Summary
Burada, anjiogenik tedavilerin etkinliğini değerlendirmek için fonksiyonel, histolojik ve moleküler testlerin bir pil tarafından izlenen kritik bir hindekstremite iskemi deneysel modeli sunulmuştur.
Abstract
Kritik ekstremite iskemi (CLı), alt ekstremite amputasyonu riski yüksek olan ciddi bir durumdur. Revaskülarizasyon altın standardı tedavi olmasına rağmen, önemli sayıda CLI hasta ya cerrahi veya endovasküler revaskülarizasyon için uygun değildir. Anjiyojenik tedaviler bu hastalar için bir seçenek olarak ortaya çıkmaktadır ancak halen soruşturma altındadır. İnsanlarda uygulamadan önce, bu tedaviler hayvan modellerinde test edilmelidir ve mekanizmaları açıkça anlaşılmalıdır. Hindekstremite iskemi (HLı) bir hayvan modeli, farelerde distal dış iliak ve femoral arterlerin ve damarların ligasyon ve eksizyonu ile geliştirilmiştir. İskemi ve Putatif anjiyojenik tedavilerin fonksiyonel, histolojik ve moleküler seviyelerde etkilerini değerlendirmek için kapsamlı bir test panosu toplandı. Lazer Doppler, perfüzyonun akış ölçümü ve fonksiyonel değerlendirilmesi için kullanılmıştır. Doku tepkisi, gasronemius kasının histolojik bölümlerinde Anti-CD31 antikor ile boyama sonrası kapiller yoğunluğunun analizi ile ve terleme sonrası damar yoğunluğunun ölçülmesi ile değerlendirildi. Anjiyojenik genlerin ifadesi, fare gastroknemius kaslarından lazer yakalama mikrodiseksiyondan sonra yalnızca endotel hücrelerinde (ECS) seçilen anjiyojenik faktörleri hedefleyen RT-PCR tarafından ölçülebilir. Bu yöntemler, iskemik ve iskemik olmayan ekstremite arasında ve tedavi edilen ve tedavi edilmeyen ekstremite arasındaki farklılıkları tanımlamada hassastır. Bu protokol, tekrarlanabilir bir CLı modeli ve anjiyojenik tedaviler test etmek için bir çerçeve sağlar.
Introduction
Periferik arter hastalığı (PAD) ağırlıklı olarak alt ekstremite etkiler. PAD ateroskleroz neden olur, alt ekstremite kan akışına ciddi kısıtlama neden olabilir bir arter tıkanıklığı1. Aralıklı klodicasyon PAD ilk tezahürü ve yürüyüş kas ağrısı anlamına gelir. CLı, iskemik dinlenme ağrısı, ülser veya kangren2gösteren hastalarda teşhis EDILIYOR, Pad en şiddetli aşamasıdır. CLı olan hastalarda özellikle tedavi edilmemiş3amputasyon riski yüksektir. Alt ekstremite revaskülarizasyon (ya açık cerrahi veya endovasküler prosedür) Şu anda ekstremite kurtarma elde etmek için tek yoldur. Ancak, bu prosedürler için, lezyonların yerini, arter tıkanıklığı ve geniş komorbiditesi4,5' i içeren nedenlerle, CLI hastalarının yaklaşık% 30 ' unda bu yordamlar için uygun değildir. Bu nedenle, bu başka tedavi edilemez hastalar için yeni tedaviler gereklidir, anjiyogenez tanıtımı ile daha yoğun soruşturma altında strateji olmak.
İnsanlarda test yapmadan önce, yeni terapilerin etkinliği ve güvenliği hayvan modellerinde değerlendirilmelidir. Birkaç model, genellikle fareler6,7,8,9,10içinde hindekstremite iskemi (HLI) inducing tarafından, CLI çalışması için geliştirilmiştir. Ancak, bu modeller ve/veya ekisize ve damarları ve sinirler çevreleyen da6,7,8disseke olup olmadığını arterlerin doğası da dahil olmak üzere çeşitli yönleri farklıdır 9,10. Birlikte alındığında, bu yönleri her hayvanın iskemi-reperfüzyon yaralanması şiddeti etkileyecektir, sonuçları karşılaştırmak zor hale. Bu nedenle, belirli bir anjiyojenik tedavinin etkili olup olmadığını değerlendirmek için iskemi ve farklı hedeflerin değerlendirilmesine neden olan prosedürün standartlaştırılmalıdır etkili bir protokol geliştirmek önemlidir. Tüm bu yönleri kapsayacak şekilde tasarlanan deneysel bir protokol, anjiyojenik tedavilerin etkilerini ve bunların her bir sonuçlarının her birinde etkinliğini ölçen mekanizmalar tarafından kapsamlı bir anlayış sağlayacaktır. Son zamanlarda ekibimiz tarafından yayınlanan iki farklı eserler iyi bir örnek olan11,12, hangi farklı yaklaşımlar terapötik anjiyojenezi neden bu daha fazla ayrıntı ile tarif edilecektir aynı protokol kullanılarak değerlendirildi Protokolü.
Bu protokolün genel amacı, CLı 'nin etkilerini taklit edebilir ve deneysel anjiogenik fonksiyonel, histolojik ve moleküler etkilerinin kapsamlı bir şekilde değerlendirilmesi için deney temelini koyabilen yeniden üretilebilen bir deneysel modeli açıklamak. Ajan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan prosedürleri Direktifi 2010/63/EU uyarınca ve kurumsal hayvan refah organı tarafından onaylanmış ve DGAV tarafından lisanslı, hayvan koruma için Portekiz yetkili kurumu (lisans numarası 023861/2013)
DIKKAT: protokollerde kullanılan kimyasalların birkaç tanesi toksik ve zararlıdır. Lütfen tüm uygun güvenlik uygulamalarını ve kişisel koruyucu ekipmanları (eldiven, laboratuar ceket, tam boy pantolon ve kapalı ayak ayakkabıları) kullanın
1. hindekstremite iskemi murine modeli
Not: tüm deneyler 22 haftalık C57BL/6 kadın fareler üzerinde gerçekleştirilir.
