Summary
Hier wird ein kritisches Hinterlimb Ischämie-Experimentalmodell vorgestellt, gefolgt von einer Batterie funktioneller, histologischer und molekularer Tests zur Beurteilung der Wirksamkeit angiogener Therapien.
Abstract
Kritische GliedmaßenIschämie (CLI) ist eine ernste Erkrankung, die ein hohes Risiko für eine Amputation der unteren Gliedmaßen mit sich bringt. Obwohl die Revaskularisation die Goldstandardtherapie ist, ist eine beträchtliche Anzahl von CLI-Patienten weder für chirurgische noch für endovaskuläre Revaskularisation geeignet. Angiogene Therapien entwickeln sich als Option für diese Patienten, werden aber derzeit noch untersucht. Vor der Anwendung beim Menschen müssen diese Therapien in Tiermodellen getestet werden, und ihre Mechanismen müssen klar verstanden werden. Ein Tiermodell der Hinterlimbischämie (HLI) wurde durch die Ligation und Exzision der distalen äußeren Ilias und Femoralarterien und Venen bei Mäusen entwickelt. Ein umfassendes Testgremium wurde zusammengestellt, um die Auswirkungen von Ischämie und vermeintlichen angiogenen Therapien auf funktioneller, histologischer und molekularer Ebene zu bewerten. Laser Doppler wurde für die Durchflussmessung und funktionelle Beurteilung der Perfusion verwendet. Die Gewebereaktion wurde durch die Analyse der Kapillardichte nach der Färbung mit dem Anti-CD31-Antikörper an histologischen Abschnitten des Magen-Darm-Muskels und durch Messung der Konlateralgefäßdichte nach der Diaphonisierung bewertet. Die Expression angiogener Gene wurde durch RT-PCR quantifiziert, das auf ausgewählte angiogene Faktoren ausschließlich in Endothelzellen (ECs) nach Lasererfassungsmikrodissektion von Mäusen gastrocnemius Muskeln abzielte. Diese Methoden waren empfindlich bei der Identifizierung von Unterschieden zwischen ischämischen und nicht-ischämischen Gliedmaßen und zwischen behandelten und nicht behandelten Gliedmaßen. Dieses Protokoll bietet ein reproduzierbares CLI-Modell und ein Framework für die Prüfung angiogener Therapien.
Introduction
Periphere arterielle Erkrankungen (PAD) betreffen vorwiegend die unteren Gliedmaßen. PAD wird durch Arteriosklerose verursacht, eine Arterienverstopfung, die schwere Einschränkung des Blutflusses in den unteren Gliedmaßen verursachen kann1. Intermittierende Claudication ist die erste Manifestation von PAD und bezieht sich auf Muskelschmerzen beim Gehen. CLI ist das schwerste Stadium der PAD, diagnostiziert bei Patienten, die ischämische Ruheschmerzen, Geschwüre oder Gangränzeigen 2. Patienten mit CLI haben ein hohes Amputationsrisiko, insbesondere wenn sie unbehandelt sind3. Die Revaskularisation der unteren Gliedmaßen (entweder durch offene Operation oder ein endovaskuläres Verfahren) ist derzeit der einzige Weg, um Gliedmaßenzubergung zu erreichen. Jedoch, etwa 30% der CLI-Patienten sind nicht für diese Verfahren geeignet, aus Gründen, die die Lage der Läsionen, das Muster der arteriellen Okklusion und umfangreiche Komorbidität4,5. Daher sind neue Therapien für diese ansonsten unheilbaren Patienten erforderlich, wobei die Förderung der Angiogenese die Strategie ist, die intensiver untersucht wird.
Vor tests am Menschen müssen die Wirksamkeit und Sicherheit neuer Therapien in vivo in Tiermodellen berücksichtigt werden. Mehrere Modelle wurden für die Untersuchung von CLI entwickelt, vor allem durch induzierende HinterlimbIschämie (HLI) bei Mäusen6,7,8,9,10. Diese Modelle unterscheiden sich jedoch in mehreren Aspekten, einschließlich der Art der Arterien, die ligiert und/oder ausgeschnitten sind und ob die Venen und Nerven umgeben sowie seziert werden6,7,8, 9,10. Zusammengenommen werden diese Aspekte die Schwere der Ischämie-Reperfusionsverletzung bei jedem Tier beeinflussen, was den Vergleich der Ergebnisse erschwert. Daher ist es wichtig, ein wirksames Protokoll zu entwickeln, in dem das Verfahren zur Induzieren von Ischämie und die Bewertung verschiedener Ziele standardisiert werden sollten, um zu beurteilen, ob eine bestimmte angiogene Therapie wirksam sein wird. Ein experimentelles Protokoll, das alle diese Aspekte abdeckt, würde ein umfassendes Verständnis der Mechanismen bieten, mit denen angiogene Therapien ihre Wirkung entfalten, und ein Maß für ihre Wirksamkeit bei jedem ihrer Ergebnisse. Zwei verschiedene Werke, die kürzlich von unserem Team veröffentlicht wurden, sind ein gutes Beispiel11,12, in dem verschiedene Ansätze zur Induzieren therapeutischen Angiogenese mit dem gleichen Protokoll bewertet wurden, das in diesem Abschnitt ausführlicher beschrieben wird. protokoll.
Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, ein reproduzierbares experimentelles Modell zu beschreiben, das die Auswirkungen von CLI imitieren und die experimentelle Grundlage für eine umfassende Bewertung der funktionellen, histologischen und molekularen Wirkungen vermeintlicher angiogener Agents.
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Protocol
Alle Tierverfahren stehen im Einklang mit der Richtlinie 2010/63/EU und wurden von der Institutionellen Tierschutzstelle genehmigt und von dGAV, der zuständigen portugiesischen Tierschutzbehörde, zugelassen (Lizenznummer 023861/2013).
