Summary
यहाँ, एक महत्वपूर्ण Hindlimb ischemia प्रयोगात्मक मॉडल कार्यात्मक की एक बैटरी के बाद प्रस्तुत किया है, हिस्टोलॉजिक और आणविक परीक्षणों angiogenic चिकित्सा की प्रभावशीलता का आकलन करने के लिए.
Abstract
क्रिटिकल लिंब इस्किमिया (सीएलआई) एक गंभीर स्थिति है जो निचले अंग विच्छेदन के उच्च जोखिम पर जोर देती है। पुनर्संवति के बावजूद सोने के मानक चिकित्सा किया जा रहा है, CLI रोगियों की एक काफी संख्या या तो शल्य चिकित्सा या endovascular revascularization के लिए अनुकूल नहीं हैं. एंजियोजेनिक चिकित्सा इन रोगियों के लिए एक विकल्प के रूप में उभर रहे हैं, लेकिन वर्तमान में जांच के तहत अभी भी कर रहे हैं. मनुष्यों में आवेदन से पहले, उन उपचार पशु मॉडल में परीक्षण किया जाना चाहिए और इसके तंत्र स्पष्ट रूप से समझा जाना चाहिए. चूहों में दूरस्थ बाहरी iliac और ऊरु धमनियों और नसों के लिगेशन और उच्छेदन द्वारा हिंडिम्ब इस्किमिया (एचएलआई) का एक पशु मॉडल विकसित किया गया है। परीक्षणों का एक व्यापक पैनल कार्यात्मक, हिस्टोलॉजिक और आणविक स्तर पर इस्कीमिया और putative एंजियोजेनिक उपचार के प्रभाव का आकलन करने के लिए इकट्ठा किया गया था। लेजर डॉपलर प्रवाह माप और भ्रम के कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया गया था। ऊतक प्रतिक्रिया गैस्ट्रोकेनियस मांसपेशियों के हिस्टोलॉजिकल वर्गों पर एंटी-सीडी31 एंटीबॉडी के साथ धुंधला करने के बाद और डायफोनाइजेशन के बाद संपार्श्विक पोत घनत्व की माप द्वारा केशिका घनत्व के विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन किया गया था। चूहों गैस्ट्रोकेनियस मांसपेशियों से लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन के बाद विशेष रूप से एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईसी) में चयनित एंजियोजेनिक कारकों को लक्षित करने वाले एंजियोजेनिक जीनों की अभिव्यक्ति को आरटी-पीसीआर द्वारा निर्धारित किया गया था। इन तरीकों इस्कीमिक और गैर-इस्कीमिक अंगों के बीच और इलाज और गैर इलाज अंगों के बीच मतभेद की पहचान करने में संवेदनशील थे। इस प्रोटोकॉल CLI के एक reproduible मॉडल और angiogenic चिकित्सा के परीक्षण के लिए एक रूपरेखा प्रदान करता है.
Introduction
परिधीय धमनी रोग (पीएडी) मुख्य रूप से निचले अंगों को प्रभावित करता है। पैड एथेरोस्क्लेरोसिस के कारण होता है, एक धमनी बाधा जो निचले अंगों में रक्त प्रवाह के लिए गंभीर प्रतिबंध पैदा कर सकतीहै1। विरामी claudication पैड की पहली अभिव्यक्ति है और चलने के दौरान मांसपेशियों में दर्द को संदर्भित करता है। CLI पैड का सबसे गंभीर चरण है, रोगियों है कि इस्कीमिक आराम दर्द, अल्सर या Gangrene2दिखाने में निदान किया जा रहा है. CLI के साथ रोगियों विच्छेदन का एक उच्च जोखिम है, खासकर अगर इलाज3. कम अंग revascularization (या तो खुली सर्जरी या एक endovascular प्रक्रिया द्वारा) वर्तमान में अंग बचाव को प्राप्त करने के लिए एक ही रास्ता है. हालांकि, CLI रोगियों के लगभग 30% इन प्रक्रियाओं के लिए अनुकूल नहीं हैं, कारण है कि घावों के स्थान शामिल हैं के लिए, धमनी occlusion के पैटर्न और व्यापक comorbidity4,5. इसलिए, इन अन्यथा untreatable रोगियों के लिए नए उपचार की जरूरत है, और अधिक गहन जांच के तहत रणनीति जा रहा है angiogenesis के संवर्धन के साथ.
मनुष्यों में परीक्षण से पहले, प्रभावशीलता और विवो में नए उपचार की सुरक्षा पशु मॉडल में विचार किया जाना चाहिए. सीएलआई के अध्ययन के लिए कई मॉडल विकसित किए गए हैं , जिनमें से अधिकतर चूहों में हिंदलिम्ब इस्किमिया (एचएलआई ) को प्रेरित करके6,7,8,9,10. हालांकि, इन मॉडलों धमनियों कि ligated और / या excised कर रहे हैं की प्रकृति सहित कई पहलुओं में अलग है और क्या नसों और नसों के आसपास के रूप में अच्छी तरह से विच्छेदन कर रहे हैं6,7,8, 9,10. एक साथ लिया, इन पहलुओं प्रत्येक जानवर में इस्कीमिया-रिफ्यूजन चोट की गंभीरता को प्रभावित करेगा, जिससे परिणाम की तुलना में मुश्किल हो. इसलिए, एक प्रभावी प्रोटोकॉल विकसित करना महत्वपूर्ण है जिसमें इस्किमिया को प्रेरित करने की प्रक्रिया और विभिन्न लक्ष्यों का मूल्यांकन मानकीकृत किया जाना चाहिए ताकि यह आकलन किया जा सके कि क्या दिया गया एंजियोजेनिक थेरेपी प्रभावी होगी। इन सभी पहलुओं को कवर करने के लिए डिज़ाइन किया गया एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल तंत्र की एक व्यापक समझ प्रदान करेगा जिसके द्वारा एंजियोजेनिक उपचार उनके प्रभाव और उनके परिणामों में से प्रत्येक पर उनकी प्रभावकारिता का एक उपाय लागू करते हैं। दो अलग काम करता है हाल ही में हमारी टीम द्वारा प्रकाशित एक अच्छा उदाहरणहैं 11,12, जिसमें चिकित्सीय एंजियोजेनेसिस प्रेरित करने के लिए विभिन्न दृष्टिकोण एक ही प्रोटोकॉल है कि इस में और अधिक विस्तार के साथ वर्णित किया जाएगा का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया प्रोटोकॉल.