- Çözümlerin hazırlanması
-
Anestezik çözümün hazırlanması
Not: Bu anestezik kombinasyon (Medetomidin ve ketamin) kadar sağlar 30 dk immobilizasyon ve bir cerrahi pencere 15 dakika. Etki atipamezol yönetimi tarafından geri alınabilir.- Temiz, 1cc şırınga ile, 1 mL Medetomidin (1 mg/kg vücut ağırlığı) geri çekin, doğru ölçümler için hava kabarcıkları ortadan kaldırmak ve 15 mL Falcon tüp ekleyin.
- Temiz, 1 cc şırınga ile, 0,75 mL ketamin (75 mg/kg vücut ağırlığı) geri çekin, doğru ölçümler için hava kabarcıkları ortadan kaldırmak ve medetomidine içeren 15 mL şahin tüp ekleyin.
- 10 mL anestezik çözelti elde etmek için 8,25 mL steril tuz (0,9% NaCl) ekleyin.
- Bileşiklerin adı ile tüp tanımlamak, Tarih karışık ve son kullanma tarihi.
- 4 °C ' de karanlıkta saklayın.
-
Anti-sedatif çözümün hazırlanması
- Temiz, 1 cc şırıngayla, 1 mL atipamezol (5 mg/kg vücut ağırlığı) çekin, doğru ölçümler için hava kabarcıklarını ortadan kaldırın ve 15 mL 'Lik şahin tüpüne ekleyin.
- 10 mL reversiyon çözeltisi elde etmek için 9 mL steril tuz (0,9% NaCl) ekleyin.
- Bileşiklerin adı ile tüp tanımlamak, Tarih karışık ve son kullanma tarihi.
- 4 °C ' de karanlıkta saklayın.
-
Ameliyat sonrası analjezi çözeltisi hazırlanması
- Temiz, 1 cc şırıngayla, 0,5 mL buprenorfik (100 μL/15-30 g vücut ağırlığı) çekin, doğru ölçümler için hava kabarcıklarını ortadan kaldırın ve 15 mL 'Lik şahin tüpüne ekleyin.
- 10 mL analjezi çözeltisi elde etmek için 9,5 mL steril tuz (0,9% NaCl) ekleyin.
- Bileşiklerin adı ile tüp tanımlamak, Tarih karışık ve son kullanma tarihi.
- 4 °C ' de karanlıkta saklayın.
-
Anestezik çözümün hazırlanması
- Hindekstremite iskemi cerrahi indüksiyon
- Bu müdahale için gerekli cerrahi aletler: sivri forseps, yay makas, oftalmik iğne tutucu, cerrahi makas ve iğne tutucu. Kullanmadan önce tüm cerrahi aletleri Otoklav içinde sterilize edin. Subkutan yağ diseksiyonu için pamuk bezlerden kullanın.
- Fare tutmadan önce anestezi çözeltisi ile şırıngayı yükleyin.
- Fare hareketli tutmak için mümkün olduğunca çok cilt tutarak, kafes ızgarasına karşı kulaklarının arkasında kuvvet uygulayarak hayvan restrain.
- Kafasını indirdi ile eğilmiş hayvan tutun ve anestezi çözeltisi bir intraperitoneal enjeksiyon gerçekleştirmek, fare gövdesi ile 45 ° açı şırınga tutarak.
- Anestezi derinliği değerlendirmek için, pedal çekilme refleksleri yokluğunda kontrol edin.
- Bir elektrikli tıraş makinesi kullanarak sağ arka ekstremite saç çıkarın. Cilt hazırlama için bir klorheksisin dezenfektan sabun fırçalayın kullanın. Suds kaldırmak için temiz bir kağıt havlu kullanın. Bir klorheksisin cerrahi fırçalayın uygulayın ve cerrahi steril paketi fareler taşımadan önce steril bir örtü ile cilt alanı korumak.
- Hayvan dorsal dekübitus yerleştirin ve dört ekstremite ayrı yaymak ve teyp ile güvenli ile dizginlemek.
DIKKAT: hayvanın vücut sıcaklığını kararlı tutmak için ısıtmalı bir yastık üzerinde prosedürü gerçekleştirin; cerrahi prosedür, 10X veya 20X büyütme sırasında bir diseksiyon mikroskop kullanılarak gerçekleştirilir. - Cilt hazırlığı sonuçlandırmak için steril gazlı bez kullanarak bir klorheksidin antiseptik solüsyon uygulayın. 11 numaralı Cerrahi neşter bıçağını kullanarak, sağ bacakın uyluk üzerine 1 cm 'lik bir cilt kesi gerçekleştirin.
- Künt subkutan yağ nörovasküler paket açığa sökme. Sivri forseps kullanarak, yay makas ve oftalmik iğne tutucu, distal dış iliak ve femoral damarların ortaya çıkarmak için membranöz İLİO-Femoral Kılıf açın.
- Damarları (arter ve ven) sinirden ayırır ve ayırın. Bir 7,0 kullanarak Emilemeyen polipropilen sütür distal dış iliak arter ve ven ve distal femoral arter ve ven indirgeme uzman.
