Summary
Her presenteres en kritisk hindlimb bentap iskemi eksperimentell modell etterfulgt av et batteri av funksjonelle, histologic og molekylære tester for å vurdere effektiviteten av angiogenic terapier.
Abstract
Kritisk lem iskemi (CLI) er en alvorlig tilstand som medfører en høy risiko for lavere lem amputasjon. Til tross for revaskularisering er gull-standard terapi, et betydelig antall CLI pasienter er ikke egnet for enten kirurgisk eller endovaskulær revaskularisering. Angiogenic terapier fremstår som et alternativ for disse pasientene, men er for tiden fortsatt under etterforskning. Før påføring hos mennesker, må disse behandlingene testes i dyremodeller og dens mekanismer må være klart forstått. En dyr modell av hindlimb bentap iskemi (HLI) har blitt utviklet av ligation og fjerning av den eksterne ytre iliaca og lår arterier og årer i mus. En omfattende panel av tester ble montert for å vurdere virkningene av iskemi og antatte angiogenic terapier på funksjonelle, histologic og molekylære nivåer. Laser Doppler ble brukt til strømnings måling og funksjonell vurdering av Vevs responsen ble evaluert av analyse av kapillær tetthet etter farging med anti-CD31 antistoff på histologiske deler av gastrocnemius muskel og ved måling av pant fartøy tetthet etter diaphonization. Uttrykk for angiogenic gener ble kvantifisert av RT-PCR rettet mot utvalgte angiogenic faktorer utelukkende i endothelial celler (ECs) etter laser fangst microdissection fra mus gastrocnemius muskler. Disse metodene var følsomme i å identifisere forskjeller mellom iskemiske og ikke-iskemiske lemmer og mellom behandlet og ikke-behandlet lemmer. Denne protokollen gir en reproduserbar modell av CLI og et rammeverk for testing angiogenic terapier.
Introduction
Perifer arteriell sykdom (PAD) påvirker hovedsakelig de nedre lemmer. PAD er forårsaket av aterosklerose, en arterie obstruksjon som kan forårsake alvorlig begrensning i blodstrømmen i de nedre lemmer1. Intermitterende claudicatio er den første manifestasjon av PAD og refererer til muskel smerter når du går. CLI er den mest alvorlige fasen av PAD, blir diagnostisert hos pasienter som viser iskemiske hvile smerte, magesår eller koldbrann2. Pasienter med CLI har høy risiko for amputasjon, spesielt hvis ubehandlet3. Nedre lem revaskularisering (enten ved åpen kirurgi eller en endovaskulær prosedyre) er for tiden den eneste måten å oppnå lem berging. Men rundt 30% av CLI pasienter er ikke egnet for disse prosedyrene, av grunner som inkluderer plasseringen av lesjoner, mønsteret av arteriell okklusjon og omfattende komorbiditet. Derfor, nye terapier er nødvendig for disse ellers botemiddel pasienter, med fremming av angiogenese være strategien under mer intens etterforskning.
Før testing hos mennesker, må effektiviteten og sikkerheten til nye terapier in vivo vurderes i dyremodeller. Flere modeller har blitt utviklet for studiet av CLI, for det meste ved å indusere hindlimb bentap ischemia (HLI) i mus6,7,8,9,10. Men disse modellene varierer i flere aspekter, inkludert arten av arteriene som er ligaturer og/eller excised og om årer og nerver rundt er dissekert også6,7,8, 9,10. Til sammen vil disse aspektene påvirke alvorlighetsgraden av ischemia-reperfusion skade i hvert dyr, noe som gjør resultatene vanskelig å bli sammenlignet. Derfor er det avgjørende å utvikle en effektiv protokoll der prosedyren for å indusere iskemi og evaluering av ulike mål bør være standardisert for å vurdere om en gitt angiogenic behandling vil være effektiv. En eksperimentell protokoll designet for å dekke alle disse aspektene vil gi en helhetlig forståelse av de mekanismer som angiogenic terapier utøve sine effekter og et mål på deres effekt på hver av sine utfall. To distinkte arbeider nylig publisert av vårt team er et godt eksempel11,12, der ulike tilnærminger for å indusere terapeutisk angiogenese ble vurdert ved hjelp av samme protokoll som vil bli beskrevet med flere detaljer i denne Protokollen.
Det overordnede målet med denne protokollen er å beskrive en reproduserbar eksperimentell modell som kan etterligne virkningene av CLI og legge det eksperimentelle fundamentet for en helhetlig vurdering av de funksjonelle, histologic og molekylære virkningene av antatte angiogenic Agenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr prosedyrer er i samsvar med direktiv 2010/63/EU og har blitt godkjent av den institusjonelle dyrevelferd Body og lisensiert av DGAV, den portugisiske kompetente myndighet for dyr beskyttelse (lisensnummer 023861/2013)
FORSIKTIG: flere av kjemikaliene som brukes i protokollene, er giftige og skadelige. Bruk all hensiktsmessig sikkerhetspraksis og personlig verneutstyr (hansker, laboratoriefrakk, full lengde bukser, og lukkede-toe sko)
1. den murine modell av hindlimb bentap iskemi
Merk: alle eksperimenter utføres på 22-ukers gamle C57BL/6 kvinnelige mus.
