Summary
Den här artikeln beskrivs ett FRET-baserat flöde flödescytometrianalys protokoll för att kvantifiera protein självmontering i både S. cerevisiae och HEK293T celler.
Abstract
Protein själv-församlingen reglerar proteinfunktion och compartmentalizes cellulära processer i tid och rum. Nuvarande metoder för att studera det lider av låg känslighet, indirekta Läs-outs, begränsad genomströmning, och/eller populationsnivå snarare än encellig upplösning. Vi konstruerade en flödescytometri-baserad enda metod som tar upp alla dessa begränsningar: distribuerade Amphifluoric FRET eller DAmFRET. DAmFRET detekterar och kvantifierar proteinself-församlingar av sensibiliserade emission FRET in vivo, möjliggör distribution över modellsystem-från jäst till mänskliga celler-och uppnår känslig, Single-cell, hög genomströmning avläsnings-oberoende av protein lokalisering eller löslighet.
Introduction
Analyser för att studera homotypic protein interaktioner, eller "själv-församling" är viktiga eftersom oligomeriska tillstånd och löslighet av proteiner diktera deras funktion. Proteomen vimlar av homo-multimers1,2,3,4, medan förhållandevis få proteiner fungerar som monomerer. Proteiner kan också montera aberrantly på grund av stress, ålder, eller misregulation, vilket leder till patologiska förändringar i aktivitet. Att identifiera de faktorer som modulera sådana händelser, eller ens den fysiska karaktären av sammansättningarna, är ofta exceptionellt utmanande.
Ett växande antal proteiner är nu erkända för att själv montera med extraordinära kooperativitet och obestämd stökiometri, vilket resulterar i deras demixning från andra cellulära beståndsdelar, som protein täta faser. Dessa tar formen av oordnade kondensat, såsom droppar och geler, eller mycket beställda glödtrådar, såsom amyloid fibrer. Den överensstämmande fluktuationer i samband med den senare göra sin ursprungliga bildandet, eller nukleation, till sin natur probabilistiska på molekylär nivå5,6. Eftersom sannolikheten för kärnbildning skalor med volym, kan bildandet av sådana församlingar vara mycket stokastiska i de rumsliga gränserna för levande celler7,8. Vid extrema av stokastisk nukleation-begränsad fasseparation är prioner, mycket beställda protein sammansättningar som bara sällan nukleate spontant, men en gång bildats, mall sin egen tillväxt på obestämd tid. Ett sådant protein, som kallas ASC, utför en digital Prion-liknande switch i aktiviteten hos däggdjurs medfödda immunceller. ASC självmontering är kärnan i dess interaktion med specifika proteiner som har själva oligomerized på bindande patogen-eller faroassocierade molekylära mönster. Den ASC församlingar i sin tur sedan procaspase-1 att själv montera och aktivera, vilket leder till cytokin mognad och pyroptos i cellen9,10. Regionen av ASC som är ansvarig för dess enhet, hör hemma till död området Superfamily, som består av över 100 medlemmar i människa proteomen. Trots de centrala rollerna för döden domäner i medfödda immunitet och programmerad celldöd, de flesta av dem har ännu inte karakteriserats med avseende på självmontering. Upptäckten och karaktäriseringen av ytterligare proteiner med sådant beteende kommer att underlättas avsevärt av en direkt, encellig avläsning av protein självmontering.
De klassiska proteinbiokemiska metoderna för att studera proteiners själv sammansättning, såsom kromatografi av storlek och ultracentrifugation, är till stor del begränsade till bedömningar på populationsnivå. Men cell-till-cell heterogenitet till följd av nukleation-begränsade fasövergångar kan inte modelleras med denna detaljnivå. Single-cell metoder baserade på fluorescens mikroskopi återfå denna förmåga, men saknar den genomströmning som krävs för att exakt kvantifiera nukleation eller att upptäcka sällsynta sammansättningar. Dessutom är lösliga själv sammansättningar, som de flesta enzymer och oligomerer före amyloid, för små och mobila att lösas med vanlig ljusmikroskopi. De kan upptäckas med mer sofistikerade metoder såsom fluorescens korrelationsspektroskopi, men dessa är mycket begränsade i cell nummer och genomströmning.
