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Evaluación de la angiogénesis terapéutica en un modelo murino de isquemia de las extremidades posteriores

Published: June 8, 2019 doi: 10.3791/59582
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 2, 3, 1
1Centro Cardiovascular da Universidade de Lisboa, Lisbon School of Medicine of the Universidade de Lisboa, 2Centro Hospitalar Universitário Lisboa Norte, 3Nova Medical School/Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Nova de Lisboa

Summary

Aquí, se presenta un modelo experimental crítico de isquemia de la extremidad posterior seguido de una batería de pruebas funcionales, histológicas y moleculares para evaluar la eficacia de las terapias angiogénicas.

Abstract

La isquemia crítica de las extremidades (CLI) es una afección grave que implica un alto riesgo de amputación de las extremidades inferiores. A pesar de que la revascularización es la terapia estándar de oro, un número considerable de pacientes con CLI no son adecuados para la revascularización quirúrgica o endovascular. Las terapias angiogénicas están emergiendo como una opción para estos pacientes, pero actualmente todavía están bajo investigación. Antes de su aplicación en humanos, estas terapias deben probarse en modelos animales y sus mecanismos deben entenderse claramente. Un modelo animal de isquemia de la extremidad posterior (HLI) se ha desarrollado por la ligadura y la escisión de las arterias y venas externas lílicas y femorales en ratones. Se reunió un panel completo de pruebas para evaluar los efectos de la isquemia y las terapias angiogénicas putativas a nivel funcional, histológico y molecular. Laser Doppler se utilizó para la medición de flujo y la evaluación funcional de la perfusión. La respuesta del tejido se evaluó mediante el análisis de la densidad capilar después de la tinción con el anticuerpo anti-CD31 en secciones histológicas del músculo gastrocnemius y mediante la medición de la densidad colateral del vaso después de la diofonización. La expresión de genes angiogénicos se cuantificó mediante RT-PCR dirigido a factores angiogénicos seleccionados exclusivamente en células endoteliales (CE) después de la microdisección de captura láser de los músculos gastrocnemius ratones. Estos métodos fueron sensibles a la hora de identificar las diferencias entre las extremidades isquémicas y no isquémicas y entre las extremidades tratadas y no tratadas. Este protocolo proporciona un modelo reproducible de CLI y un marco para probar terapias angiogénicas.

Introduction

La enfermedad arterial periférica (PAD) afecta predominantemente a las extremidades inferiores. La PAD es causada por la aterosclerosis, una obstrucción arterial que puede causar una restricción grave al flujo sanguíneo en las extremidades inferiores1. La claudicación intermitente es la primera manifestación de la PAD y se refiere al dolor muscular al caminar. La CLI es la etapa más grave de la PAD, siendo diagnosticada enpacientes que muestran dolor isquémico de reposo, úlceras o gangrena 2. Los pacientes con CLI tienen un alto riesgo de amputación, especialmente si no se tratan3. La revascularización de las extremidades inferiores (ya sea mediante cirugía abierta o un procedimiento endovascular) es actualmente la única manera de lograr el salvamento de las extremidades. Sin embargo, alrededor del 30% de los pacientes con CLI no son adecuados para estos procedimientos, porrazones que incluyen la ubicación de las lesiones, el patrón de oclusión arterial y la amplia comorbilidad 4,5. Por lo tanto, se necesitan nuevas terapias para estos pacientes de otro modo intratables, siendo la promoción de la angiogénesis la estrategia bajo una investigación más intensa.

Antes de las pruebas en humanos, la eficacia y seguridad de las nuevas terapias in vivo debe tenerse en cuenta en modelos animales. Se han desarrollado varios modelos para el estudio de la CLI, principalmente induciendo isquemia de la extremidad posterior (HLI) en ratones6,7,8,9,10. Sin embargo, estos modelos difieren en varios aspectos, incluyendo la naturaleza de las arterias que están ligadas y/o extirpadas y si las venas y los nervios que rodean también se diseccionan6,7,8, 9,10. En conjunto, estos aspectos afectarán la gravedad de la lesión por isquemia-reperfusión en cada animal, lo que dificultará la comparación de los resultados. Por lo tanto, es fundamental desarrollar un protocolo eficaz en el que se estampar el procedimiento para inducir la isquemia y la evaluación de diferentes objetivos para evaluar si una terapia angiogénica determinada será eficaz. Un protocolo experimental diseñado para abarcar todos estos aspectos proporcionaría una comprensión completa de los mecanismos por los cuales las terapias angiogénicas ejercen sus efectos y una medida de su eficacia en cada uno de sus resultados. Dos obras distintas publicadas recientemente por nuestro equipo son un buen ejemplo11,12, en el que se evaluaron diferentes enfoques para inducir la angiogénesis terapéutica utilizando el mismo protocolo que se describirá con más detalle en este Protocolo.

El objetivo general de este protocolo es describir un modelo experimental reproducible que pueda imitar los efectos de la CLI y sentar las bases experimentales para una evaluación integral de los efectos funcionales, histológicos y moleculares de la angiogena putativa Agentes.