- Utarbeidelse av løsninger
-
Utarbeidelse av anestesi løsning
Merk: denne anestesi kombinasjonen (medetomidine og ketamin) gir opptil 30 min immobilisering og et kirurgisk vindu på 15 min. Effekten kan tilbakestilles av administrasjonen av atipamezole.- Med en ren, 1cc sprøyte, trekker du ut 1 mL medetomidine (1 mg/kg kroppsvekt), eliminerer luftbobler for nøyaktige målinger, og legger det til en 15 mL Falk tube.
- Med en ren, 1 cc sprøyte, trekker du 0,75 mL ketamin (75 mg/kg kroppsvekt), eliminerer luftbobler for nøyaktige målinger og legger det til et 15 mL Falk rør som inneholder medetomidine.
- Tilsett 8,25 mL sterilt saltvann (0,9% NaCl), for å oppnå 10 mL bedøvelse løsning.
- Identifiser røret med navnet på forbindelsene, datoen blandet og utløpsdatoen.
- Oppbevares i mørket ved 4 ° c.
-
Utarbeidelse av anti-beroligende løsning
- Med en ren, 1 cc sprøyte, trekker du ut 1 mL atipamezole (5 mg/kg kroppsvekt), eliminerer luftbobler for nøyaktige målinger, og legger det til en 15 mL Falk tube.
- Tilsett 9 mL sterilt saltvann (0,9% NaCl) for å få 10 mL reversion oppløsning.
- Identifiser røret med navnet på forbindelsene, datoen blandet og utløpsdatoen.
- Oppbevares i mørket ved 4 ° c.
-
Utarbeidelse av post-operative analgesi løsning
- Med en ren, 1 cc sprøyte, trekker du 0,5 mL buprenorfin (100 μL/15-30 g kroppsvekt), eliminerer luftbobler for nøyaktige målinger, og legger det til en 15 mL Falk tube.
- Tilsett 9,5 mL sterilt saltvann (0,9% NaCl) for å oppnå 10 mL analgesi oppløsning.
- Identifiser røret med navnet på forbindelsene, datoen blandet og utløpsdatoen.
- Oppbevares i mørket ved 4 ° c.
-
Utarbeidelse av anestesi løsning
- Kirurgisk induksjon av hindlimb bentap iskemi
- Kirurgiske verktøy som trengs for denne intervensjonen: spiss tang, fjær saks, øyen nål holder, kirurgisk saks og en nål holderen. Sterilisere alle kirurgiske verktøy i en autoklav før bruk. Bruk bomullspinner for Disseksjon av subkutant fett.
- Legg sprøyten med anestesi løsningen før du holder musen.
- Holde dyret ved å påføre kraft bak ørene mot buret rutenettet, holder så mye hud som mulig for å holde musen Immobile.
- Hold dyret vippet med hodet senket og utføre en intraperitoneal injeksjon av anestesi løsning, holde sprøyten på en 45 ° vinkel med musen kropp.
- Sjekk for fravær av pedal abstinens reflekser, for å evaluere dybden av anestesi.
- Fjern håret fra høyre hindlimb bentap ved hjelp av en elektrisk barbermaskin. Bruk en klorheksidin desinfiserende såpe skrubb for hud forberedelse. Bruk et rent papir håndkle for å fjerne Suds. Påfør en klorheksidin kirurgisk skrubb og Beskytt hud området med en steril gardin, før du transporterer musene til den kirurgiske, sterile suiten.
- Plasser dyret i rygg ligge og begrense det med de fire lemmer spredt fra hverandre og sikret med tape.
FORSIKTIG: Utfør prosedyren på en oppvarmet pute for å holde dyrets kroppstemperatur stabilt; kirurgiske prosedyren utføres ved hjelp av et disseksjon mikroskop ved 10x eller 20x forstørrelse. - Påfør en klorheksidin antiseptisk løsning ved hjelp av sterilt gasbind for å ferdigstille hudens forberedelse. Ved hjelp av en nummer 11 kirurgisk skalpell blad utføre en 1-cm hud snitt overliggende låret av høyre hindlimb bentap.
- Blunt analysere subkutant fett utsette nevrovaskulære bunt. Bruk den spisse tang, fjær saksen og nål holde ren til å åpne membranous Ilio for å avdekke de eksterne iliaca og lår beholderne.
- Analysere og skille fartøyene (arterie og vene) fra nerve. Ved hjelp av en 7,0 ikke-absorberbare polypropylen-Sutur ombinde den eksterne iliaca arterien og venen og den opp-
- Kontinuerlig segmentet av Ilio og venene mellom de proksimale knop med fjær saksen.
- Lukk snittet med en absorberbare Sutur (f. eks, 5,0 Vicryl Sutur).