इस प्रोटोकॉल के समग्र लक्ष्य CLI के प्रभाव की नकल कर सकते हैं कि एक reproduible प्रयोगात्मक मॉडल का वर्णन करने के लिए और कार्यात्मक, हिस्टोलॉजिक और putative angiogenic के आणविक प्रभाव का एक व्यापक मूल्यांकन के लिए प्रयोगात्मक नींव रखना है एजेंटों.
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Protocol
सभी पशु प्रक्रियाएं निदेशक 2010/63/ईयू के अनुसार हैं और संस्थागत पशु कल्याण निकाय द्वारा अनुमोदित और डीजीएवी द्वारा लाइसेंस प्राप्त की गई हैं, जो पशु संरक्षण के लिए पुर्तगाली सक्षम प्राधिकारी (लाइसेंस संख्या 023861/
चेतावनी: प्रोटोकॉल में इस्तेमाल रसायनों के कई विषाक्त और हानिकारक हैं. सभी उचित सुरक्षा प्रथाओं और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (ग्लव्स, प्रयोगशाला कोट, पूर्ण लंबाई पैंट, और बंद हाथ जूते) का उपयोग करें
1. हिंदलिम्ब इस्किमिया का murine मॉडल
नोट: सभी प्रयोगों पर प्रदर्शन कर रहे हैं 22-सप्ताह पुराने C57BL/6 महिला चूहों.
- समाधान की तैयारी
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संवेदनाहारी समाधान की तैयारी
नोट: यह संवेदनाहारी संयोजन (medetomidine और ketamine) अप करने के लिए प्रदान करता है 30 मिनट स्थिरीकरण और 15 मिनट की एक शल्य खिड़की. प्रभाव atipamezole के प्रशासन द्वारा वापस किया जा सकता है.- एक साफ, 1cc सिरिंज के साथ, 1 एमएल मेडेटोमिडीन (1 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन) को वापस लें, सटीक माप के लिए हवा के बुलबुले को खत्म करें, और इसे 15 एमएल बाज़ ट्यूब में जोड़ें।
- एक साफ, 1 सीसी सिरिंज के साथ, Ketamine के 0.75 एमएल वापस लेने (75 mg/Kg शरीर के वजन), सटीक माप के लिए हवा के बुलबुले को खत्म करने और यह एक 15 एमएल बाज़ ट्यूब medetomidine युक्त करने के लिए जोड़ें।
- एनेस्थेटिक घोल के 10 एमएल प्राप्त करने के लिए 8.25 एमएल बाँझ लवण (0.9% NaCl) जोड़ें।
- यौगिकों के नाम के साथ ट्यूब की पहचान, मिश्रित तारीख और समाप्ति की तारीख.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर।
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विरोधी sedative समाधान की तैयारी
- एक साफ, 1 सीसी सिरिंज के साथ, 1 एमएल एटिपामेज़ोल (5 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन) को वापस लें, सटीक माप के लिए हवा के बुलबुले को खत्म करें, और इसे 15 एमएल बाज़ ट्यूब में जोड़ें।
- 10 एमएल प्रत्यावर्तन समाधान प्राप्त करने के लिए 9 एमएल बाँझ लवण (0.9% NaCl) जोड़ें।
- यौगिकों के नाम के साथ ट्यूब की पहचान, मिश्रित तारीख और समाप्ति की तारीख.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर।
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पोस्ट ऑपरेटिव analgesia समाधान की तैयारी
- एक साफ, 1 सीसी सिरिंज के साथ, buprenorphine के 0.5 एमएल वापस लेने (100 $L/15-30 ग्राम शरीर के वजन), सटीक माप के लिए हवा के बुलबुले को खत्म करने, और यह एक 15 एमएल बाज़ ट्यूब में जोड़ें.
- 10 एमएल एनल एनएल घोल प्राप्त करने के लिए 9.5 एमएल बाँझ लवण (0.9% NaCl) जोड़ें।
- यौगिकों के नाम के साथ ट्यूब की पहचान, मिश्रित तारीख और समाप्ति की तारीख.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर।
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संवेदनाहारी समाधान की तैयारी
- हिंदलिम्ब इस्किमिया का सर्जिकल प्रेरण
- सर्जिकल उपकरण इस हस्तक्षेप के लिए आवश्यक: नुकीले संदृश, वसंत कैंची, नेत्र सुई धारक, शल्य कैंची और एक सुई धारक. उपयोग करने से पहले एक ऑटोक्लेव में सभी शल्य चिकित्सा उपकरणों का बंध्याकरण करें। अधत्वकात्से वसा के विच्छेदन के लिए कपास swabs का प्रयोग करें.
- माउस को पकड़ने से पहले संज्ञाहरण समाधान के साथ सिरिंज लोड करें।
- पिंजरे के ग्रिड के खिलाफ अपने कान के पीछे बल लागू करने से जानवर को रोकें, माउस को स्थिर रखने के लिए जितना संभव हो उतना त्वचा पकड़े।
- जानवर को अपने सिर को कम से झुकारखें रखें और संज्ञाहरण समाधान का एक इंट्रापेरिटोनल इंजेक्शन करें, माउस के शरीर के साथ 45 डिग्री कोण पर सिरिंज रखते हुए।
- पेडल वापसी सजगता के अभाव के लिए जाँच करें, संज्ञाहरण की गहराई का मूल्यांकन करने के लिए.
- एक बिजली शेवर का उपयोग कर सही Hindlimb से बाल निकालें. त्वचा की तैयारी के लिए क्लोरहेक्सीडीन कीटाणुनाशक साबुन स्क्रब का उपयोग करें। suds को दूर करने के लिए एक साफ कागज तौलिया का प्रयोग करें। चूहों को सर्जिकल बाँझ सुइट में ले जाने से पहले एक क्लोरहेक्सीडीन सर्जिकल स्क्रब लागू करें और त्वचा क्षेत्र की रक्षा करें।
- पृष्ठीय decubitus में जानवर प्लेस और यह चार अंगों के साथ नियंत्रण अलग फैल गया और टेप के साथ सुरक्षित.
चेतावनी: पशु के शरीर के तापमान को स्थिर रखने के लिए एक गर्म पैड पर प्रक्रिया प्रदर्शन; शल्य प्रक्रिया 10x या 20x आवर्धन पर एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जाता है. - त्वचा की तैयारी को अंतिम रूप देने के लिए बाँझ धुंध का उपयोग करके क्लोरहेक्सीडीन एंटीसेप्टिक समाधान लागू करें। एक नंबर का उपयोग 11 शल्य खोपड़ी ब्लेड एक 1 सेमी त्वचा चीरा सही Hindlimb की जांघ overlying प्रदर्शन करते हैं.
