Summary
Este artigo descreve um protocolo fret-based do citometria do fluxo para quantificar o Self-assembly da proteína em células de S. cerevisiae e de HEK293T.
Abstract
A auto-montagem da proteína governa a função da proteína e compartimentaliza processos celulares no espaço e no tempo. Os métodos atuais para estudá-lo sofrem de baixa sensibilidade, leitura indireta, taxa de transferência limitada e/ou nível de população em vez de resolução de célula única. Nós projetamos uma metodologia única baseada em citometria de fluxo que aborda todas essas limitações: FRET ou DAmFRET de Anfífluoricos distribuídos. DAmFRET detecta e quantifica auto-montagens de proteínas por emissão sensibilizada FRET in vivo, permite a implantação através de sistemas de modelo-de levedura para células humanas-e atinge sensível, Single-Cell, high-throughput de leitura-outs independentemente da proteína localização ou solubilidade.
Introduction
Os ensaios para estudar interações de proteínas neutralizantes, ou "automontagem" são importantes porque o estado oligomérico e a solubilidade das proteínas determinam sua função. O proteoma abunda com homo-multimers1,2,3,4, enquanto relativamente poucas proteínas funcionam como monómeros. As proteínas também podem montar aberrantemente devido ao stress, idade ou desregulação, levando a alterações patológicas na atividade. Identificar os fatores que modulam tais eventos, ou mesmo a natureza física das assembléias, é muitas vezes excepcionalmente desafiador.
Um número crescente de proteínas são agora reconhecidos para se automontar com extraordinária cooperatividade e estequiometria indeterminada, resultando em sua demixing de outros constituintes celulares, como fases proteínas-densas. Estes tomam a forma de condensados desordenados, tais como gotículas e géis, ou filamentos altamente ordenados, tais como fibras amilóides. As flutuações conformacionais associadas a este último tornam sua formação inicial, ou nucleação, inerentemente probabilística no nível molecular5,6. Como a probabilidade de escalas de nucleação com volume, a formação de tais montagens pode ser altamente estocástica nos limites espaciais das células vivas7,8. No extremo da separação de fase limitada de nucleação estocástica são prions, conjuntos de proteínas altamente ordenados que raramente nucleam espontaneamente, mas uma vez formados, modelam seu próprio crescimento indefinidamente. Uma dessas proteínas, conhecida como ASC, executa um interruptor como prion digital na atividade de células imunes inatas de mamíferos. A auto-montagem ASC é nucleada por sua interação com proteínas específicas que se têm oligomerizadas ao patógeno vinculativo ou padrões moleculares associados ao perigo. Os conjuntos ASC, por sua vez, nucleam procaspase-1 para automontar e ativar, levando à maturação de citocinas e piroptose da célula9,10. A região da ASC responsável por sua montagem pertence à superfamília do domínio da morte, que consiste em mais de 100 membros no Proteome humano. Apesar dos papéis cruciais dos domínios da morte na imunidade inata e na morte celular programada, a maioria deles ainda não se caracterizou em relação à automontagem. A descoberta e a caracterização de proteínas adicionais com tal comportamento serão facilitadas extremamente por um leitura direto, da único-pilha do self-assembly da proteína.
As abordagens de bioquímica de proteínas clássicas para estudar a automontagem de proteínas, como a cromatografia de exclusão de tamanho e a ultracentragem, são largamente limitadas às avaliações de nível populacional. No entanto, a heterogeneidade célula a célula resultante de transições de fase limitadas por nucleação não pode ser modelada com esse nível de detalhe. As aproximações da único-pilha baseadas na microscopia de fluorescência recuperam esta capacidade, mas faltam a taxa de transferência necessária para quantificar com precisão a nucleação ou para detectar montagens raras. Além disso, os self-assemblies solúveis tais como a maioria de enzimas e oligomers do pre-amyloid, são demasiado pequenos e móveis a ser resolvidos pela microscopia de luz padrão. Eles podem ser detectados por abordagens mais sofisticadas, como espectroscopia de correlação de fluorescência, mas elas são muito limitadas no número de células e na taxa de transferência.