- İLİO-femoral arter ve damarları, yay makas ile distal ve proksimal knot arasındaki segmenti Transect.
- Kesi emilebilen sütür ile kapatın (örn., 5,0 vicryl sütür).
- Şırıngayı Anti-sedatif çözelti ile yükleyin ve anti-sedatif çözeltinin intraperitoneal enjeksiyonu yapmak için 1.2.3 ve 1.2.4 'de ayrıntılı olarak aynı yöntemi kullanın.
- Ameliyat sonrası izleme
Not: hayvanlar dikkatle tüm hayvanların Anti-sedatif iyi kurtarmak emin olmak için her 15-20 dk gözlenen; anestezileştirilmiş hayvanlar asla gözetimsiz bırakılmamalıdır.- Anestezi kurtarma değerlendirmek: 1) solunum hızını ve derinliği izlemek; 2) hayvan refleksleri (pedal ve göz pozisyonu) değerlendirmek
- Post-operatif analjezi her 8-12 h bir Subkutan Enjeksiyon gerçekleştirin.
- Hayvan sağlık durumu ve cerrahi site görünümü kısa bir açıklama kayıt ameliyattan sonra günlük hayvanları izlemek, tüm dikiş kapalı olduğundan emin olun.
- Eğer ayrılması oluşursa, kesi yeniden dikişe. Başarısız olursa, idrar, dışkı atılımları, sürtünme ve cildin kesme korumak ve iyileşme sürecine yardımcı olmak için kesi bir cilt bariyer film uygulayın.
2. anjiyojenik etkisinin değerlendirilmesi
Not: iskemi indüksiyon sonra, çalışmada terapötik ajan uygulamak ve aşağıdaki prosedürleri elde. Diğer zaman noktalarında gerçekleştirilen adımlar ilgili bölüm altında ayrıntılı olarak görülmektedir.
- Lazer Doppler perfüzyon görüntüleme
- Bir gün önce bir elektrikli tıraş makinesi kullanarak analizinden sonra her iki hindekstremite saç çıkarın dondurmacı krem.
- Anestezik çözeltisi kullanarak fareler anestezize.
- İşlem sırasında sıcaklık değişmeyecek sağlamak için 5 dakika için 37 °C Isıtma pad üzerinde hayvan yerleştirin
- Hayvanı, bacaklarla birlikte, uzun bir pozisyonda güvenli bir konuma yerleştirin. Zaman içinde hindekstremite perfüzyon değişiklikleri takip etmek için prosedür tekrarlanmalıdır zaman hayvan konumlandırma benzer olmalıdır her hayvan için sağ ve sol bacaklar ve ayaklar arasındaki mesafeyi ölçmek.
- Lazer Doppler perfüzyon görüntüleştirici kullanarak veri almaya başlayın.
- Satın alma tamamlandıktan sonra, Anti-sedatif solüsyon ile anestezi geri dönün.
- Görüntü analiz yazılımını açın ve iskemik hindekstremite etrafında ilgi alanı (YG) ve non-iskemik hindekstremite etrafında karşılaştırılabilir bir YG çizin.
- Flux değerleri gözlemlemek ve iskemik ekstremite perfüzyon bir oranı olarak perfüzyon belirlemek olmayan-iskemik ekstremitede. Perfüzyon oranındaki değişiklikler zamanla ölçülür.
- İmmünhistokimya ve kılcal Yoğunluk Analizi
- Anestezinden sonra, fareleri servikal dislocation ile feda et.
- Her iki bacakların gasrocnemius kasları toplamak için, ilk olarak, her iki arka ekstremite cilt çıkarın.
- Aşil tendonu tanımlayın ve bir 11-Blade neşter kullanarak kemik tendon ayırın.
- Aşil tendonu tutun ve yay makas ile diz eklem kadar Tibia ve fibula kas ayırın.
- Pazı femoris 'i gastroknemius kasından ayırın.
- Diz eklem seviyesinde gastroknemius kaslarının eklemeler kesmek için yay makas kullanın.
- 10% tragacanth yardımıyla küçük bir mantar disk üzerinde bir enine yönde hasat gastrorocnemius kasları yerleştirin.
- Numuneleri sıvı nitrojen soğutmalı isopentane ile dondurur ve sekene kadar-80 °C ' de saklayın.
- Kas numunelerinin 7 μm bölümlerini bir kriyostat üzerinde kesebilir ve cam slaytlarda monte edilir.
Not: protokol burada duraklatılmış olabilir. - Soğutucu saf aseton (yaklaşık 50 mL) içeren bir şişe içinde-20 °C ' de 10 dakika boyunca cam slaytları düzeltin.
- Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca metanol (50 mL) olarak seyreltilmiş% 0,3 hidrojen peroksidaz ekleyin.
- Toplam 10 dakika boyunca fosfat-tamponlu tuz (PBS) (50 mL) olarak iki kez yıkayın.
- Bölümler etrafında hidrofobik kalem kullanın.
Not: hidrofobik kalem kullanımı, protokol sırasında harcanan çözümlerin miktarını azaltmanıza olanak tanır. Tüm inküler için 100 μL tüm çözümleri, bölüm başına kullanın. - Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBS 'de% 5 tavşan serumu engelleme çözümü uygulayın.
- Numuneleri, PBS 'de% 1 sığır serum albümin (BSA) olarak 1:500 ' de seyreltilmiş Anti-CD31 Rat monoklonal antikor ile Oda sıcaklığında 1 h için inküt.
- Toplam 30 dakika boyunca PBS 'de üç kez yıkayın.
- PBS 'de% 1 BSA ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 5 tavşan serumu olarak 1:200 at ikincil biyotinlenmiş tavşan Anti-Rat IgG antikor ekleyin.