- Legg sprøyten med den anti-beroligende løsningen og bruk den samme metoden som er beskrevet i 1.2.3 og 1.2.4 for å utføre en intraperitoneal injeksjon av anti-beroligende løsning.
- Postoperativ overvåkning
Merk: dyr er nøye observert hver 15-20 min for å sikre at alle dyrene gjenopprette godt fra anti-beroligende; anesthetized dyrene er aldri forlatt uten tilsyn.- Vurdere utvinningen fra anestesi: 1) overvåke hastigheten og dybden av respirasjon; 2) vurdere dyr reflekser (pedal og øye posisjon)
- Utfør en subkutan injeksjon av post-operative analgesi hver 8-12 h.
- Monitor dyrene daglig etter operasjonen innspillingen en kort beskrivelse av dyrets helsetilstand og kirurgi nettsted utseende, sikre at alle sting er lukket.
- Re-Sutur snittet, hvis dehiscence oppstår. Hvis mislykket, Påfør en hudbarriere film på snittet for å beskytte mot urin, avføring ekskreter, friksjon og skjær i huden og for å hjelpe helbredelsesprosessen.
2. vurdering av angiogenic effekt
Merk: etter iskemi induksjon, bruke terapeutisk agent i studien og oppnå følgende prosedyrer. Trinn foretatt på andre tidspunkter er beskrevet under den tilsvarende seksjonen.
- Laser Doppler-bilde
- Fjern håret fra begge hindlimbs en dag før analysen ved hjelp av en elektrisk barbermaskin etterfulgt av riktige krem.
- Bedøve musene ved hjelp av anestesi løsningen.
- Plasser dyret på en 37 ° c varmepute i 5 minutter for å sikre at temperaturen ikke vil endres under prosedyren
- Plasser dyret i liggende posisjon med bena sikret i en lengre posisjon. Mål avstanden mellom høyre og venstre ben og føtter for hvert dyr siden plasseringen av dyret skal være tilsvarende når prosedyren må gjentas for å følge endringer i hindlimb bentap over tid.
- Begynn å innhente data ved hjelp av et laser Doppler-Imager.
- Etter oppkjøpet er fullført, tilbake anestesi med anti-beroligende løsning.
- Åpne bildet analyseprogramvare og tegne regionen av interesse (ROI) rundt iskemiske hindlimb bentap og en sammenlignbar avkastning rundt ikke-iskemiske hindlimb bentap.
- Observer Flux verdier og bestemme at den er et forhold mellom en hjerne i iskemiske lem som i den ikke-iskemiske lem. Endringer i forholdet måles over tid.
- Analyse av immunhistokjemi og kapillær tetthet
- Etter anesthetizing, ofre musene ved cervical forvridning.
- Å høste gastrocnemius musklene i begge beina, først, fjerne huden fra begge hindlimbs.
- Identifiser Achilles sene og skille senen fra benet ved hjelp av en 11-blad skalpell.
- Hold Achilles sene og skille muskelen fra Tibia og fibula opp til kneleddet med våren saks.
- Skill biceps femoris fra gastrocnemius muskelen.
- Bruk vår saks for å kutte innsettinger av gastrocnemius musklene på kneleddet nivå.
- Plasser høstet gastrocnemius musklene i en tverrgående orientering på en liten kork disk med hjelp av 10% tragacanth.
- Smekk fryse prøvene i flytende nitrogen kjølte isopentane og oppbevar dem ved-80 ° c til snitting.
- Skjær 7 μm deler av muskel prøver på en kryostaten og Monter på glass lysbilder.
Merk: protokollen kan stanses midlertidig her. - Fest glass lysbildene i en flaske som inneholder avkjølt ren aceton (ca. 50 mL) i 10 minutter ved-20 ° c.
- Tilsett hydrogen peroksidase 0,3% fortynnet i metanol (50 mL) i 30 min ved romtemperatur.
- Vask to ganger i fosfat-bufret saltvann (PBS) (50 mL) i totalt 10 minutter.
- Bruk en hydrofobe penn rundt delene.
Merk: bruk av en hydrofobe penn gjør det mulig å redusere mengden av løsninger som brukes under protokollen. For alle incubations bruk 100 μL av alle løsninger, per seksjon. - Påfør en blokkerings løsning på 5% kanin serum i PBS i 30 min ved romtemperatur.
- Ruge prøvene i 1 time ved romtemperatur med anti-CD31 rotte monoklonale antistoff fortynnet ved 1:500 i 1% storfe serum albumin (BSA) i PBS.
- Vask tre ganger i PBS for totalt 30 min.
- Legg til en sekundær biotinylated kanin anti-rotte IgG antistoff på 1:200 i 1% BSA i PBS og 5% kanin serum i 30 min ved romtemperatur.
- Vask i PBS som før og Legg merket avidin-bøyd peroksidase kompleks i 30 min ved romtemperatur.
- Skyll 3 ganger i PBS for 5 min og tilsett diaminobenzidine (DAB) peroksidase substrat Kit for ytterligere 5 min.