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Protocol

Todos los procedimientos animales se ajustan a la Directiva 2010/63/UE y han sido aprobados por el Organismo Institucional de Bienestar Animal y autorizados por DGAV, la autoridad competente portuguesa para la protección animal (número de licencia 023861/2013)

ADVERTENCIA: Varios de los productos químicos utilizados en los protocolos son tóxicos y dañinos. Utilice todas las prácticas de seguridad apropiadas y equipo de protección personal (guantes, abrigo de laboratorio, pantalones de longitud completa y zapatos de punta cerrada)

1. El modelo murino de la isquemia de las extremidades posteriores

NOTA: Todos los experimentos se realizan en ratones hembra C57BL/6 de 22 semanas de edad.

  1. Preparación de soluciones
    1. Preparación de la solución anestésica
      Nota: Esta combinación anestésica (medetomidina y ketamina) proporciona hasta 30 minutos de inmovilización y una ventana quirúrgica de 15 min. El efecto puede ser revertido por la administración de atipamezol.
      1. Con una jeringa limpia de 1 cc, retire 1 ml de medetomidina (1 mg/kg de peso corporal), elimine las burbujas de aire para mediciones precisas y agréguela a un tubo de halcón de 15 ml.
      2. Con una jeringa limpia de 1 cc, retire 0,75 ml de ketamina (75 mg/Kg de peso corporal), elimine las burbujas de aire para mediciones precisas y agréguela a un tubo de halcón de 15 ml que contenga la medetomidina.
      3. Añadir 8,25 ml de solución salina estéril (0,9% NaCl), para obtener 10 ml de solución anestésica.
      4. Identifique el tubo con el nombre de los compuestos, la fecha mezclada y la fecha de caducidad.
      5. Conservar en la oscuridad a 4oC.
    2. Preparación de la solución antisedante
      1. Con una jeringa limpia de 1 cc, retire 1 ml de atipamezol (5 mg/kg de peso corporal), elimine las burbujas de aire para mediciones precisas y agréguelo a un tubo de halcón de 15 ml.
      2. Añadir 9 ml de solución salina estéril (0,9% NaCl), para obtener 10 ml de solución de reversión.
      3. Identifique el tubo con el nombre de los compuestos, la fecha mezclada y la fecha de caducidad.
      4. Conservar en la oscuridad a 4oC.
    3. Preparación de la solución de analgesia postoperatoria
      1. Con una jeringa limpia de 1 cc, retire 0,5 ml de buprenorfina (100 l/15-30 g de peso corporal), elimine las burbujas de aire para mediciones precisas y agréguela a un tubo de halcón de 15 ml.
      2. Añadir 9,5 ml de solución salina estéril (0,9% NaCl), para obtener 10 ml de solución de analgesia.
      3. Identifique el tubo con el nombre de los compuestos, la fecha mezclada y la fecha de caducidad.
      4. Conservar en la oscuridad a 4oC.
  2. Inducción quirúrgica de isquemia de la extremidad posterior
    1. Herramientas quirúrgicas necesarias para esta intervención: fórceps puntiagudos, tijeras de resorte, soporte de aguja oftálmica, tijeras quirúrgicas y un soporte de aguja. Esterilice todas las herramientas quirúrgicas en un autoclave antes de su uso. Use hisopos de algodón para la disección de grasa subcutánea.
    2. Cargue la jeringa con la solución de anestesia antes de sujetar el ratón.
    3. Sujete al animal aplicando fuerza detrás de sus orejas contra la rejilla de la jaula, sosteniendo tanta piel como sea posible para mantener el ratón inmóvil.
    4. Mantenga al animal inclinado con la cabeza baja y realice una inyección intraperitoneal de la solución de anestesia, manteniendo la jeringa en un ángulo de 45o con el cuerpo del ratón.
    5. Compruebe la ausencia de reflejos de abstinencia del pedal, para evaluar la profundidad de la anestesia.
    6. Retire el cabello de la extremidad posterior derecha con una afeitadora eléctrica. Use un exfoliante de jabón desinfectante de clorhexidina para la preparación de la piel. Use una toalla de papel limpia para quitar los suds. Aplique un exfoliante quirúrgico de clorhexidina y proteja el área de la piel con una cortina estéril antes de transportar los ratones a la suite quirúrgica estéril.
    7. Colocar el animal en decúmito dorsal y sujetarlo con las cuatro extremidades separadas y aseguradas con cinta adhesiva.
      ADVERTENCIA: Realice el procedimiento en una almohadilla calentada para mantener estable la temperatura corporal del animal; el procedimiento quirúrgico se realiza utilizando un microscopio de disección con un aumento de 10x o 20x.
    8. Aplicar una solución antiséptica de clorhexidina con gasa estéril para finalizar la preparación de la piel. Usando una cuchilla de bisturí quirúrgico número 11 realizar una incisión cutánea de 1 cm sobre el muslo de la extremidad posterior derecha.
    9. Diseccione grasa subcutánea con exposición del haz neurovascular. Usando los fórceps puntiagudos, las tijeras de resorte y el soporte de la aguja oftálmica, abren la vaina ilio-femoral membranosa para exponer los vasos anilánicos y femorales externos distales.
    10. Diseccionar y separar los vasos (arteria y vena) del nervio. Usando una sutura de polipropileno no absorbible 7.0 ligar la arteria ilíaca externa distal y la vena y la arteria femoral distal y la vena.
    11. Transectele el segmento de la arteria ilio-femoral y las venas entre los nudos distales y proximales con las tijeras de resorte.
    12. Cierre la incisión con una sutura absorbible (por ejemplo, sutura 5.0 Vicryl).
    13. Cargue la jeringa con la solución antisedante y utilice el mismo método detallado en 1.2.3 y 1.2.4 para realizar una inyección intraperitoneal de la solución antisedante.
  3. Monitoreo postoperatorio
    NOTA: Los animales son observados cuidadosamente cada 15-20 minutos para asegurarse de que todos los animales se recuperen bien del antisedante; animales anestesiados nunca se quedan desatendidos.
    1. Evaluar la recuperación de la anestesia: 1) monitorear la velocidad y profundidad de la respiración; 2) evaluar los reflejos animales (pedal y posición ocular)
    2. Realizar una inyección subcutánea de la analgesia postoperatoria cada 8-12 h.
    3. Monitorear a los animales diariamente después de la cirugía registrando una breve descripción del estado de salud del animal y la apariencia del sitio de la cirugía, asegúrese de que todas las suturas estén cerradas.
    4. Vuelva a suturar la incisión, si se produce dehiscencia. Si no tiene éxito, aplique una película de barrera cutánea en la incisión para protegerla de la orina, las excreciones fecales, la fricción y la cizalladura de la piel y para ayudar al proceso de curación.

