Summary
Aqui, é apresentado um modelo experimental de isquemia do membro posterior crítico, seguido de uma bateria de testes funcionais, histológicos e moleculares para avaliar a efetividade das terapias angiogênicas.
Abstract
A isquemia crítica do membro (CLI) é uma condição séria que implique um risco elevado de uma amputação mais baixa do membro. Apesar da revascularização ser a terapia padrão-ouro, um número considerável de pacientes com CLI não é adequado para revascularização cirúrgica ou endovascular. As terapias angiogénicas estão emergindo como uma opção para estes pacientes mas estão atualmente ainda a investigação. Antes da aplicação em seres humanos, essas terapias devem ser testadas em modelos animais e seus mecanismos devem ser claramente compreendidos. Um modelo animal da isquemia do hindmembro (HLI) foi desenvolvido pela ligadura e pela excisão das artérias ilíacas e femoral externas longe do ponto de origem e das veias nos ratos. Um painel detalhado dos testes foi montado para avaliar os efeitos da isquemia e de terapias angiogênico putativo em níveis funcionais, histologic e moleculars. O laser Doppler foi utilizado para a mensuração do fluxo e avaliação funcional da perfusão. A resposta tecidual foi avaliada pela análise da densidade capilar após coloração com o anticorpo CD31 em cortes histológicos do músculo gastrocnêmio e pela mensuração da densidade de vasos colaterais após a diaphonização. A expressão de genes angiogênicos foi quantificada por RT-PCR visando fatores angiogênicos selecionados exclusivamente em células endoteliais (ECS) após microdissecção de captura a laser de músculos gastrocnêmio de camundongos. Esses métodos foram sensíveis na identificação de diferenças entre os membros isquêmicos e não isquêmicos e entre os membros tratados e não tratados. Este protocolo fornece um modelo reprodutível de CLI e uma estrutura para testar terapias angiogênico.
Introduction
A doença arterial periférica (PAD) acomete predominantemente os membros inferiores. A PAD é causada pela aterosclerose, uma obstrução da artéria que pode causar severa restrição ao fluxo sanguíneo nos membros inferiores1. A claudicação intermitente é a primeira manifestação da PAD e refere-se à dor muscular ao caminhar. A CLI é o estágio mais grave da PAD, sendo diagnosticada em pacientes que apresentam dor de repouso isquêmica, úlceras ou gangrena2. Pacientes com CLI apresentam alto risco de amputação, especialmente se não forem tratados3. A revascularização do membro inferior (seja por cirurgia aberta ou por procedimento endovascular) é atualmente a única maneira de conseguir o resgate dos membros. No entanto, cerca de 30% dos pacientes com CLI não são adequados para esses procedimentos, por razões que incluem a localização das lesões, o padrão de oclusão arterial e extensa comorbidade4,5. Portanto, novas terapias são necessárias para estes pacientes de outra forma intratáveis, com a promoção da angiogênese sendo a estratégia investigação mais intensa.
Antes de testar em seres humanos, a eficácia e segurança de novas terapias in vivo deve ser considerada em modelos animais. Vários modelos foram desenvolvidos para o estudo da CLI, principalmente por indução de isquemia do membro posterior (HLI) em camundongos6,7,8,9,10. No entanto, esses modelos diferem em vários aspectos, incluindo a natureza das artérias que são ligadas e/ou extirpada e se as veias e os nervos que cercam são dissecados também6,7,8, 9,10. Tomados em conjunto, esses aspectos afetarão a severidade da lesão de isquemia-reperfusão em cada animal, dificultando a comparação dos resultados. Portanto, é fundamental desenvolver um protocolo efetivo no qual o procedimento para induzir a isquemia e a avaliação de diferentes alvos deva ser padronizado para avaliar se uma determinada terapia angiogênica será efetiva. Um protocolo experimental destinado a abranger todos esses aspectos proporcionaria uma compreensão abrangente dos mecanismos pelos quais as terapias angiogênicas exercem seus efeitos e uma medida de sua eficácia em cada um de seus desfechos. Duas obras distintas recentemente publicadas por nossa equipe são um bom exemplo11,12, em que diferentes abordagens para induzir a angiogênese terapêutica foram avaliadas usando o mesmo protocolo que será descrito com mais detalhes neste Protocolo.
O objetivo geral deste protocolo é descrever um modelo experimental reprodutível que pode imitar os efeitos da CLI e estabelecer a base experimental para uma avaliação abrangente dos efeitos funcionais, histológicos e moleculares do putativo angiogênico Agentes.