Os ensaios de proximidade de conjunto proteico, como o FRET e a complementação do fluoróforo dividido, oferecem uma solução potencial para esses problemas. No entanto, eles geralmente exigem o uso de dois diferentes construtos expressando a proteína de interesse fundido com tags complementares-os fluoróforos doador e aceitador no caso da FRET. Isto compromete a taxa de transferência experimental e igualmente reduz a sensibilidade devido à variação da pilha-à-pilha nos níveis relativos de doador e de acceptor. Para contornar isso, projetamos um ensaio que emprega um fluoróforo fotoconversível, mEos 3.111, que permite que um único construto expresse tanto a proteína doador-e aceitadora-etiquetada. O espectro das emissões de mEos não convertidos 3.1 (GFP-como o doador) sobrepõe-se suficientemente com o espectro da excitação de mEos photoconvertido 3.1 (dsRed-como o Acceptor) para permitir que o FRET ocorra quando as moléculas estão na proximidade próxima (< 10 nanômetro). Assim, expondo as células a uma dose empiricamente determinada de 405 nm de luz, que fotoconverte uma fração óptima do total de mEos 3.1 na forma aceitadora, nós alcançamos níveis relativos consistentes e reprodutíveis de doador e aceitador em várias amostras, níveis de expressão e experimentos. Nós medimos a fluorescência do aceitador quando excitado diretamente com luz de 561 nanômetro, ou indiretamente (pela transferência de energia do doador) com luz de 488 nanômetro (isto é, FRET sensibilizado da emissão). Nós relatamos o conjunto da proteína como a relação destes dois valores e termo ele traste amphifluoric ou AmFRET.
A fim de calcular a concentração proteica por citometria de fluxo, primeiro calculamos a intensidade média de fluorescência de Spc42 marcada com os mEos 3.1. Como as células de levedura contêm aproximadamente 1000 moléculas de Spc42, calculamos então a intensidade da fluorescência de uma única molécula verde fluorescente de mEos 3.1. Ao alavancar a fotoconversão mesmo em todas as concentrações celulares (Figura 1e), correlacionamos, então, os valores totais de fluorescência de meos 3.1 para todas as intensidades aceptoras após a fotoconversão. Em seguida, podemos dividir o número total de moles de proteínas fluorescentes pelo volume citosólico aproximado (como determinado usando citometria de fluxo de imagem) para obter a concentração citosólica total da proteína de interesse. Para cálculos exatos, por favor, consulte o manuscrito original8.
Ao expressar os mEos 3,1-proteína fundida a partir de um plasmídeo 2μ em levedura, nós sonda uma faixa de aproximadamente mil vezes de concentração de proteínas em cada amostra8. Nós alcançamos o mesmo em células HEK293T em virtude da variação na captação do plasmídeo durante o transfection, e daqui número variável da cópia.
A distribuição resultante de amfret, ou damfret, para muitos milhares de pilhas revela a concentração-dependência do self-assembly no citosol para toda a proteína do interesse. No geral, o DAmFRET representa uma metodologia capacitando para descobrir e caracterizar a automontagem de proteínas com uma combinação inédita de sensibilidade, throughput e reprodutibilidade.
Ao usar um citômetro da imagem latente permite-nos de obter medições in vivo da concentração da proteína, tais citômetros não estão ainda disponíveis em a maioria de instituições de pesquisa. Não obstante, damfret pode ser funcionado mesmo em um citômetro não-imagem típico para começ distribuições do conjunto da proteína sobre a escala da expressão da proteína.
Protocol
1. preparação de Saccharomyces cerevisiae para ensaio de damfret
- Transforme cepas de levedura experimentalmente relevantes com um plasmídeo inducible de 2μ galactose que expresse a proteína de interesse8 marcada no terminal C ou N com os meos 3.1 usando um protocolo de acetato de lítio padrão12 .
- Cresça o fermento na cultura líquida.
- Para cada proteína de consulta, inoculam colônias de levedura (transformadas), em triplicado, cada uma em 200 μL de meios de crescimento não induzindo apropriados (ou seja, meios contendo 2% de dextrose, base de nitrogênio de levedura e aminoácidos para seleção do plasmídeo) em uma placa de 96 poços ( Figura 1C).
- Incube as pilhas ao agitar em um abanador da placa (veja a tabela dos materiais) com a órbita de 1,5 milímetros em 1200 RPM em 30 ° c por 16 h.
- Induzir a expressão do gene de interesse (protocolo representativo para 16 h-algumas proteínas podem demorar mais ou menos tempo).
- Após 16 h de indução, gire a placa em 2200 x g por 2 min à temperatura ambiente (RT0 para pellet as amostras.