- Daha önce olduğu gibi PBS 'de yıkayın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca etiketli avidin-konjueli peroksidaz kompleksi ekleyin.
- 5 dakika boyunca PBS 'de 3 kez durulayın ve başka bir 5 dakika diaminobenzidin (DAB) peroksidaz substrat kiti ekleyin.
- Montajdan önce 10 s için hematoksilen ile bölümleri counterstain.
- Her örnekli 4 ayrı anatomik alanın 2 farklı bölümünde (yani, miyoksit sayısı başına kılcal sayısı) bir dik aydınlık alan mikroskop kullanarak kılcal yoğunlukları ölçün.
- Kontrast aracı perfüzyon
- Anestezik çözeltisi kullanarak fareler anestezize.
- 15 numaralı neşter bıçağı kullanarak Median laparotomi gerçekleştirin.
- Abdominal aort ve kaudal Vena Cava 'ı açığa çıkararak, küçük bağırsak ve yay makası kullanarak yanal geri çekildikten sonra.
- 1 26-Gauge kateteri kransal olarak abdominal aort ve başka bir şekilde aynı yönde olan kaudal Vena Cava 'ya yerleştirin.
- Bir konaklama sütür gerçekleştirmek için bir 5/0 ipek dikiş kullanarak yerde güvenli kateterler.
- Vasküler sistemi, 10 ml Şırıngayı kullanarak abdominal aort içine itilmiş heparin (500 adet/100 ml) içeren 37 °c ' lik bir tuz çözeltisi ile yıkayın. Kaudal Vena Cava içine yerleştirilen kateter dışarı çıkan net bir çözüm görülene kadar nazik perfüzyon devam edin.
Not: genellikle 30 için 40 ml bir heparinize tuz çözeltisi bir yetişkin sıçan vasküler sistemi durulamak için gereklidir. - 2 dakika boyunca adenozin (1 mg/L) ve papaverin (4 mg/L) karışımı yönetin.
- Aort kateterine enjekte 10% 50 Baryum sülfat ve% 5 jelatin karışımı mL.
Not: çözeltinin kalınlaşmasını önlemek için 60 °C ' de tutulması gerekir. - Damar dökümüne katılaşma sağlamak için fareler-4 °C ' de en az 4 saat bırakın.
- Her fare alt gövdesinde cilt çıkarın.
- Diaphonization - spalteholz tekniği
- En az 72 h için% 10 formaldehit çözeltisi içinde daldırma tarafından fareler düzeltin.
- 24 saat boyunca% 30 hidrojen peroksit çözeltisi içinde daldırma tarafından fare Bleach.
- Dondurma değiştirme tekniği kullanarak fareler susuz. Bu metodoloji, fareleri, her biri 24 saat boyunca-20 °C ' de saf aseton olan Art arda geçişte (ortalama dört) göndererek oluşur.
- 100% Benzil benzoat ve 100% metil salisilat bir 3:5 oranında karışımı içeren bir çözelti içine daldırarak fareler açıklığa kavuşturmak (Bu karışımı da Spalteholz çözüm olarak da bilinir) 13.
- Fareleri Spalteholz solüsyonu içinde bir vakum odasında batırın, genellikle 5 ila 7 gün sürer.
- Numunenin temizlenmeden önce karanlık hale gelirse, çözümü değiştirin.
- Teminat gemiler ölçümü
- Stereotaktik mikroskop kullanarak Spalteholz çözeltisi içinde transaydınlatma altında askıya alınan farelere dikkat edin. Hafifçe kavramak ve taşımak için mikrocerrahi forseps kullanın.
- Mikroskop bağlı bir dijital kamera kullanarak tüm ekstremite fotoğraf.
- Uygun yazılımı kullanarak tüm ekstremite fotoğraflarını alın.
- Uygun yazılımı kullanarak onları vurgulayarak teminat gemileri manuel segmentasyon gerçekleştirin.
Not: teminat gemileri longland 'ın tanımına göre tanımlanır, tanımlanmış bir kök, orta bölge, ve yeniden giren, 20 ve 300 μm arasında bir çap ile, femoral, safen ve popliteal arterlerin ve tüm venöz yapıları hariç. - Cerrahi tıkanıklığı çevreleyen ve altında, adductor aynı anatomik bölgede her fare Roıs tanımlayın.
- Toplam ekstremite alanının% 20 ' sini eşdeğer ROIs 'te bulunan teminat damar yoğunluğunu (CVD) ölçün. CVD, vasküler alan ile ROIs alanları arasındaki oran olarak hesaplanır. Tüm yoğunluk ölçümleri ımagej yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir.
Not: her fare için iskemik ekstremite CVD değeri anatomi, perfüzyon veya diaphonization prosedürlerinde varyasyonları dışlamak için% 100 ' e karşılık kabul edilir. İskemik ekstremite CVD yüzdesi, bu nedenle, olmayan-iskemik bir göreli olarak hesaplanır. - CVD artış yüzdesini iskemik ve noniskemik ekstremite arasında CVD yüzdesi arasındaki fark olarak belirleyin.
- Lazer yakalama mikrodiseksiyonu kapillaries
- Anestezinden sonra, fareleri servikal dislocation ile feda et.
- Her iki bacakların gasrocnemius kasları hasat etmek için, fareler her iki arka ekstremite cilt çıkarın.
- Aşil tendonu tanımlayın ve bir 11-Blade neşter kullanarak kemik tendon ayırın.
- Aşil tendonu tutun ve yay makas ile diz eklem kadar Tibia ve fibula kas ayırın.