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Protocol
Todos os procedimentos em animais estão em conformidade com a diretiva 2010/63/UE e foram aprovados pelo organismo institucional de bem-estar animal e licenciados pela DGAV, a autoridade portuguesa competente para a protecção dos animais (número de licença 023861/2013)
Cuidado: diversos dos produtos químicos usados nos protocolos são tóxicos e prejudiciais. Por favor, use todas as práticas de segurança apropriadas e equipamentos de proteção individual (luvas, jaleco, calça de corpo inteiro e sapatos de dedo fechado)
1. o modelo murino de isquemia do membro posterior
Nota: todos os experimentos são realizados em ratos fêmeas de 22 semanas de idade C57BL/6.
- Preparação de soluções
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Preparação da solução anestésica
Nota: esta combinação anestésica (medetomidina e cetamina) fornece até 30 min de imobilização e uma janela cirúrgica de 15 min. O efeito pode ser revertido pela administração de atipamezole.- Com uma seringa limpa de 1cc, retire 1 mL de medetomidina (1 mg/kg de peso corporal), elimine as bolhas de ar para medições precisas e adicione-a a um tubo Falcon de 15 mL.
- Com uma seringa limpa de 1 cc, retire 0,75 mL de cetamina (75 mg/kg de peso corporal), elimine as bolhas de ar para medições precisas e adicione-a a um tubo Falcon de 15 mL contendo a medetomidina.
- Adicionar 8,25 mL de soro fisiológico estéril (0,9% NaCl), a fim de obter 10 mL de solução anestésica.
- Identifique o tubo com o nome dos compostos, a data misturada e a data de expiração.
- Conservar no escuro a 4 ° c.
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Preparação da solução antisedativa
- Com uma seringa limpa de 1 cc, retire 1 mL de atipamezol (5 mg/kg de peso corporal), elimine as bolhas de ar para medições precisas e adicione-a a um tubo Falcon de 15 mL.
- Adicionar 9 mL de soro fisiológico estéril (0,9% NaCl), a fim de obter 10 mL de solução de reversão.
- Identifique o tubo com o nome dos compostos, a data misturada e a data de expiração.
- Conservar no escuro a 4 ° c.
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Preparação da solução de analgesia pós-operatória
- Com uma seringa limpa de 1 cc, retire 0,5 mL de buprenorfina (100 μL/15-30 g de peso corporal), elimine as bolhas de ar para medições precisas e adicione-a a um tubo Falcon de 15 mL.
- Adicionar 9,5 mL de soro fisiológico estéril (0,9% NaCl), a fim de obter 10 mL de solução de analgesia.
- Identifique o tubo com o nome dos compostos, a data misturada e a data de expiração.
- Conservar no escuro a 4 ° c.
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Preparação da solução anestésica
- Indução cirúrgica da isquemia do membro posterior
- Ferramentas cirúrgicas necessárias para esta intervenção: pinça pontiaguda, tesoura de mola, suporte de agulha oftálmico, tesoura cirúrgica e suporte de agulha. Esterilizar todas as ferramentas cirúrgicas em autoclave antes de usar. Use cotonetes de algodão para a dissecção de gordura subcutânea.
- Carregue a seringa com a solução anestésica antes de segurar o rato.
- Contenha o animal aplicando a força atrás de suas orelhas contra a grade da gaiola, segurando o máximo de pele possível para manter o mouse imóvel.
- Mantenha o animal inclinado com a cabeça abaixada e realize uma injeção intraperitoneal da solução anestésica, mantendo a seringa em um ângulo de 45 ° com o corpo do mouse.
- Verifique a ausência de reflexos de retirada do pedal, para avaliar a profundidade da anestesia.
- Retire o cabelo do membro posterior direito usando um barbeador elétrico. Use um sabonete desinfetante de clorexidina para preparação da pele. Use uma toalha de papel limpa para remover os Suds. Aplique uma esfoliação cirúrgica de clorexidina e proteja a área da pele com um drapejar estéril antes de transportar os camundongos para a suíte cirúrgica estéril.
- Coloque o animal em decúbito dorsal e contenha-o com os quatro membros espalhados e fixados com fita adesiva.
Cuidado: realize o procedimento em uma almofada aquecida para manter a temperatura do corpo do animal estável; o procedimento cirúrgico é realizado usando um microscópio de dissecção a uma ampliação de 10x ou 20x. - Aplique uma solução antisséptica de clorexidina usando gaze estéril para finalizar a preparação da pele. Usando uma lâmina cirúrgica do bisturi do número 11 realize uma incisão da pele de 1 cm que sobrejacente a coxa do hindmembro direito.
- Gordura subcutaneous dissecar Blunt que expõe o pacote neurovascular. Usando o fórceps pointed, as tesouras da mola e o suporte oftálmica da agulha, abrem a bainha Ilio-femoral membranous para expor os vasos ilíaco e femoral externos longe do ponto de origem.
- Dissecar e separar os vasos (artéria e veia) do nervo. Usando uma sutura não-absorvível do polipropileno 7,0 ligadura a artéria ilíaca externa e a veia longe do ponto de origem e a artéria e a veia femoral longe do ponto de origem.