2. Evaluación del efecto angiogénico

NOTA: Después de la inducción de la isquemia, aplicar el agente terapéutico en el estudio y lograr los siguientes procedimientos. Las medidas emprendidas en otros momentos se detallan en la sección correspondiente.

  1. Imágenes por perfusión Láser Doppler
    1. Retire el cabello de ambas extremidades posteriores un día antes del análisis utilizando una afeitadora eléctrica seguida de crema depilatoria.
    2. Anestetizar a los ratones utilizando la solución anestésica.
    3. Colocar el animal sobre una almohadilla calefactora de 37 oC durante 5 minutos para asegurarse de que la temperatura no cambiará durante el procedimiento
    4. Coloque al animal en posición supina con las piernas fijadas en una posición extendida. Mida la distancia entre las patas y los pies derecho e izquierdo para cada animal, ya que el posicionamiento del animal debe ser similar siempre que el procedimiento deba repetirse para seguir los cambios en la perfusión de las extremidades posteriores a lo largo del tiempo.
    5. Comience a adquirir datos mediante un imager de perfusión Doppler láser.
    6. Una vez completada la adquisición, revierta la anestesia con la solución antisedantes.
    7. Abra el software de análisis de imágenes y dibuje la región de interés (ROI) alrededor de la extremidad posterior isquémica y un ROI comparable alrededor de la extremidad posterior no isquémica.
    8. Observar los valores de flujo y determinar la perfusión como una relación de la perfusión en la extremidad isquémica a la de la extremidad no isquémica. Los cambios en la relación de perfusión se miden con el tiempo.
  2. Inmunohistoquímica y análisis de densidad capilar
    1. Después de anestesiar, sacrificar a los ratones por luxación cervical.
    2. Para cosechar los músculos gastrocnemius de ambas piernas, primero, eliminar la piel de ambas extremidades posteriores.
    3. Identifique el tendón de Aquiles y separe el tendón del hueso con un bisturí de 11 hojas.
    4. Sostenga el tendón de Aquiles y separe el músculo de la tibia y el peroné hasta la articulación de la rodilla con tijeras de primavera.
    5. Separe el bíceps femoris del músculo gastrocnemius.
    6. Utilice tijeras de resorte para cortar las inserciones de los músculos gastrocnemius a nivel de la articulación de la rodilla.
    7. Coloque los músculos gastrocnemius cosechados en una orientación transversal en un pequeño disco de corcho con la ayuda de 10% de tragacanth.
    8. Congele las muestras en isopentano líquido refrigerado por nitrógeno y guárdelas a -80 oC hasta el ensección.
    9. Cortar 7 m secciones de las muestras musculares en un criostato y montar en diapositivas de vidrio.
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
    10. Fijar los portaobjetos de vidrio en una botella que contiene acetona pura enfriada (aproximadamente 50 ml) durante 10 min, a -20 oC.
    11. Añadir el hidrógeno peroxidasa 0,3% diluido en metanol (50 ml) durante 30 min a temperatura ambiente.
    12. Lavar dos veces en solución salina con fosfato (PBS) (50 ml) durante un total de 10 min.
    13. Utilice una pluma hidrófoba alrededor de las secciones.
      NOTA: El uso de una pluma hidrófoba permite reducir la cantidad de soluciones gastadas durante el protocolo. Para todas las incubaciones utilice 100 ml de todas las soluciones, por sección.
    14. Aplicar una solución de bloqueo de 5% de suero de conejo en PBS durante 30 min a temperatura ambiente.
    15. Incubar los especímenes durante 1 h a temperatura ambiente con anticuerpo monoclonal anti-CD31 diluido a 1:500 en 1 % de albúmina sérica bovina (BSA) en PBS.
    16. Lavar tres veces en PBS durante un total de 30 min.
    17. Añadir un anticuerpo secundario antirrata IgG de conejo biotinilado a 1:200 en 1% de BSA en PBS y un 5% de suero de conejo durante 30 min a temperatura ambiente.
    18. Lavar en PBS como antes y añadir complejo de peroxidasa conjugada con avidina durante 30 minutos a temperatura ambiente.
    19. Enjuague 3 veces en PBS durante 5 min y agregue el kit de sustrato de peroxidasa de diaminobenzidina (DAB) durante otros 5 min.
    20. Contratratar las secciones con hematoxilina durante 10 s antes del montaje.
    21. Mida las densidades capilares utilizando un microscopio de campo brillante vertical (es decir, número de capilares por número de miocitos) en 2 secciones diferentes de 4 áreas anatómicas distintas en cada espécimen.
  3. Perfusión de agentes de contraste
    1. Anestetizar a los ratones utilizando la solución anestésica.
    2. Realice una laparotomía mediana con una cuchilla de bisturí número 15.
    3. Exponer la aorta abdominal y la vena cava caudal, después de retraer senos lateralmente el intestino delgado y usar tijeras de primavera.
    4. Inserte un catéter de calibre 26 cranealmente en la aorta abdominal y otro en la vena cava caudal en la misma dirección.
    5. Fije los catéteres en su lugar con una sutura de seda 5/0 para realizar una sutura de estancia.
    6. Lavar el sistema vascular con una solución salina de 37 oC que contenga heparina (500 unidades/100 ml) empujada en la aorta abdominal con una jeringa de 10 ml. Continúe la perfusión suave hasta que se pueda ver una solución transparente que sale del catéter colocado dentro de la vena cava caudal.
      NOTA: Por lo general, se requieren de 30 a 40 ml de una solución salina heparinizada para enjuagar el sistema vascular de una rata adulta.
    7. Administrar una mezcla de adenosina (1 mg/L) y papaverina (4 mg/L) durante 2 min.
    8. Inyectar en el catéter aórtico 10 ml de una mezcla de 50% sulfato de bario y 5% gelatina.
      NOTA: La solución debe mantenerse a 60 oC para evitar el engrosamiento.
    9. Dejar los ratones a - 4 oC durante al menos 4 h, con el fin de permitir que la fundición vascular se solidifique.
    10. Retire la piel de la parte inferior del cuerpo de cada ratón.
  4. Diofonización - Técnica Spalteholz