Närhet-baserade analyser av protein sammansättningen, såsom FRET och Split fluorophore kompletation, erbjuder en potentiell lösning på dessa problem. Emellertid, de kräver i allmänhet användning av två olika konstruktioner uttrycker protein av intresse smält till kompletterande Taggar-givaren och acceptorn fluoroforer i fallet med FRET. Detta äventyrar experimentell genomströmning och minskar också känsligheten på grund av cell-till-cell variation i de relativa nivåerna av givare och acceptor. För att kringgå detta, designade vi ett test som sysselsätter en photoconvertible fluorophore, mEos 3,111, som tillåter en enda konstruktion för att uttrycka både givare-och acceptor-märkta protein. Utsläppet spektrum av okonverterade mEos 3,1 (GFP-liknande givare) tillräckligt överlappar excitation spektrum av photokonverterade mEos 3,1 (dsRed-liknande acceptor) för att FRET att inträffa när molekylerna är i närheten (< 10 nm). Således, genom att utsätta celler till en empiriskt bestämd dos av 405 nm ljus, som photokonverterar en optimal fraktion av totala mEos 3,1 i acceptor form, vi uppnå konsekventa och reproducerbara relativa nivåer av givare och acceptor över flera prover, uttrycks nivåer och experiment. Vi mäter acceptorfluorescensen när upphetsad antingen direkt med 561 nm ljus, eller indirekt (genom energiöverföring från givaren) med 488 nm ljus (dvs., sensibiliserade utsläpp FRET). Vi rapporterar protein sammansättning som förhållandet mellan dessa två värden och term det amphifluoric FRET eller AmFRET.
För att beräkna protein koncentrationen med flödescytometri beräknar vi först den genomsnittliga fluorescensintensiteten hos Spc42 märkta med mEos 3.1. Eftersom jästceller innehåller cirka 1000 molekyler av Spc42, beräknar vi sedan fluorescensintensiteten hos en enda fluorescerande grön mEos 3.1-molekyl. Genom att utnyttja även photoconversion vid alla cellulära koncentrationer (figur 1e), korrelerar vi sedan totala MeOS 3,1 fluorescens värden för alla acceptor intensiteter efter photoconversion. Vi kan sedan dela upp det totala antalet mol av fluorescerande proteiner med den ungefärliga cytosoliska volym (som bestäms med hjälp av Imaging Flow cytometry) för att få den totala cytosoliska koncentrationen av proteinet av intresse. För exakta beräkningar, vänligen se originalmanuskriptet8.
Genom att uttrycka mEos 3,1-smält protein från en 2Μ plasmid i jäst, vi sond en cirka tusen gånger proteinkoncentration i varje prov8. Vi uppnår samma i HEK293T celler på grund av variation i plasmid upptag under transfektion, och därmed variabel kopia nummer.
Den resulterande fördelningen av AmFRET, eller DAmFRET, för många tusen celler avslöjar koncentrationsberoende av själv-församlingen i Cytosol för något protein av intresse. Övergripande, DAmFRET representerar en möjliggörande metod för att upptäcka och karakterisera protein självmontering med en oöverträffad kombination av känslighet, genomströmning, och reproducerbarhet.
När du använder en avbildning flödescytometerns gör det möjligt för oss att få in vivo protein koncentrationen mätningar, sådana cytometrar är ännu inte tillgängliga på de flesta forskningsinstitut. Ändå kan DAmFRET köras även i en typisk icke-avbildning flödescytometerns att få distributioner av protein sammansättningen över utbudet av proteinuttryck.
Protocol
1. beredning av Saccharomyces cerevisiae för damfret assay
- Omvandla experimentellt relevanta jäststammar med en 2Μ galaktos-inducerbar plasmid som uttrycker proteinet av intresse8 taggade antingen på C eller N ändstationen med MeOS 3.1 med en standard litium acetat protokoll12 .
- Odla jästen i flytande kultur.
- För varje fråga protein, Inokulera jäst kolonier (omvandlas), i tre exemplar, var i 200 μL av lämpliga icke-inducerande tillväxt medier (dvs., media som innehåller 2% dextros, jäst kväve bas och aminosyror för val av plasmid) i en 96-brunn tallrik ( Figur 1c).
- Inkubera celler medan skaka på en tallrik shaker (se tabellen av material) med 1,5 mm omloppsbana vid 1200 rpm vid 30 ° c för 16 h.
- Framkalla uttryck av genen av intresserar (representativt protokoll för 16 h-några proteiner kan ta mer eller mindre tid).