- Transect o segmento da artéria e das veias Ilio-femoral entre os nós longe do ponto de origem e os proximal com as tesouras da mola.
- Feche a incisão com uma sutura absorvível (por exemplo, 5,0 sutura Vicryl).
- Coloque a seringa com a solução antisedativa e use o mesmo método detalhado em 1.2.3 e 1.2.4 para realizar uma injeção intraperitoneal da solução antisedativa.
- Monitorização pós-operatória
Nota: os animais são cuidadosamente observados a cada 15-20 min para garantir que todos os animais se recuperem bem do antisedativo; animais anestesiados nunca são deixados sem vigilância.- Avaliar a recuperação da anestesia: 1) monitorar a taxa e a profundidade da respiração; 2) avaliar reflexos animais (pedal e posição do olho)
- Realize uma injeção subcutânea da analgesia pós-operatória a cada 8-12 h.
- Monitore os animais diariamente após a cirurgia registrando uma breve descrição do estado de saúde do animal e da aparência do local da cirurgia, assegure-se de que todas as suturas estejam fechadas.
- Re-sutura da incisão, se a deiscência ocorre. Se não tiver êxito, aplique uma película de barreira cutânea na incisão para proteger da urina, excreções fecais, atrito e cisalhamento da pele e para ajudar o processo de cicatrização.
2. avaliação do efeito angiogênico
Nota: após a indução da isquemia, aplique o agente terapêutico no estudo e consiga os seguintes procedimentos. As etapas empreendidas em outros pontos do tempo são detalhadas a seção correspondente.
- Imagem latente da perfusão do laser Doppler
- Retire o cabelo de ambos os membros posteriores um dia antes da análise usando um barbeador elétrico seguido de creme depilatório.
- Anestesie os camundongos utilizando a solução anestésica.
- Coloque o animal numa almofada de aquecimento de 37 ° c durante 5 min para garantir que a temperatura não mudará durante o procedimento
- Coloque o animal na posição supina com as pernas fixadas em uma posição estendida. Medir a distância entre as pernas direita e esquerda e os pés para cada animal, uma vez que o posicionamento do animal deve ser semelhante sempre que o procedimento deve ser repetido, a fim de acompanhar as alterações na perfusão do membro posterior ao longo do tempo.
- Comece adquirindo dados usando um Imager da perfusão do laser Doppler.
- Após a conclusão da aquisição, reverter a anestesia com a solução antisedativa.
- Abra o software de análise de imagem e desenhe a região de interesse (ROI) em torno do membro posterior isquêmico e um ROI comparável em torno do membro posterior não isquêmico.
- Observar os valores de fluxo e determinar a perfusão como uma proporção da perfusão no membro isquêmico para o membro não isquêmico. As alterações na relação de perfusão são medidas ao longo do tempo.
- Análise de imunohistoquímica e densidade capilar
- Após anestesia, Sacrifique os camundongos por luxação cervical.
- Para colher os músculos gastrocnêmio de ambas as pernas, primeiro, retire a pele de ambos os membros posteriores.
- Identifique o tendão de Aquiles e separe o tendão do osso usando um bisturi de 11 lâminas.
- Segure o tendão de Aquiles e separe o músculo da tíbia e fíbula até a articulação do joelho com tesoura de mola.
- Separe o bíceps femoral do músculo gastrocnêmio.
- Use tesouras de mola para cortar as inserções dos músculos gastrocnêmio no nível da articulação do joelho.
- Coloque os músculos gastrocnêmio colhidas em uma orientação transversal em um pequeno disco de cortiça com a ajuda de 10% tragacanto.
- Congelar os espécimes em isopentano líquido refrigerado a nitrogênio e armazená-los em-80 ° c até o corte.
- Corte 7 μm seções dos espécimes musculares em um criostat e montagem em lâminas de vidro.
Observação: o protocolo pode ser pausado aqui. - Fixar as lâminas de vidro em uma garrafa contendo acetona pura arrefecida (aproximadamente 50 mL) por 10 min, a-20 ° c.
- Adicionar hidrogênio peroxidase 0,3% diluído em metanol (50 mL) por 30 min à temperatura ambiente.
- Lave duas vezes em solução salina tampão fosfato (PBS) (50 mL) para um total de 10 min.
- Use uma caneta hidrofóbica ao redor das seções.
Nota: o uso de uma caneta hidrofóbica permite reduzir a quantidade de soluções gastas durante o protocolo. Para todas as incubações use 100 μL de todas as soluções, por seção. - Aplique uma solução de bloqueio de 5% de soro de coelho em PBS por 30 min à temperatura ambiente.