VORSICHT: Mehrere der in den Protokollen verwendeten Chemikalien sind giftig und schädlich. Bitte verwenden Sie alle geeigneten Sicherheitspraktiken und persönliche Schutzausrüstung (Handschuhe, Labormantel, Hose in voller Länge und schuhe mit geschlossenem Zehen)
1. Das murine Modell der hinteren Limbischämie
HINWEIS: Alle Experimente werden an 22 Wochen alten C57BL/6 weiblichen Mäusen durchgeführt.
- Vorbereitung von Lösungen
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Vorbereitung der Anästhetikumlösung
Hinweis: Diese Anästhesie-Kombination (Medetomidin und Ketamin) bietet bis zu 30 min Immobilisierung und ein chirurgisches Fenster von 15 min. Der Effekt kann durch die Verabreichung von Atipamezol rückgängig gegeben werden.- Mit einer sauberen 1cc Spritze 1 ml Medetomidin (1 mg/Kg Körpergewicht) zurückziehen, Luftblasen für genaue Messungen eliminieren und zu einem 15 ml Falkenrohr hinzufügen.
- Mit einer sauberen 1-c-Spritze 0,75 ml Ketamin (75 mg/Kg Körpergewicht) zurückziehen, Luftblasen für genaue Messungen eliminieren und in ein 15 ml Falkenrohr mit dem Medetomidin geben.
- Fügen Sie 8,25 ml sterile Saline (0,9% NaCl) hinzu, um 10 ml Anästhetikum zu erhalten.
- Identifizieren Sie die Röhre mit dem Namen der Verbindungen, dem Gemischten Datum und dem Ablaufdatum.
- Bei 4 °C im Dunkeln lagern.
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Vorbereitung der antisedativen Lösung
- Mit einer sauberen 1-c-Spritze 1 ml Atipamezol (5 mg/Kg Körpergewicht) zurückziehen, Luftblasen für genaue Messungen eliminieren und zu einem 15 ml Falkenrohr hinzufügen.
- Fügen Sie 9 ml sterile Saline (0,9% NaCl) hinzu, um 10 ml Reversionslösung zu erhalten.
- Identifizieren Sie die Röhre mit dem Namen der Verbindungen, dem Gemischten Datum und dem Ablaufdatum.
- Bei 4 °C im Dunkeln lagern.
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Vorbereitung der postoperativen Analgesielösung
- Mit einer sauberen 1-c-Spritze 0,5 ml Buprenorphin (100 l/15-30 g Körpergewicht) abziehen, Luftblasen für genaue Messungen eliminieren und zu einem 15 ml Falkenrohr hinzufügen.
- Fügen Sie 9,5 ml sterile Saline (0,9% NaCl) hinzu, um 10 ml Analgesielösung zu erhalten.
- Identifizieren Sie die Röhre mit dem Namen der Verbindungen, dem Gemischten Datum und dem Ablaufdatum.
- Bei 4 °C im Dunkeln lagern.
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Vorbereitung der Anästhetikumlösung
- Chirurgische Induktion von Hinterlimbischämie
- Chirurgische Werkzeuge, die für diesen Eingriff benötigt werden: spitze Zange, Federschere, ophthalmologischer Nadelhalter, chirurgische Schere und nadelhalter. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Werkzeuge in einem Autoklaven vor der Verwendung. Verwenden Sie Wattestäbchen für die Zerlegung von subkutanem Fett.
- Laden Sie die Spritze mit der Anästhesielösung, bevor Sie die Maus halten.
- Halten Sie das Tier zurück, indem Sie Kraft hinter den Ohren auf das Gitter des Käfigs anwenden und so viel Haut wie möglich halten, um die Maus unbeweglich zu halten.
- Halten Sie das Tier mit gesenktem Kopf geneigt und führen Sie eine intraperitoneale Injektion der Anästhesielösung durch, wobei die Spritze mit dem Körper der Maus in einem 45°-Winkel gehalten wird.
- Prüfen Sie, ob keine Pedalentzugsreflexe anstehen, um die Tiefe der Anästhesie zu bewerten.
- Entfernen Sie das Haar von der rechten Hinterbein mit einem elektrischen Rasierer. Verwenden Sie ein Chlorhexidin Desinfektionsmittel Seifenpeeling für die Hautvorbereitung. Verwenden Sie ein sauberes Papiertuch, um die Suds zu entfernen. Tragen Sie ein chirurgisches Chlorhexidin-Peeling auf und schützen Sie den Hautbereich mit einem sterilen Vorhang, bevor Sie die Mäuse in die chirurgische sterile Suite transportieren.
- Legen Sie das Tier in dorsalen Dekubitus und halten Sie es mit den vier Gliedmaßen auseinander gestreut und mit Klebeband gesichert.
VORSICHT: Führen Sie das Verfahren auf einem beheizten Pad durch, um die Körpertemperatur des Tieres stabil zu halten; der chirurgische Eingriff wird mit einem Seziermikroskop bei 10- oder 20-facher Vergrößerung durchgeführt. - Tragen Sie eine antiseptische Chlorhexidinlösung mit steriler Gaze auf, um die Hautzubereitung fertigzustellen. Mit einer Nummer 11 chirurgische SkalpellKlinge führen Sie einen 1-cm-Hautschnitt über dem Oberschenkel des rechten Hinterbeins.
- Blunt sezieren subkutanes Fett, das das neurovaskuläre Bündel freisetzt. Mit der spitzen Zange, der Federschere und dem ophthalmologischen Nadelhalter öffnen Sie die membranöse ilio-femorale Hülle, um die distalen äußeren Ilias- und Femoralgefäße freizulegen.
- Sezieren und trennen die Gefäße (Arterie und Vene) vom Nerv. Mit einer 7,0 nicht resorbierbaren Polypropylen-Naht ligate die distale äußere Iliac arterie und Vene und die distale femorale Arterie und Vene.
- Transect das Segment der ilio-femoralen Arterie und Venen zwischen den distalen und proximalen Knoten mit der Federschere.