- Efter 16 h induktion, snurra plattan på 2200 x g för 2 min vid rumstemperatur (RT0 till pellet proverna.
- Ta bort media med kraftfull inversion. Omsuspendera celler med 200 μL av lämpligt induktions medium (dvs. mediainnehåll ande 2% galaktos, kväve bas i jästen och aminosyror för val av plasmid). Se diagram 1c.
- Inkubera celler medan du skakar vid 30 ° c i 12 timmar.
- Centrifugera (se material tabellen) plattan på 2200 x g för 2 min vid RT för att pelleten proverna. Ta bort media med kraftfull inversion. Omsuspendera celler med 200 μL av induktions mediet.
- Inkubera celler medan du skakar vid 1200 rpm vid 30 ° c i ytterligare 4 timmar. Denna resuspension i färskt Media bör ske 4 h innan du kör DAmFRET, för att minska autofluorescence.
2. skapande av däggdjurs plasmid
- Konstruera en däggdjur vektor som har en konstitutiv promotor och mEos 3,1 med en platshållare för att infoga genen av intresse och en länkare i mellan dem.
Anmärkning: vi konstruerade en Golden Gate kompatibel vektor, M1, från en allmänt tillgänglig plasmid (se tabellen av material) med följande ändringar: en befintlig bsai-plats togs bort av en punktmutation G till a (vid position 3719 enligt den deponerade sekvens). mEos 3.1 erhölls med hjälp av platsriktad mutagenes av fluorophore vid I157V. Inverterade BsaI platser följt av 4x (EAAAR) länkare infördes, av Gibson församling, i-Frame mellan CMV promotor och mEos 3,1 att producera den slutliga M1 vektor. Protein uttryck drivs av CMV Enhancer och promotor; och transkription av SV40 polyadenylationssignal. - Skapa ett bibliotek med skär som är kompatibelt med den konstruerade vektorn.
Obs: vi beställer våra skär för Golden Gate församling som syntetiska linjära fragment (se tabell över material) flankerad av BsaI platser för ligering i M1 mellan CMV promotor och 4x (EAAAR)-mEos 3,1.
3. däggdjurscell kultur och transfektion
- Culture HEK293T-celler i DMEM + 10% FBS + 1x PenStrep-media vid 37 ° c vid 5% CO2.
- På dagen före transfektion, utsäde 5 x 105 celler i en 6-brunn tallrik med 2 ml media.
- Transfect-celler med 2 μg plasmid-DNA med en transfektionsreagens (se tabell över material) vid ett förhållande på 3:1 (transfektionsreagens: DNA). Blanda komponenterna i 150 μL av reducerat serum medium (se tabell över material) och inkubera den vid RT i 15 min, tillsätt blandningen i varje brunn och inkubera för 48 h för proteinuttryck.
- Bekräfta proteinuttryck efter 24 h genom epifluorescens mikroskopi (488 nm excitation, 515 nm emission).
4. beredning av däggdjursceller för DAmFRET analys
- Efter 48 h av proteinuttryck, ta bort media från varje brunn och noggrant tvätta celler med 1 mL 37 ° c fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Efter tvättning, aspirera PBS.
- Tillsätt 0,5 mL trypsin-etylendiamintetraättiksyra (EDTA) (0,25%) och inkubera i 5 min vid 37 ° c.
- Tillsätt 0,5 ml komplett DMEM-media till varje brunn, Omsuspendera cellerna under celler och se till att inga stora klumpar syns.
- Överför hela volymen av varje brunn till 1,5 mL-rör.
- Snurra celler i 5 min vid 1000 x g vid rumstemperatur (RT).
- Avlägsna supernatanten och Omsuspendera cellpelleten i 1 mL PBS + 10 mM EDTA.
- Snurra cellerna i 5 min vid 1000 x g vid RT.
- Avlägsna supernatanten och Omsuspendera cellpelleten i 1 mL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) + 10 mM EDTA i PBS.
- Fix celler för 5 min på ett skaka bord med ständig rörelse.
- Snurra celler i 5 min vid 1000 x g vid RT.
- Avlägsna supernatanten och Omsuspendera cellpelleten i 1 mL PBS + 10 mM EDTA.
- Snurra celler i 5 min vid 1000 x g vid RT.