- Remover mídia por inversão vigorosa. Reressuscite as células com 200 μL de meios de indução apropriados (i.e., meios contendo 2% de galactose, base de nitrogênio de levedura e aminoácidos para a seleção do plasmídeo). Consulte a Figura 1C.
- Incubar as células enquanto treme a 30 ° c durante 12 h.
- Centrifugador (veja a tabela de materiais) a placa em 2200 x g para 2 minutos em RT para pellet as amostras. Remover mídia por inversão vigorosa. Reressuscite as células com 200 μL do meio de indução.
- Incubar as células enquanto treme a 1200 RPM a 30 ° c por mais 4 h. Este ressuspensão em meios frescos deve acontecer 4 h antes de executar damfret, a fim reduzir o autofluorescence.
2. criação de plasmídeo de mamíferos
- Construa um vetor de mamíferos que tem um promotor constitutivo e mEos 3.1 com um espaço reservado para inserir o gene de interesse e um vinculador entre eles.
Nota: nós construímos um vetor compatível da porta dourada, M1, de um plasmídeo publicamente disponível (veja a tabela dos materiais) com as seguintes modificações: um local existente de bsai foi removido por uma mutação de ponto G a a (na posição 3719 como por o depositado sequência). os mEos 3.1 foram obtidos por meio da mutagenese local-dirigida do fluoróforo em I157V. Os locais invertidos de BsaI seguidos pelo vinculador de 4x (EAAAR) foram inseridos, pelo conjunto de Gibson, no quadro entre o promotor CMV e os mEos 3.1 para produzir o vetor M1 final. A expressão protéica é impulsionada pelo potenciador e promotor CMV; e terminação da transcrição pelo sinal da poliadenilação SV40. - Crie uma biblioteca de inserções, compatível com o vetor construído.
Nota: nós requisitamos nossas inserções para o conjunto dourado da porta como fragmentos lineares sintéticos (veja a tabela dos materiais) flanqueado por locais de BsaI para a ligadura no M1 entre o promotor CMV e o 4x (EAAAR)-mEos 3.1.
3. cultura e transfecção de células de mamíferos
- Cultura HEK293T células em DMEM + 10% FBS + 1x PenStrep Media a 37 ° c a 5% CO2.
- No dia anterior ao transfection, semente 5 x 105 pilhas em uma placa de 6 poços com 2 ml dos meios.
- Pilhas do transfect com 2 μg do ADN do plasmídeo usando um reagente do transfection (veja a tabela dos materiais) em uma relação de 3:1 (reagente do transfection: ADN). Misture os componentes em 150 μL de meios séricos reduzidos (ver a tabela de materiais) e incubar-o em RT por 15 min, adicione a mistura a cada poço e incubar por 48 h para a expressão protéica.
- Confirme a expressão protéica após 24 h por microscopia de epifluorescência (488 nm de excitação, 515 emissão de nm).
4. preparação de células de mamíferos para o ensaio DAmFRET
- Após 48 h de expressão protéica, remova a mídia de cada poço e Lave cuidadosamente as células com 1 mL de soro fisiológico com tampão fosfato de 37 ° c (PBS). Após a lavagem, aspirar a PBS.
- Adicionar 0,5 mL de ácido tripsina-etilenodiaminotetracético (EDTA) (0,25%) e incubar por 5 min a 37 ° c.
- Adicione 0,5 mL de mídia completa de DMEM a cada poço, reressuscite as células e assegure que não haja aglomerados grandes visíveis.
- Transfira todo o volume de cada poço em 1,5 tubos de mL.
- Gire as células por 5 min a 1000 x g à temperatura ambiente (RT).
- Retire o sobrenadante e ressuspender o pellet de células em 1 mL de PBS + 10 mM de EDTA.
- Gire as células por 5 min em 1000 x g em RT.
- Retire o sobrenadante e ressuscitem o pellet celular em 1 mL 4% paraformaldeído (PFA) + 10 mM EDTA em PBS.
- Fixar células por 5 min em uma tabela de agitação com movimento constante.
- Gire as células por 5 min em 1000 x g em RT.
- Retire o sobrenadante e ressuscitem o pellet celular em 1 mL de PBS + 10 mM EDTA.
- Gire as células por 5 min em 1000 x g em RT.
- Retire o sobrenadante e ressuscitem as células em volume adequado de tampão para o funcionamento da citometria (para 1 poço de um 96-bem uso da placa 200 μL de PBS + 10 mM EDTA).