    1. Fijar los ratones por inmersión en una solución de formaldehído al 10% durante al menos 72 h.
    2. Blanquear a los ratones por inmersión en una solución de peróxido de hidrógeno al 30% durante 24 horas.
    3. Deshidratar a los ratones utilizando la técnica de sustitución de congelación. Esta metodología consiste en someter a los ratones a pasajes sucesivos (en promedio cuatro) de acetona pura a - 20 oC para 24 h cada uno.
    4. Aclarar los ratones sumergiéndolo en una solución que contiene una mezcla de 100% benzoato de bencilo y 100% salicilato de metilo en una proporción 3:5 (esta mezcla también se conoce como solución Spalteholz) 13.
    5. Deje a los ratones sumergidos en la solución de Spalteholz en el interior en una cámara de vacío hasta que se vuelva diáfano, lo que suele tardar de 5 a 7 días.
    6. Reemplace la solución, si se oscurece antes de que la muestra se aclare.
  5. Cuantificación de buques colaterales
    1. Observe los ratones suspendidos en la solución de Spalteholz bajo transiluminación utilizando un microscopio estereono. Use fórceps de microcirugía para agarrarlo y moverlo suavemente.
    2. Fotografíe todas las extremidades utilizando una cámara digital conectada al microscopio.
    3. Obtenga fotografías de extremidades completas utilizando el software adecuado.
    4. Realice una segmentación manual de los recipientes colaterales resaltándolos utilizando el software adecuado.
      NOTA: Los vasos colaterales se definen de acuerdo con la definición de Longland, un tallo definido, una zona media y un re-participante, con un diámetro entre 20 y 300 m, excluyendo las arterias femorales, safenosas y popliteales y todas las estructuras venosas.
    5. Definir los IRU en cada ratón en la misma región anatómica en el aductor, circundante y por debajo de la oclusión quirúrgica.
    6. Cuantifique la densidad de los buques colaterales (CVD) en ROI equivalentes correspondientes al 20% del área total de las extremidades. La ECV se calcula como la relación entre el área vascular y las áreas de los IRO. Todas las mediciones de densidad se realizan utilizando el software ImageJ.
      NOTA: Se supone que el valor de ECV de la extremidad no isquémica para cada ratón corresponde al 100% para excluir las variaciones en los procedimientos de anatomía, perfusión o diofonización. Por lo tanto, el porcentaje de ECV en la extremidad isquémica se calculó en relación con el porcentaje no isquémico.
    7. Determinar el porcentaje de aumento de ECV como la diferencia entre el porcentaje de ECV entre las extremidades isquémicas y no isquémicas.
  6. Microdisección de captura láser de capilares
    1. Después de anestesiar, sacrificar a los ratones por luxación cervical.
    2. Para cosechar los músculos gastrocnemius de ambas piernas, retire la piel de los ratones ambas extremidades posteriores.
    3. Identifique el tendón de Aquiles y separe el tendón del hueso con un bisturí de 11 hojas.
    4. Sostenga el tendón de Aquiles y separe el músculo de la tibia y el peroné hasta la articulación de la rodilla con tijeras de primavera.
    5. Separe el bíceps femoris del músculo gastrocnemius.
    6. Utilice tijeras de resorte para cortar las inserciones de los músculos gastrocnemius a nivel de la articulación de la rodilla.
    7. Coloque los músculos gastrocnemius cosechados en una orientación transversal en un pequeño disco de corcho con la ayuda de un 10 % de tragacanth.
    8. Congele las muestras en isopentano líquido refrigerado por nitrógeno y guárdelas a -80 oC hasta el ensección.
    9. Cortar en un criostato de 12 m secciones de las muestras musculares y montar en diapositivas de vidrio.
      NOTA: Para la protección del ARN, tome un portaobjetos preenfriado y toque la parte posterior de la diapositiva con el dedo (guantes) para calentar solo la región para colocar la sección. Transfiera la sección del cuchillo criostato tocando con la zona calentada y seque a -20 oC en el criostato durante 2-3 min. El protocolo se puede pausar aquí.
      1. Fijar los portaobjetos de vidrio en una botella que contiene acetona pura enfriada (aproximadamente 50 ml) durante 5 minutos a -20 oC y secarlos al aire.
      2. Utilice una pluma hidrófoba alrededor de las secciones.
        NOTA: El uso de la pluma hidrófoba ayuda a reducir la cantidad de soluciones gastadas durante el protocolo. Para todas las incubaciones utilice 100 ml de todas las soluciones, por sección.
      3. Rehidratar con 2 M NaCl/PBS a 4oC e incubar los especímenes durante la noche a 4oC con anticuerpo monoclonal de rata anti-CD31 a 1:500 en 2M NaCl/PBS.
      4. Lavar dos veces en 2M NaCl/PBS para un total de 6 min.
      5. Añadir un anticuerpo secundario antirrata igG de conejo biotinilado a 1:200 en 2M NaCl/PBS y un 5% de suero de conejo durante 30 min a 4oC.
      6. Lavar en 2 M NaCl/PBS como antes y añadir complejo de peroxidasa conjugada con avidina durante 30 min a 4 oC.
      7. Enjuague y agregue el kit de sustrato de peroxidasa DAB durante 5 min.
      8. Deshidratar las secciones en etanol 90 % helado seguido de etanol al 100 % y dejarlas secar.
      9. Diseccionar 10 000 capilares por ratones utilizando un sistema de microdisección láser equipado con un láser pulsado de estado sólido de 355 nm y catapultar los capilares diseccionados a una tapa adhesiva de tubo de microfusión.
  7. Extracción de ARN, síntesis de ADNc, preamplificación y RT-PCR
    1. Aislar el ARN total de los capilares microdiseccionados utilizando un kit adecuado, el ARN total obtenido está entre 1,5-3 ng/L.
    2. Utilice un kit de síntesis de ADNc para la síntesis y dos rondas de preamplificación, utilizando las imprimaciones descritas en la Tabla1.
    3. Realice el RT-PCR para los mismos destinos descritos en el paso anterior. Utilice un programa que consista en un paso inicial de desnaturalización a 95 oC durante 10 min, seguido de 50 ciclos a 95 oC durante 15 s y a 60 oC durante 1 min.