- Ta bort supernatanten och Omsuspendera cellerna i tillräcklig mängd buffert för flödescytometrianalys-körningen (för 1 brunn av en 96-well-platta Använd 200 μL PBS + 10 mM EDTA).
- Överför de återsuspenderade cellerna till en brunn av en rund botten 96-bra tallrik.
5. foto omvandling av jäst och däggdjursceller för analysen
- Photoconvert prover i en mikrotiterplattor utan lock med en UV-lampa (se tabellen av material) försedd med en 320-500 Nm (violett) filter och en balk kollimator, placerad 45 cm ovanför plattan, för en varaktighet av 25 min under skakning. Dessa villkor är lämpliga när balken makten på plattan är 11,25 mW/cm2, med cirka 17 000 MJ/cm2 av total Photon dos8.
6. DAmFRET datainsamling
- Analys celler med hjälp av en flödescytometerns med icke-collinear 488/561 lasrar. Följande uppgifter är de minimikrav för beräkning av FRET.
- Använd en 488 nm excitation/515 nm emissions kanal för insamling av givarens fluorescens.
- Använd en 488 nm excitation/595 nm emissions kanal för insamling av fluorescens av bandet signalen.
- Använd en 561 nm excitation/595 nm emissions kanal (icke-collinear med 488/595-kanalen) för uppsamling av acceptorfluorescensen.
- Använd en 405 nm excitation/457 nm emissions kanal för uppsamling av autofluorescence8.
- Använd en brightfield-bildkanal för volymberäkning.
Obs: Imaging flödescytometerns inställningar för S. cerevisiae är följande: 60x mål vid låg flödeshastighet och hög känslighet; Laser krafterna är inställda på 405 nm vid 15 mW, 488 Nm vid 15 mW, 561 Nm vid 20 mW. Imaging flödescytometerns inställningar för HEK293T celler är följande: 40x mål vid lågt flöde och hög känslighet; Laser krafter som är inställda på 405 nm vid 15 mW, 488 Nm vid 15 mW, 561 Nm vid 20 mW. Observera också att vår Imaging flödescytometerns var skräddarsydda för att ha rumsligt separerade 488 nm och 561 nm lasrar (dvs. på olika kameror) för att få en tydlig upplösning av FRET från acceptor fluorescen Ce.
- Samla in data för 20000-50000 enskilda celler per prov inom en fluorescens positiv grind.
- Grind enstaka celler med ett högt bildförhållande och ett litet cellområde i motsats till klumpade celler eller skräp som skulle ha låg bildförhållande och stora eller mycket små cellområden respektive.
Anmärkning: motsvarande parametrar i en icke-avbildning flödescytometerns är FSC (forward scatter) för ungefärlig Cellstorlek och SSC (Side scatter) för cell granularitet. Dessutom, använda FSC puls höjd kontra pulsbredd som en genom fullmakt för enkel cell gating. Dessutom är det viktigt att inte samla in händelser som har fluorescensvärden utöver den övre gränsen för känsligheten hos cytometer. I vår Imaging cytometer begränsar vi insamling av händelser till en rå maximal pixelvärde av en mindre än mättnadsgränsen för varje fluorescerande kanal vi samlar in. På samma sätt bör för konventionella flödescytometrar datapunkter i den högsta intensitet bin (som innehåller händelser som ligger utanför det dynamiska omfånget för detektering) inte analyseras.
- Grind enstaka celler med ett högt bildförhållande och ett litet cellområde i motsats till klumpade celler eller skräp som skulle ha låg bildförhållande och stora eller mycket små cellområden respektive.
7. analys av data
- Utför kompensation med ett icke-fotokonverterat mEos 3.1-prov för den rena givar signalen och monomeriska DsRed2, som har ett liknande spektrum till den röda formen av mEos 3.1, för den rena acceptorsignalen13. För mer känslighet, se till att bandet detektor kanal anses också som ett spridnings mål, i analysprogrammet.
- Grind prov för att välja endast enstaka celler som är fluorescenspositiva (som i figur 2).
- Beräkna AmFRET parametern som förhållandet mellan total FRET signal (488ex/595em) dividerat med den totala FRET acceptor (561ex/595em) signal.
- Visualisera data med hjälp av ett flödescytometri-program (se material tabellen).
Anmärkning: cytosoliska koncentrationer för S. cerevisiae i denna studie beräknades med inställningarna nedan som i Khan et al.8. Data analys utfördes med hjälp av flödescytometriprogramvara (se tabell över material).