- Transfira as células ressuscipended para um poço de uma placa de fundo redondo 96-bem.
5. fotoconversão de levedura e células de mamíferos para o ensaio
- Photoconvert amostras em um microplate sem a tampa usando uma lâmpada UV (veja a tabela dos materiais) cabido com um filtro de 320-500 nanômetro (violeta) e um Collimator do feixe, posicionado 45 cm acima da placa, para uma duração de 25 minutos ao agitar. Estas condições são apropriadas quando a potência do feixe na placa é 11,25 mW/cm2, com aproximadamente 17.000 MJ/cm2 da dose total8do fóton.
6. coleção de dados DAmFRET
- Células de ensaio usando um citometro com lasers não-collineares 488/561. Os seguintes dados são os requisitos mínimos para o cálculo do FRET.
- Use um canal de emissão de 488 nm de excitação/515 nm para a coleta da fluorescência do doador.
- Utilize um canal de emissão de 488 nm de excitação/595 nm para a recolha da fluorescência do sinal FRET.
- Use um canal de emissão de 561 nm de excitação/595 nm (não-collinear com o canal 488/595) para coleta da fluorescência do aceitador.
- Use um canal de emissão de 405 nm de excitação/457 nm para a coleta de autofluorescência8.
- Utilize um canal de imagem brightfield para cálculo de volume.
Nota: os ajustes do citômetro da imagem latente para S. cerevisiae são como segue: objetivo 60x na baixa taxa de fluxo e na sensibilidade elevada; potências do laser ajustadas a 405 nanômetro em 15 MW, 488 nanômetro em 15 MW, 561 nanômetro em 20 MW. as configurações do citômetro da imagem latente para HEK293T pilhas são como segue: objetivo 40x na baixa taxa de fluxo e na sensibilidade elevada; os poderes do laser ajustaram-se a 405 nanômetro em 15 MW, 488 nanômetro em 15 MW, 561 nanômetro em 20 MW. igualmente note que, nosso citômetro da imagem latente era costume-projetado ter separado espacialmente 488 nanômetro e 561 lasers do nanômetro (isto é, em câmeras diferentes) para obter a definição desobstruída do fret do Acceptor fluorescente CE.
- Colete dados para 20000-50000 únicas pilhas por a amostra dentro de uma porta positiva da fluorescência.
- Porta células únicas por uma alta proporção e uma pequena área celular em oposição a células ou detritos aglomerados que teriam baixa proporção e áreas de células grandes ou muito pequenas, respectivamente.
Nota: os parâmetros equivalentes em um citômetro da não-imagem latente são FSC (dispersão para diante) para o tamanho aproximado da pilha e o SSC (dispersão lateral) para a granularidade da pilha. Adicionalmente, use a altura de pulso do FSC contra a largura de pulso como um proxy para a única pilha que gating. Além disso, é crucial não coletar eventos que tenham valores de fluorescência além do limite superior de sensibilidade do citometro. Em nosso cytometer da imagem latente, Nós restringimos a coleção dos eventos a um valor máximo cru do pixel de um menos do que o limite da saturação para cada canaleta fluorescente que nós coletamos. Da mesma forma, para os citometros de fluxo convencionais, os pontos de dados no compartimento de maior intensidade (que inclui eventos que estão além da faixa dinâmica de detecção) não devem ser analisados.
- Porta células únicas por uma alta proporção e uma pequena área celular em oposição a células ou detritos aglomerados que teriam baixa proporção e áreas de células grandes ou muito pequenas, respectivamente.
7. análise de dados
- Realize uma compensação usando uma amostra não fotoconvertida de mEos 3.1 para o sinal de doador puro e o DsRed2 monomérico, que tem um espectro semelhante à forma vermelha de mEos 3.1, para o sinal de aceitador puro13. Para mais sensibilidade, assegure-se de que o canal do detector FRET também seja considerado como um alvo de spillover, no programa de análise.
- Amostras de portão para selecionar apenas células únicas que são fluorescentes positivas (como na Figura 2).
- Calcule o parâmetro de AmFRET como a relação do sinal total do FRET (488ex/595em) dividido pelo sinal total do Acceptor do FRET (561ex/595em).
- Visualize dados usando um software de citometria de fluxo (consulte a tabela de materiais).
Nota: as concentrações Citosómicas para S. cerevisiae neste estudo foram calculadas com as configurações abaixo, como em Khan et al.8. A análise dos dados foi realizada por meio do software de citometria de fluxo (ver tabela de materiais).
