Summary

힌들보 리 허 혈의 뮤린 모델에서 치료 혈관 신생 평가

Published: June 08, 2019
doi:

Summary

여기에서, 중요한 뒷다리 허혈 실험 모형은 혈관 신생 치료의 효과를 평가하기 위하여 기능적, 적학 및 분자 시험의 건전지에 선행됩니다.

Abstract

중요한 사지 허혈은 (CLI) 더 낮은 사지 절단의 고위험을 수반하는 심각한 상태입니다. 금 표준 치료인 재혈관화에도 불구하고, 상당수의 CLI 환자는 외과적 또는 혈관내 혈관 혈관 혈관 혈관 화에 적합하지 않습니다. 혈관 신생 치료는 이 환자를 위한 선택권으로 나오고 있습니다 그러나 현재 조사되고 있습니다. 인간에 있는 신청의 앞에, 그 치료는 동물 모형에서 시험되어야 하고 그것의 기계장치는 명확하게 이해되어야 합니다. 뒷다리 허혈 (HLI)의 동물 모델은 쥐에서 말단 외부 불역및 대퇴 동맥 및 정맥의 결찰 및 절제에 의해 개발되었습니다. 기능, 기능학 및 분자 수준에서 허혈 및 가용 혈관 신생 요법의 효과를 평가하기 위해 포괄적 인 테스트 패널이 모였습니다. 레이저 도플러는 관류의 유량 측정 및 기능적 평가에 사용되었다. 조직 반응은 위장근육의 조직학적 섹션상에서 항 CD31 항체로 염색한 후 모세관 밀도를 분석하고 대각선 화 후 부수적인 혈관 밀도를 측정하여 평가하였다. 혈관신생 유전자의 발현은 쥐 위장관 근육으로부터 레이저 포획 미세내부를 포착한 후 내피 세포(ECs)에서만 선택된 혈관신생 인자를 대상으로 RT-PCR 표적화에 의해 정량화되었다. 이 방법은 허혈성 및 비 허혈성 사지 사이 그리고 처리되고 처리되지 않은 사지 사이 다름을 확인하는 에서 민감했습니다. 이 프로토콜은 CLI의 재현 가능한 모델과 혈관 신생 요법을 테스트하기위한 프레임 워크를 제공합니다.

Introduction

말초 동맥 질환 (PAD)은 주로 더 낮은 사지에 영향을 미칩니다. PAD는 동맥 경화증, 하반신의 혈류에 심각한 제한을 일으킬 수있는 동맥폐쇄에 의해 발생 1. 간헐적 파행은 PAD의 첫 번째 징후이며 걸을 때 근육 통을 말합니다. CLI는 PAD의 가장 가혹한 단계, 허혈성 나머지 통증, 궤양 또는 회지2를 보여주는 환자에서 진단되고. CLI를 가진 환자는 절단의 고위험이 있습니다, 치료되지 않는 경우에 특히3. 더 낮은 사지 revascularization (개천 수술 또는 혈관 내 절차에 의해) 현재 사지 회수를 달성하는 유일한 방법입니다. 그러나, CLI 환자의 약 30%는 병변의 위치, 동맥 폐색의 패턴 및 광범위한 동반변을 포함하는 이유로 이러한절차에 적합하지 않습니다 4,5. 그러므로, 혈관신생의 승진이 더 강렬한 조사에서 전략인 것과 더불어, 이 그렇지 않으면 치료할 수 없는 환자를 위해 새로운 치료가 필요합니다.

인간에서 테스트하기 전에 생체 내 새로운 치료법의 효과와 안전성을 동물 모델에서 고려해야 합니다. 몇몇 모형은 CLI의 연구 결과를 위해 개발되었습니다, 주로마우스6,7,8,9,10에있는 뒷다리 허혈 (HLI)를 유도하 여. 그러나, 이 모형은 결찰및/또는 절제되는 동맥의 본질 및 및 주위정맥 및 신경이 또한 6,7,8, 해부되는지 의 여부를 포함하여 몇몇 양상에서 다릅니다 9,10. 종합하면, 이러한 양상은 각 동물의 허혈 재관류 손상의 중증도에 영향을 미치므로 결과를 비교하기가 어렵습니다. 따라서, 허혈을 유도하는 절차와 다른 표적의 평가를 표준화하여 주어진 혈관신생 치료가 효과적일 지 여부를 평가하는 효과적인 프로토콜을 개발하는 것이 중요하다. 이러한 모든 측면을 커버하도록 설계된 실험 프로토콜은 혈관 신생 치료가 효과를 발휘하는 메커니즘과 각 결과에서 효능의 측정을 포괄적으로 이해할 수 있습니다. 우리 팀에 의해 최근에 간행된 2개의 명백한 일은 좋은 보기11,12,치료 혈관신생을 유도하기 위하여 다른 접근이 이것에 더 상세히 기술될 것이다 동일 프로토콜을 사용하여 평가되었다는 것을 프로토콜.