- Counterstain seksjonene med hematoksylin for 10 s før montering.
- Mål kapillær tettheten ved å bruke et oppreist brightfield mikroskop (dvs. antall blodkar per antall myocytter) i 2 forskjellige deler av 4 distinkte anatomiske områder i hvert eksemplar.
- Farge for kontrastmiddel
- Bedøve musene ved hjelp av anestesi løsningen.
- Utfør en median laparotomy ved hjelp av et nummer 15 skalpell blad.
- Utsett abdominal aorta og caudal vena cava, etter trekke sideveis den lille tarmen og bruke vår saks.
- Sett inn 1 26-gauge kateter cranially inn i abdominal aorta og en annen inn i caudal vena cava i samme retning.
- Sikre katetre på plass ved hjelp av en 5/0 silke Sutur for å utføre et opphold Sutur.
- Vask det vaskulære systemet med en 37-saltoppløsning som inneholder heparin (500 enheter/100 mL) som er skjøvet inn i abdominal aorta ved hjelp av en 10 mL sprøyte. Fortsett forsiktig med å komme frem til en klar løsning som kommer ut av kateteret plassert inne i caudal vena cava.
Merk: vanligvis er 30 til 40 mL av en heparinisert saltvannsoppløsning nødvendig for å skylle det vaskulære systemet til en voksen rotte. - Administrer en blanding av adenosin (1 mg/L) og papaverine (4 mg/L) i 2 min.
- Injiser i aorta kateteret 10 mL av en blanding av 50% barium sulfat og 5% gelatin.
Merk: oppløsningen må oppbevares ved 60 ° c for å unngå tykkere. - La musene ved-4 ° c i minst 4 h, for å tillate vaskulær cast å stivne.
- Fjern huden fra den nedre delen av hver mus.
- Diaphonization - Spalteholz teknikk
- Fest mus ved nedsenkning i en 10% formaldehyd løsning for minst 72 h.
- Bleach musene ved nedsenkning i en 30% hydrogen peroxide løsning for 24 h.
- Tørke musene ved hjelp av fryse substitusjons teknikken. Denne metodikken består av å sende musene til etterfølgende passasjer (i gjennomsnitt fire) av ren aceton ved-20 ° c for 24 timer hver.
- Avklare musene ved å dyppe den i en løsning som inneholder en blanding av 100% benzylalkohol benzoate og 100% methyl salicylate i en 3:5 andel (denne blandingen er også kjent som Spalteholz løsning) 13.
- La musene være nedsenket i Spalteholz-løsningen inne i et vakuum kammer til den blir diaphanous, noe som vanligvis tar 5 til 7 dager.
- Bytt ut oppløsningen hvis den blir mørk før prøven blir klar.
- Sikkerhet fartøy kvantifisering
- Observer musene suspendert i Spalteholz løsningen under transillumination ved hjelp av et stereotaxic mikroskop. Bruk mikrokirurgi tang for å forsiktig gripe og flytte den.
- Fotografere hele lemmer ved hjelp av et digitalt kamera som er koblet til mikroskopet.
- Få hele lem fotografier ved hjelp av riktig programvare.
- Utfør en manuell segmentering av sikkerhet fartøy ved å markere dem ved hjelp av riktig programvare.
Merk: sivile fartøy er definert i henhold til Longland definisjon, en definert stamme, mid-sone, og re-deltaker, med en diameter mellom 20 og 300 μm, unntatt lår, saphenavenen og popliteal arterier og alle venøs strukturer. - Definer ROIs i hver mus i samme anatomiske regionen i adductor, rundt og under kirurgisk okklusjon.
- Kvantifisere sikkerhet fartøyet tetthet (CVD) i tilsvarende ROIs tilsvarende 20% av den totale lem området. Den CVD beregnes som forholdet mellom det vaskulære området og ROIs områder. Alle tetthetsmålinger utføres ved hjelp av ImageJ-programvare.
Merk: CVD-verdien av ikke-iskemiske lem for hver mus antas å tilsvare 100% for å utelukke variasjoner i anatomi, eller diaphonization prosedyrer. CVD-prosenten i iskemiske lem var derfor beregnet i forhold til ikke-iskemiske en. - Bestem prosentandelen av CVD økning som forskjellen mellom CVD prosentandel blant iskemiske og nonischemic lemmer.
- Laser fangst microdissection av blodkar
- Etter anesthetizing, ofre musene ved cervical forvridning.
- Å høste gastrocnemius musklene i begge beina, fjerne huden fra mus begge hindlimbs.
- Identifiser Achilles sene og skille senen fra benet ved hjelp av en 11-blad skalpell.
- Hold Achilles sene og skille muskelen fra Tibia og fibula opp til kneleddet med våren saks.
- Skill biceps femoris fra gastrocnemius muskelen.
- Bruk vår saks for å kutte innsettinger av gastrocnemius musklene på kneleddet nivå.
- Plasser høstet gastrocnemius musklene i en tverrgående orientering på en liten kork disk med hjelp av 10% tragacanth.