- Schließen Sie den Schnitt mit einer resorbierbaren Naht (z.B. 5.0 Vicryl Naht).
- Laden Sie die Spritze mit der antisedativen Lösung und verwenden Sie das gleiche Verfahren gemäß 1.2.3 und 1.2.4, um eine intraperitoneale Injektion der antisedativen Lösung durchzuführen.
- Postoperative Überwachung
HINWEIS: Tiere werden alle 15-20 min sorgfältig beobachtet, um sicherzustellen, dass sich alle Tiere gut vom Antisedativ erholen; anästhesierte Tiere werden nie unbeaufsichtigt gelassen.- Beurteilung der Erholung von der Anästhesie: 1) Überwachung der Rate und Tiefe der Atmung; 2) Beurteilung der Tierreflexe (Pedal- und Augenposition)
- Führen Sie alle 8-12 h eine subkutane Injektion der postoperativen Analgesie durch.
- Überwachen Sie die Tiere täglich nach der Operation und zeichnen Sie eine kurze Beschreibung des Gesundheitszustands des Tieres und des Aussehens der Operationsstelle auf, stellen Sie sicher, dass alle Nähte geschlossen sind.
- Den Schnitt wieder veransanallen, wenn eine Dehiszenz auftritt. Wenn dies nicht gelingt, tragen Sie einen Hautbarrierefilm auf den Schnitt auf, um vor Urin, Fäkalienausscheidungen, Reibung und Scherung der Haut zu schützen und den Heilungsprozess zu unterstützen.
2. Beurteilung der angiogenen Wirkung
HINWEIS: Nach der Ischämie-Induktion das therapeutische Mittel in der Studie anwenden und die folgenden Verfahren erreichen. Die zu anderen Zeitpunkten durchgeführten Schritte werden im entsprechenden Abschnitt beschrieben.
- Laser Doppler Perfusionsbildgebung
- Entfernen Sie das Haar von beiden Hinterbeinen einen Tag vor der Analyse mit einem elektrischen Rasierer gefolgt von Enthaarungscreme.
- Anästhesisieren Sie die Mäuse mit der Anästhesielösung.
- Legen Sie das Tier für 5 min auf ein 37 °C Heizkissen, um sicherzustellen, dass sich die Temperatur während des Vorgangs nicht ändert.
- Legen Sie das Tier in die Supine-Position mit gesicherten Beinen in einer verlängerten Position. Messen Sie den Abstand zwischen rechten und linken Beinen und Füßen für jedes Tier, da die Positionierung des Tieres ähnlich sein sollte, wenn das Verfahren wiederholt werden muss, um Veränderungen der Hinterkieferperfusion im Laufe der Zeit zu folgen.
- Beginnen Sie mit der Datenerfassung mit einem Laser-Doppler-Perfusionsbildner.
- Nach Abschluss der Übernahme die Anästhesie mit der antisedativen Lösung wiederherstellen.
- Öffnen Sie die Bildanalyse-Software und zeichnen Sie die Interessenregion (ROI) um das ischämische Hinterglied und einen vergleichbaren ROI um das nicht-ischämische Hinterglied.
- Beobachten Sie die Flusswerte und bestimmen Sie die Perfusion als Verhältnis der Perfusion in der ischämischen Gliedmaße zu der in der nicht-ischämischen Extremität. Veränderungen des Perfusionsverhältnisses werden im Laufe der Zeit gemessen.
- Immunhistochemie und Kapillardichteanalyse
- Nach der Anästhesisierung, opfern Sie die Mäuse durch Zervix-Dislokation.
- Um die Gastrocnemius-Muskeln beider Beine zu ernten, zuerst, entfernen Sie die Haut von beiden Hinterbeinen.
- Identifizieren Sie die Achillessehne und trennen Sie die Sehne vom Knochen mit einem 11-Blatt-Skalpell.
- Halten Sie die Achillessehne und trennen Sie den Muskel von der Tibia und Fibel bis zum Kniegelenk mit einer Federschere.
- Trennen Sie den Bizeps femoris vom Magen-Darm-Muskel.
- Verwenden Sie eine Federschere, um die Einfügungen der Gastrocnemius-Muskeln auf Kniegelenksebene zu schneiden.
- Legen Sie die geernteten Gastrocnemius-Muskeln mit Hilfe von 10% Tragacanth in querer Ausrichtung auf eine kleine Korkscheibe.
- Die Proben in flüssigstickstoffgekühltem Isopentan einfrieren und bei -80 °C bis zum Schnitt lagern.
- Schneiden Sie 7 m Abschnitte der Muskelproben auf einem Kryostat und montieren Sie auf Glasrutschen.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. - Befestigen Sie die Glasgletten in einer Flasche mit gekühltem reinem Aceton (ca. 50 ml) für 10 min bei -20 °C.
- Wasserstoffperoxidase 0,3% in Methanol (50 ml) verdünnt für 30 min bei Raumtemperatur hinzufügen.
- Zweimal in phosphatgepufferter Saline (PBS) (50 ml) für insgesamt 10 min waschen.
- Verwenden Sie einen hydrophoben Stift um die Abschnitte.
HINWEIS: Die Verwendung eines hydrophoben Pens ermöglicht es, die Menge der während des Protokolls verbrauchten Lösungen zu reduzieren. Für alle Inkubationen verwenden Sie 100 l aller Lösungen pro Abschnitt. - Tragen Sie eine Blockierlösung von 5% Kaninchenserum in PBS für 30 min bei Raumtemperatur auf.
- Inkubieren Sie die Proben für 1 h bei Raumtemperatur mit monoklonenantiktem Anti-CD31-Rattenantikörper, der bei 1:500 in 1 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS verdünnt wird.
- Waschen Sie dreimal in PBS für insgesamt 30 min.
- Fügen Sie einen sekundären biotinylierten Kaninchen Anti-Ratten-IgG-Antikörper bei 1:200 in 1% BSA in PBS und 5% Kaninchenserum für 30 min bei Raumtemperatur hinzu.