- Pazı femoris 'i gastroknemius kasından ayırın.
- Diz eklem seviyesinde gastroknemius kaslarının eklemeler kesmek için yay makas kullanın.
- 10% tragacanth yardımıyla küçük bir mantar disk üzerinde bir enine yönde hasat gastrorocnemius kasları yerleştirin.
- Numuneleri sıvı nitrojen soğutmalı isopentane ile dondurur ve sekene kadar-80 °C ' de saklayın.
- Kas örneklerinin bir kriyostat 12 μm bölümleri üzerinde kesme ve cam slaytlar üzerinde monte.
Not: RNA koruması Için, ön soğutmalı bir slayt alın ve slaytın arka tarafına parmağınızı (eldivenler) dokunup, yalnızca bölümü yerleştirmek için bölgeyi ısıtın. Kriyostat bıçağından transfer bölümü, sıcak alan ile dokunarak ve-20 °c ' de 2-3 dk. için kriyostat 'ta kuru. Protokol burada duraklatılmış olabilir.- -20 °C ' de 5 dakika boyunca soğutmalı saf aseton (yaklaşık 50 mL) içeren bir şişede cam slaytları düzeltin ve onları havaya kurutun.
- Bölümler etrafında hidrofobik kalem kullanın.
Not: hidrofobik kalem kullanımı, protokol sırasında harcanan çözüm miktarının azaltılmasına yardımcı olur. Tüm inküler için 100 μL tüm çözümleri, bölüm başına kullanın. - 4 °C ' de 2 M NaCl/PBS ile rehidrat ve 1:500 Ila 2M NaCl/PBS 'de Anti-CD31 Rat monoklonal antikor ile 4 °C ' de bir gecede örneklerin inküyesi.
- Toplam 6 dakika boyunca 2M NaCl/PBS 'de iki kez yıkayın.
- 1:200 at 2m NaCl/PBS ve% 5 tavşan serumu 4 °c ' de 30 dakika için ikincil biyotinlenmiş tavşan Anti-Rat IgG antikor ekleyin.
- Daha önce olduğu gibi 2 M NaCl/PBS 'de yıkayın ve 4 °C ' de 30 dakika boyunca etiketli avidin-konjueli peroksidaz kompleksini ekleyin.
- DAB peroksidaz substrat kiti 5 dakika boyunca durulayın ve ekleyin.
- Buz-soğuk bölümler% 90 etanol% 100 etanol takip ve kuru bırakın.
- Darbe katı hal 355 nm lazer ile donatılmış bir lazer gösterilmesi sistemi kullanarak fare başına 10 000 kapiller dissect ve bir mikrofuge tüp yapıştırıcı-Cap içine disseke kapillaries mancınık.
- RNA ekstraksiyon, cDNA sentezi, ön amplifikasyon ve RT-PCR
- Mikrodissected kapillarilerin toplam RNA 'sını uygun bir kit kullanarak yalıtın, elde edilen toplam RNA 1,5-3 ng/μL arasındadır.
- Tablo 1' de açıklanan astar kullanarak sentez ve iki tur ön amplifikasyon Için bir cDNA sentezi kiti kullanın.
- Önceki adımda açıklanan aynı hedefler için RT-PCR gerçekleştirin. 95 °C ' de 10 dakika boyunca ilk denatürasyon adımından oluşan bir program, 15 s için 95 °C ' de 50 döngüleri ve 1 dk için 60 °C ' de kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tanımlanan protokolün kullanılması, göbek kordon mezenkimal kök hücreleri ve düşük doz iyonlaştırıcı radyasyon (ldır) Putatif anjiyojenik tedaviler olarak test edildi 11,12. Lazer Doppler perfüzyon ölçümleri, iskemi İndüksiyon öncesi ve iskemi indüksiyon hemen sonra 45 gün sonrası iskemi arasında değişen önceden belirlenmiş timepoints elde edildi. Lazer Doppler ile doku perfüzyon ölçümleri, koyu mavi olarak görüntülenen perfüzyon ve kırmızı olarak görüntülenen en yüksek perfüzyon seviyesi ile renk kodlu görüntüler olarak kaydedildi. 2A ve 3A figürleri ve 2B ve 3Brakamlara göre gösterildiği gibi, hindekstremite iskemi indüksiyonunun hemen ardından tüm farelerde tam bir dalbacak perfüzyon kaybı gözlenen arka ekstremite iskemi inducing için teknik tekrarlanabilirlik. Önemlisi, iskemi şiddeti tüm hayvanların benzer. Bir YG iskemik hindekstremite etrafında çizilmiş ve karşılaştırılabilir bir YG perfüzyon ölçülmesi gerçekleştirmek için olmayan-iskemik hindekstremite etrafında çizilmiş. Perfüzyon, iskemik ekstremite perfüzyon olmayan-iskemik ekstremite bir oranı olarak ifade edilir. Perfüzyon oranındaki değişiklikler zamanla ölçülür.
İmmunohistokimya 15 ila 90 gün sonrası iskemi arasında yapılmıştır. Farklı Pro-anjiyojenik tedavilerin sürekli ve uzun süreli proanjiyojenik etkiye neden olduğunu sağlayarak, 45-ve 70-gün sonrası iskemi indüksiyon arasında 19 ve 90 gün sonrası iskemi ve kapiller mikrodiseksiyon arasında diaphonization yapılmıştır.
Gasrocnemius kasının histolojik bölümlerinde CD31 pozitif kapillarilerin ölçülmesini kapiller yoğunluğu değerlendirildi ve bu kas liflerinin sayısı başına kılcal sayısı olarak ifade edildi. Şekil 4' te görüldüğü gibi, kapiller yoğunluğu iskemik olmayan iskemik ekstremite karşı daha büyükse.