- Smekk fryse prøvene i flytende nitrogen kjølte isopentane og oppbevar dem ved-80 ° c til snitting.
- Skjær på en kryostaten 12 μm deler av muskelen prøvene og montere på glass lysbilder.
Merk: for RNA-beskyttelse tar du et forkjøles lysbilde og berører baksiden av lysbildet med fingeren (hansker) for å varme bare området for plassering av seksjonen. Overføringsdelen fra kryostaten kniven ved å berøre varme området og tørke ved-20 ° c i kryostaten i 2-3 min. Protokollen kan stanses midlertidig her.- Fest glass lysbildene i en flaske som inneholder avkjølt ren aceton (ca. 50 mL) i 5 minutter ved-20 ° c og lufttørke dem.
- Bruk en hydrofobe penn rundt delene.
Merk: bruk av hydrofobe pennen bidrar til å redusere mengden av løsninger som brukes under protokollen. For alle incubations bruk 100 μL av alle løsninger, per seksjon. - Rehydrate med 2 M NaCl/PBS ved 4 ° c og ruge prøvene over natten ved 4 ° c med anti-CD31 rotte monoklonale antistoff ved 1:500 i 2M NaCl/PBS.
- Vask to ganger i 2M NaCl/PBS for totalt 6 min.
- Legg til en sekundær biotinylated kanin anti-rotte IgG antistoff på 1:200 i 2M NaCl/PBS og 5% kanin serum i 30 min ved 4 ° c.
- Vask i 2 M NaCl/PBS som før og Legg til merket avidin-bøyd peroksidase kompleks i 30 min ved 4 ° c.
- Skyll og tilsett DAB-peroksidase i 5 min.
- Tørke seksjonene i iskald 90% etanol etterfulgt av 100% etanol og la dem tørke.
- Analysere 10 000 blodkar per mus benytter en laser microdissection system utstyrt med med en pulserende robust-begrunne 355 NM laser og katapult det dissekert blodkar i en microfuge rør lim-lua.
- RNA-ekstraksjon, cDNA-syntese, pre-forsterkning, og RT-PCR
- Isoler total RNA fra microdissected blodkar ved hjelp av et egnet sett, den totale RNA-en som oppnås er mellom 1.5-3 ng/μL.
- Bruk en cDNA syntese Kit for syntese og to runder av pre-forsterkning, ved hjelp av primere beskrevet i tabell 1.
- Utfør RT-PCR for de samme målene som er beskrevet i forrige trinn. Bruk et program som består av et innledende denaturering trinn ved 95 ° c i 10 min, etterfulgt av 50 sykluser ved 95 ° c for 15 s og ved 60 ° c i 1 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av den beskrevne protokollen, navlestreng Mesenchymal stamceller og lav dose ioniserende stråling (LDIR) ble testet som antatte angiogenic behandling 11,12. Laser Doppler-måling ble innhentet før iskemi induksjon og på pre-spesifiserte tidspunkter alt fra umiddelbart etter iskemi induksjon til 45 dager post-iskemi. Målinger av vevs-og laser-Doppler ble registrert som fargekodede bilder, uten at det ble vist en rød farge som mørk blå og det høyeste nivået som ble vist som rødt. Som vist i figur 2A og 3a og kvantifisert i tall 2B og 3b, ble det observert et fullstendig tap av hindlimb bentap i alle mus umiddelbart etter induksjon av hindlimb bentap iskemi, noe som sikrer at reproduserbarhet av teknikken for inducing hindlimb bentap iskemi. Viktigere, alvorlighetsgraden av iskemi er lik i alle dyr. En ROI ble trukket rundt iskemiske hindlimb bentap og en sammenlignbar ROI ble trukket rundt ikke-iskemiske hindlimb bentap å utføre kvantifisering. Å bli uttrykt som et forhold mellom andre i iskemiske lem som i den ikke-iskemiske lem. Endringer i forholdet måles over tid.
Immunhistokjemi ble fremført mellom 15 og 90 dager etter ischemia. Diaphonization ble foretatt mellom 19-og 90-dagers post-iskemi og kapillær microdissection mellom 45-og 70-dager etter iskemi induksjon sikre at de ulike Pro-angiogenic terapier indusert en varig og langvarig proangiogenic effekt.
Kvantifisering av CD31-positive blodkar i histologiske deler av gastrocnemius muskelen vurderte kapillær tettheten og dette ble uttrykt som antall blodkar per antall muskelfibre. Som vist i Figur 4, var kapillær tetthet større i iskemiske versus ikke-iskemiske lem.
For å evaluere sikkerhet fartøy tetthet, mus var diaphonized og en tilsvarende avkastning, tilsvarende 20% av lem området, ble valgt for kvantifisering. Sikkerhet fartøy tetthet stadig økt i iskemiske lem, slik at data knyttet til behandlet og kontroll lemmer ble uttrykt som prosentandelen av sikkerhet fartøy tetthet økning i iskemiske Lem er relativt til ikke-iskemiske en (figur 5 ).