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Representative Results

Utilizando el protocolo descrito, las células madre mesenquimales del cordón umbilical y la radiación ionizante de dosis baja (LDIR) se probaron como terapias angiogénicas putativas 11,12. Las lecturas de perfusión doppler láser se obtuvieron antes de la inducción de la isquemia y en los plazos especificados previamente que van desde inmediatamente después de la inducción de la isquemia hasta 45 días después de la isquemia. Las lecturas de perfusión de tejido por láser Doppler se registraron como imágenes codificadas por colores, sin que la perfusión se mostrara como azul oscuro y el nivel de perfusión más alto mostrado como rojo.  Como se muestra en las figuras 2A y 3A y cuantificado en las figuras 2B y 3B, se observó una pérdida completa de perfusión de las extremidades posteriores en todos los ratones inmediatamente después de la inducción de la isquemia de las extremidades posteriores, asegurando la reproducibilidad de la técnica para inducir la isquemia de la extremidad posterior. Es importante destacar que la gravedad de la isquemia es similar en todos los animales. Se dibujó un ROI alrededor de la extremidad posterior isquémica y se dibujó un ROI comparable alrededor de la extremidad posterior no isquémica para realizar la cuantificación de la perfusión. La perfusión se expresa como una relación de la perfusión en la extremidad isquémica con la de la extremidad no isquémica. Los cambios en la relación de perfusión se miden con el tiempo.