- Incubar os espécimes por 1 h à temperatura ambiente com anticorpo monoclonal de rato CD31 diluído em 1:500 em 1% de albumina sérica bovina (BSA) em PBS.
- Lave três vezes em PBS durante um total de 30 min.
- Adicionar um secundário biotinylated coelho anticorpo IgG anti-Rat em 1:200 em 1% BSA em PBS e 5% de soro de coelho para 30 min à temperatura ambiente.
- Lave em PBS como antes e adicione o complexo rotulado de peroxidase avidina-conjugado por 30 min à temperatura ambiente.
- Enxague 3 vezes em PBS durante 5 min e adicione o kit de substrato de peroxidase de diaminobenzidina (DAB) por mais 5 min.
- Contratura as secções com hematoxilina por 10 s antes da montagem.
- Meça as densidades capilares usando um microscópio de brightfield ereto (isto é, número de capilares por o número de myocytes) em 2 seções diferentes de 4 áreas anatômicas distintas em cada espécime.
- Perfusão do agente de contraste
- Anestesie os camundongos utilizando a solução anestésica.
- Realize uma laparotomia mediana usando uma lâmina de bisturi número 15.
- Expor a aorta abdominal e a veia cava caudal, após retrar lateralmente o intestino delgado e usar tesouras de mola.
- Insira o cateter 1 26-Gauge cranialmente na aorta abdominal e outro na veia cava caudal na mesma direção.
- Fixe cateteres no lugar usando uma sutura de seda 5/0 para executar uma sutura da estada.
- Lave o sistema vascular com uma solução salina de 37 ° c contendo heparina (500 unidades/100 mL) empurrada para a aorta abdominal usando uma seringa de 10 mL. Continue a perfusão suave até que uma solução clara seja vista saindo do cateter colocado dentro da veia cava caudal.
Nota: geralmente 30 a 40 mL de uma solução salina heparinizada são necessários para enxaguar o sistema vascular de um rato adulto. - Administrar uma mistura de adenosina (1 mg/L) e papaverina (4 mg/L) durante 2 min.
- Injete no cateter aórtico 10 mL de uma mistura de 50% de sulfato de bário e 5% de gelatina.
Nota: a solução deve ser mantida a 60 ° c para evitar espessamento. - Deixe os camundongos a-4 ° c por pelo menos 4 h, a fim de permitir que o elenco vascular solidifique.
- Retire a pele do corpo inferior de cada rato.
- Diaphonization - técnica de Spalteholz
- Fixar os camundongos por imersão em uma solução de formaldeído a 10% por pelo menos 72 h.
- Bleach os camundongos por imersão em uma solução de peróxido de hidrogênio a 30% para 24 h.
- Deshidratar os camundongos usando a técnica de substituição de congelamento. Esta metodologia consiste em submeter os camundongos a passagens sucessivas (em média quatro) de acetona pura a-20 ° c por 24 h cada.
- Esclarecer os camundongos por imersão em uma solução contendo uma mistura de 100% benzoato de benzilo e 100% salicilato de metilo em uma proporção de 3:5 (esta mistura também é conhecida como solução de Spalteholz) 13.
- Deixe os ratos imersos na solução de Spalteholz dentro de uma câmara de vácuo até que se torne Diaphanous, que toma geralmente 5 a 7 dias.
- Substitua a solução, se escurecer antes que o espécime se torne desobstruído.
- Quantificação dos vasos colaterais
- Observe os camundongos suspensos na solução de Spalteholz transiluminação usando um microscópio estereotódico. Use fórceps de microcirurgia para agarrar e movê-lo suavemente.
- Fotografe os membros inteiros usando uma câmera digital conectada ao microscópio.
- Obtenha fotografias inteiras do membro usando o software apropriado.
- Realize uma segmentação manual dos vasos colaterais, destacando-os usando o software apropriado.
Nota: os vasos colaterais são definidos de acordo com a definição de Longland, uma haste definida, zona média e reentrante, com diâmetro entre 20 e 300 μm, excluindo as artérias femoral, safena e poplítea e todas as estruturas venosas. - Definir ROIs em cada rato na mesma região anatômica no adutor, circunvizinho e abaixo da oclusão cirúrgica.
- Quantificar a densidade do vaso colateral (DCV) em ROIs equivalentes correspondendo a 20% da área total do membro. A DCV é calculada como a razão entre a área vascular e as áreas de ROIs. Todas as medições de densidade são executadas usando o software ImageJ.
Nota: presume-se que o valor CVD do membro não isquêmico para cada camundongo corresponda a 100% para excluir variações nos procedimentos de anatomia, perfusão ou diaphonização. A porcentagem de DCV no membro isquêmico foi, portanto, calculada em relação à não isquêmica. - Determinar a porcentagem de aumento da DCV como a diferença entre o percentual de DCV entre os membros isquêmicos e não isquêmicos.