- ब्लंट विच्छेदन अध:स्त्वक्षे वसा तंत्रिकासंवहनी बंडल को उजागर करता है. नुकीले संदबे, वसंत कैंची और नेत्र सुई धारक का उपयोग करना, झिल्ली ilio-femoral म्यान खोलने के लिए distal बाहरी iliac और femoral वाहिकाओं का पर्दाफाश.
- तंत्रिका से वाहिकाओं (धमनी और नस) को अलग और अलग करें। एक 7.0 गैर अवशोषित polypropylene सीवन का उपयोग कर दूर बाहरी iliac धमनी और नस और दूरस्थ ऊरु धमनी और नस ligate.
- इलियो-फेमोरल धमनी और वसंत कैंची के साथ दूरस्थ और समीपस्थ समुद्री मील के बीच नसों के खंड को पार करें।
- एक अवशोषण सीवन के साथ चीरा बंद करें (उदा., 5.0 Vicryl सीवन).
- एंटी-सेडेटिव समाधान के साथ सिरिंज लोड करें और एंटी-सेडेटिव समाधान के इंट्रापेरिटोनल इंजेक्शन को करने के लिए 1.2.3 और 1.2.4 में विस्तृत एक ही विधि का उपयोग करें।
- पोस्ट-ऑपरेटिव मॉनिटरिंग
नोट: जानवरों को ध्यान से सभी जानवरों विरोधी sedative से अच्छी तरह से ठीक सुनिश्चित करने के लिए हर 15-20 मिनट मनाया जाता है; एनेस्थेटाइज्ड जानवरों को कभी भी उपेक्षित नहीं छोड़ा जाता है।- संज्ञाहरण से वसूली का आकलन: 1) श्वसन की दर और गहराई की निगरानी; 2) पशु सजगता का आकलन (पैडल और आंख की स्थिति)
- पोस्ट ऑपरेटिव analgesia हर 8-12 एच के एक subcutaneous इंजेक्शन प्रदर्शन करते हैं।
- पशु के स्वास्थ्य की स्थिति और सर्जरी साइट उपस्थिति का एक संक्षिप्त विवरण रिकॉर्डिंग सर्जरी के बाद दैनिक जानवरों की निगरानी, सभी टांके बंद कर रहे हैं सुनिश्चित करें।
- यदि विहिक्षता होती है तो चीरा को पुन: सुवना दिया जाए। यदि असफल, चीरा पर एक त्वचा बाधा फिल्म लागू करने के लिए मूत्र से बचाने के लिए, मल उत्सर्जन, घर्षण और त्वचा की कतरनी और उपचार प्रक्रिया में मदद करने के लिए.
2. एंजियोजेनिक प्रभाव का आकलन
नोट: इस्किमिया प्रेरण के बाद, अध्ययन में चिकित्सीय एजेंट लागू करें और निम्नलिखित प्रक्रियाओं को प्राप्त करें। अन्य समय बिंदुओं पर किए गए कदमों का विवरण संगत अनुभाग के अंतर्गत दिया गया है।
- लेजर डॉपलर परफ्यूजन इमेजिंग
- एक बिजली की शेवर का उपयोग कर विश्लेषण से एक दिन पहले दोनों hindlimbs से बालों को निकालें depilatory क्रीम के बाद.
- संवेदनाहारी समाधान का उपयोग कर चूहों एनेस्थेटाइज करें।
- 5 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस हीटिंग पैड पर जानवर प्लेस करने के लिए सुनिश्चित करें कि तापमान प्रक्रिया के दौरान नहीं बदल जाएगा
- एक विस्तारित स्थिति में सुरक्षित पैर के साथ सुपाच्य स्थिति में जानवर रखें। प्रत्येक जानवर के लिए दाएं और बाएं पैरों और पैरों के बीच की दूरी को मापें क्योंकि जानवर की स्थिति समान होनी चाहिए जब भी प्रक्रिया को समय के साथ हिंदलिंब भ्रम में परिवर्तन का पालन करने के लिए दोहराया जाना चाहिए।
- एक लेजर डॉपलर perfusion छवि का उपयोग करके डेटा प्राप्त करना शुरू करो.
- अधिग्रहण के पूरा होने के बाद, विरोधी-sedative समाधान के साथ संज्ञाहरण वापस।
- छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें और इस्कीमिक हिंदलिम्ब के आसपास ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र को आकर्षित करें और गैर-इस्केमिक हिंदलिम्ब के आसपास एक तुलनीय आरओआई।
- फ्रलक्स मानों का प्रेक्षण कीजिए तथा अइस्केमिक अंग में इस ालु्क के वषय के अनुपात के रूप में परागमन का निर्धारण कीजिए। परफ्यूजन अनुपात में परिवर्तन समय के साथ मापा जाता है।
- इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और केशिका घनत्व विश्लेषण
- एनेस्थेटाइज़िंग के बाद, गर्भाशय ग्रीवा की अव्यवस्था से चूहों का बलिदान करें।
- दोनों पैरों की गैस्ट्रोकेनियस मांसपेशियों को फसल के लिए, पहले, दोनों हिंदलिंब से त्वचा को हटा दें।
- Achilles कण्डरा की पहचान और एक 11 ब्लेड स्केलपेल का उपयोग कर हड्डी से कण्डरा अलग.
- Achilles कण्डरा पकड़ो और टिबिया से मांसपेशियों को अलग और वसंत कैंची के साथ घुटने के संयुक्त करने के लिए fibula.
- गैस्ट्रोकेनियस मांसपेशियों से बाइसेप्स फीमोरिस को अलग करें।
- घुटने के संयुक्त स्तर पर गैस्ट्रोकेनियस मांसपेशियों की सम्मिलन में कटौती करने के लिए वसंत कैंची का उपयोग करें।
- 10% tragacanth की मदद से एक छोटे कॉर्क डिस्क पर एक अनुप्रस्थ अभिविन्यास में काटा gastrocnemius मांसपेशियों रखें.
- स्नैप तरल नाइट्रोजन-कूल्ड सिओपेन में नमूनों को फ्रीज करें और उन्हें अनुभागिंग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- एक cryostat पर पेशी नमूनों के 7 डिग्री मीटर वर्गों में कटौती और कांच की स्लाइड पर माउंट.
नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है। - -20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ठंडा शुद्ध एसीटोन (लगभग 50 एमएल) युक्त एक बोतल में कांच स्लाइड को ठीक करें।
- कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए मेथनॉल (50 एमएल) में पतला हाइड्रोजन peroxidase जोड़ें।
- कुल 10 मिनट के लिए फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) (50 एमएल) में दो बार धोएं।
- वर्गों के चारों ओर एक हाइड्रोफोबिक पेन का प्रयोग करें.