Representative Results
Detecção de oligômeros que não formam puncta
Nós aplicamos previamente DAmFRET para a caracterização da separação da fase da proteína, que conduz tipicamente à formação de grandes conjuntos da proteína que podem igualmente ser detectados pela microscopia de fluorescência. Para demonstrar a aplicabilidade do DAmFRET a conjuntos proteicos com limitação de difração, analisamos uma proteína bioquimicamente bem caracterizada que forma discretos Homo-heptamers que são muito pequenos para serem visualizados pela microscopia de luz: o humano co-chaperonin, HSPE114. Comparamos os perfis DAmFRET de células de levedura expressando os mEos 3.1 sozinhos, ou HSPE1-mEos 3.1. O último exibiu valores de AmFRET positivos uniformes, quando o anterior exibiu AmFRET insignificante (Figura 3a). As imagens de células adquiridas pelo citometro de fluxo de imagem (ver a tabela de materiais) revelaram fluorescência difusa em todos os canais-doador, fret e aceitador, tanto para os meos 3.1-quanto para o HSPE1-meos 3.1-expressando células (Figura 3B). Para confirmar esse achado em maior resolução óptica, utilizamos microscopia confocal para capturar pilhas z para múltiplos campos de células. De fato, a fluorescência foi uniformemente distribuída em todo o citosol, sem puncta detectável, se as células expressaram HSPE1-mEos 3.1 ou o fluoróforo isoladamente (Figura 3C). Note-se que o Kd caracterizado de HSPE1 é de cerca de 3 μm que está ligeiramente abaixo da sensibilidade do nosso sistema, e, portanto, não observamos a relação sigmoidal de fret à concentração que seria esperado para este homo-Oligomer discreto. No entanto, concluímos que o DAmFRET detecta de forma robusta a homo-oligomerização solúvel in vivo na resolução de uma única célula.
Detecção de montagens limitadas por nucleação
Para demonstrar a capacidade do damfret de distinguir Homo-oligomers discretos de conjuntos de nucleação limitados, como prions, analisamos a proteína humana do inflamassoma ASC. Considerando que o WT ASCPYD forma filamentos in vivo, o mutante R41E inativo do ASCPYD não9,10. Nós expressamos em pilhas do fermento ambos os mEos 3.1 sozinho, ou os mEos 3.1 fundidos a um WT ou a R41E ASCPYD. As células de levedura expressando o fluoróforo isoladamente ou a forma mutante de ASCPYD exibiram amfret insignificante em toda a faixa de concentração, indicando uma incapacidade de se autointeragir. Em contrapartida, o WT ASCPYD exibiu um perfil damfret com duas populações: um com amfret insignificante e outro com amfret elevado (figura 4a). Como confirmado pelas imagens de fluorescência (Figura 4B), essas populações representam células que contêm apenas proteínas solúveis ou, em vez disso, contêm principalmente proteínas automontadas, respectivamente. A relação descontínua entre as populações, e o fato de que ocorrem em concentrações sobrepostas indica que uma barreira de nucleação estabiliza a forma monomérica da proteína e pode mantê-lo de montagem ao longo da duração do experimento 8. a lacuna na amfret entre as duas populações indica que, uma vez que ocorre a nucleação, perto instantaneamente modelos outros monómeros para a forma montada e atinge um novo nível de estado estacionário de amfret. DAmFRET corroborou dados estruturais anteriores que o ponto mutante ASCPYD R41E interromperam a nucleação em todas as concentrações realizáveis por este sistema de expressão (figura 4a).
Aplicabilidade de DAmFRET em células de mamíferos
Embora as células de levedura sejam células hospedeiras ideais para DAmFRET, desejámos estender a aplicabilidade de DAmFRET a células de mamíferos. A fim de evitar a morte celular causada por polímeros funcionais ASC, testamos DAmFRET em células HEK293T que faltam a expressão de caspase-1. Nós expressamos as mesmas proteínas em células HEK293T como fizemos nas células de levedura na figura 4a. Os perfis DAmFRET resultantes em células HEK293T assemelham-se qualitativamente àqueles em células de levedura (figuras 4a,C). DAmFRET, assim, serve como o método mais versátil in vivo para detectar e quantificar a proteína nucleada Self-assemblies na resolução de células únicas com alta taxa de transferência, independentemente da presença de puncta microscopicamente visíveis, bem como o tipo de célula.