- Microdissecção da captação do laser dos capilares
- Após anestesia, Sacrifique os camundongos por luxação cervical.
- Para colher os músculos gastrocnêmio de ambas as pernas, retire a pele dos camundongos ambos os membros posteriores.
- Identifique o tendão de Aquiles e separe o tendão do osso usando um bisturi de 11 lâminas.
- Segure o tendão de Aquiles e separe o músculo da tíbia e fíbula até a articulação do joelho com tesoura de mola.
- Separe o bíceps femoral do músculo gastrocnêmio.
- Use tesouras de mola para cortar as inserções dos músculos gastrocnêmio no nível da articulação do joelho.
- Coloque os músculos gastrocnêmio colhidas em uma orientação transversal em um pequeno disco de cortiça com a ajuda de 10% tragacanto.
- Congelar os espécimes em isopentano líquido refrigerado a nitrogênio e armazená-los em-80 ° c até o corte.
- Corte em um criostat 12 μm seções dos espécimes musculares e montagem em lâminas de vidro.
Nota: para a proteção do RNA tome um slide pré-arrefecido e toque no verso do slide com o dedo (luvas) para aquecer apenas a região para colocar a seção. Seção de transferência da faca do criostat tocando com a área aquecida e seque a-20 ° c no criostat para 2-3 min. O protocolo pode ser pausado aqui.- Fixe as lâminas de vidro numa garrafa contendo acetona pura arrefecida (aproximadamente 50 mL) durante 5 min a-20 ° c e seque-as com ar.
- Use uma caneta hidrofóbica ao redor das seções.
Nota: o uso da caneta hidrofóbica ajuda na redução da quantidade de soluções gastas durante o protocolo. Para todas as incubações use 100 μL de todas as soluções, por seção. - Hidratar com 2 M de NaCl/PBS a 4 ° c e incubar os espécimes durante a noite a 4 ° c com anticorpo monoclonal de rato CD31 a 1:500 em 2M NaCl/PBS.
- Lave duas vezes em 2M NaCl/PBS para um total de 6 min.
- Adicione um anticorpo de IgG anti-rato biotinylated secundário do coelho em 1:200 em 2M NaCl/PBS e no soro do coelho de 5% por 30 minutos em 4 ° c.
- Lave em 2 M NaCl/PBS como antes e adicione o complexo rotulado de peroxidase avidina-conjugado por 30 min a 4 ° c.
- Enxágüe e adicione o kit de substrato de peroxidase DAB por 5 min.
- Desidratar as secções no gelo-frio 90% etanol seguido por 100% etanol e deixá-los a secar.
- Dissect 10 000 capilares por camundongos usando um sistema de microdissecção a laser equipado com um laser de estado sólido pulsado 355 NM e catapulta os capilares dissecados em um tubo de microcentrífuga adesivo-tampão.
- Extração de RNA, síntese de cDNA, pré-amplificação e RT-PCR
- Isole o RNA total dos capilares microdissecados usando um kit apropriado, o RNA total obtido é entre 1,5-3 ng/μL.
- Use um kit de síntese de cDNA para síntese e duas rodadas de pré-amplificação, utilizando os primers descritos na tabela 1.
- Execute RT-PCR para os mesmos alvos descritos na etapa anterior. Use um programa que consiste em uma etapa inicial da desnaturação em 95 ° c por 10 minutos, seguida por 50 ciclos em 95 ° c para 15 s e em 60 ° c por 1 minuto.
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Representative Results
Usando o protocolo descrito, as pilhas de haste mesenquimais do cabo de cordão umbilical e a radiação ionizante da baixo-dose (ldir) foram testadas como terapias angiogénicas putativo 11,12. As leituras da perfusão do laser Doppler foram obtidas antes da indução da isquemia e em temporais pré-especificados que variam de imediatamente após a indução da isquemia a 45 dias após a isquemia. As leituras de perfusão tecidual por Doppler laser foram registradas como imagens codificadas por cor, sem perfusão apresentada como azul escuro e o maior nível de perfusão apresentado como vermelho. Como demonstrado nas figuras 2a e 3a e quantificadas nas figuras 2B e 3B, foi observada uma perda completa da perfusão dos membros posteriores em todos os camundongos imediatamente após a indução de isquemia do membro posterior, assegurando a reprodutibilidade da técnica para induzir a isquemia dos membros posteriores. É importante ressaltar que a gravidade da isquemia é semelhante em todos os animais. Um ROI foi desenhado em torno do membro posterior isquêmico e um ROI comparável foi desenhado em torno do membro posterior não isquêmico para realizar a quantificação da perfusão. A perfusão é expressa como uma relação da perfusão no membro isquêmico àquele no membro não-isquêmico. As alterações na relação de perfusão são medidas ao longo do tempo.