नोट: एक हाइड्रोफोबिक पेन का उपयोग प्रोटोकॉल के दौरान खर्च किए गए समाधानों की मात्रा को कम करने की अनुमति देता है। सभी ऊष्मायनों के लिए प्रति अनुभाग 100 $L सभी समाधानों का उपयोग करें. - कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए पीबीएस में 5% खरगोश सीरम का एक अवरुद्ध समाधान लागू करें।
- पीबीएस में 1 % गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) में 1:500 में पतला एंटी-सीडी31 चूहा मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए नमूनों को इनक्यूबेट करें।
- 30 मिनट की कुल के लिए पीबीएस में तीन बार धो लें।
- पीबीएस में 1% बीएसए में 1:200 पर एक माध्यमिक biotinylated खरगोश विरोधी IgG एंटीबॉडी जोड़ें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 5% खरगोश सीरम.
- पहले की तरह पीबीएस में धोएं और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए लेबल एविडिन-संयोजित पेरोक्सिडस कॉम्प्लेक्स जोड़ें।
- 5 मिनट के लिए पीबीएस में 3 बार कुल्ला और एक और 5 मिनट के लिए diaminobenzidine (DAB) peroxidase सब्सट्रेट किट जोड़ें.
- बढ़ते से पहले 10 s के लिए hematoxylin के साथ वर्गों counterstain.
- प्रत्येक नमूने में 4 अलग-अलग शारीरिक क्षेत्रों के 2 विभिन्न वर्गों में एक ईमानदार ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप (यानी, मायोसाइट्स की संख्या प्रति केशिकाओं की संख्या) का उपयोग करके केशिका घनत्व को मापें।
- इसके विपरीत एजेंट भ्रम
- संवेदनाहारी समाधान का उपयोग कर चूहों एनेस्थेटाइज करें।
- एक संख्या 15 स्केलपेल ब्लेड का उपयोग कर एक औसत laparotomy प्रदर्शन.
- बाद में छोटे आंत्र वापस लेने और वसंत कैंची का उपयोग करने के बाद पेट के आवरित और पुच्छ वीना कैवा को उजागर करें।
- एक 26 गेज कैथेटर को पेट के आरटा में और दूसरा एक ही दिशा में पुच्छीय वेना कैवा में डालें।
- एक रहने सीवन प्रदर्शन करने के लिए एक 5/0 रेशम सीवन का उपयोग कर जगह में सुरक्षित कैथेटर।
- हेपरिन (500 इकाइयों/100 एमएल) युक्त 37 डिग्री सेल्सियस नमकीन समाधान के साथ संवहनी प्रणाली को धोएं जो 10 एमएल सिरिंज का उपयोग करके पेट के आरोटा में धकेल दिया गया। कोमल भ्रम जारी रखें जब तक एक स्पष्ट समाधान कौडल वेना कैवा के अंदर रखा कैथेटर से बाहर आ रहा है देखा जाता है।
नोट: आमतौर पर एक heparinized नमकीन समाधान के 30 से 40 एमएल एक वयस्क चूहे के संवहनी प्रणाली कुल्ला करने के लिए आवश्यक हैं। - एडेनोसाइन (1 मिलीग्राम/एल) और पैपावेरीन (4 मिलीग्राम/एल) का मिश्रण 2 मिनट के लिए प्रशासित करें।
- 50% बेरियम सल्फेट और 5% जिलेटिन के मिश्रण के महाधमनी कैथेटर 10 एमएल में इंजेक्शन।
नोट: समाधान 60 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाना चाहिए मोटाई से बचने के लिए। - पर चूहों को छोड़ दो - कम से कम 4 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस, संवहनी डाली ठोस करने के लिए अनुमति देने के लिए।
- प्रत्येक माउस के निचले शरीर से त्वचा निकालें.
- डायफोनाइजेशन - स्पैल्टेहोल्ज तकनीक
- कम से कम 72 एच के लिए एक 10% formaldehyde समाधान में विसर्जन द्वारा चूहों को ठीक करें.
- 24 ज के लिए एक 30% हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान में विसर्जन द्वारा चूहों ब्लीच.
- फ्रीज प्रतिस्थापन तकनीक का उपयोग कर चूहों को निर्जलित करें। इस पद्धति में चूहों को क्रमिक मार्ग (औसत चार पर) शुद्ध एसीटोन के 20 डिग्री सेल्सियस के लिए 24 एच प्रत्येक के लिए प्रस्तुत करने के होते हैं।
- चूहों को एक समाधान में डुबोकर इसे स्पष्ट करें जिसमें 100% बेंजिल बेंजोएट और 100% मिथाइल सैलिसिलेट का मिश्रण 3:5 अनुपात में होता है (इस मिश्रण को स्पैल्टेहोल्ज समाधान के रूप में भी जाना जाता है) 13.
- एक निर्वात कक्ष में अंदर Spalteholz समाधान में डूबे चूहों छोड़ दो जब तक यह diaphanous हो जाता है, जो आम तौर पर 5 से 7 दिन लगते हैं.
- नमूना स्पष्ट होने से पहले यह अंधेरा हो जाता है, तो समाधान को बदलें।
- कोलैटरल जहाजों क्वांटिफिकेशन
- एक स्टीरियोटैक्सिक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर transillumination के तहत Spalteholz समाधान में निलंबित चूहों का निरीक्षण करें। माइक्रोसर्जरी बल का प्रयोग धीरे से समझ और इसे स्थानांतरित करने के लिए.
- माइक्रोस्कोप से जुड़े डिजिटल कैमरे का उपयोग करके पूरे अंगों की फोटो।
- उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग करके पूरे अंग तस्वीरें प्राप्त करें।
- उचित सॉफ्टवेयर का उपयोग कर उन्हें उजागर करके संपार्श्विक जहाजों के एक मैनुअल विभाजन प्रदर्शन.
नोट: कोलैटरल जहाजों लांगलैंड की परिभाषा, एक परिभाषित स्टेम, मध्य क्षेत्र, और फिर से प्रवेश के अनुसार परिभाषित कर रहे हैं, के बीच एक व्यास के साथ 20 और 300 डिग्री, femoral को छोड़कर, saphenous और popliteal धमनियों और सभी शिरापरक संरचनाओं. - अभिवर्तनी में एक ही परमाणु क्षेत्र में हर माउस में ROIs परिभाषित करें, आसपास और शल्य occlusion के नीचे.
- कुल अंग क्षेत्र के 20% के अनुरूप समकक्ष आरओआई में संपार्श्विक पोत घनत्व (सीवीडी) को मात्रा में निर्धारित करें। सीवीडी संवहनी क्षेत्र और ROIs क्षेत्रों के बीच अनुपात के रूप में गणना की है. सभी घनत्व माप ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रदर्शन कर रहे हैं.