La inmunohistoquímica se realizó entre 15 y 90 días después de la isquemia. La diofonización se llevó a cabo entre 19 y 90 días después de la isquemia y la microdisección capilar entre 45 y 70 días de inducción post-isquemia, asegurando que las diferentes terapias pro-angiogénicas indujeran un efecto proangiogénico sostenido y prolongado.

La cuantificación de los capilares CD31 positivos en las secciones histológicas del músculo gastrocnemius evaluó la densidad capilar y esto se expresó como el número de capilares por número de fibras musculares. Como se muestra en la Figura4, la densidad capilar fue mayor en la isquémica frente a la extremidad no isquémica.

Para evaluar la densidad de los buques colaterales, los ratones fueron diofonizados y se seleccionó un ROI equivalente, correspondiente al 20 % del área de las extremidades, para la cuantificación. La densidad de los buques colaterales aumentó constantemente en la extremidad isquémica, por lo que los datos relativos a las extremidades tratadas y de control se expresaron como el porcentaje de aumento de la densidad de los buques colaterales en la extremidad isquémica relativa a la no isquémica (Figura5 ).

La expresión de genes pro-angiogénicos por eCs fue analizada por RT-PCR cuantitativo de células CD31 positivas. Las transcripciones de Vegfr2, Vegfr1, Fgf2, Angpt2, Pdgfc, Tgfb2, Hgf y Met mostraron una clara variación en la expresión entre las extremidades isquémicas y no isquémicas, exclusivamente en ratones expuestos al estímulo pro-angiogénico (Figura6).