Uttrykk for Pro-angiogenic gener ved ECs ble analysert av kvantitativ RT-PCR av CD31-positive celler. Transkripsjoner for Vegfr2, Vegfr1, Fgf2, Angpt2, Pdgfc, Tgfb2, hgf, og møtte viste en klar variasjon i uttrykk mellom iskemiske og ikke-iskemiske lemmer, utelukkende i mus eksponert for Pro-angiogenic stimulans (figur 6).
Figur 1 : Skjematisk illustrasjon av anatomien til musen hindlimb bentap blodkar viser ligation nettsteder. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : LDIR øker utvinningen. Etter kirurgisk induksjon av ensidig HLI, både hindlimbs av C57BL/6 mus var humbug bestrålt eller bestrålt med fire daglige fraksjoner av 0,3 gy, i påfølgende dager og lov til å gjenopprette. (A) representant laser Doppler Flow bilder pre-HLI, og ved dager 0 (D0) og 15 (D15) post-HLI induksjon. (B) kvantitativ evaluering av blodstrømmen uttrykt som et forhold på ISC til NISC lem demonstrert betydelig forbedret lem blodstrøm i bestrålt mus kontra humbug-bestrålt seg både på dager 15 (D15) og 45 (d45) post-HLI. Mellom gruppe endringer ble vurdert av toveis gjentatte målinger ANOVA etterfulgt av Bonferroni post-hoc-test (n = 12 mus per gruppe). Means ± SEM er vist. P < 0,001; NS, nonsignificant. HLI, hindlimb bentap iskemi; ISC, iskemiske; NISC, ikke-iskemiske; Pre-HLI, før hindlimb bentap iskemi. Tilpasset fra 11. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Navlestreng Mesenchymal stamceller (ucx) øke utvinningen. UCX eller deres kjøretøy (som en kontroll) ble administrert i iskemisk gastrocnemius muskelen 5 timer etter HLI induksjon. (A) representative laser Doppler Flow bilder før (PRE-HLI), umiddelbart etter (D0 POST-HLI) og ved 7, 14 og 21 dager etter HLI induksjon (D7 POST-HLI, D14 POST-HLI, d21 POST-HLI). (B) kvantitativ evaluering av blodstrøm uttrykt som et forhold på ISC til NISC lem demonstrert betydelig forbedret lem blodstrøm i navlestreng Mesenchymal stamceller-behandlet mus på 7, 14 og 21 dager post-HLI. (n = 16 for hver eksperimentell gruppe; D7: t (22,69) = 4,26; P ˂ 0,001; effekt størrelse var 1,51 og kraft 0,98; D14: t (30) = 4,7; P ˂ 0,001; effekt størrelse var 1,66 og kraft 0,99; D21: t (30) = 7,22; P ˂ 0,001; effekt størrelse var 2,56 og kraft 0,99). HLI, hindlimb bentap iskemi; ISC, iskemiske; NISC, ikke-iskemiske. Tilpasset fra11. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : LDIR øker kapillær tettheten. (A) representative seksjoner fra humbug-bestrålt og bestrålt iskemiske gastrocnemius musklene på dagen 45 post-HLI. Blodkar og myocytter ble identifisert av henholdsvis CD31 immunhistokjemi og hematoksylin. Scale bar, 150 mm. (B) kvantitativ analyse avslørte økt kapillær tetthet (blodkar/myocyte) i bestrålt iskemiske gastrocnemius musklene sammenlignet med humbug-bestrålt iskemiske seg på dager 15 og 45 post-HLI. Mixed ANOVA etterfulgt av Bonferroni post-hoc-test ble utført med en innenfor-subjekt faktor av ISC og mellom-fag faktorer for dag og bestråling (n = 6 mus per gruppe). Individuelle data og midler ± SEM vises. P < 0.001; NS, nonsignificant. ISC, iskemiske; NISC, ikke-iskemiske. Tilpasset fra11. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: LDIR øker sivile tetthet. (A) illustrerende bilder av utvalgte ROIs for humbug-bestrålt og bestrålt mus. ISC og NISC lemmer på dag 90 post-HLI vises. Scale bar, 300 mm. (B) data er representert som prosentandelen av CVD økning av ISC lem relativt til NISC ett. Ved dag 15 og 90 post-HLI, bestrålt mus en signifikant høyere CVD-økning (%) VS. humbug-bestrålt mus. Toveis ANOVA ble utført etterfulgt av Bonferroni post-hoc-test med mellom faktorer i dag og bestråling (n = 6 mus per gruppe). Individuelle data og midler ± SEM vises. * P < 0,05; P < 0.001; NS, nonsignificant. HLI, hindlimb bentap iskemi; ISC, iskemiske; NISC, ikke-iskemiske. Tilpasset fra11. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : LDIR upregulates uttrykk for angiogenic gener i ECs isolert fra bestrålt iskemiske gastrocnemius muskler. Etter kirurgisk induksjon av ensidig HLI, både hindlimbs av C57BL/6 mus var humbug-bestrålt eller bestrålt med fire daglige fraksjoner av 0,3 gy, i påfølgende dager og lov til å gjenopprette. På dag 45 post-HLI, uttrykk for Pro-angiogenic faktorer og deres reseptorer ble evaluert av qRT-PCR utelukkende på ECs. Gastrocnemius muskel seksjoner ble beiset for CD31. Individuelle endothelial CD31 + celler ble vist, dissekert, og isolert ved hjelp av en laser microdissection system. Hver bar representerer den relative genuttrykk i ett dyr. Hvite og grå barer representerer humbug-bestrålt og bestrålt mus, henholdsvis. Verdier ble normalisert til 18S for å oppnå relative uttrykks nivåer. Resultater uttrykt som log2 fold endringer mellom iskemiske og ikke-iskemiske prøver demonstrert den relative overflod av transkripsjoner i bestrålt mus; i kontrast er en ned-regulering observert i humbug-bestrålt mus. Tilpasset fra11. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Vegfr1_F (5 '-TTGAGGAGCTTTCACCGAACTCCA-3 '); |
| Vegfr1_R (5 '-TATCTTCATGGAGGCCTTGGGCTT-3 '); |
| Vegfr2_F (5 '-AGGCCCATTGAGTCCAACTACACA-3 '); |
| Vegfr2_R (5 '-AGACCATGTGGCTCTGTTTCTCCA-3 '); |
| PDGF-c_F (5 '-ATGCCACAAGTCACAGAAACCACG-3 '); |
| PDGF-c_R (5 '-AAGGCAGTCACAGCATTGTTGAGC-3 '); |
| Met_F (5 '-ACGTTGAAATGCACAGTTGGTCCC-3 '); |
| Met_R (5 '-TTGCGTCGTCTCTCGACTGTTTGA-3 '); |
| Fgf2_F (5 '-ACTCCAGTTGGTATGTGGCACTGA-3 '); |
| Fgf2_R (5 '-AACAGTATGGCCTTCTGTCCAGGT-3 '); |
| Tgfb2_F (5 '-GCTTTGGATGCGGCCTATTGCTTT-3 '); |
| Tgfb2_R (5 '-CTCCAGCACAGAAGTTGGCATTGT-3 '); |
| Ang2_F (5 '-ATCCAACACCGAGAAGATGGCAGT-3 '); |
| Ang2_R (5 '-AACTCATTGCCCAGCCAGTACTCT-3 '); |
| Hgf_F (5 '-GCATTCAAGGCCAAGGAGAAGGTT-3 '); |
| Hgf_R (5 '-TCATGCTTGTGAGGGTACTGCGAA-3 '); |
| 18s_F (5 '-GCCCTATCAACTTTCGATTGGTAGT-3 '); |
| 18s_R (5 '-CCGGAATCGAACCCTGATT-3 '). |
Tabell 1: grunning som brukes til studien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Murine modeller av CLI har for det meste bestått i ligation av lårarterien like til opprinnelsen til profunda femoris 4,5,6, 7,8,9. Dette har vist å forlate det meste av sikkerhet sirkulasjon intakt, som gjenoppretter blodtilførselen til lem innen 7 dager 9. Fjerning av sikkerhet seng kan oppnås ved fjerning av lårarterien. Men opp til en tredjedel av den opprinnelige blodstrømmen kan gjenopprettes så snart som 7 dager etter inngrepet, gitt at de fleste sikkerhetsstillelse fartøy oppstår fra den interne iliaca arterien 7. Lejay et al har foreslått sekvensiell ligations med en andre ligation utført på den felles iliaca arterien, effektivt redusere sikkerhetsstillelse fra den interne iliaca arterien 4. Kritiske skritt i denne protokollen inkluderer ikke bare identifisering av den eksterne iliaca arterien like over lysken leddbånd, men også ligation og fjerning av den som er den eksterne iliaca og lår arterier og årer, som tjener en dobbel formål: å øke alvorlighetsgraden av iskemi, samt å forbedre den tekniske reproduserbarhet av modellen, som eksponering av lårarterien alene ofte resulterer i rive av venen.
En begrensning av denne teknikken er akutt avbrudd i blodstrømmen til lem, som avviker fra den langvarige prosessen knyttet til oppbygging av aterosklerotiske plakk som fører til arteriell stenose og okklusjon. Likevel, reduksjon av blodstrømmen var til stede godt etter 2 uker, den etablerte timepoint for diagnostisering av kroniske iskemi. Også collateralization ble økt med iskemiske fornærmelse alene, som etterligner prosessen med sikkerhet formasjon observert i kronisk iskemiske lemmer.