नोट: प्रत्येक माउस के लिए गैर-इस्कीमिक अंग के CVD मान शरीर रचना विज्ञान, भ्रम या डायफोनाइजेशन प्रक्रियाओं में बदलाव को बाहर करने के लिए 100% के अनुरूप माना जाता है। इसलिए, इस्कीमिक अंग में सीवीडी प्रतिशत गैर-इस्कीमिक एक के सापेक्ष गणना की गई थी। - इस्कीमिक और nonischemic अंगों के बीच CVD प्रतिशत के बीच अंतर के रूप में CVD वृद्धि का प्रतिशत निर्धारित करते हैं.
- केशिकाओं का लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन
- एनेस्थेटाइज़िंग के बाद, गर्भाशय ग्रीवा की अव्यवस्था से चूहों का बलिदान करें।
- दोनों पैरों के gastrocnemius मांसपेशियों फसल के लिए, चूहों दोनों hindlimbs से त्वचा को हटा दें.
- Achilles कण्डरा की पहचान और एक 11 ब्लेड स्केलपेल का उपयोग कर हड्डी से कण्डरा अलग.
- Achilles कण्डरा पकड़ो और टिबिया से मांसपेशियों को अलग और वसंत कैंची के साथ घुटने के संयुक्त करने के लिए fibula.
- गैस्ट्रोकेनियस मांसपेशियों से बाइसेप्स फीमोरिस को अलग करें।
- घुटने के संयुक्त स्तर पर गैस्ट्रोकेनियस मांसपेशियों की सम्मिलन में कटौती करने के लिए वसंत कैंची का उपयोग करें।
- काटा गैस्ट्रोकेमियस मांसपेशियों को एक छोटे कॉर्क डिस्क पर अनुप्रस्थ अभिविन्यास में 10 % ट्रैगाकैन्थ की सहायता से रखें।
- स्नैप तरल नाइट्रोजन-कूल्ड सिओपेन में नमूनों को फ्रीज करें और उन्हें अनुभागिंग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- मांसपेशी नमूनों के एक cryostat 12 डिग्री मीटर वर्गों पर कट और कांच की स्लाइड पर माउंट.
नोट: आरएनए संरक्षण के लिए एक precooled स्लाइड लेने के लिए और अनुभाग रखने के लिए केवल क्षेत्र को गर्म करने के लिए अपनी उंगली (ग्लोव्स) के साथ स्लाइड के पीछे की ओर स्पर्श करें। क्रायोस्टैट चाकू से स्थानांतरण अनुभाग गर्म क्षेत्र के साथ छू कर और 2-3 मिनट के लिए cryostat में -20 डिग्री सेल्सियस पर सूखी। प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है।- -20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ठंडा शुद्ध एसीटोन (लगभग 50 एमएल) युक्त एक बोतल में कांच की स्लाइड्स को ठीक करें और उन्हें हवा में सुखाएं।
- वर्गों के चारों ओर एक हाइड्रोफोबिक पेन का प्रयोग करें.
नोट: हाइड्रोफोबिक पेन का उपयोग प्रोटोकॉल के दौरान खर्च किए गए समाधानों की मात्रा को कम करने में मदद करता है। सभी ऊष्मायनों के लिए प्रति अनुभाग 100 $L सभी समाधानों का उपयोग करें. - 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 एम NaCl/PBS के साथ पुनः हाइड्रेट करें और नमूनों को रात भर में 4 डिग्री सेल्सियस पर एंटी-CD31 चूहा मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ 2M NaCl/PBS में 1:500 पर इनक्यूबेट करें।
- कुल 6 मिनट के लिए 2M NaCl/PBS में दो बार धो लें।
- 2M NaCl/PBS में 1:200 पर एक माध्यमिक biotinylated खरगोश विरोधी IgG एंटीबॉडी जोड़ें और 5% खरगोश सीरम के लिए 30 मिनट पर 4 डिग्री सेल्सियस.
- पहले के रूप में 2 एम NaCl/PBS में धो लें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए लेबल avidin-संयुग्मी peroxidase परिसर जोड़ें।
- कुल्ला और 5 मिनट के लिए DAB peroxidase सब्सट्रेट किट जोड़ें.
- बर्फ ठंडा 90 % इथेनॉल में वर्गों निर्जलीकरण 100 % इथेनॉल के बाद और उन्हें सूखने के लिए छोड़ दें।
- एक स्पंदित ठोस राज्य 355 एनएम लेजर से लैस एक लेजर microdissection प्रणाली का उपयोग कर चूहों प्रति 10 000 केशिकाओं विच्छेदन और एक microfuge ट्यूब चिपकने वाला टोपी में विच्छेदन केशिकाओं गुलेल।
- आरएनए निष्कर्षण, cDNA संश्लेषण, पूर्व amplification, और आरटी-पीसीआर
- एक उपयुक्त किट का उपयोग करके सूक्ष्मविच्छतियुक्त केशिकाओं से कुल आरएनए को अलग करें, प्राप्त कुल आरएनए 1.5-3 एनजी/जेडएल के बीच है।
- सारणी 1में वर्णित प्राइमर का उपयोग करते हुए संश्लेषण के लिए सीडीएनए संश्लेषण किट और पूर्व-प्रवर्धन के दो दौर का उपयोग करें।
- पिछले चरण में वर्णित समान लक्ष्य के लिए RT-PCR निष्पादित करें। 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रारंभिक विकृतीकरण कदम से मिलकर एक कार्यक्रम का प्रयोग करें, 15 s के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर 50 चक्र और 1 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर के बाद।
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Representative Results
वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, गर्भनाल मेसेन्काइमल स्टेम सेल और कम खुराक आयनकारी विकिरण (एलडीआईआर) का परीक्षण putative angiogenic चिकित्सा 11,12के रूप में किया गया था। लेजर डॉपलर परफ्यूजन रीडिंग इस्किमिया प्रेरण से पहले और पूर्व-निर्दिष्ट समय बिंदुओं पर प्राप्त की गई थी जो तुरंत बाद इस्किमिया प्रेरण से लेकर 45 दिनों के बाद इस्किमिया। लेजर डॉपलर द्वारा ऊतक भ्रम रीडिंग रंग कोडित छवियों के रूप में दर्ज किए गए थे, गहरे नीले रंग के रूप में प्रदर्शित कोई भ्रम और लाल के रूप में प्रदर्शित उच्चतम भ्रम स्तर के साथ। जैसा कि चित्र 2ए और 3ए में दिखाया गया है और चित्र 2बी और 3 बीमें मात्रा निर्धारित की गई है , सभी चूहों में हिंदलिम्ब इस्किमिया के प्रेरण के तुरंत बाद एक पूर्ण हानि देखी गई थी, यह सुनिश्चित करना हिंदलिम्ब इस्किमिया को प्रेरित करने के लिए तकनीक की पुन: उत्पादनीयता। महत्वपूर्ण बात यह है कि इस्कीमिया की गंभीरता सभी जानवरों में समान है। इस्कीमिक हिंदलिम्ब के चारों ओर एक आरओआई तैयार की गई थी और अइस्मिक हिंदलिम्ब के चारों ओर एक तुलनीय आरओआई तैयार की गई थी ताकि भ्रम की मात्रा को पूरा किया जा सकता है। परफ्यूजन को इस्कीमिक अंग में भ्रम के अनुपात के रूप में व्यक्त किया जाता है जो कि गैर-इस्कीमिक अंग में होता है। परफ्यूजन अनुपात में परिवर्तन समय के साथ मापा जाता है।
इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री 15 और 90 दिनों के बाद इस्किमिया के बीच किया गया था। डायफोनाइजेशन 19 और 90 दिनों के बाद इस्किमिया और केशिका माइक्रोडिससेक्शन के बीच 45 और 70 दिनों के बाद इस्किमिया प्रेरण सुनिश्चित करने के बीच किया गया था कि विभिन्न समर्थक एंजियोजेनिक उपचार एक निरंतर और लंबे समय तक प्रोएंजियोजेनिक प्रभाव को प्रेरित करते हैं।
गैस्ट्रोकेनमीअस मांसपेशी के हिस्टोलॉजिकल वर्गों में सीडी31-सकारात्मक केशिकाओं का परिमाणीकरण केशिका घनत्व का मूल्यांकन किया गया था और यह मांसपेशी फाइबर की संख्या के अनुसार केशिकाओं की संख्या के रूप में व्यक्त किया गया था। जैसा कि चित्र 4में दर्शाया गया है, केशिका घनत्व इस्कीमिक बनाम गैर-इस्कीमिक अंग में अधिक था।
संपार्श्विक पोत घनत्व का मूल्यांकन करने के लिए, चूहों को डायफोनाइज किया गया और एक समतुल्य आरओआई, जो अंग क्षेत्र के 20% के अनुरूप है, को परिमाणीकरण के लिए चुना गया था। इस्कीमिक अंग में कोलैटरल पोत घनत्व लगातार बढ़ जाता है, इसलिए उपचारित और नियंत्रण अंगों से संबंधित आंकड़ों को इस्कीमिक अंग में संपार्श्विक पोत घनत्व वृद्धि के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया गया था जो गैर-इस्केमिक एक के सापेक्ष है (चित्र5) ).
ईसी द्वारा प्रो-एंजियोजेनिक जीनों की अभिव्यक्ति का विश्लेषण सीडी 31-पॉजीटिव कोशिकाओं के मात्रात्मक आरटी-पीसीआर द्वारा किया गया था। Vegfr2, Vegfr1, Fgf2, Angpt2, Pdgfc, Tgfb2, Hgf, और मौसम के लिए Transcripts ischemic और गैर इस्कीमिक अंगों के बीच अभिव्यक्ति में एक स्पष्ट भिन्नता से पता चला, विशेष रूप से चूहों में प्रो-एंजियोजेनिक उत्तेजना के संपर्क में (चित्र 6).
चित्र 1 : माउस हिंदलिंब vasculature के शरीर रचना विज्ञान के योजनाबद्ध उदाहरण ligation साइटों दिखा. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2 : LDIR perfusion वसूली बढ़ जाती है. एकतरफा HLI के सर्जिकल प्रेरण के बाद, C57BL/6 चूहों के दोनों hindlimbs शर्म विकिरणित या 0.3Gy के चार दैनिक अंशों के साथ विकिरण किया गया, लगातार दिनों में और ठीक करने की अनुमति दी. (A) प्रतिनिधि लेजर डॉपलर प्रवाह छवियों पूर्व HLI, और दिनों में 0 (d0) और 15 (d15) के बाद HLI प्रेरण. (ख) आईएससी के अनुपात के रूप में व्यक्त रक्त प्रवाह का मात्रात्मक मूल्यांकन एनआईएससी अंग के अनुपात के रूप में विकिरणित चूहों बनाम शम-विकिरणित दोनों दिनों में 15 (डी 15) और 45 (डी45) पोस्ट एचएलआई में काफी बढ़ाया अंग रक्त परफ्यूजन का प्रदर्शन किया। के बीच समूह परिवर्तन दो तरह से दोहराया माप ANOVA द्वारा मूल्यांकन किया गया Bonferroni पोस्ट-हॉक परीक्षण के बाद (एन $ 12 प्रति समूह चूहों). मतलब - SEM दिखाया जाता है. पी एंड टी एल; 0.001; एन एस, गैर महत्वपूर्ण. एचएलआई, हिंदलिम्ब इस्कीमिया; आईएससी, इस्कीमिक; एनआईएससी, गैर-इस्केमिक; पूर्व HLI, Hindlimb ischemia से पहले. 11से अनुकूलित | कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3 : नाभि कॉर्ड मेसेन्काइमल स्टेम सेल (UCX) परफ्यूजन वसूली में वृद्धि. UCX या उनके वाहन (एक नियंत्रण के रूप में) ISchemic gastrocnemius मांसपेशियों में प्रशासित किया गया 5 घंटे HLI प्रेरण के बाद. (ए) प्रतिनिधि लेजर डॉपलर प्रवाह छवियों से पहले (पूर्व-एचएलआई), तुरंत बाद (d0 पोस्ट-HLI) और 7, 14 और 21 दिनों के बाद HLI प्रेरण (d7 पोस्ट-HLI, d14 पोस्ट-HLI, d21 पोस्ट-HLI) पर। (बी) एनआईएससी अंग के लिए आईएससी के अनुपात के रूप में व्यक्त रक्त प्रवाह के मात्रात्मक मूल्यांकन ने गर्भनाल मेसेन्काइमल स्टेम कोशिकाओं में काफी बढ़ाया अंग रक्त परफ्यूजन का प्रदर्शन किया - 7, 14 और 21 दिनों के बाद एचएलआई में चूहों का इलाज किया। (प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह के लिए n$16; D7: t (22.69) ] 4.26; पी $ 0.001; प्रभाव का आकार 1.51 और बिजली 0.98 था; D14: t (30) $ 4.7; पी $ 0.001; प्रभाव का आकार 1.66 और बिजली 0.99 था; D21: t (30) ] 7.22; पी $ 0.001; प्रभाव का आकार 2.56 और बिजली 0.99) था. एचएलआई, हिंदलिम्ब इस्कीमिया; आईएससी, इस्कीमिक; एनआईएससी, गैर-इस्केमिक। 