Yan damar yoğunluğunu değerlendirmek için fareler ölçülenmiş, ekstremite alanının% 20 ' sini alan eşdeğer bir YG, miktarın belirlenmesi için seçildi. Yan damar yoğunluğu sürekli iskemik ekstremitede artan, bu nedenle tedavi ve kontrol ekstremiteler ile ilgili verileri olmayan iskemik bir nispeten iskemik ekstremite teminat damar yoğunluğu artışı yüzdesi olarak ifade edildi (Şekil 5 ).
ECs tarafından Pro-anjiyojenik genler ifadesi CD31-pozitif hücrelerin nicel RT-PCR tarafından incelendi. Vegfr2, Vegfr1, Fgf2, Angpt2, Pdgfc, Tgfb2, hgf ve met için transkriptler, sadece Pro-anjiyojenik stimülasyona maruz kalan farelerde, iskemik ve iskemik olmayan ekstremite arasındaki ifadede net bir değişiklik gösterdi (Şekil 6).
Şekil 1 : Ligasyon siteleri gösteren fare hindekstremite damar anatomisinin şematik Illustration. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : Ldır perfüzyon iyileşmesini artırır. Tek taraflı HLı cerrahi İndüksiyondan sonra, C57BL/6 farelerin her iki arka ekstremite, ardışık günlerde ve geri kazanmasına izin verilen dört günlük 0.3 GY fraksiyonlarla ışınlanmış veya ışınlanmış. (A) temsilci lazer Doppler akış görüntüleri HLı öncesi ve gün 0 (D0) ve 15 (D15) Post-HLı indüksiyon. (B) ISC 'nin NıSC ekstremite oranı olarak ifade edilen kan akışının niceliksel değerlendirilmesi, ışınlanmış farelerde, 15 (D15) ve 45 (D45) Post-HLı olarak da Şam radyasyona maruz kaldı Grup arasında yapılan değişiklikler iki yönlü tekrarlayan ölçümler ile değerlendirildi ve ardından Bonferroni post-hoc testi (grup başına n = 12 fare). Anlamına gelir ± SEM gösterilir. P < 0,001; NS, önemsiz. HLı, hindekstremite iskemi; ISC, iskemik; NISC, olmayan-iskemik; Ön-HLI, önce ekstremite iskemi. 11' den itibaren adapte olunur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 : Umbilical kordon mezenkimal kök hücreler (UCX) perfüzyon iyileşmesini artırın. HLı indüksiyonunda 5 saat sonra UCX veya onların aracı (bir kontrol olarak) iskemik gasrocnemius kas uygulandı. (A) temsilci lazer Doppler akış görüntüleri (PRE-HLI), hemen sonra (D0 POST-HLI) ve 7, 14 ve 21 gün sonrası-HLI İndüksiyon (D7 POST-HLI, D14 POST-HLI, D21 POST-HLI). (B) ISC 'nin nisc ekstremite oranı olarak ifade edilen kan akışının nicel değerlendirilmesi, 7, 14 ve 21 gün Post-hLi ' d e, göbek kordon mezenkimal kök hücrelerde tedavi edilen farelerde önemli ölçüde gelişmiş ekstremite kan perfüzyon gösterdi. (n = 16 her deneysel grup için; D7: t (22,69) = 4,26; P ˂ 0,001; etkisi boyutu 1,51 ve güç 0,98 oldu; D14: t (30) = 4,7; P ˂ 0,001; etkisi boyutu 1,66 ve güç 0,99 oldu; D21: t (30) = 7,22; P ˂ 0,001; etkisi boyutu 2,56 ve güç 0,99) oldu. HLı, hindekstremite iskemi; ISC, iskemik; NISC, iskemik olmayan. 11' den itibaren adapte olunur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4 : Ldır kapiller yoğunluğunu arttırır. (A) 45 gün içinde Sham-ışınlanmış ve ışınlanmış iskemik gasrocnemius kaslarından gelen temsili bölümler-hLi. Kapiller ve miyositler sırasıyla CD31 immünhistokimya ve hematoxylin ile tespit edildi. Ölçek çubuğu, 150 mm. (B) niceliksel analiz, 15 ve 45 Post-hLi günlerde Sham-ışınlanmış iskemik olanlar ile karşılaştırıldığında ışınlanmış iskemik gasronemius kaslarında yüksek kapiller yoğunluğu (kılcal/miyoksit) ortaya çıktı. Karışık ANOVA tarafından takip edilen Bonferroni post-hoc testi, ıSC 'nin içinde yer alan bir faktör ve gün ve ışınlama faktörlerinin arasında (grup başına n = 6 fare) yapılmıştır. Bireysel veri ve anlamına gelir ± SEM gösterilir. P < 0.001; NS, önemsiz. ISC, iskemik; NISC, iskemik olmayan. 11' den itibaren adapte olunur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5: Ldır, teminat yoğunluğunu arttırır. (A) sahte radyasyona ve ışınlanmış fareler Için seçilmiş Rois 'in açıklayıcı görüntüleri. 