- In PBS wie bisher waschen und beschrifteten avidinkonjugierten Peroxidase-Komplex für 30 min bei Raumtemperatur hinzufügen.
- Spülen Sie 3 mal in PBS für 5 min und fügen Sie Diaminobenzidin (DAB) Peroxidase Substrat Kit für weitere 5 min.
- Die Abschnitte mit Hämatoxylin für 10 s vor der Montage verfärben.
- Messen Sie die Kapillardichten mit einem aufrechten Hellfeldmikroskop (d. h. Anzahl der Kapillaren pro Anzahl von Myozyten) in 2 verschiedenen Abschnitten von 4 verschiedenen anatomischen Bereichen in jeder Probe.
- Kontrastmittelperfusion
- Anästhesisieren Sie die Mäuse mit der Anästhesielösung.
- Führen Sie eine mediane Laparotomie mit einer Skalpellklinge der Nummer 15 durch.
- Die Bauchaorta und die kaudale Vena cava aussetzen, nachdem sie seitlich den kleinen Darm zurückgezogen und eine Federschere verwendet haben.
- Setzen Sie einen 26-Spur-Katheter kranial in die Bauchaorta und einen anderen in die kaudale Vena cava in die gleiche Richtung ein.
- Sichere Katheter an Ort und Stelle mit einer 5/0 Seidennaht, um eine Aufenthaltsnaht durchzuführen.
- Waschen Sie das Gefäßsystem mit einer 37 °C-Salinelösung mit Heparin (500 Einheiten/100 ml), die mit einer 10 ml Spritze in die Bauchaorta geschoben wird. Fahren Sie mit sanfter Perfusion fort, bis eine klare Lösung aus dem Katheter im inneren der kaudalen Vena cava kommt.
HINWEIS: Normalerweise sind 30 bis 40 ml einer heparinisierten Salinelösung erforderlich, um das Gefäßsystem einer erwachsenen Ratte zu spülen. - Eine Mischung aus Adenosin (1 mg/L) und Papaverin (4 mg/L) 2 min.
- Injizieren Sie in den Aortenkatheter 10 ml einer Mischung aus 50% Bariumsulfat und 5% Gelatine.
HINWEIS: Die Lösung muss bei 60 °C gehalten werden, um eine Verdickung zu vermeiden. - Lassen Sie die Mäuse bei - 4 °C für mindestens 4 h, damit der Gefäßguss verfestigt werden kann.
- Entfernen Sie die Haut aus dem Unterkörper jeder Maus.
- Diaphonisierung - Spalteholz-Technik
- Fixieren Sie die Mäuse durch Eintauchen in eine 10% Formaldehydlösung für mindestens 72 h.
- Bleichen Sie die Mäuse durch Eintauchen in eine 30% Wasserstoffperoxidlösung für 24 h.
- Dehydrieren Sie die Mäuse mit der Gefriersubstitutionstechnik. Diese Methode besteht darin, die Mäuse aufeinanderfolgende Passagen (im Durchschnitt vier) von reinem Aceton bei - 20 °C für jeweils 24 h zu unterwerfen.
- Klären Sie die Mäuse, indem Sie sie in eine Lösung eintauchen, die ein Gemisch aus 100% Benzylbenzoat und 100% Methylsalicylat in einem Anteil von 3:5 enthält (dieses Gemisch wird auch als Spalteholzlösung bezeichnet) 13.
- Lassen Sie die Mäuse in der Spalteholz-Lösung in einer Vakuumkammer eintauchen, bis sie diaphan wird, was in der Regel 5 bis 7 Tage dauert.
- Ersetzen Sie die Lösung, wenn es dunkel wird, bevor die Probe klar wird.
- Quantifizierung von Begleitgefäßen
- Beobachten Sie die Mäuse, die in der Spalteholz-Lösung unter Transillumination mit einem stereotaxic Mikroskop aufgehängt sind. Verwenden Sie Mikrochirurgie Zangen, um es sanft zu greifen und zu bewegen.
- Fotografieren Sie die gesamten Gliedmaßen mit einer Mit-Digitalkamera, die mit dem Mikroskop verbunden ist.
- Besorgen Sie sich ganze Gliedmaßenfotos mit der entsprechenden Software.
- Führen Sie eine manuelle Segmentierung der Begleitgefäße durch, indem Sie sie mit der entsprechenden Software hervorheben.
ANMERKUNG: Kollateralgefäße werden gemäß der Definition von Longland definiert, einem definierten Stamm, einer mittleren Zone und einem wiedereintretenden, mit einem Durchmesser zwischen 20 und 300 m, ausgenommen Femoral-, Sapheno- und Poplitealarterien und alle venösen Strukturen. - Definieren Sie ROIs in jeder Maus im gleichen anatomischen Bereich im Adduktor, um die Umgebung und unterhalb der chirurgischen Okklusion.
- Quantifizieren Sie die Kollateralgefäßdichte (CVD) in äquivalenten ROIs, die 20 % der gesamten Gliedmaßenfläche entsprechen. Die CVD wird als Verhältnis zwischen dem Gefäßbereich und den ROIs-Bereichen berechnet. Alle Dichtemessungen werden mit der ImageJ-Software durchgeführt.
HINWEIS: Es wird davon ausgegangen, dass der CVD-Wert der nicht-ischämischen Extremität für jede Maus 100 % entspricht, um Variationen in den Anatomie-, Perfusions- oder Diaphonisierungsverfahren auszuschließen. Der CVD-Prozentsatz in der ischämischen Gliedmaße wurde daher relativ zum nicht-ischämischen berechnet. - Bestimmen Sie den Prozentsatz des CVD-Anstiegs als Differenz zwischen dem CVD-Prozentsatz zwischen den ischämischen und nonischenmischen Gliedmaßen.
- Laseraufnahme Mikrodissektion von Kapillaren
- Nach der Anästhesisierung, opfern Sie die Mäuse durch Zervix-Dislokation.
