זה בתפוקה מגיע על חשבון מידע לוקליזציה וקביעת עוצמה, כך שהרכבה עצמית צריכה להיות מנותח כפונקציה של ביטוי חלבונים ולא ריכוז. זו אינה בעיה לניתוח איכותני. בנוסף, ייתכן שניתן יהיה להעריך את הנפח ציטוסולג על ידי החדרת fluorophore ברורים באופן שונה כדי אנדוגני "משק" החלבון אשר הביטוי באופן הדוק עם נפח cytosolic.
כפי שאנו הפגינו דרך הפריסה שלנו של DAmFRET בתאי שמרים וממגלית, ניתן להתאים בקלות למערכות ביטויים שונות. זה מאפשר הרכבה עצמית של חלבונים ללמוד בהקשרים הסלולר הילידים שלהם. כמו-כן, היא מציעה את היכולת להשוות את מכלול החלבון לאורך מודלים מפוצלים של תרבות התא כדי ללמוד את שימור המנגנונים השולטים בהרכבה עצמית של חלבון.
Disclosures
המחברים לא מצהירים על אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
אנו רוצים להודות לג לנג, ג'יי נגשתי, ג'יאנג'נג וו, טאריקה חאן ואלן קטר על עבודתם לקראת פיתוח הבקשה. עבודה זו נעשתה על מנת למלא, בין השאר, את הדרישות של מחקר התזה לדוקטורט עבור T.S.K. ו-A. R כסטודנטים הרשומים באוניברסיטה הפתוחה, בריטניה ומכון הסטורים ללימודי רפואה בבית הספר, ארה ב, בהתאמה. מידע נוסף הקשור לאלה ניתן למצוא ב https://doi.org/10.1016/j.molcel.2018.06.016. ניתן לגשת לנתונים המקוריים שבבסיס כתב יד זה ממאגר הנתונים המקורי של סטורס ב-http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1372. העבודה הזאת ממומנת על ידי פרס העצמאות המוקדמת של מנהל NIH DP5-OD009152, מארס של מטבעות המלך 5-FY17-32, ומכון הסטודרים למחקר רפואי.
תרומות לכותב הן כדלקמן. המשמה: T.S.K., S.V. וR.H.; מתודולוגיה: T.S.K., S.V., A.R.G. ו-A. B; תחקיר: S.V., T.S.K. וA.R.G.; אנליזה פורמלית: S.V. ו-T.S.K.; היווצרות נתונים: T.S.K.; הדמיה: T. S. K, ו S.V., כתיבה (טיוטה מקורית): S.V., ו T.S.K.; כתיבה (סקירה, עריכה): R.H., S.V. ו-T.S.K.; ורכישת מימון: R.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Plate | Axygen | P96-450R-C-S | |
| ASC 2-92 (mammalian plasmid) | rhm1.0095 | Available on request | |
| ASC 2-92 (R41E) (mammalian plasmid) | rhm1.0096 | Available on request | |
| ASC 2-92 (R41E) (yeast plasmid) | rhx2432 | Available on request | |
| ASC 2-92 (yeast plasmid) | rhx2431 | Available on request | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | "centrifuge" in text |
| CSM -Ura | Sunrise Science Products | 1004-100 | |
| Dextrose | EMD Millipore | DX0145-5 | |
| DMEM | Gibco | 11966025 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS-500G | |
| FCS Express 6 | DeNovo | FCS Express 6 Flow | "flow cytometry software" in text |
| Fetal Bovine Serum | VWR Life Science | 45001-108 | |
| Flow Cytometer | BioRad | ZE5 | Non-imaging flow cytometer |
| FUGENE HD | Promega | E2311 | "transfection reagent" in text |
| Galactose | VWR Life Science | 0637-500g | |
| HSPE1 (yeast plasmid) | rhx1531 | Available on request | |
| Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ImageStream X Mark II | "imaging flow cytometer" in text |
| Mammalian Cells | HEK293T | ||
| mEos3.1 (mammalian plasmid) | rhm1 | Available on request | |
| mEos3.1 (yeast plasmid) | rhx0935 | Available on request | |
| optiMEM | Gibco | 31985062 | "reduced serum media" in text |
| PBS | VWR Life Science | 45000-446 | |
| PenStrep | Gibco | 15070063 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
| Photoconversion Lamp | OmniCure | S1000 | |
| Plasmid #54525 | Addgene | #54525 | "publicly available plasmid" in text |
| Titramax 1000 Plate Shaker | Heidolph Instruments | 1000 | "plate shaker" in text |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| Yeast Strain | rhy1713 | Available on request- S288c (MATα lyp1Δ can1Δ::STE2pr_SpHIS5 his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 cln3Δ0::GAL1pr_WHI5_hphMX) |
References
- Krissinel, E., Henrick, K. Inference of macromolecular assemblies from crystalline state. Journal of Molecular Biology. 372 (3), 774-797 (2007).
- Kühner, S., van Noort, V., et al. Proteome organization in a genome-reduced bacterium. Science. 326 (5957), 1235-1240 (2009).
- Marianayagam, N. J., Sunde, M., Matthews, J. M. The power of two: protein dimerization in biology. Trends in Biochemical Sciences. 29 (11), 618-625 (2004).
- Matthews, J. M., Sunde, M. Dimers, oligomers, everywhere. Advances in Experimental Medicine and Biology. 747, 1-18 (2012).
- Glover, J. R., Kowal, A. S., Schirmer, E. C., Patino, M. M., Liu, J. J., Lindquist, S. Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of [PSI+], a heritable prion-like factor of S. cerevisiae. Cell. 89 (5), 811-819 (1997).
- Tanaka, M., Collins, S. R., Toyama, B. H., Weissman, J. S. The physical basis of how prion conformations determine strain phenotypes. Nature. 442 (7102), 585-589 (2006).
- Michaels, T. C. T., Dear, A. J., Knowles, T. P. J. Stochastic calculus of protein filament formation under spatial confinement. New journal of physics. , (2018).
- Khan, T., Kandola, T. S., et al. Quantifying Nucleation In Reveals the Physical Basis of Prion-like Phase Behavior. Molecular Cell. 71 (1), 155-168 (2018).
- Cai, X., Chen, J., et al. Prion-like polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and inflammasome activation. Cell. 156 (6), 1207-1222 (2014).
- Lu, A., Magupalli, V. G., et al. Unified polymerization mechanism for the assembly of ASC-dependent inflammasomes. Cell. 156 (6), 1193-1206 (2014).
- Zhang, M., Chang, H., et al. Rational design of true monomeric and bright photoactivatable fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (7), 727-729 (2012).
- Gietz, D., Jean, A., Woods, R. A., Schiestl, R. H. Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells. Nucleic Acids Research. 20 (6), 1425 (1992).
- Nishizawa, K., Kita, Y., Kitayama, M., Ishimoto, M. A red fluorescent protein, DsRed2, as a visual reporter for transient expression and stable transformation in soybean. Plant Cell Reports. 25 (12), 1355-1361 (2006).
- Luke, K., Apiyo, D., Wittung-Stafshede, P. Dissecting homo-heptamer thermodynamics by isothermal titration calorimetry: entropy-driven assembly of co-chaperonin protein 10. Biophysical Journal. 89 (5), 3332-3336 (2005).