90 günde ıSC ve NıLC ekstremite Post-HLI gösterilir. Ölçek çubuğu, 300 mm. (B) veriler, ISC EKSTREMITE CVD ARTıŞıNıN nisc birine göreceli yüzdesi olarak temsil edilir. Gün 15 ve 90 Post-HLI, radyasyonlu fareler önemli ölçüde daha yüksek CVD artışı (%) sundu vs. Sham-radyasyonlu fareler. İki yönlü ANOVA, gün ve ışınlama arasındaki konu faktörleri ile Bonferroni post-hoc testi ile yürütülmüştür (grup başına n = 6 fare). Bireysel veri ve anlamına gelir ± SEM gösterilir. * P < 0.05; P < 0.001; NS, önemsiz. HLı, hindekstremite iskemi; ISC, iskemik; NISC, iskemik olmayan. 11' den itibaren adapte olunur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 6 : Ldır, radyasyonlu iskemik gasronemius kaslarından izole edilen ECS 'deki anjiyojenik genlerin ifadesini düzenler. Tek taraflı HLı cerrahi İndüksiyondan sonra, C57BL/6 farelerin her iki arkası da Sham-radyasyona uğramış veya dört günlük kesir olan 0.3 gy ile ışınlanmış, ardışık günlerde ve kurtarılması için izin verildi. 45 gününde Post-HLI, Pro-anjiyojenik faktörlerin ifadesi ve reseptörleri qRT-PCR tarafından sadece ECs 'de değerlendirildi. CD31 için gastrocnemius kas bölümleri lekelendiler. Bireysel endotel CD31 + hücreler görselleştirilmiş, dissected ve lazer mikrodiseksiyon sistemi kullanılarak izole edildi. Her çubuk bir hayvanın göreceli gen ifadesini temsil eder. Beyaz ve gri çubuklar sırasıyla Sham-radyasyon ve ışınlanmış fareler temsil eder. Göreli ifade düzeylerini elde etmek için değerleri 18S normalleştirilmiş. Sonuçları olarak ifade log2 iskemik ve non-iskemik örnekleri arasında kat değişiklikleri radyasyonlu fareler transkriptler göreceli bolluk göstermiştir; Buna karşılık, Sham-radyasyon farelerinde bir aşağı düzenleme görülür. 11' den itibaren adapte olunur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
| Vegfr1_F (5 '-TTGAGGAGCTTTCACCGAACTCCA-3 '); |
| Vegfr1_r (5 '-TATCTTCATGGAGGCCTTGGGCTT-3 '); |
| Vegfr2_F (5 '-AGGCCCATTGAGTCCAACTACACA-3 '); |
| Vegfr2_r (5 '-AGACCATGTGGCTCTGTTTCTCCA-3 '); |
| PDGF-c_F (5 '-ATGCCACAAGTCACAGAAACCACG-3 '); |
| PDGF-c_r (5 '-AAGGCAGTCACAGCATTGTTGAGC-3 '); |
| Met_F (5 '-ACGTTGAAATGCACAGTTGGTCCC-3 '); |
| Met_r (5 '-TTGCGTCGTCTCTCGACTGTTTGA-3 '); |
| Fgf2_F (5 '-ACTCCAGTTGGTATGTGGCACTGA-3 '); |
| Fgf2_r (5 '-AACAGTATGGCCTTCTGTCCAGGT-3 '); |
| Tgfb2_F (5 '-GCTTTGGATGCGGCCTATTGCTTT-3 '); |
| Tgfb2_r (5 '-CTCCAGCACAGAAGTTGGCATTGT-3 '); |
| Ang2_F (5 '-ATCCAACACCGAGAAGATGGCAGT-3 '); |
| Ang2_r (5 '-AACTCATTGCCCAGCCAGTACTCT-3 '); |
| Hgf_F (5 '-GCATTCAAGGCCAAGGAGAAGGTT-3 '); |
| Hgf_r (5 '-TCATGCTTGTGAGGGTACTGCGAA-3 '); |
| 18s_F (5 '-GCCCTATCAACTTTCGATTGGTAGT-3 '); |
| 18s_r (5 '-CCGGAATCGAACCCTGATT-3 '). |
Tablo 1: çalışma için kullanılan astar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CLI murine modelleri çoğunlukla femoral arter ligasyon sadece Profunda femoris orijini distal oluşmuştur 4,5,6,7,8,9. Bu, 7 gün içinde ekstremite kan akışını geri yükler, korunmaz sirkülasyon çoğunu terk göstermiştir 9. Teminat yatağı kaldırılması femoral arter eksizyonu ile elde edilebilir. Ancak, orijinal kan akışının üçte biri kadar en kısa sürede restore edilebilir 7 prosedür sonrası gün, çoğu teminat gemiler iç iliak arter ortaya verilen 7. Lejay et al ortak iliak arter üzerinde gerçekleştirilen ikinci bir ligasyon ile sıralı ligasyonlar önerdi, etkili iç iliak arter tarafından sağlanan teminat perfüzyon azaltarak 4. Bu protokol içinde kritik adımlar sadece inguinal ligament üzerinde sadece dış iliak arter tanımlaması değil, aynı zamanda distal dış iliak ve femoral arterlerin ve damarların ligasyon ve eksizyonu, hangi bir çift amaç hizmet: iskemi şiddetini artırmak yanı sıra modelin teknik tekrarlanabilirlik geliştirmek için, tek başına femoral arter pozlama damar yırtılması genellikle sonuçlanır.
Bu tekniğin bir sınırlaması, arter stenozu ve oklüzyona yol açan aterosklerotik plak ile ilişkili uzun süren işlemden farklı olan ekstremite kan akışının akut kesintidir. Yine de, kan akışının azaltılması 2 hafta sonra da mevcut, kronik iskemi tanısı için kurulan timepoint. Ayrıca, teminat, kronik iskemik ekstremitelerde gözlenen teminat oluşumu sürecini taklit eden tek başına iskemik hakaret ile artırıldı.