- Um die Gastrocnemius-Muskeln beider Beine zu ernten, entfernen Sie die Haut von Mäusen beide Hinterbeine.
- Identifizieren Sie die Achillessehne und trennen Sie die Sehne vom Knochen mit einem 11-Blatt-Skalpell.
- Halten Sie die Achillessehne und trennen Sie den Muskel von der Tibia und Fibel bis zum Kniegelenk mit einer Federschere.
- Trennen Sie den Bizeps femoris vom Magen-Darm-Muskel.
- Verwenden Sie eine Federschere, um die Einfügungen der Gastrocnemius-Muskeln auf Kniegelenksebene zu schneiden.
- Legen Sie die geernteten Gastrocnemius-Muskeln mit Hilfe von 10 % Tragacanth in querer Ausrichtung auf eine kleine Korkscheibe.
- Die Proben in flüssigstickstoffgekühltem Isopentan einfrieren und bei -80 °C bis zum Schnitt lagern.
- Auf einem Kryostat 12 m Abschnitte der Muskelproben schneiden und auf Glasrutschen montieren.
HINWEIS: Nehmen Sie für den RNA-Schutz einen vorgekühlten Schlitten und berühren Sie die Rückseite des Schlittens mit dem Finger (Handschuhe), um nur den Bereich für die Platzierung des Abschnitts zu erwärmen. Abschnitt vom Kryostatmesser durch Berührung mit dem erwärmten Bereich übertragen und bei -20 °C im Kryostat 2-3 min trocknen. Das Protokoll kann hier angehalten werden.- Befestigen Sie die Glasgletten in einer Flasche mit gekühltem reinem Aceton (ca. 50 ml) für 5 min bei -20 °C und trocknen Sie sie lufttrocken.
- Verwenden Sie einen hydrophoben Stift um die Abschnitte.
HINWEIS: Die Verwendung des hydrophoben Pens trägt zur Reduzierung der Während des Protokolls verbrauchten Lösungen bei. Für alle Inkubationen verwenden Sie 100 l aller Lösungen pro Abschnitt. - Rehydrieren Sie mit 2 M NaCl/PBS bei 4 °C und inkubieren Sie die Proben über Nacht bei 4 °C mit monoklonen Anti-CD31-Ratten-Monoklon-Antikörpern bei 1:500 in 2M NaCl/PBS.
- Zweimal in 2M NaCl/PBS für insgesamt 6 min waschen.
- Fügen Sie einen sekundären biotinylierten Kaninchen Anti-Ratten-IgG-Antikörper um 1:200 in 2M NaCl/PBS und 5% Kaninchenserum für 30 min bei 4 °C hinzu.
- 2 M NaCl/PBS wie bisher einwaschen und beschrifteten avidinkonjugierten Peroxidase-Komplex 30 min bei 4 °C hinzufügen.
- Spülen und fügen Sie DAB Peroxidase Substrat Kit für 5 min.
- Die Abschnitte in eiskaltem 90 % Ethanol, gefolgt von 100 % Ethanol, dehydrieren und trocknen lassen.
- Sezieren Sie 10 000 Kapillaren pro Mäuse mit einem Laser-Mikrodissektionssystem, das mit einem gepulsten Festkörperlaser 355 nm ausgestattet ist, und katapultieren Sie die dissekierten Kapillaren in eine Mikrofugenrohr-Klebstoffkappe.
- RNA-Extraktion, cDNA-Synthese, Vorverstärkung und RT-PCR
- Isolieren Sie die gesamte RNA aus den mikrosezierten Kapillaren mit einem geeigneten Kit, die erhaltene Gesamt-RNA liegt zwischen 1,5-3 ng/l.
- Verwenden Sie ein cDNA-Synthesekit für die Synthese und zwei Runden der Vorverstärkung, indem Sie die in Tabelle 1beschriebenen Primer verwenden.
- Führen Sie RT-PCR für dieselben Ziele aus, die im vorherigen Schritt beschrieben wurden. Verwenden Sie ein Programm, das aus einem ersten Denaturierungsschritt bei 95 °C für 10 min besteht, gefolgt von 50 Zyklen bei 95 °C für 15 s und bei 60 °C für 1 min.
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Representative Results
Mit dem beschriebenen Protokoll wurden Nabelschnur mesenchymale Stammzellen und niedrig dosierte ionisierende Strahlung (LDIR) als vermeintliche angiogene Therapien 11,12getestet. Laser Doppler Perfusionswerte wurden vor der Ischämie-Induktion und zu vorab festgelegten Zeitpunkten von unmittelbar nach der Ischämie-Induktion bis 45 Tage nach der Ischämie erhalten. Gewebeperfusionsmessungen per Laser Doppler wurden als farbcodierte Bilder aufgezeichnet, ohne Durchblutung als dunkelblau und die höchste Perfusionsstufe als rot angezeigt. Wie in den Abbildungen 2A und 3A dargestellt und in den Abbildungen 2B und 3Bquantifiziert, wurde bei allen Mäusen unmittelbar nach der Induktion der Reproduzierbarkeit der Technik zur Indlimbischämie. Wichtig ist, dass die Schwere der Ischämie bei allen Tieren ähnlich ist. Ein ROI wurde um das ischämische Hinterglied gezogen und ein vergleichbarer ROI wurde um das nicht-ischämische Hinterglied gezogen, um die Quantifizierung der Perfusion durchzuführen. Perfusion wird als Verhältnis der Perfusion in der ischämischen Gliedmaße zu dem in der nicht-ischämischen Gliedmaße ausgedrückt. Veränderungen des Perfusionsverhältnisses werden im Laufe der Zeit gemessen.
Die Immunhistochemie wurde zwischen 15 und 90 Tagen nach der Ischämie durchgeführt. Die Diaphonisierung erfolgte zwischen 19- und 90-Tage nach der Ischämie und der Kapillarmikrodissektion zwischen 45- und 70-Tägiger Post-Ischämie-Induktion, die sicherstellt, dass die verschiedenen pro-angiogenen Therapien eine anhaltende und anhaltende proangiogene Wirkung induzierten.