Representative Results
Detektion av oligomerer som inte bildar Auktor
Vi har tidigare tillämpat DAmFRET för karakterisering av protein fasseparation, vilket typiskt resulterar i bildandet av stora protein sammansättningar som också kan upptäckas genom fluorescens mikroskopi. För att påvisa tillämpligheten av DAmFRET till diffraktions-begränsade protein sammansättningar, analyserade vi ett biokemiskt väl karakteriserat protein som bildar diskreta homo-heptamers som är alldeles för små för att visualiseras av ljusmikroskop: den mänskliga Co-chaperonin, HSPE114. Vi jämförde DAmFRET profiler av jästceller uttrycker mEos 3,1 ensam, eller HSPE1-mEos 3,1. Den senare uppvisade enhetliga positiva AmFRET värden, medan den förra uppvisade försumbar AmFRET (figur 3a). Bilderna av celler förvärvade av Imaging Flow flödescytometerns (se tabellen av material) avslöjade diffus fluorescens i alla kanaler-givare, FRET och acceptor, för både MeOS 3,1-och HSPE1-MeOS 3,1-uttrycker celler (figur 3b). För att bekräfta detta konstaterande vid högre optisk upplösning använde vi konfokalmikroskopi för att fånga z-stackar för flera cellområden. I själva verket var fluorescensen jämnt fördelad genom Cytosol, utan påvisbara puncta, om cellerna uttryckte HSPE1-mEos 3.1 eller enbart fluorophore (figur 3c). Observera att den kännetecknas Kd av HSPE1 är cirka 3 μm som är något under känsligheten för vårt system, och därför vi inte observera sigmodala förhållandet av FRET till koncentration som skulle förväntas för denna diskreta homo-Oligomer. Ändå, vi drar slutsatsen att damfret robust detekterar lösliga homo-oligomerisering in vivo vid enkel cell upplösning.
Detektering av nukleation-Limited församlingar
För att visa förmåga DAmFRET att skilja diskreta homo-oligomerer från nukleation-begränsade församlingar som prioner, analyserade vi den mänskliga inflammasomen proteinet ASC. WT ASCPYD bildar glödtrådar in vivo, inaktiva R41E Mutant av ASCPYD inte9,10. Vi uttryckte i jästceller antingen mEos 3,1 ensam, eller mEos 3,1 smält till antingen WT eller R41E ASCPYD. Jästceller uttrycker enbart fluorophore eller den muterade formen av ASCPYD uppvisade försumbar amfret över hela koncentrationsområdet, vilket indikerar en oförmåga att själv interagera. Däremot uppvisade WT ASCPYD en damfret-profil med två populationer: en med försumbar amfret och den andra med hög amfret (figur 4a). Som bekräftats av fluorescensbilderna (figur 4b) representerar dessa populationer celler som endast innehåller lösligt protein eller som i stället innehåller mestadels egensammansatt protein. Den diskontinuerliga relationen mellan befolkningarna, och det faktum att de förekommer vid överlappande koncentrationer indikerar att en kärnkrafts barriär stabiliserar monomerformen av proteinet och kan hålla den från att samlas under experimentets varaktighet 8. klyftan i amfret mellan de två populationerna indikerar att, när kärnbildning sker, det nära ögonblickligen mallar andra monomerer till den sammansatta formen och uppnår en ny steady state nivå av amfret. DAmFRET bekräftade tidigare strukturella data att den punkt Mutant ASCPYD R41E stört nukleation över de koncentrationer som uppnås genom detta uttrycks system (figur 4a).
Tillämplighet av DAmFRET i däggdjursceller
Även jästceller är idealiska värdceller för DAmFRET, vi ville förlänga tillämpligheten av DAmFRET till däggdjursceller. För att undvika celldöd orsakad av funktionella ASC Polymers, vi testade DAmFRET i HEK293T celler som saknar Caspas-1 uttryck. Vi uttryckte samma proteiner i HEK293T celler som vi gjorde i jästceller i figur 4a. Den resulterande DAmFRET profiler i HEK293T celler kvalitativt likna dem i jästceller (figurerna 4a,C). Damfret, således, fungerar som den mest mångsidiga in vivo-metoden för att upptäcka och kvantifiera kärn proteiner själv församlingar vid enkel cell upplösning med hög genomströmning oberoende av både närvaron av mikroskopiskt synlig Auktor samt celltyp.