11से अनुकूलित | कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4 : LDIR केशिका घनत्व बढ़ जाती है. (क) दिन में शम-विकिरणित और विकिरणित इस्कीमिक गैस्ट्रोकेमियस मांसपेशियों से प्रतिनिधि अनुभाग 45 के बाद एचएलआई। कैपिलरी और मायोसाइट्स की पहचान क्रमशः सीडी31 इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और हेमेटॉक्सिलिन द्वारा की गई थी। स्केल बार, 150 मिमी (बी) मात्रात्मक विश्लेषण से पता चला कि 15 और 45 के बाद के दिनों में शम-विकिरणित इस्केमिक वाले की तुलना में विकिरणित इस्कीमिक गैस्ट्रोकेमियस मांसपेशियों में बढ़ी हुई केशिका घनत्व (कैपिलारिस/मायोसाइट)। मिश्रित ANOVA Bonferroni के बाद-हॉक परीक्षण आईएससी के एक भीतर विषय कारक के साथ और दिन और विकिरण के विषय कारकों के बीच आयोजित किया गया था (प्रति समूह n ]6 चूहों). व्यक्तिगत डेटा और साधन - SEM दिखाए जाते हैं. पी एंड टी एल;0.001; एन एस, गैर महत्वपूर्ण. आईएससी, इस्कीमिक; एनआईएससी, गैर-इस्केमिक। 11से अनुकूलित | कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 5: एलडीआईआर संपार्श्विक घनत्व बढ़ाता है। (क) शम-किरणित और विकिरणित चूहों के लिए चयनित आरओआई की उदाहरणात्मक छवियां। आईएससी और एनआईएससी अंगों दिन में 90 के बाद HLI दिखाया जाता है. स्केल बार, 300 मिमी (बी) डेटा आईएससी अंग के सीवीडी वृद्धि के प्रतिशत के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं अपेक्षाकृत NISC एक करने के लिए. दिन में 15 और 90 के बाद HLI, विकिरणित चूहों एक काफी अधिक CVD वृद्धि प्रस्तुत (%) बनाम शम-विकिरणित चूहे। दो तरह से ANOVA दिन और विकिरण के विषय कारकों के बीच एक के साथ Bonferroni पोस्ट-हॉक परीक्षण के बाद आयोजित किया गया था (प्रति समूह n ]6 चूहों). व्यक्तिगत डेटा और साधन - SEM दिखाए जाते हैं. *पी एंड एल टी;0.05; पी एंड टी एल;0.001; एन एस, गैर महत्वपूर्ण. एचएलआई, हिंदलिम्ब इस्कीमिया; आईएससी, इस्कीमिक; एनआईएससी, गैर-इस्केमिक। 11से अनुकूलित | कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 6 : एलडीआईआर विकिरणित इस्कीमिक गैस्ट्रोकेमियस मांसपेशियों से अलग ईसी में एंजियोजेनिक जीन की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है। एकतरफा HLI के सर्जिकल प्रेरण के बाद, C57BL/6 चूहों के दोनों hindlimbs sham-radiated या 0.3Gy के चार दैनिक अंशों के साथ विकिरण ित किया गया, लगातार दिनों में और ठीक करने की अनुमति दी. दिन में 45 के बाद HLI, समर्थक angiogenic कारकों और उनके रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति विशेष रूप से ईसी पर QRT-पीसीआर द्वारा मूल्यांकन किया गया था. Gastrocnemius मांसपेशी वर्गों CD31 के लिए दाग थे. व्यक्तिगत endothelial CD31 + कोशिकाओं कल्पना, विच्छेदन, और एक लेजर microdissection प्रणाली का उपयोग कर अलग थे. प्रत्येक बार एक जानवर में सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति का प्रतिनिधित्व करता है. सफेद और भूरे रंग की सलाखों के शम-विकिरणित और विकिरणित चूहों का प्रतिनिधित्व करते हैं, क्रमशः. मान सापेक्ष व्यंजक स्तर प्राप्त करने के लिए 18S करने के लिए सामान्यीकृत किए गए थे। इस्कीमिक और गैर-इस्कीमिक नमूनों के बीच log2 गुना परिवर्तन के रूप में व्यक्त परिणाम विकिरणित चूहों में प्रतिलिपि के सापेक्ष बहुतायत का प्रदर्शन; इसके विपरीत, एक नीचे विनियमन शम-विकिरणित चूहों में मनाया जाता है। 11से अनुकूलित | कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| Vegfr1[F (5'-TTGAGCTTCACCGAACTCCA-3'); |
| Vegfr1[R (5'-TATCTCATGGCCTTGGGCTT-3'); |
| Vegfr2[F (5'-AGGCCCATGAGTCCACACA-3'); |
| Vegfr2[R (5'-AGACCATGTCTCTCTCTCTCTCCA-3'); |
| Pdgf-c[F (5'-ATGCACAAGTCACAGAAACC-3'); |
| Pdgf-c[R (5'-AAGGCAGCCATTGTGAGC-3'); |
| मेट]F (5'-ACGTTGAATGCACAGTTGGTCCC-3'); |
| मेट]आर (5'-TTGCGTCGCTCGCTGTTTGA-3'); |
| Fgf2]F (5'-ACTCCAGTTGTGTGTGGCACTGA-3'); |
| Fgf2[R (5'-AACAGTATGGCCCTGTCCAGGT-3'); |
| Tgfb2[F (5'-GCTTTGGGGCCCTGCTTT-3'); |
| Tgfb2[R (5'-CTCAGCACAGAGTGGCATTGT-3'); |
| अंग2]F (5'-ATCCAACGAGAGATGGGAT-3'); |
| Ang2[R (5'-AACTCATTGCCCAGTACTCT-3'); |
| हगफ]F (5'-GCATTCAAGGAGAGTT-3'); |
| Hgf[R (5'-TCATGCTTGTGAGGTACTGCGAA-3'); |
| 18s[F (5'-GCCCTATCAACTTCGATTAGT-3'); |
| 18s[R (5'-CCGGAATCGAACCGATGAT-3'). |
तालिका 1: अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया प्राइमर.