Quantifizierung von CD31-positiven Kapillaren in histologischen Abschnitten des Gastrocnemius-Muskels bewertete die Kapillardichte und dies wurde als Anzahl der Kapillaren pro Anzahl von Muskelfasern ausgedrückt. Wie in Abbildung 4dargestellt, war die Kapillardichte in der ischämischen im Vergleich zur nicht-ischämischen Extremität größer.
Zur Bewertung der Kollateralgefäßdichte wurden Mäuse diaphonisiert und ein gleichwertiger ROI, der 20 % der Gliedmaßenfläche entspricht, für die Quantifizierung ausgewählt. Die Kollateralgefäßdichte in der ischämischen Extremität stieg kontinuierlich an, so dass Daten über behandelte und Kontrollglieder als Prozentsatz der Erhöhung der Collateral-Gefäßdichte in der ischämischen Gliedmaße relativ zur nicht-ischämischen Glieder ausgedrückt wurden (Abbildung5 ).
Die Expression pro-angiogener Gene durch ECs wurde durch quantitative RT-PCR von CD31-positiven Zellen analysiert. Transkripte für Vegfr2, Vegfr1, Fgf2, Angpt2, Pdgfc, Tgfb2, Hgf und Met zeigten eine deutliche Variation in der Expression zwischen ischämischen und nicht-ischämischen Gliedmaßen, ausschließlich bei Mäusen, die dem pro-angiogenen Reiz ausgesetzt waren (Abbildung 6).
Abbildung 1 : Schematische Darstellung der Anatomie der Maus-Hinterkiefer-Vaskulatur, die die Ligationsstellen zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : LDIR erhöht die Perfusionsrückgewinnung. Nach der chirurgischen Induktion von einseitigem HLI wurden beide Hinterbeine von C57BL/6-Mäusen mit vier Tagesfraktionen von 0,3Gy in aufeinander folgenden Tagen bestrahlt oder bestrahlt und konnten sich erholen. (A) Repräsentative Laser-Doppler-Flussbilder vor HLI und an den Tagen 0 (d0) und 15 (d15) nach der HLI-Induktion. (B) Quantitative Auswertung des Blutflusses, ausgedrückt als Verhältnis von ISC zu NISC Gliedmaßen, zeigte signifikant verbesserte Gliedmaßenblutperfusion bei bestrahlten Mäusen im Vergleich zu scheinbestrahlten Mäusen sowohl an den Tagen 15 (d15) als auch 45 (d45) nach dem HLI. Die Veränderungen zwischen den Gruppen wurden durch zweiseitig wiederholte Messungen ANOVA gefolgt von Bonferroni Post-hoc-Test (n = 12 Mäuse pro Gruppe) bewertet. Es werden Mittel mit SEM angezeigt. P < 0,001; ns, nicht signifikant. HLI, hinterdlimb ischmia; ISC, ischämisch; NISC, nicht-ischämisch; Pre-HLI, vor der Hinterbleibsischämie. Angepasst von 11. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 : Umbilical Cord mesenchymale Stammzellen (UCX) Perfusionsrückgewinnung zu erhöhen. UCX oder ihr Fahrzeug (als Kontrolle) wurden 5 Stunden nach der HLI-Induktion im ischämischen Gastrocnemius-Muskel verabreicht. (A) Repräsentative Laserdoppler-Flussbilder vor (PRE-HLI), unmittelbar nach (d0 POST-HLI) und bei 7, 14 und 21 Tagen nach HLI-Induktion (d7 POST-HLI, d14 POST-HLI, d21 POST-HLI). (B) Die quantitative Bewertung des Blutflusses, ausgedrückt als Verhältnis von ISC zu NISC Gliedmaßen, zeigte eine signifikant verbesserte Gliedmaßenblutperfusion in nabelschnurmechymalen Stammzellen -behandelten Mäusen bei 7, 14 und 21 Tagen nach HLI. (n=16 für jede Versuchsgruppe; D7: t (22,69) = 4,26; P - 0,001; Effektgröße war 1,51 und Leistung 0,98; D14: t (30) = 4,7; P - 0,001; Effektgröße war 1,66 und Leistung 0,99; D21: t (30) = 7,22; P - 0,001; Effektgröße war 2,56 und Leistung 0,99). HLI, hinterdlimb ischmia; ISC, ischämisch; NISC, nicht-ischämisch. Angepasst von11. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4 : LDIR erhöht die Kapillardichte. (A) Repräsentative Abschnitte der scheinbestrahlten und bestrahlten ischämischen Gastrocnemius-Muskeln an Tag 45 nach HLI. Kapillaren und Myozyten wurden durch CD31-Immunhistochemie bzw. Hämatoxylin identifiziert. Scale bar, 150 mm. (B) Quantitative Analyse ergab eine erhöhte Kapillardichte (Kapillaren/Myozyten) in bestrahlten ischämischen Gastrocnemius-Muskeln im Vergleich zu scheinbestrahlten ischämischen an den Tagen 15 und 45 nach hlI. Gemischte ANOVA gefolgt von Bonferroni Post-hoc-Test wurde mit einem innerhalb des Subjektfaktors von ISC und zwischen den Probanden Faktoren der Tages- und Bestrahlung (n=6 Mäuse pro Gruppe) durchgeführt. Es werden individuelle Daten und Mittel wertet. P<0,001; ns, nicht signifikant. ISC, ischämisch; NISC, nicht-ischämisch. Angepasst von11. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: LDIR erhöht die Collateral-Dichte. (A) Illustrative Bilder ausgewählter ROIs für scheinbestrahlte und bestrahlte Mäuse. ISC- und NISC-Glieder an Tag 90 nach HLI werden angezeigt. Skala bar, 300 mm. (B) Daten werden als Prozentsatz der CVD-Zunahme der ISC-Extremität relativ zum NISC dargestellt. An den Tagen 15 und 90 nach hlI zeigten bestrahlte Mäuse einen signifikant höheren CVD-Anstieg (%) gegen scheinbestrahlte Mäuse. Zweiseitig wurde ANOVA durchgeführt, gefolgt von einem Bonferroni-Post-hoc-Test mit einem zwischen den Probandenfaktoren Tag und Bestrahlung (n=6 Mäuse pro Gruppe). Es werden individuelle Daten und Mittel wertet. *P<0.05; P<0,001; ns, nicht signifikant. HLI, hinterdlimb ischmia; ISC, ischämisch; NISC, nicht-ischämisch. Angepasst von11. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6 : LDIR reguliert die Expression angiogener Gene in ECs, die aus bestrahlten ischämischen Gastrocnemius-Muskeln isoliert sind. Nach der chirurgischen Induktion von einseitigem HLI wurden beide Hinterbeine von C57BL/6-Mäusen an aufeinanderfolgenden Tagen mit vier Tagesfraktionen von 0,3Gy bestrahlt oder bestrahlt und konnten sich erholen. Am Tag 45 nach hlI wurde die Expression pro-angiogener Faktoren und ihrer Rezeptoren von qRT-PCR ausschließlich an ECs bewertet. Gastrocnemius Muskelabschnitte wurden für CD31 gefärbt. Einzelne endotheliale CD31+ Zellen wurden mit einem Lasermikrodissektionssystem visualisiert, seziert und isoliert. Jeder Balken stellt die relative Genexpression in einem Tier dar. Weiße und graue Balken stellen scheinbestrahlte bzw. bestrahlte Mäuse dar. Die Werte wurden auf 18S normalisiert, um relative Ausdrucksebenen zu erhalten. Die Ergebnisse, die als log2-Faltenwechsel zwischen ischämischen und nicht-ischämischen Proben ausgedrückt wurden, zeigten die relative Häufigkeit der Transkripte bei bestrahlten Mäusen; im Gegensatz dazu wird bei scheinbestrahlten Mäusen eine Down-Regulierung beobachtet. Angepasst von11. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Vegfr1_F (5'-TTGAGGAGCTCTCGAACTCCA-3'); |
| Vegfr1_R (5'-TATCTTCATGGAGGCCTTGGGCTT-3'); |
| Vegfr2_F (5'-AGGCCCATTGAGTCCAACTACACA-3'); |
| Vegfr2_R (5'-AGACCATGTGGCTCTCTCTTCCA-3'); |
| Pdgf-c_F (5'-ATGCCACAAGTCACAGAAACCACG-3'); |
| Pdgf-c_R (5'-AAGGCAGTCACAGCATTGTTGAGC-3'); |
| Met_F (5'-ACGTTGAAATGCACAGTTGGTCCC-3'); |
| Met_R (5'-TTGCGTCGTCTCTCGACTGTTTGA-3'); |
| Fgf2_F (5'-ACTCCAGTTGGTATGTGGCACTGA-3'); |
| Fgf2_R (5'-AACAGTATGGCCTTCTGTCCAGGT-3'); |
| Tgfb2_F (5'-GCTTTGGATGCGGCCTATTGCTTT-3'); |
| Tgfb2_R (5'-CTCCAGAGAgAAGTTGGCATTGT-3'); |
| Ang2_F (5'-ATCCAACACGAGAAGATGGCAGT-3'); |
| Ang2_R (5'-AACTCATTGCCCAGCCAGTACTCT-3'); |
| Hgf_F (5'-GCATTCAAGGCCAAGGAGAAGGTT-3'); |
| Hgf_R (5'-TCATGCTTGTGAGGGTACTGCGAA-3'); |
| 18s_F (5'-GCCCTATCAACTTTCGATTGGTAGT-3'); |
| 18s_R (5'-CCGGAATCGAACCCTGATT-3'). |
Tabelle 1: Für die Studie verwendete Primer.
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Discussion
Murine Modelle der CLI bestanden meist in Ligation der Femoralarterie nur distal zum Ursprung der profunda femoris 4,5,6,7,8,9. Dies hat gezeigt, dass der größte Teil der Kollateralzirkulation intakt bleibt, was den Blutfluss in die Gliedmaßen innerhalb von 7 Tagen wiederherstellt 9. Die Entfernung des Kollateralbettes kann durch Exzision der Oberschenkelarterie erreicht werden. Bis zu einem Drittel des ursprünglichen Blutflusses kann jedoch bereits 7 Tage nach dem Eingriff wiederhergestellt werden, da die meisten Kollateralgefäße aus der inneren Iliasarterie 7stammen. Lejay et al. haben sequenzielle Ligationen mit einer zweiten Ligation vorgeschlagen, die auf der gemeinsamen Iliasarterie durchgeführt wird, wodurch die durch die interne Iliasarterie 4bereitgestellte Kollateraldurchblutung effektiv reduziert wird. Kritische Schritte innerhalb dieses Protokolls sind nicht nur die Identifizierung der äußeren Iliasarterie direkt über dem Leistenband, sondern auch die Ligation und Exzision der distalen äußeren Ilias und Femoralarterien und Venen, die einem doppelten Zweck dient: die Schwere der Ischämie zu erhöhen sowie die technische Reproduzierbarkeit des Modells zu verbessern, da die Exposition der Oberschenkelarterie allein oft zum Reißen der Vene führt.
Eine Einschränkung dieser Technik ist die akute Unterbrechung des Blutflusses an die Gliedmaßen, die sich von dem langwierigen Prozess unterscheidet, der mit dem Aufbau von atherosklerotischer Plaque verbunden ist, die zu arterieller Stenose und Okklusion führt. Dennoch war die Reduktion des Blutflusses bereits nach 2 Wochen vorhanden, dem festgelegten Zeitpunkt für die Diagnose der chronischen Ischämie. Auch die Besicherung wurde allein mit der ischämischen Beleidigung erhöht, die den Prozess der Kollateralbildung nachahmt, der in chronisch ischämischen Gliedmaßen beobachtet wird.