Figur 1 : Översikt över experimentell design för S. cerevisiae. Denna siffra har anpassats från Khan et al.8 med tillstånd. (A) 2Μ plasmid karta som visar den öppna läsramen för proteinet av intresse, märkta med photoconvertible MeOS 3,1 och drivs av en inducerbara promotor. (B) när omvandlas till jästceller, det 2Μ systemet för replikering leder till hög kopia nummer variation bland celler. Denna variation, kombinerat med det transkriptionella bullret från GAL1 promotorn, resulterar i en bred spridning av proteinuttryck i en population av celler. (C) experimentell översikt för jäst damfret analys. För att säkerställa friska celler för analysen, kolonier är först inokuleras för spridning över 16 h i syntetiska medier som innehåller icke-inducerande kol källa, dextros. Efter spridning, celler överförs till syntetiska medier som innehåller inducerande kol källa, galaktos, för 16 h. Efter induktion, celler är delvis och jämnt photokonverterad genom exponering för 405 nm ljus. D) proverna analyseras sedan med hjälp av bildflödescytometri. De spektra och intensiteter av grönt och rött mEos 3,1 göra dem väl lämpade för en FRET givare och acceptor, respektive. När i närheten av varandra, som förekommer i polymeren som skildras i botten cellen, kommer de röda molekylerna fluorescens vid excitation av gröna molekyler (FRET). (E) Plot av givare kontra acceptor intensiteter som visar en stram linjär relation vid foto konvertering, visar att effektiviteten i photoconversion inte påverkas av uttrycksnivå. F) spridningsdiagram med genomsnittlig acceptor kontra givar intensitet från populationer av celler som uttrycker en mängd olika MeOS-märkta proteiner, i både lösliga och amyloid former, som visar att verkningsgraden för foto omvandling inte påverkas av fusion partner eller löslighet (felstaplar indikerar standardavvikelse för biologiska tre exemplar). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Damfret gating strategi för Imaging Flow flödescytometrianalys data. Gating strategi som används för att analysera endast fokuserade, unbudded enstaka celler som har låg autofluorescence och uttrycka fluorescerande protein. (A) hierarki av grindar för att få välfokuserade, levande, enstaka celler för analys. (B) histogram över LUTNINGS RMS för brightfield Channel. Denna mätning gör det möjligt att välja celler som är ordentligt fokuserade under genomlysnings ljus. (C) densitet Plot av cirkularitet kontra område som visar gated population av unbudded sfäriska enstaka celler. Ddensitet tomt som visar autofluorescence (Ch07) kontra givare fluorescens (Ch02) intensitet som visar separata populationer av att uttrycka celler (gated) och mörka celler. (E) spridningsdiagram av givare kontra acceptorintensiteter som visar en tydlig förlust i donatorfluorescensen i en delmängd av cellerna, till följd av gräma mellan givaren och acceptorens fluoroforer. Fslutlig damfret tomt. Celler som innehåller osammansatt protein är centrerad kring noll AmFRET, medan celler som innehåller självmonterade protein uppvisar en positiv AmFRET värde. Två överlappande populationer i observationsområdet är ett tecken på ett ändligt hinder för att nukleera det proteinet till högre ordningens sammansättningar som amyloider. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Representativa uppgifter om monomer och heptameric proteiner genom flödescytometri och mikroskopi. (A) damfret profil monomer MeOS 3,1 protein (vänster) och heptameric HSPE1 märkta med MeOS 3,1 (höger) visar ökad ratiometriska bandet till följd av homotypic församling. (B) bilder från cytometer, av celler som uttrycker MeOS 3.1 (vänster) och HSPE1 (höger) som visas i alla fångade kanaler. Crepresentativa bilder av jästceller som uttrycker monomeriska MeOS 3.1 (till vänster) och HSPE1 (höger). Bilderna är summerings prognoser för konfokalskivor. Minst 50 celler var avbildade för att bekräfta denna observation. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Damfret profiler visar liknande själv monterings beteende hos humant ASCPYD protein i S. cerevisiae och HEK293T celler. A) densitettomter som visar amfret kontra cytosolisk koncentration (i μm) av MeOS 3.1 (vänster), eller MeOS 3.1 SMÄLT till WT (Center) eller monomerizing Mutant av ASCPYD (höger) i S. cerevisiae. (B) bilder från cytometer, av celler från de nedre och övre portarna (vänster och mittpaneler, respektive) som uttrycker WT ASCPYD; och av celler som uttrycker ASCPYD R41E av indikerade utfärda utegångsförbud för (den högra panelen). C) densitettomter som visar amfret kontra acceptorintensitet för samma serie proteiner som i (a) men uttryckta i HEK293T celler. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
DAmFRET är den mest omfattande metoden för att upptäcka protein självmontering in vivo. DAmFRET kombinerar direkt läsning av homotypic protein-protein interaktioner över ett brett spektrum av koncentration, med enkel cell upplösning och högt genomströmning. Den direkta uppläsning av DAmFRET och det faktum att de smält proteiner inte kräver en specifik subcellulär lokalisering eller olösligt tillstånd eliminerar falska positiva och utökar dess tillämplighet till ett brett spektrum av proteiner på deras inhemska subcellulära platser. I synnerhet genom att märka organeller med fluoroforer som är spektralt förenliga med mEos 3.1, såsom T-Sapphire och mCardinal, kan den subcellulära lokalisering av lösliga och sammansatta former av proteiner bestämmas tillsammans med DAmFRET.