Figure 1
Figura 1 : Ilustración esquemática de la anatomía de la vasculatura de la extremidad posterior del ratón que muestra los sitios de ligadura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : LDIR aumenta la recuperación de perfusión. Después de la inducción quirúrgica de HLI unilateral, ambas extremidades posteriores de ratones C57BL/6 fueron irradiadas falsas o irradiadas con cuatro fracciones diarias de 0.3Gy, en días consecutivos y se les permitió recuperarse. (A) Imágenes representativas de flujo Doppler láser pre-HLI, y en los días 0 (d0) y 15 (d15) inducción post-HLI. (B) La evaluación cuantitativa del flujo sanguíneo expresada en una proporción de ISC a la extremidad NISC demostró una perfusión de sangre de las extremidades significativamente mejorada en ratones irradiados frente a los irradiados por falsos tanto en los días 15 (d15) como en 45 (d45) después de la HLI. Los cambios entre grupos se evaluaron mediante mediciones repetidas bidireccionales ANOVA seguidas de la prueba post-hoc de Bonferroni (n a 12 ratones por grupo). Medios: se muestran los SEM.  P < 0.001; ns, no significativo. HLI, isquemia de la extremidad posterior; ISC, isquémico; NISC, no isquémico; Pre-HLI, antes de la isquemia de la extremidad posterior. Adaptado a partir de 11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Células madre mesenquimales del cordón umbilical (UCX) aumentar la recuperación de perfusión. UCX o su vehículo (como control) se administraron en el músculo isquémico de gascocente 5 horas después de la inducción de LA HLI. (A) Imágenes representativas de flujo de dosificador láser antes (PRE-HLI), inmediatamente después (d0 POST-HLI) y a 7, 14 y 21 días de inducción post-HLI (d7 POST-HLI, d14 POST-HLI, d21 POST-HLI). (B) La evaluación cuantitativa del flujo sanguíneo expresada en una proporción de ISC a la extremidad NISC demostró una perfusión de sangre de las extremidades significativamente mejorada en células madre mesenquimales del cordón umbilical -ratones tratados a los 7, 14 y 21 días después de la HLI. (n-16 para cada grupo experimental; D7: t (22,69) a 4,26; P á 0,001; el tamaño del efecto fue de 1,51 y la potencia 0,98; D14: t (30) a 4,7; P á 0,001; el tamaño del efecto fue de 1,66 y la potencia 0,99; D21: t (30) a 7,22; P á 0,001; tamaño del efecto fue de 2,56 y potencia 0,99). HLI, isquemia de la extremidad posterior; ISC, isquémico; NISC, no isquémico. Adaptado a partir de11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : LDIR aumenta la densidad capilar. (A) Secciones representativas de los músculos falsos e irradiados de gasco-isquémio isquémicos en el día 45 después de la HLI. Los capilares y miocitos fueron identificados por inmunohistoquímica CD31 y hematoxilina, respectivamente. Barra de escala, 150 mm.(B) El análisis cuantitativo reveló un aumento de la densidad capilar (capilares/miocitos) en los músculos gascocentimicos irradiados en comparación con los isquémicos irradiados por falsos en los días 15 y 45 después de la HLI. El ANOVA mixto seguido de la prueba post-hoc de Bonferroni se llevó a cabo con un factor dentro del sujeto de ISC y factores entre sujetos del día y la irradiación (n-6 ratones por grupo). Se muestran los datos y medios individuales: SEM. P<0.001; ns, no significativo. ISC, isquémico; NISC, no isquémico. Adaptado a partir de11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: LDIR aumenta la densidad colateral. (A) Imágenes ilustrativas de ROI seleccionados para ratones irradiados e irradiados. Se muestran las extremidades ISC y NISC en el día 90 después de la HLI. Barra de escala, 300 mm. (B) Los datos se representan como el porcentaje de aumento de CVD de la extremidad ISC relativamente a la NISC. En los días 15 y 90 después de la HLI, los ratones irradiados presentaron un aumento significativamente mayor de la ECV (%) frente a ratones falsos. Se llevó a cabo ANOVA bidireccional seguido de la prueba post-hoc de Bonferroni con un entre los factores sujetos del día y la irradiación (n-6 ratones por grupo).  Se muestran los datos y medios individuales: SEM. *P<0.05; P<0.001; ns, no significativo. HLI, isquemia de la extremidad posterior; ISC, isquémico; NISC, no isquémico. Adaptado a partir de11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6 : LDIR regula la expresión de genes angiogénicos en EF aisladas de los músculos de la gasclecímica isquémica irradiada. Después de la inducción quirúrgica de HLI unilateral, ambas extremidades posteriores de ratones C57BL/6 fueron irradiadas falsas o irradiadas con cuatro fracciones diarias de 0.3Gy, en días consecutivos y se les permitió recuperarse. En el día 45 post-HLI, la expresión de factores pro-angiogénicos y sus receptores fue evaluada por qRT-PCR exclusivamente en los CP. Las secciones musculares de Gastrocnemius se teñiron para CD31. Las células endoteliales individuales CD31+ fueron visualizadas, diseccionadas y aisladas usando un sistema de microdisección láser. Cada barra representa la expresión génica relativa en un animal. Las barras blancas y grises representan ratones irradiados e irradiados, respectivamente. Los valores se normalizaron a 18S para obtener niveles de expresión relativos. Los resultados expresados en los cambios de pliegue log2 entre muestras isquémicas y no isquémicas demostraron la abundancia relativa de las transcripciones en ratones irradiados; por el contrario, se observa una regulación descendente en ratones irradiados por falsas. Adaptado a partir de11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Vegfr1_F (5'-TTGAGGAGCTTTCACCGAACTCCA-3');
Vegfr1_R (5'-TATCTTCATGGAGGCCTTGGGCTT-3');
Vegfr2_F (5'-AGGCCCATTGAGTCCAACTACACA-3');
Vegfr2_R (5'-AGACCATGTCTCTCTGTTCTCCA-3');
Pdgf-c_F (5'-ATGCCACAAGTCACAGAAACCACG-3');
Pdgf-c_R (5'-AAGGCAGTCACAGCATTGTTGAGC-3');
Met_F (5'-ACGTTGAAATGCACAGTTGGTCCC-3');
Met_R (5'-TTGCGTCGTCTCTCTACTGTTTGA-3');
Fgf2_F (5'-ACTCCAGTTGGTATGTGGCACTGA-3');
Fgf2_R (5'-AACAGTATGGCCTTCTGTCCAGGT-3');
Tgfb2_F (5'-GCTTGGATGCCCCCTATTGCTTTTT3');
Tgfb2_R (5'-CTCCAGCACAGAAGTTGGCATTGT-3');
Ang2_F (5'-ATCCAACACCGAGAAGATGGCAGT-3');
Ang2_R (5'-AACTCATTGCCCAGCCAGTACTCT-3');
Hgf_F (5'-GCATTCAAGGCCAAGGAGAAGGTT-3');
Hgf_R (5'-TCATGCTTGTGAGGGTACTGCGA-3');
18s_F (5'-GCCCTATCAACTTTCGATTGGTAGT-3');
18s_R (5'-CCGGAATCGAACCCTGATT-3').

Tabla 1: Primers utilizados para el estudio.

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Discussion

Los modelos murinos de CLI han consistido principalmente en la ligadura de la arteria femoral sólo distal al origen de la profunda femoris 4,5,6,7,8,9. Esto ha demostrado dejar intacta la mayor parte de la circulación colateral, que restaura el flujo sanguíneo a la extremidad dentro de los 7 días 9. La eliminación del lecho colateral se puede lograr mediante la escisión de la arteria femoral. Sin embargo, hasta un tercio del flujo sanguíneo original puede ser restaurado tan pronto como 7 días después del procedimiento, dado que la mayoría de los vasos colaterales surgen de la arteria ilíaca interna 7. Lejay et al han propuesto ligaduras secuenciales con una segunda ligadura realizada en la arteria ilíaca común, reduciendo efectivamente la perfusión colateral proporcionada por la arteria ilíaca interna 4. Los pasos críticos dentro de este protocolo incluyen no sólo la identificación de la arteria ilíaca externa justo por encima del ligamento inguinal, sino también la ligadura y escisión de las arterias y venas externas lílicas y femorales, que sirve un doble propósito: aumentar la gravedad de la isquemia, así como para mejorar la reproducibilidad técnica del modelo, ya que la exposición de la arteria femoral por sí sola a menudo resulta en el desgarro de la vena.