Die Neovaskularisation ischämischer Gliedmaßen beinhaltet ein komplexes Zusammenspiel biologischer Ereignisse, nämlich Angiogenese und Arteriogenese. Dieses Protokoll enthält eine Vielzahl von Assays, die die Interferenz von vermeintlichen angiogenen Therapien bei der angiogenen Keimung (Kapillargefäßdichte) und der Entwicklung von Begleitgefäßen (Arteriogenese), dem wichtigsten Mechanismus für die menschliche Toleranz, bewerteten. zur Eschämia der unteren Gliedmaßen. Gleichzeitig wird Laser Doppler zur Enthüllung der Funktion dieser neuen oder vergrößerten Gefäße verwendet, und zum ersten Mal wird die Lasermikrodissektion von Kapillaren verwendet, um ECs zu sammeln, die die molekularen Mechanismen offenlegen, die der funktionellen Wiederherstellung zugrunde liegen. Dieses Protokoll liefert ein reproduzierbares Tiermodell, das die Wirkung von CLI als Teststandard nachahmen kann, wenn die Tiere mit möglichen angiogenen Therapien behandelt werden, die in Zukunft in einem klinischen Kontext angewendet werden könnten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken José Rino und Ténia Carvalho, Leiter der Bioimaging Facility und Histologie und Vergleichendes Pathologielabor des Instituto de Medicina Molecular Joo Lobo Antunes. Wir danken auch Vyacheslav Sushchyk von der Abteilung für Anatomie der Nova Medical School/Faculdade de Ciéncias Médicas, Universidade Nova de Lisboa.
Förderreferenz: Projekt, das von UID/IC/0306/2016 Fundaéo para a Ciéncia e a Tecnologia finanziert wird. Paula de Oliveira wird durch ein Stipendium (SFRH/BD/80483/2011) von Fundaéo para a Ciéncia e Tecnologia unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7500 Fast Real-Time PCR | Applied Biosystems | Instrument | |
| Acetone | Merk | 1000141000 | Reagent; Caution - highly flammable |
| Adenosine | Valdepharm | Reagent | |
| Atipamezole | OrionPharma | Reagent | |
| Barium sulphate (Micropaque) | Guebert | 8671404 (ref. Infarmed) | Reagent |
| Buprenorphine | RichterPharma | Reagent | |
| Carl Zeiss Opmi-1 FC Surgical Microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| cDNA RT2 PreAMP cDNA Synthesis kit | Qiagen | 7335730 | Reagent |
| Cryostat Leica CM | Leica Microsystems | 3050S | Instrument |
| DAB peroxidase substrate kit | DAKO;Vector Laboratories | K3468 | Reagent |
| hydrogen peroxidase | Merk | 1072090250 | Reagent; Caution - nocif |
| hydrophobic pen | Dako | 411121 | Reagent; Caution - toxic |
| Ketamidor | Richterpharma | CN:580393,7 630/01/12 Dfvf | Reagent |
| Laser Doppler perfusion imager moorLDI2-HIR | MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK | 5710 | Instrument |
| Leica DM2500 upright brightfield microscope | Leica Microsystems | Instrument | |
| Medetor | Virbac | 037/01/07RFVPT | Reagent |
| methanol | VWR | UN1230 | Reagent; Caution - toxic and highly flammable |
| Papaverine | Labesfal | Reagent | |
| Pentano Isso | Merk | 1060561000 | Reagent; Caution - highly flammable |
| Power SYBR® Green | Applied Biosystems | 4309155 | Reagent |
| Purified rat anti-mouse CD31 | Pharmingen | 550274 | Reagent |
| RNeasy Micro kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Surgic-Pro 6.0 | Medtronic (Coviden) | VP733X | Suture |
| VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, Rat IgG) | Vectastain ABC kit; Vector Laboratories | PK-4004 | Reagent |
| Vicryl5.0/ Vicryl 6.0 | Medtronic (Covidien) | UL202/ UL101 | Suture |
| Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection System | Carl Zeiss Microscopy, Germany | 1023290916 | Instrument |
| Stereotaxic microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| Digital camera | Linux | Instrument |
References
- Becker, F., et al. Chapter I: Definitions, epidemiology, clinical presentation and prognosis. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 42 Suppl 2, S4-S12 (2011).
- Fowkes, F. G., et al. Peripheral artery disease: epidemiology and global perspectives. Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 156-170 (2017).
- Abu Dabrh, A. M., et al. The natural history of untreated severe or critical limb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 62 (6), 1642-1651 (2015).
- Lejay, A., et al. A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 49 (2), 205-212 (2015).
- Sprengers, R. W., Lips, D. J., Moll, F. L., Verhaar, M. C. Progenitor cell therapy in patients with critical limb ischemia without surgical options. Annals of Surgery. 247 (3), 411-420 (2008).
- Lotfi, S., et al. Towards a more relevant hind limb model of muscle ischaemia. Atherosclerosis. 227 (1), 1-8 (2013).
- Masaki, I., et al. Angiogenic gene therapy for experimental critical limb ischemia: acceleration of limb loss by overexpression of vascular endothelial growth factor 165 but not of fibroblast growth factor-2. Circulation Research. 90 (9), 966-973 (2002).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
- Brevetti, L. S., et al. Exercise-induced hyperemia unmasks regional blood flow deficit in experimental hindlimb ischemia. Journal of Surgical Research. 98 (1), 21-26 (2001).
- Ministro, A., et al. Low-dose ionizing radiation induces therapeutic neovascularization in a pre-clinical model of hindlimb ischemia. Cardiovascular Research. 113 (7), 783-794 (2017).
- Pereira, A. R., et al. Therapeutic angiogenesis induced by human umbilical cord tissue-derived mesenchymal stromal cells in a murine model of hindlimb ischemia. Stem Cell Research Therapy. 7 (1), 145 (2016).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