Med hjälp av Imaging Flow flödescytometerns som beskrivs här, det tar 8 h att analysera en 96-bra tallrik med cirka 20 000 gated celler per brunn. Men vi utför också rutinmässigt DAmFRET med standard (icke-Imaging) cytometrar som uppnår mycket högre genomströmning (upp till 20 prover per minut). I själva verket, någon flödescytometer med rumsligt separerade 488 och 561 nm lasrar som är fri från log amp artefakter och har lämpliga PMTs och filter för att upptäcka givare, FRET, och acceptor signaler är tillräckligt för att utföra DAmFRET. För närvarande kommer denna förstärkning i genomströmningen på bekostnad av lokaliseringsinformation och volym bestämning, så att självmontering måste sedan analyseras som en funktion av proteinuttryck snarare än koncentration. Detta är inte ett problem för kvalitativa analyser. Dessutom, det kan vara möjligt att uppskatta cytosoliska volym genom att fixera en spektralt distinkt fluorophore till ett endogent "Housekeeping" protein vars uttryck tätt korrelerar med cytosoliska volym.
Som vi har visat genom vår utplacering av DAmFRET i både jäst och däggdjursceller, kan DAmFRET enkelt anpassas till olika uttrycks system. Detta möjliggör självmontering av proteiner som ska studeras i deras inhemska cellulära sammanhang. Dessutom erbjuder det möjligheten att jämföra protein sammansättningen över vitt skilda cell-kultur modeller för att studera bevarandet av mekanismer som reglerar protein självmontering.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Vi vill tacka Jeff Lange, Jay Unruh, Jianzheng Wu, Tarique Khan, och Ellen Ketter för deras arbete mot utveckling av analysen. Detta arbete gjordes för att uppfylla, delvis, krav på doktorsavhandling forskning för T.S.K. och A. G som studenter registrerade hos Open University, Storbritannien, och Stowers Institute for Medical Research Graduate School, USA, respektive. Ytterligare analysrelaterad information finns på https://doi.org/10.1016/j.molcel.2018.06.016. Ursprungliga data bakom detta manuskript kan nås från Stowers ursprungliga dataarkivet på http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1372. Detta arbete finansierades av NIH Director ' s Early Independence Award DP5-OD009152, mars Dimes Foundation Grant nr 5-VÅ17-32, och Stowers Institute for Medical Research.