이 프로토콜의 전반적인 목표는 CLI의 효과를 모방하고 가양성 혈관 신생의 기능적, 적학적 및 분자 적 효과에 대한 포괄적 인 평가를위한 실험 기반을 마련 할 수있는 재현 가능한 실험 모델을 설명하는 것입니다. 에이전트.

Protocol

모든 동물 절차는 지침 2010/63/EU에 따라 되며 기관 동물 복지 기구의 승인을 받았으며 포르투갈 동물 보호 당국인 DGAV의 허가를 받았습니다(면허 번호 023861/2013). 주의: 프로토콜에 사용된 몇몇 화학물질은 독성이 있고 유해합니다. 모든 적절한 안전 관행 및 개인 보호 장비(장갑, 실험실 코트, 전신 바지, 발가락 신발)를 사용하십시오. 1. 뒷다리 허혈의 뮤린 ?…

Representative Results

기재된 프로토콜을 사용하여, 탯줄 중간엽 줄기 세포 및 저용량 이온화 방사선(LDIR)을 가설 혈관신생 요법으로 시험하였다 11,12. 레이저 도플러 관류 판독값은 허혈 유도 전과 허혈 유도 직후부터 허혈 후 45일까지 미리 지정된 시점에서 수득하였다. 레이저 도플러에 의한 조직 관류 수치는 색으로 구분된 이미지로 기록되었으며, 관류는 진한 파란색으로…

Discussion

CLI의 뮤린 모델은 대부분 프로펀다 페모리스 4,5,6,7,8,9의 기원에 불과한 대퇴동맥의 결찰로 이루어져있다. 이것은 7 일 9안에 사지에 혈류량을 복구하는 부수적인 순환의 대부분을 그대로 두는 것을 보여주었습니다. 부수적 인 침?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 호세 리노와 타니아 카르발호, 생물 이미징 시설의 머리와 인스티투토 드 메디치나 분자 주앙 로보 Antunes의 조직학 및 비교 병리학 연구소의 머리, 각각 감사합니다. 우리는 또한 노바 의과 대학 / Faculdade 드 Ciências 메디카스, 유니버시 다드 노바 드 리스보아의 해부학학과에서 Vyacheslav Sushchyk 감사합니다.

자금 지원 참조: UID/IC/0306/2016 Fundação 파라 a Ciência e a Tecnologia에 의해 투자된 프로젝트. 폴라 드 올리베이라는 Fundação 파라 아 시에엔시아 e 테크놀로지아에서 펠로우십(SFRH/BD/80483/2011)에 의해 지원됩니다.

Materials

7500 Fast Real-Time PCR Applied Biosystems Instrument
Acetone Merk 1000141000 Reagent; Caution – highly flammable
Adenosine Valdepharm Reagent
Atipamezole OrionPharma Reagent
Barium sulphate (Micropaque) Guebert 8671404 (ref. Infarmed) Reagent
Buprenorphine RichterPharma Reagent
Carl Zeiss Opmi-1 FC Surgical Microscope Carl Zeiss Microscopy, Germany Instrument
cDNA RT2 PreAMP cDNA Synthesis kit Qiagen 7335730 Reagent
Cryostat Leica CM Leica Microsystems 3050S Instrument
DAB peroxidase substrate kit DAKO;Vector Laboratories K3468 Reagent
hydrogen peroxidase Merk 1072090250 Reagent; Caution – nocif
hydrophobic pen Dako 411121 Reagent; Caution – toxic
Ketamidor Richterpharma CN:580393,7 630/01/12 Dfvf Reagent
Laser Doppler perfusion imager moorLDI2-HIR MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK 5710 Instrument
Leica DM2500 upright brightfield microscope Leica Microsystems Instrument
Medetor Virbac 037/01/07RFVPT Reagent
methanol VWR UN1230 Reagent; Caution – toxic and highly flammable
Papaverine Labesfal Reagent
Pentano Isso Merk 1060561000 Reagent; Caution – highly flammable
Power SYBR® Green Applied Biosystems 4309155 Reagent
Purified rat anti-mouse CD31 Pharmingen 550274 Reagent
RNeasy Micro kit Qiagen 74004 Reagent
Surgic-Pro 6.0 Medtronic (Coviden) VP733X Suture
VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, Rat IgG) Vectastain ABC kit; Vector Laboratories PK-4004 Reagent
Vicryl5.0/ Vicryl 6.0 Medtronic (Covidien) UL202/ UL101 Suture
Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection System Carl Zeiss Microscopy, Germany 1023290916 Instrument
Stereotaxic microscope Carl Zeiss Microscopy, Germany Instrument
Digital camera Linux Instrument

References

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Cite This Article
Ministro, A., de Oliveira, P., Nunes, R. J., dos Santos Rocha, A., Ferreira, T., Goyri-O’Neill, J., Rosa Santos, S. C. Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia. J. Vis. Exp. (148), e59582, doi:10.3791/59582 (2019).

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