Una limitación de esta técnica es la interrupción aguda del flujo sanguíneo a la extremidad, que difiere del proceso prolongado asociado con la acumulación de placa aterosclerótica que conduce a la estenosis arterial y oclusión. Aún así, la reducción del flujo sanguíneo estuvo presente mucho después de 2 semanas, el plazo establecido para el diagnóstico de isquemia crónica. Además, la colateralización se incrementó con el insulto isquémico solo, que imita el proceso de formación colateral observado en las extremidades isquémicas crónicas.

La neovascularización de las extremidades isquémicas implica una interacción compleja de eventos biológicos, a saber, la angiogénesis y la arteriogénesis. Este protocolo incluye una variedad de ensayos que evaluaron la interferencia de las terapias angiogénicas putativas en la brotación angiogénica (densidad capilar de los vasos) y el desarrollo de vasos colaterales (arteriogénesis), el mecanismo más importante en la tolerancia humana a la isquemia de las extremidades inferiores. Simultáneamente, Doppler láser se utiliza para revelar la función de estos vasos nuevos o ampliados, y por primera vez microdisección láser de capilares se utiliza para recoger los ECs que revelan los mecanismos moleculares que subyacen a la recuperación funcional. Este protocolo produce un modelo animal reproducible que puede imitar los efectos de la CLI un estándar de pruebas cuando los animales son tratados con posibles terapias angiogénicas que podrían aplicarse en un contexto clínico en el futuro.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a José Rino y a Tonia Carvalho, jefes del Centro de Bioimagen y del Laboratorio de Histología y Patología Comparada del Instituto de Medicina Molecular Joao Lobo Antunes, respectivamente. También agradecemos a Vyacheslav Sushchyk del Departamento de Anatomía de la Escuela de Medicina Nova/Faculdade de Ciencias Médicas, Universidade Nova de Lisboa.

Referencia de financiación: proyecto financiado por UID/IC/0306/2016 Fundación para la Ciencia y una Tecnología. Paula de Oliveira cuenta con el apoyo de una beca (SFRH/BD/80483/2011) de la Fundación para la Ciencia y la Tecnología.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7500 Fast Real-Time PCR Applied Biosystems Instrument
Acetone Merk 1000141000 Reagent; Caution - highly flammable
Adenosine Valdepharm Reagent
Atipamezole OrionPharma Reagent
Barium sulphate (Micropaque) Guebert 8671404 (ref. Infarmed) Reagent
Buprenorphine RichterPharma Reagent
Carl Zeiss Opmi-1 FC Surgical Microscope Carl Zeiss Microscopy, Germany Instrument
cDNA RT2 PreAMP cDNA Synthesis kit Qiagen 7335730 Reagent
Cryostat Leica CM Leica Microsystems 3050S Instrument
DAB peroxidase substrate kit DAKO;Vector Laboratories K3468 Reagent
hydrogen peroxidase Merk 1072090250 Reagent; Caution - nocif
hydrophobic pen Dako 411121 Reagent; Caution - toxic
Ketamidor Richterpharma CN:580393,7 630/01/12 Dfvf Reagent
Laser Doppler perfusion imager moorLDI2-HIR MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK 5710 Instrument
Leica DM2500 upright brightfield microscope Leica Microsystems Instrument
Medetor Virbac 037/01/07RFVPT Reagent
methanol VWR UN1230 Reagent; Caution - toxic and highly flammable
Papaverine Labesfal Reagent
Pentano Isso Merk 1060561000 Reagent; Caution - highly flammable
Power SYBR® Green Applied Biosystems 4309155 Reagent
Purified rat anti-mouse CD31 Pharmingen 550274 Reagent
RNeasy Micro kit Qiagen 74004 Reagent
Surgic-Pro 6.0 Medtronic (Coviden) VP733X Suture
VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, Rat IgG) Vectastain ABC kit; Vector Laboratories PK-4004 Reagent
Vicryl5.0/ Vicryl 6.0 Medtronic (Covidien) UL202/ UL101 Suture
Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection System Carl Zeiss Microscopy, Germany 1023290916 Instrument
Stereotaxic microscope Carl Zeiss Microscopy, Germany Instrument
Digital camera Linux Instrument

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References

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  3. Abu Dabrh, A. M., et al. The natural history of untreated severe or critical limb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 62 (6), 1642-1651 (2015).
  4. Lejay, A., et al. A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 49 (2), 205-212 (2015).
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Medicina Número 148 Angiogénesis Angiogénesis Terapéutica Isquemia crítica de las extremidades Enfermedad arterial periférica Modelo de isquemia de la extremidad posterior de la murina CLI
Evaluación de la angiogénesis terapéutica en un modelo murino de isquemia de las extremidades posteriores
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