Neovascularization av iskemiske lemmer innebærer et komplekst samspill av biologiske hendelser, nemlig angiogenese og arteriogenesis. Denne protokollen inneholder en rekke analyser som vurderte forstyrrelsen av antatte angiogenic behandling på angiogenic spirende (kapillær fartøy tetthet) og sikkerhet fartøy utvikling (arteriogenesis), den viktigste mekanismen i menneskets toleranse til lavere lem iskemi. Samtidig, laser Doppler brukes til avsløring funksjonen av disse nye eller forstørrede fartøy, og for første gang laser microdissection av blodkar brukes til å samle ECs avsløre den molekylære mekanismer som ligger til grunn funksjonell utvinning. Denne protokollen gir en reproduserbar dyremodell som kan etterligne virkningene av CLI en standard for testing når dyrene blir behandlet med mulige angiogenic terapier som kan anvendes i en klinisk sammenheng i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker José Rino og Tânia Carvalho, lederne for Bioimaging Facility og histologi og sammenlignende patologi laboratorium for Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes, henholdsvis. Vi takker også Vjatsjeslav Sushchyk fra Institutt for anatomi av Nova Medical School/Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Nova de Lisboa.
Finansierings referanse: prosjekt finansiert av UID/IC/0306/2016 Fundação para a Ciência e a Tecnologia. Paula de Oliveira er støttet av et fellesskap (SFRH/BD/80483/2011) fra Fundação para a Ciência e Tecnologia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7500 Fast Real-Time PCR | Applied Biosystems | Instrument | |
| Acetone | Merk | 1000141000 | Reagent; Caution - highly flammable |
| Adenosine | Valdepharm | Reagent | |
| Atipamezole | OrionPharma | Reagent | |
| Barium sulphate (Micropaque) | Guebert | 8671404 (ref. Infarmed) | Reagent |
| Buprenorphine | RichterPharma | Reagent | |
| Carl Zeiss Opmi-1 FC Surgical Microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| cDNA RT2 PreAMP cDNA Synthesis kit | Qiagen | 7335730 | Reagent |
| Cryostat Leica CM | Leica Microsystems | 3050S | Instrument |
| DAB peroxidase substrate kit | DAKO;Vector Laboratories | K3468 | Reagent |
| hydrogen peroxidase | Merk | 1072090250 | Reagent; Caution - nocif |
| hydrophobic pen | Dako | 411121 | Reagent; Caution - toxic |
| Ketamidor | Richterpharma | CN:580393,7 630/01/12 Dfvf | Reagent |
| Laser Doppler perfusion imager moorLDI2-HIR | MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK | 5710 | Instrument |
| Leica DM2500 upright brightfield microscope | Leica Microsystems | Instrument | |
| Medetor | Virbac | 037/01/07RFVPT | Reagent |
| methanol | VWR | UN1230 | Reagent; Caution - toxic and highly flammable |
| Papaverine | Labesfal | Reagent | |
| Pentano Isso | Merk | 1060561000 | Reagent; Caution - highly flammable |
| Power SYBR® Green | Applied Biosystems | 4309155 | Reagent |
| Purified rat anti-mouse CD31 | Pharmingen | 550274 | Reagent |
| RNeasy Micro kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Surgic-Pro 6.0 | Medtronic (Coviden) | VP733X | Suture |
| VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, Rat IgG) | Vectastain ABC kit; Vector Laboratories | PK-4004 | Reagent |
| Vicryl5.0/ Vicryl 6.0 | Medtronic (Covidien) | UL202/ UL101 | Suture |
| Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection System | Carl Zeiss Microscopy, Germany | 1023290916 | Instrument |
| Stereotaxic microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| Digital camera | Linux | Instrument |
References
- Becker, F., et al. Chapter I: Definitions, epidemiology, clinical presentation and prognosis. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 42 Suppl 2, S4-S12 (2011).
- Fowkes, F. G., et al. Peripheral artery disease: epidemiology and global perspectives. Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 156-170 (2017).
- Abu Dabrh, A. M., et al. The natural history of untreated severe or critical limb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 62 (6), 1642-1651 (2015).
- Lejay, A., et al. A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 49 (2), 205-212 (2015).
- Sprengers, R. W., Lips, D. J., Moll, F. L., Verhaar, M. C. Progenitor cell therapy in patients with critical limb ischemia without surgical options. Annals of Surgery. 247 (3), 411-420 (2008).
- Lotfi, S., et al. Towards a more relevant hind limb model of muscle ischaemia. Atherosclerosis. 227 (1), 1-8 (2013).
- Masaki, I., et al. Angiogenic gene therapy for experimental critical limb ischemia: acceleration of limb loss by overexpression of vascular endothelial growth factor 165 but not of fibroblast growth factor-2. Circulation Research. 90 (9), 966-973 (2002).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
- Brevetti, L. S., et al. Exercise-induced hyperemia unmasks regional blood flow deficit in experimental hindlimb ischemia. Journal of Surgical Research. 98 (1), 21-26 (2001).
- Ministro, A., et al. Low-dose ionizing radiation induces therapeutic neovascularization in a pre-clinical model of hindlimb ischemia. Cardiovascular Research. 113 (7), 783-794 (2017).
- Pereira, A. R., et al. Therapeutic angiogenesis induced by human umbilical cord tissue-derived mesenchymal stromal cells in a murine model of hindlimb ischemia. Stem Cell Research Therapy. 7 (1), 145 (2016).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