Författarens bidrag är följande. Konceptualisering: T.S.K., S.V. och R.H.; Metodik: T.S.K., S.V., A.R.G. och A. B. Utredning: S.V., T.S.K., och A.R.G.; Formell analys: S.V., och T.S.K.; Data Curation: T.S.K.; Visualisering: T. S. K och S.V., skriva (original utkast): S.V., och T.S.K.; Skriva (granska, redigera): R.H., S.V. och T.S.K.; och finansiering förvärv: R.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Plate | Axygen | P96-450R-C-S | |
| ASC 2-92 (mammalian plasmid) | rhm1.0095 | Available on request | |
| ASC 2-92 (R41E) (mammalian plasmid) | rhm1.0096 | Available on request | |
| ASC 2-92 (R41E) (yeast plasmid) | rhx2432 | Available on request | |
| ASC 2-92 (yeast plasmid) | rhx2431 | Available on request | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | "centrifuge" in text |
| CSM -Ura | Sunrise Science Products | 1004-100 | |
| Dextrose | EMD Millipore | DX0145-5 | |
| DMEM | Gibco | 11966025 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS-500G | |
| FCS Express 6 | DeNovo | FCS Express 6 Flow | "flow cytometry software" in text |
| Fetal Bovine Serum | VWR Life Science | 45001-108 | |
| Flow Cytometer | BioRad | ZE5 | Non-imaging flow cytometer |
| FUGENE HD | Promega | E2311 | "transfection reagent" in text |
| Galactose | VWR Life Science | 0637-500g | |
| HSPE1 (yeast plasmid) | rhx1531 | Available on request | |
| Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ImageStream X Mark II | "imaging flow cytometer" in text |
| Mammalian Cells | HEK293T | ||
| mEos3.1 (mammalian plasmid) | rhm1 | Available on request | |
| mEos3.1 (yeast plasmid) | rhx0935 | Available on request | |
| optiMEM | Gibco | 31985062 | "reduced serum media" in text |
| PBS | VWR Life Science | 45000-446 | |
| PenStrep | Gibco | 15070063 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
| Photoconversion Lamp | OmniCure | S1000 | |
| Plasmid #54525 | Addgene | #54525 | "publicly available plasmid" in text |
| Titramax 1000 Plate Shaker | Heidolph Instruments | 1000 | "plate shaker" in text |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| Yeast Strain | rhy1713 | Available on request- S288c (MATα lyp1Δ can1Δ::STE2pr_SpHIS5 his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 cln3Δ0::GAL1pr_WHI5_hphMX) |
References
- Krissinel, E., Henrick, K. Inference of macromolecular assemblies from crystalline state. Journal of Molecular Biology. 372 (3), 774-797 (2007).
- Kühner, S., van Noort, V., et al. Proteome organization in a genome-reduced bacterium. Science. 326 (5957), 1235-1240 (2009).
- Marianayagam, N. J., Sunde, M., Matthews, J. M. The power of two: protein dimerization in biology. Trends in Biochemical Sciences. 29 (11), 618-625 (2004).
- Matthews, J. M., Sunde, M. Dimers, oligomers, everywhere. Advances in Experimental Medicine and Biology. 747, 1-18 (2012).
- Glover, J. R., Kowal, A. S., Schirmer, E. C., Patino, M. M., Liu, J. J., Lindquist, S. Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of [PSI+], a heritable prion-like factor of S. cerevisiae. Cell. 89 (5), 811-819 (1997).
- Tanaka, M., Collins, S. R., Toyama, B. H., Weissman, J. S. The physical basis of how prion conformations determine strain phenotypes. Nature. 442 (7102), 585-589 (2006).
- Michaels, T. C. T., Dear, A. J., Knowles, T. P. J. Stochastic calculus of protein filament formation under spatial confinement. New journal of physics. , (2018).
- Khan, T., Kandola, T. S., et al. Quantifying Nucleation In Reveals the Physical Basis of Prion-like Phase Behavior. Molecular Cell. 71 (1), 155-168 (2018).
- Cai, X., Chen, J., et al. Prion-like polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and inflammasome activation. Cell. 156 (6), 1207-1222 (2014).
- Lu, A., Magupalli, V. G., et al. Unified polymerization mechanism for the assembly of ASC-dependent inflammasomes. Cell. 156 (6), 1193-1206 (2014).
- Zhang, M., Chang, H., et al. Rational design of true monomeric and bright photoactivatable fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (7), 727-729 (2012).
- Gietz, D., Jean, A., Woods, R. A., Schiestl, R. H. Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells. Nucleic Acids Research. 20 (6), 1425 (1992).
- Nishizawa, K., Kita, Y., Kitayama, M., Ishimoto, M. A red fluorescent protein, DsRed2, as a visual reporter for transient expression and stable transformation in soybean. Plant Cell Reports. 25 (12), 1355-1361 (2006).
- Luke, K., Apiyo, D., Wittung-Stafshede, P. Dissecting homo-heptamer thermodynamics by isothermal titration calorimetry: entropy-driven assembly of co-chaperonin protein 10. Biophysical Journal. 89 (5), 3332-3336 (2005).