Figura 1 : Visão geral do projeto experimental para S. cerevisiae. Este número foi adaptado de Khan et al.8 com permissão. (A) mapa de plasmídeo de 2 μ que mostra o quadro de leitura aberto para a proteína de interesse, marcado com os meos photoconvertible 3.1 e conduzido por um promotor induzível. (B) quando transformado em células de levedura, o sistema de replicação de 2μ leva à variabilidade do número de cópias de alta entre as células. Essa variação, combinada com o ruído transcricional do promotor GAL1, resulta em uma ampla distribuição da expressão protéica em uma população de células. (C) visão geral experimental para o ensaio de levedura damfret. Para garantir células saudáveis para o ensaio, as colônias são inoculadas pela primeira vez para a proliferação de mais de 16 h em meios sintéticos contendo a fonte de carbono não-induzindo, dextrose. Após a proliferação, as células são transferidas para meios sintéticos contendo a fonte de carbono induzindo, galactose, para 16 h. Após a indução, as células são parcialmente e uniformemente fotoconvertidas por exposição a 405 nm de luz. (D) as amostras são então analisadas usando citometria de fluxo de imagem. Os espectros e intensidades de mEos verdes e vermelhos 3.1 tornam-nos bem adaptados para um doador e aceitador FRET, respectivamente. Quando em estreita proximidade entre si, como ocorre no polímero representado na célula inferior, as moléculas vermelhas irão fluorescência após a excitação de moléculas verdes (FRET). (E) parcela das intensidades do doador versus aceitador mostrando uma relação linear apertada sobre a fotoconversão, demonstrando que a eficiência da fotoconversão não é influenciada pelo nível de expressão. F) gráfico de dispersão das intensidades médias de aceitador versus doador de populações de células que expressam uma variedade de proteínas com tags de mEos, tanto em formas solúveis quanto em amilóides, demonstrando que a eficiência da fotoconversão não é influenciada pela fusão parceiro ou solubilidade (as barras de erro indicam o desvio padrão dos triplicados biológicos). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Damfret que gating a estratégia para dados da citometria do fluxo da imagem latente. A estratégia de gating usou-se para analisar somente as únicas pilhas focalizadas, unbudded que têm a baixa autofluorescence e expressam a proteína fluorescente. (A) hierarquia de portões para obtenção de células bem focadas, ao vivo e únicas para análise. (B) histograma do gradiente RMS do canal brightfield. Esta medida permite a seleção das pilhas que são focalizadas corretamente a luz transmitida. (C) parcela de densidade da circularidade versus área que mostra a população bloqueada de células únicas esféricas unbudded. (D) parcela de densidade mostrando autofluorescência (Ch07) versus fluorescência de doador (Ch02) intensidade mostrando populações separadas de expressar células (fechadas) e células escuras. (E) dispersão de intensidades de doador versus aceitador mostrando uma perda clara na fluorescência do doador em um subconjunto de células, resultante da traste entre os fluoróforos do doador e do aceitador. (F) final damfret Plot. As células contendo proteínas não montadas são centradas em torno de zero AmFRET, enquanto as células contendo proteínas automontadas exibem um valor AmFRET positivo. Duas populações sobrepostas na parcela são indicativas de uma barreira finita para Nucleating essa proteína em uns conjuntos da elevado-ordem tais como amyloids. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Dados representativos de proteínas monoméricas e heptaméricas por citometria de fluxo e microscopia. (A) perfil damfret da proteína monomérica dos meos 3.1 (esquerda) e do HEPTAMÉRICO HSPE1 marcados com meos 3.1 (à direita) mostrando aumento da traste ratiométrica resultante do conjunto homotípico. (B) imagens do citometro, de células expressando meos 3.1 (esquerda) e HSPE1 (direita) mostradas em todos os canais capturados. (C) imagens representativas de células de levedura expressando os monoméricos meos 3.1 (esquerda) e HSPE1 (direita). As imagens são projeções de soma de fatias confocais. Pelo menos 50 células foram imaged para corroborar esta observação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Os perfis de Damfret mostram o comportamento similar do self-assembly do ASC humanoPYD proteína em S. cerevisiae e células HEK293T. (A) parcelas de densidade mostrando amfret versus concentração citosólica (em μm) de meos 3.1 (esquerda), ou meos 3,1 fundidos ao WT (centro) ou mutante monomerizante de ASCPYD (direita) em S. cerevisiae. (B) imagens do cytometer, das pilhas das portas mais baixas e superiores (painéis esquerdos e Center, respectivamente) que expressam o WT ASCPYD; e de células expressando ASCPYD R41E do portão indicado (painel direito). (C) parcelas de densidade mostrando a intensidade de amfret versus aceitador para as mesmas séries de proteínas que em (a), mas expressas em células HEK293T. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
DAmFRET é o método mais abrangente para detectar a automontagem de proteínas in vivo. Damfret combina o Read-Out direto de interações neutralizantes da proteína-proteína sobre uma escala larga da concentração, com a única definição da pilha e a taxa de transferência elevada. O Read-Out direto de DAmFRET e o fato de que as proteínas fundidas não exigem uma localização Subcellular específica ou um estado insolúvel elimina positivos falsos e estende sua aplicabilidade a uma escala larga das proteínas em seus locais subcellular nativos. Notavelmente, marcando organelas com fluoróforos que são espectralmente compatíveis com os mEos 3.1, como T-Sapphire e mCardinal, a localização subcelular de formas solúveis e montadas de proteínas pode ser determinada ao lado de DAmFRET.