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Discussion
सीएलआई के मौरीन मॉडलों में ज्यादातर ऊरु धमनी का शिलान्या होता है , जो प्रोफंडा फेमोरिस 4,5,6,7,8,9की उत्पत्ति के लिए अलग हो जाता है . इससे अधिकांश संपार्श्विक परिसंचरण को अक्षुण्ण रखा गया है, जो 7 दिनों 9 के भीतर अंग में रक्त के प्रवाह को बहाल करता है। संपार्श्विक बिस्तर को हटाने के लिए ऊरु धमनी के उच्छेदन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, मूल रक्त प्रवाह का एक तिहाई तक प्रक्रिया के बाद 7 दिनों के रूप में जल्द ही बहाल किया जा सकता है, यह देखते हुए कि अधिकांश संपार्श्विक वाहिकाओं आंतरिक श्रोणि धमनी 7से उत्पन्न होते हैं। लेजे एट अल ने सामान्य श्रोणि धमनी पर किए गए दूसरे लिगेशन के साथ अनुक्रमिक लिगेशन का प्रस्ताव किया है, जो आंतरिक श्रोणि धमनी 4द्वारा प्रदान की गई संपार्श्विक भ्रम को प्रभावी ढंग से कम करता है। इस प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम न केवल वंष्ण स्नायु बंधन के ऊपर बाहरी iliac धमनी की पहचान शामिल है, लेकिन यह भी ligation और distal बाहरी iliac और femoral धमनियों और नसों, जो एक डबल उद्देश्य कार्य करता है के विच्छेदन और चीरा: इस्कीमिया की गंभीरता में वृद्धि के साथ-साथ मॉडल की तकनीकी पुनरुत्पादनीयता में सुधार करने के लिए, अकेले ऊरु धमनी के जोखिम के रूप में अक्सर नस के फाड़ में परिणाम।
इस तकनीक की एक सीमा अंग में रक्त के प्रवाह का तीव्र रुकावट है, जो एथेरोस्क्लेरोटिक पट्टिका के निर्माण से जुड़ी लंबी प्रक्रिया से अलग है जिससे धमनी स्टेनोसिस और ऑक्यूशन होता है। फिर भी, रक्त के प्रवाह में कमी अच्छी तरह से 2 सप्ताह के बाद मौजूद था, पुरानी इस्किमिया के निदान के लिए स्थापित समय बिंदु. इसके अलावा, अकेले इस्कीमिक अपमान के साथ संपार्श्विकीकरण में वृद्धि हुई थी, जो लंबे समय से इस्कीमिक अंगों में मनाया संपार्श्विक गठन की प्रक्रिया की नकल करता है।
इस्कीमिक अंगों के नवसंवहनीकरण में जैविक घटनाओं की एक जटिल परस्पर क्रिया शामिल होती है, जैसे एंजियोजेनेसिस और धमनीजनन। इस प्रोटोकॉल पर ामाल विभिन्न प्रकार के परखों में एंजियोजेनिक स्प्राउटिंग (कैपिलरी पोत घनत्व) और संपार्श्विक पोत विकास (आर्टीरियोजेनेसिस), मानव सहिष्णुता में सबसे महत्वपूर्ण तंत्र पर putative एंजियोजेनिक चिकित्सा के हस्तक्षेप का मूल्यांकन शामिल है अंग इस्किमिया को कम करने के लिए। इसके साथ ही, लेजर डॉपलर इन नए या बढ़े हुए जहाजों के समारोह का अनावरण करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और पहली बार केशिकाओं के लेजर microdissection के लिए ईसीएस आणविक तंत्र है कि कार्यात्मक वसूली underlie खुलासा इकट्ठा करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इस प्रोटोकॉल पैदावार एक reproduible पशु मॉडल है कि CLI परीक्षण के एक मानक के प्रभाव की नकल कर सकते हैं जब जानवरों संभव angiogenic उपचार है कि भविष्य में एक नैदानिक संदर्भ में लागू किया जा सकता है के साथ इलाज कर रहे हैं.
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Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम क्रमशः Instituto de Medicina आणविक जोओ लोबो Antunes के Bioimaging सुविधा और ऊतक विज्ञान और तुलनात्मक पैथोलॉजी प्रयोगशाला के प्रमुख जोस Rino और T$nia Carvalho धन्यवाद. हम नोवा मेडिकल स्कूल के एनाटॉमी विभाग से Vyacheslav Sushchyk भी धन्यवाद /
अनुदान संदर्भ: UID/IC/0306/2016 फंडाओ पैरा एक सिएनसिया ई एक टेक्नोलोजिया द्वारा वित्त पोषित परियोजना। पाउला डे Oliveira एक फैलोशिप द्वारा समर्थित है (SFRH/BD/80483/2011) Funda]o पैरा एक Ci$ncia ई Tecnologia से.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7500 Fast Real-Time PCR | Applied Biosystems | Instrument | |
| Acetone | Merk | 1000141000 | Reagent; Caution - highly flammable |
| Adenosine | Valdepharm | Reagent | |
| Atipamezole | OrionPharma | Reagent | |
| Barium sulphate (Micropaque) | Guebert | 8671404 (ref. Infarmed) | Reagent |
| Buprenorphine | RichterPharma | Reagent | |
| Carl Zeiss Opmi-1 FC Surgical Microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| cDNA RT2 PreAMP cDNA Synthesis kit | Qiagen | 7335730 | Reagent |
| Cryostat Leica CM | Leica Microsystems | 3050S | Instrument |
| DAB peroxidase substrate kit | DAKO;Vector Laboratories | K3468 | Reagent |
| hydrogen peroxidase | Merk | 1072090250 | Reagent; Caution - nocif |
| hydrophobic pen | Dako | 411121 | Reagent; Caution - toxic |
| Ketamidor | Richterpharma | CN:580393,7 630/01/12 Dfvf | Reagent |
| Laser Doppler perfusion imager moorLDI2-HIR | MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK | 5710 | Instrument |
| Leica DM2500 upright brightfield microscope | Leica Microsystems | Instrument | |
| Medetor | Virbac | 037/01/07RFVPT | Reagent |
| methanol | VWR | UN1230 | Reagent; Caution - toxic and highly flammable |
| Papaverine | Labesfal | Reagent | |
| Pentano Isso | Merk | 1060561000 | Reagent; Caution - highly flammable |
| Power SYBR® Green | Applied Biosystems | 4309155 | Reagent |
| Purified rat anti-mouse CD31 | Pharmingen | 550274 | Reagent |
| RNeasy Micro kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Surgic-Pro 6.0 | Medtronic (Coviden) | VP733X | Suture |
| VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, Rat IgG) | Vectastain ABC kit; Vector Laboratories | PK-4004 | Reagent |
| Vicryl5.0/ Vicryl 6.0 | Medtronic (Covidien) | UL202/ UL101 | Suture |
| Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection System | Carl Zeiss Microscopy, Germany | 1023290916 | Instrument |
| Stereotaxic microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| Digital camera | Linux | Instrument |
References
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