A imunohistoquímica foi realizada entre 15 e 90 dias pós-isquemia. A diaphonização foi realizada entre 19 e 90 dias pós-isquemia e microdissecção capilar entre 45 e 70 dias de indução pós-isquemia, assegurando que as diferentes terapias pró-angiogênicas induziram um efeito proangiogênico sustentado e prolongado.
A quantificação de capilares CD31-positive em cortes histológicos do músculo gastrocnêmio avaliou a densidade capilar e esta foi expressa como o número de capilares por número de fibras musculares. Como mostrado na Figura 4, a densidade capilar foi maior no membro isquêmico versus não isquêmico.
A fim de avaliar a densidade dos vasos colaterais, os camundongos foram diaphonizados e um ROI equivalente, correspondendo a 20% da área do membro, foi selecionado para quantificação. A densidade dos vasos colaterais aumentou consistentemente no membro isquêmico, de modo que os dados referentes aos membros tratados e de controle foram expressos como a porcentagem de aumento da densidade dos vasos colaterais no membro isquêmico relativamente à não-isquêmica (Figura 5 ).
A expressão de genes pró-angiogênicos por ECs foi analisada por RT-PCR quantitativa de células CD31-positivas. Transcrições para Vegfr2, Vegfr1, Fgf2, Angpt2, Pdgfc, Tgfb2, HGF e Met mostraram uma nítida variação na expressão entre membros isquêmicos e não isquêmicos, exclusivamente em camundongos expostos ao estímulo pró-angiogênico (Figura 6).
Figura 1 : Ilustração esquemática da anatomia do vasculatura do hindmembro do rato que mostra os locais da ligadura. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Ldir aumenta a recuperação da perfusão. Após a indução cirúrgica da HLI unilateral, ambos os membros posteriores dos camundongos C57BL/6 foram simulados ou irradiados com quatro frações diárias de 0,3 GY, em dias consecutivos e permitiram a recuperação. (A) imagens de fluxo de Doppler laser representativas pré-HLI, e nos dias 0 (D0) e 15 (D15) indução pós-HLI. (B) a avaliação quantitativa da circulação sanguínea expressa como uma relação de ISC ao membro de NISC demonstrou a perfusão significativamente aumentada do sangue do membro em ratos irradiados contra os Sham-irradiados ambos nos dias 15 (D15) e 45 (D45) borne-HLI. As alterações entre grupos foram avaliadas por meio de ANOVA de medidas repetidas em duas vias, seguida de teste post-hoc de Bonferroni (n = 12 camundongos por grupo). Médias ± SEM são mostrados. P < 0, 1; ns, não significativo. HLI, isquemia do membro posterior; ISC isquêmica; NISC, não isquêmico; Pré-HLI, antes da isquemia do membro posterior. Adaptado de 11. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Células-tronco mesenquimais do cordão umbilical (UCX) aumente a recuperação da perfusão. UCX ou seu veículo (como um controle) foram administrados no músculo gastrocnêmio isquêmico 5 horas após a indução de HLI. (A) imagens representativas do fluxo do laser Doppler antes (PRE-HLI), imediatamente depois (D0 borne-HLI) e em 7, 14 e 21 dias de indução pós-HLI (D7 borne-HLI, D14 borne-HLI, D21 borne-HLI). (B) a avaliação quantitativa da circulação sanguínea expressa como uma relação do ISC ao membro de NISC demonstrou a perfusão significativamente aumentada do sangue do membro em ratos de haste mesenquimais do cabo de cordão umbilical-tratados em 7, 14 e 21 dias borne-HLI. (n = 16 para cada grupo experimental; D7: t (22,69) = 4,26; P ˂ 0, 1; o tamanho do efeito era 1,51 e poder 0,98; D14: t (30) = 4,7; P ˂ 0, 1; o tamanho do efeito era 1,66 e poder 0,99; D21: t (30) = 7,22; P ˂ 0, 1; o tamanho do efeito era 2,56 e poder 0,99). HLI, isquemia do membro posterior; ISC isquêmica; NISC, não isquêmico. Adaptado de11. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Ldir aumenta a densidade capilar. (A) secções representativas de músculos gastrocnêmio isquêmicos irradiados e irradiados no dia 45 pós-HLI. Os capilares e os miócitos foram identificados por CD31 immunohistochemistry e pelo hematoxylin, respectivamente. Barra de escala, 150 mm. (B) a análise quantitativa revelou aumento da densidade capilar (capilares/miócitos) em músculos gastrocnêmio isquêmicos irradiados em comparação com os isquêmicos de Sham-irradiados nos dias 15 e 45 pós-HLI. ANOVA mista seguida de teste post-hoc de Bonferroni foi conduzida com um fator dentro do assunto de ISC e fatores entre os sujeitos do dia e irradiação (n = 6 camundongos por grupo). Dados individuais e médias ± SEM são mostrados. P < 0,001; ns, não significativo. ISC isquêmica; NISC, não isquêmico. Adaptado de11. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Ldir aumenta a densidade colateral. (A) Imagens ilustrativas de Rois selecionados para camundongos Sham-irradiados e irradiados. Os membros do ISC e do NISC no dia 90 borne-HLI são mostrados. Barra da escala, 300 milímetros. (B) os dados são representados como a porcentagem do aumento do CVD do membro do ISC relativamente ao NISC um. Nos dias 15 e 90 pós-HLI, camundongos irradiados apresentaram aumento significativamente maior de DCV (%) vs. ratos Sham-irradiados. A ANOVA bidirecional foi conduzida seguida pelo teste post-hoc de Bonferroni com um entre os fatores sujeitos do dia e a irradiação (n = 6 camundongos por grupo). Dados individuais e médias ± SEM são mostrados. * P < 0,05; P < 0,001; ns, não significativo. HLI, isquemia do membro posterior; ISC isquêmica; NISC, não isquêmico. Adaptado de11. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Ldir upregulates a expressão de genes angiogênico nos ECS isolados dos músculos isquêmicos irradiados do gastrocnêmio. Após a indução cirúrgica da HLI unilateral, ambos os membros posteriores dos camundongos C57BL/6 foram simulados ou irradiados com quatro frações diárias de 0,3 GY, em dias consecutivos e permitiram a recuperação. No dia 45 pós-HLI, a expressão de fatores pró-angiogênicos e seus receptores foi avaliada pela qRT-PCR exclusivamente em ECs. As seções do músculo de gastrocnemius foram manchadas para CD31. As células endoteliais individuais CD31 + foram visualizadas, dissecadas e isoladas por meio de um sistema de microdissecção a laser. Cada barra representa a expressão gênica relativa em um animal. As barras brancas e cinzentas representam camundongos simulados e irradiados, respectivamente. Os valores foram normalizados para 18S para obter níveis de expressão relativa. Os resultados expressos em alterações de log2 vezes entre as amostras isquêmicas e não isquêmicas demonstraram a abundância relativa das transcrições em camundongos irradiados; em contraste, observa-se um baixo-regulamento em camundongos Sham-irradiados. Adaptado de11. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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| Vegfr2_ F (5 '-AGGCCCATTGAGTCCAACTACACA-3 '); |
| Vegfr2_ R (5 '-AGACCATGTGGCTCTGTTTCTCCA-3 '); |
| PDGF-c_ F (5 '-ATGCCACAAGTCACAGAAACCACG-3 '); |
| PDGF-c_ R (5 '-AAGGCAGTCACAGCATTGTTGAGC-3 '); |
| Met_ F (5 '-ACGTTGAAATGCACAGTTGGTCCC-3 '); |
| Met_ R (5 '-TTGCGTCGTCTCTCGACTGTTTGA-3 '); |
| Fgf2_ F (5 '-ACTCCAGTTGGTATGTGGCACTGA-3 '); |
| Fgf2_ R (5 '-AACAGTATGGCCTTCTGTCCAGGT-3 '); |
| Tgfb2_ F (5 '-GCTTTGGATGCGGCCTATTGCTTT-3 '); |
| Tgfb2_ R (5 '-CTCCAGCACAGAAGTTGGCATTGT-3 '); |
| Ang2_ F (5 '-ATCCAACACCGAGAAGATGGCAGT-3 '); |
| Ang2_ R (5 '-AACTCATTGCCCAGCCAGTACTCT-3 '); |
| HGF_ F (5 '-GCATTCAAGGCCAAGGAGAAGGTT-3 '); |
| HGF_ R (5 '-TCATGCTTGTGAGGGTACTGCGAA-3 '); |
| 18s_ F (5 '-GCCCTATCAACTTTCGATTGGTAGT-3 '); |
| 18s_ R (5 '-CCGGAATCGAACCCTGATT-3 '). |
Tabela 1: primers utilizados para o estudo.
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Discussion
Os modelos de Murine de CLI consistiram na maior parte na ligadura da artéria femoral apenas distal à origem do femoral do profunda 4,5,6,7,8,9. Isto demonstrou deixar intacta a maior parte da circulação colateral, o que restaura o fluxo sanguíneo para o membro no prazo de 7 dias 9. A remoção da cama colateral pode ser conseguida pela excisão da artéria femoral. No entanto, até um terço do fluxo sanguíneo original pode ser restaurado assim que 7 dias após o procedimento, uma vez que a maioria dos vasos colaterais surgem da artéria ilíaca interna 7. Lejay et al propuseram ligações sequenciais com uma segunda ligadura realizada na artéria ilíaca comum, reduzindo efetivamente a perfusão colateral proporcionada pela artéria ilíaca interna 4. As etapas críticas dentro deste protocolo incluem não somente a identificação da artéria ilíaca externa apenas acima do ligamento inguinal, mas igualmente a ligadura e a excisão das artérias e das veias ilíacas e femoral externas longe do ponto de origem, que sere uma finalidade dobro: a aumentar a severidade da isquemia, bem como melhorar a reprodutibilidade técnica do modelo, pois a exposição da artéria femoral por si só muitas vezes resulta em ruptura da veia.