Usando o citômetro do fluxo da imagem latente como descrito aqui, toma 8 h para analisar uma placa 96-well com aproximadamente 20.000 pilhas fechadas por bem. No entanto, também rotineiramente realizamos DAmFRET com citometros padrão (não-imagem) que atingem uma taxa de transferência muito maior (até 20 amostras por minuto). De facto, todo o citômetro do fluxo com os lasers espacialmente separados de 488 e de 561 nanômetro que é livre dos artefatos do ampère do registro e tem os PMTs apropriados e os filtros para detectar o doador, o fret, e os sinais do Acceptor são suficientes executar damfret. Presentemente, este ganho na taxa de transferência vem à custa da informação da localização e da determinação do volume, tais que o Self-assembly deve então ser analisado em função da expressão da proteína um pouco do que a concentração. Este não é um problema para análises qualitativas. Adicionalmente, pode ser possível estimar o volume citosólico por fusão um fluoróforo especèstica distinto a uma proteína endógena do "Housekeeping" cuja a expressão correlaciona firmemente com volume citosólico.
Como temos demonstrado através da nossa implantação de DAmFRET em ambas as células de levedura e de mamíferos, DAmFRET pode ser facilmente adaptado para diferentes sistemas de expressão. Isto permite que o Self-assembly das proteínas seja estudado em seus contextos celulares nativos. Além disso, oferece a habilidade de comparar a montagem da proteína através dos modelos extensamente divergentes da pilha-cultura para estudar a conservação dos mecanismos que governam o Self-assembly da proteína.
Disclosures
Os autores não declaram interesses concorrentes.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Jeff Lange, Jay Unruh, Jianzheng Wu, Tarique Khan, e Ellen ketter por seu trabalho para o desenvolvimento do ensaio. Este trabalho foi feito para cumprir, em parte, os requisitos para a pesquisa de teses de doutorado para T.S.K. e a. R. G como estudantes cadastrados na Universidade aberta, Reino Unido, e no Instituto de pós-graduação de pesquisa médica da faculdade de medicina, EUA, respectivamente. Informações adicionais relacionadas com o ensaio podem ser encontradas em https://doi.org/10.1016/j.molcel.2018.06.016. Os dados originais subjacentes a este manuscrito podem ser acessados a partir do repositório de dados original do Stowers em http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1372. Este trabalho foi financiado pelo prêmio de independência antecipada do diretor da NIH DP5-OD009152, March of Dimes Foundation Grant no. 5-FY17-32, e o Instituto de pesquisas médicas da Stowers.