İskemik ekstremite neovaskülarizasyon biyolojik olayların karmaşık bir etkileşim içerir, yani, anjiyogenez ve arteriogenesis. Bu protokol, insan toleransındaki en önemli mekanizma olan anjiyojenik çimlenme (kapiller damar yoğunluğu) ve koruyucu damar gelişimi (arteriogenesis) üzerinde Putatif anjiyojenik tedavilerin müdahalesi değerlendirilen çeşitli bulguları içerir ekstremite iskemi alt. Aynı anda, lazer Doppler bu yeni veya genişlemiş damarların fonksiyonunu açığa çıkarmak için kullanılır, ve ilk kez lazer mikrodiseksiyonu için kapillaries ECS toplamak için kullanılır fonksiyonel iyileşme altında yatan moleküler mekanizmaları açıklanması. Bu protokol, hayvanların gelecekte bir klinik bağlamda uygulanabilecek olası anjiyojenik terapilerle tedavi edildiğinde, CLı 'nin bir test standardının etkilerini taklit eden yeniden üretilebilen bir hayvan modeli verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz, sırasıyla Instituto de Medicina moleküler João Lobo Antunes Bioımaging tesis ve Histoloji ve karşılaştırmalı patoloji laboratuvarı başkanları José Rino ve Tânia Carvalho teşekkür ederiz. Ayrıca Nova Tıp Fakültesi/Faculdade de Ciências médicas, Universidade Nova de Lisboa anatomisi bölümünden Vyacheslav Sushchyk teşekkür ederiz.
Finansman referansı: UID/ıC/0306/2016 Fundação para a Ciência e a Tecnologia tarafından finanse edilen proje. Paula de Oliveira, Fundação para a Ciência e Tecnologia 'dan bir burs (SFRH/BD/80483/2011) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7500 Fast Real-Time PCR | Applied Biosystems | Instrument | |
| Acetone | Merk | 1000141000 | Reagent; Caution - highly flammable |
| Adenosine | Valdepharm | Reagent | |
| Atipamezole | OrionPharma | Reagent | |
| Barium sulphate (Micropaque) | Guebert | 8671404 (ref. Infarmed) | Reagent |
| Buprenorphine | RichterPharma | Reagent | |
| Carl Zeiss Opmi-1 FC Surgical Microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| cDNA RT2 PreAMP cDNA Synthesis kit | Qiagen | 7335730 | Reagent |
| Cryostat Leica CM | Leica Microsystems | 3050S | Instrument |
| DAB peroxidase substrate kit | DAKO;Vector Laboratories | K3468 | Reagent |
| hydrogen peroxidase | Merk | 1072090250 | Reagent; Caution - nocif |
| hydrophobic pen | Dako | 411121 | Reagent; Caution - toxic |
| Ketamidor | Richterpharma | CN:580393,7 630/01/12 Dfvf | Reagent |
| Laser Doppler perfusion imager moorLDI2-HIR | MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK | 5710 | Instrument |
| Leica DM2500 upright brightfield microscope | Leica Microsystems | Instrument | |
| Medetor | Virbac | 037/01/07RFVPT | Reagent |
| methanol | VWR | UN1230 | Reagent; Caution - toxic and highly flammable |
| Papaverine | Labesfal | Reagent | |
| Pentano Isso | Merk | 1060561000 | Reagent; Caution - highly flammable |
| Power SYBR® Green | Applied Biosystems | 4309155 | Reagent |
| Purified rat anti-mouse CD31 | Pharmingen | 550274 | Reagent |
| RNeasy Micro kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Surgic-Pro 6.0 | Medtronic (Coviden) | VP733X | Suture |
| VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, Rat IgG) | Vectastain ABC kit; Vector Laboratories | PK-4004 | Reagent |
| Vicryl5.0/ Vicryl 6.0 | Medtronic (Covidien) | UL202/ UL101 | Suture |
| Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection System | Carl Zeiss Microscopy, Germany | 1023290916 | Instrument |
| Stereotaxic microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| Digital camera | Linux | Instrument |
References
- Becker, F., et al. Chapter I: Definitions, epidemiology, clinical presentation and prognosis. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 42 Suppl 2, S4-S12 (2011).
- Fowkes, F. G., et al. Peripheral artery disease: epidemiology and global perspectives. Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 156-170 (2017).
- Abu Dabrh, A. M., et al. The natural history of untreated severe or critical limb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 62 (6), 1642-1651 (2015).
- Lejay, A., et al. A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 49 (2), 205-212 (2015).
- Sprengers, R. W., Lips, D. J., Moll, F. L., Verhaar, M. C. Progenitor cell therapy in patients with critical limb ischemia without surgical options. Annals of Surgery. 247 (3), 411-420 (2008).
- Lotfi, S., et al. Towards a more relevant hind limb model of muscle ischaemia. Atherosclerosis. 227 (1), 1-8 (2013).
- Masaki, I., et al. Angiogenic gene therapy for experimental critical limb ischemia: acceleration of limb loss by overexpression of vascular endothelial growth factor 165 but not of fibroblast growth factor-2. Circulation Research. 90 (9), 966-973 (2002).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
- Brevetti, L. S., et al. Exercise-induced hyperemia unmasks regional blood flow deficit in experimental hindlimb ischemia. Journal of Surgical Research. 98 (1), 21-26 (2001).
- Ministro, A., et al. Low-dose ionizing radiation induces therapeutic neovascularization in a pre-clinical model of hindlimb ischemia. Cardiovascular Research. 113 (7), 783-794 (2017).
- Pereira, A. R., et al. Therapeutic angiogenesis induced by human umbilical cord tissue-derived mesenchymal stromal cells in a murine model of hindlimb ischemia. Stem Cell Research Therapy. 7 (1), 145 (2016).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