Uma limitação dessa técnica é a interrupção aguda do fluxo sanguíneo para o membro, o que difere do processo prolongado associado à acumulação de placa aterosclerótica, levando a estenose arterial e oclusão. Ainda, a redução do fluxo sanguíneo estava presente bem após 2 semanas, o ponto de tempo estabelecido para o diagnóstico de isquemia crônica. Além disso, a collateralização foi aumentada com o insulto isquêmico isoladamente, o que imita o processo de formação colateral observado em Membros cronicamente isquêmicos.
A neovascularização dos membros isquêmicos envolve uma complexa interação de eventos biológicos, a saber, a angiogênese e a arteriogênese. Este protocolo inclui uma variedade de ensaios que avaliaram a interferência de terapias angiogênicas putativas na brotação angiogênica (densidade de vasos capilares) e o desenvolvimento de vasos colaterais (arteriogênese), o mecanismo mais importante na tolerância humana para a isquemia de membros inferiores. Simultaneamente, o laser Doppler é usado para revelar a função desses vasos novos ou ampliados, e para a microdissecção de laser pela primeira vez dos capilares é usado para coletar ECs divulgando os mecanismos moleculares que sustentam a recuperação funcional. Este protocolo produz um modelo animal reprodutível que possa imitar os efeitos do CLI um padrão do teste quando os animais são tratados com as terapias angiogênico possíveis que poderiam ser aplicadas em um contexto clínico no futuro.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a José Rino e Tânia carvalho, chefes da unidade de Bioimagem e histologia e laboratório de patologia comparativa do Instituto de medicina molecular João Lobo Antunes, respectivamente. Agradecemos também Vyacheslav Sushchyk do departamento de anatomia da nova Medical School/Faculdade de ciências médicas, Universidade Nova de Lisboa.
Referência de financiamento: projeto financiado pela UID/IC/0306/2016 Fundação para a ciência e a tecnologia. Paula de Oliveira é apoiada por uma bolsa de estudos (SFRH/BD/80483/2011) da Fundação para a ciência e tecnologia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7500 Fast Real-Time PCR | Applied Biosystems | Instrument | |
| Acetone | Merk | 1000141000 | Reagent; Caution - highly flammable |
| Adenosine | Valdepharm | Reagent | |
| Atipamezole | OrionPharma | Reagent | |
| Barium sulphate (Micropaque) | Guebert | 8671404 (ref. Infarmed) | Reagent |
| Buprenorphine | RichterPharma | Reagent | |
| Carl Zeiss Opmi-1 FC Surgical Microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| cDNA RT2 PreAMP cDNA Synthesis kit | Qiagen | 7335730 | Reagent |
| Cryostat Leica CM | Leica Microsystems | 3050S | Instrument |
| DAB peroxidase substrate kit | DAKO;Vector Laboratories | K3468 | Reagent |
| hydrogen peroxidase | Merk | 1072090250 | Reagent; Caution - nocif |
| hydrophobic pen | Dako | 411121 | Reagent; Caution - toxic |
| Ketamidor | Richterpharma | CN:580393,7 630/01/12 Dfvf | Reagent |
| Laser Doppler perfusion imager moorLDI2-HIR | MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK | 5710 | Instrument |
| Leica DM2500 upright brightfield microscope | Leica Microsystems | Instrument | |
| Medetor | Virbac | 037/01/07RFVPT | Reagent |
| methanol | VWR | UN1230 | Reagent; Caution - toxic and highly flammable |
| Papaverine | Labesfal | Reagent | |
| Pentano Isso | Merk | 1060561000 | Reagent; Caution - highly flammable |
| Power SYBR® Green | Applied Biosystems | 4309155 | Reagent |
| Purified rat anti-mouse CD31 | Pharmingen | 550274 | Reagent |
| RNeasy Micro kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Surgic-Pro 6.0 | Medtronic (Coviden) | VP733X | Suture |
| VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, Rat IgG) | Vectastain ABC kit; Vector Laboratories | PK-4004 | Reagent |
| Vicryl5.0/ Vicryl 6.0 | Medtronic (Covidien) | UL202/ UL101 | Suture |
| Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection System | Carl Zeiss Microscopy, Germany | 1023290916 | Instrument |
| Stereotaxic microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| Digital camera | Linux | Instrument |
References
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