Contribuições do autor são as seguintes. Conceitualização: T.S.K., SV e H.R.; Metodologia: T.S.K., SV, A.R.G., e A. B; Investigação: SV, T.S.K. e A.R.G.; Análise formal: SV, e T.S.K.; Curation dos dados: T.S.K.; Visualização: T. S. K e SV, escrita (rascunho original): SV, e T.S.K.; Redação (revisão, edição): H.R., SV e T.S.K.; e aquisição de financiamento: H.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Plate | Axygen | P96-450R-C-S | |
| ASC 2-92 (mammalian plasmid) | rhm1.0095 | Available on request | |
| ASC 2-92 (R41E) (mammalian plasmid) | rhm1.0096 | Available on request | |
| ASC 2-92 (R41E) (yeast plasmid) | rhx2432 | Available on request | |
| ASC 2-92 (yeast plasmid) | rhx2431 | Available on request | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | "centrifuge" in text |
| CSM -Ura | Sunrise Science Products | 1004-100 | |
| Dextrose | EMD Millipore | DX0145-5 | |
| DMEM | Gibco | 11966025 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS-500G | |
| FCS Express 6 | DeNovo | FCS Express 6 Flow | "flow cytometry software" in text |
| Fetal Bovine Serum | VWR Life Science | 45001-108 | |
| Flow Cytometer | BioRad | ZE5 | Non-imaging flow cytometer |
| FUGENE HD | Promega | E2311 | "transfection reagent" in text |
| Galactose | VWR Life Science | 0637-500g | |
| HSPE1 (yeast plasmid) | rhx1531 | Available on request | |
| Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ImageStream X Mark II | "imaging flow cytometer" in text |
| Mammalian Cells | HEK293T | ||
| mEos3.1 (mammalian plasmid) | rhm1 | Available on request | |
| mEos3.1 (yeast plasmid) | rhx0935 | Available on request | |
| optiMEM | Gibco | 31985062 | "reduced serum media" in text |
| PBS | VWR Life Science | 45000-446 | |
| PenStrep | Gibco | 15070063 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
| Photoconversion Lamp | OmniCure | S1000 | |
| Plasmid #54525 | Addgene | #54525 | "publicly available plasmid" in text |
| Titramax 1000 Plate Shaker | Heidolph Instruments | 1000 | "plate shaker" in text |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| Yeast Strain | rhy1713 | Available on request- S288c (MATα lyp1Δ can1Δ::STE2pr_SpHIS5 his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 cln3Δ0::GAL1pr_WHI5_hphMX) |
References
- Krissinel, E., Henrick, K. Inference of macromolecular assemblies from crystalline state. Journal of Molecular Biology. 372 (3), 774-797 (2007).
- Kühner, S., van Noort, V., et al. Proteome organization in a genome-reduced bacterium. Science. 326 (5957), 1235-1240 (2009).
- Marianayagam, N. J., Sunde, M., Matthews, J. M. The power of two: protein dimerization in biology. Trends in Biochemical Sciences. 29 (11), 618-625 (2004).
- Matthews, J. M., Sunde, M. Dimers, oligomers, everywhere. Advances in Experimental Medicine and Biology. 747, 1-18 (2012).
- Glover, J. R., Kowal, A. S., Schirmer, E. C., Patino, M. M., Liu, J. J., Lindquist, S. Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of [PSI+], a heritable prion-like factor of S. cerevisiae. Cell. 89 (5), 811-819 (1997).
- Tanaka, M., Collins, S. R., Toyama, B. H., Weissman, J. S. The physical basis of how prion conformations determine strain phenotypes. Nature. 442 (7102), 585-589 (2006).
- Michaels, T. C. T., Dear, A. J., Knowles, T. P. J. Stochastic calculus of protein filament formation under spatial confinement. New journal of physics. , (2018).
- Khan, T., Kandola, T. S., et al. Quantifying Nucleation In Reveals the Physical Basis of Prion-like Phase Behavior. Molecular Cell. 71 (1), 155-168 (2018).
- Cai, X., Chen, J., et al. Prion-like polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and inflammasome activation. Cell. 156 (6), 1207-1222 (2014).
- Lu, A., Magupalli, V. G., et al. Unified polymerization mechanism for the assembly of ASC-dependent inflammasomes. Cell. 156 (6), 1193-1206 (2014).
- Zhang, M., Chang, H., et al. Rational design of true monomeric and bright photoactivatable fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (7), 727-729 (2012).
- Gietz, D., Jean, A., Woods, R. A., Schiestl, R. H. Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells. Nucleic Acids Research. 20 (6), 1425 (1992).
- Nishizawa, K., Kita, Y., Kitayama, M., Ishimoto, M. A red fluorescent protein, DsRed2, as a visual reporter for transient expression and stable transformation in soybean. Plant Cell Reports. 25 (12), 1355-1361 (2006).
- Luke, K., Apiyo, D., Wittung-Stafshede, P. Dissecting homo-heptamer thermodynamics by isothermal titration calorimetry: entropy-driven assembly of co-chaperonin protein 10. Biophysical Journal. 89 (5), 3332-3336 (2005).
