Summary
Hier legen wir ein leicht anwendbares Protokoll vor, um die Speicherstabilität von extrazellulären Bläschen zu beurteilen, einer Gruppe natürlich vorkommender Nanopartikel, die von Zellen produziert werden. Die Vesikel werden als Modellenzym mit Glucuronidase beladen und unter unterschiedlichen Bedingungen gelagert. Nach der Lagerung werden ihre physikalisch-chemischen Parameter und die Aktivität des verkapselten Enzyms ausgewertet.
Abstract
Extrakelluläre Bläschen (EVs) sind vielversprechende Ziele in der aktuellen Forschung, die als Medikamente, Drogenträger und Biomarker eingesetzt werden sollen. Für ihre klinische Entwicklung ist nicht nur ihre pharmazeutische Aktivität wichtig, sondern auch ihre Produktion muss bewertet werden. In diesem Zusammenhang konzentriert sich die Forschung auf die Isolierung von Elektrofahrzeugen, ihre Charakterisierung und ihre Lagerung. Das vorliegende Manuskript zielt darauf ab, ein oberflächliches Verfahren zur Beurteilung der Auswirkungen unterschiedlicher Lagerbedingungen auf Elektrofahrzeuge zu ermöglichen, ohne genetische Manipulation oder spezifische funktionale Untersuchungen. So kann man sich schnell einen ersten Eindruck von der Stabilität von Elektrofahrzeugen unter einem bestimmten Speicherzustand verschaffen und aus verschiedenen Zellquellen abgeleitete Varianten leicht vergleichen. Die Stabilitätsmessung basiert auf den physikalisch-chemischen Parametern der EVs (Größe, Partikelkonzentration und Morphologie) und der Erhaltung der Ladungsaktivität. Letzteres wird durch die Saponin-vermittelte Verkapselung des Enzyms Beta-Glucuronidase in die EVs bewertet. Glucuronidase fungiert als Leihmutter und ermöglicht eine einfache Quantifizierung über die Spaltung eines fluoreszierenden Reportermoleküls. Das vorliegende Protokoll könnte ein Instrument für Forscher bei der Suche nach Speicherbedingungen sein, die die EV-Eigenschaften optimal behalten, um die EV-Forschung in Richtung klinischer Anwendung voranzutreiben.
Introduction
Es handelt sich dabei um membrangebundene Nanopartikel, die von fast allen Zelltypen hergestellt werden. Für Säugetierzellen können Elektroautos in zwei Hauptgruppen mit unterschiedlichen Produktionswegen 1,2 unterteilt werden. Membranbläschen mit einer Größe von ca. 100-1000 nm werden durch direktes Kleben aus der Zellmembran hergestellt. Exosome, die 30-200 nm groß sind, werden von multivesiculären Körpern abgeleitet, die durch innere Einkeimende in Endosomen gebildet werden, die sich anschließend mit der Zellmembran verschmelzen, um mehrere Exosomen auf einmal freizugeben. Die Hauptfunktion dieser Bläschen ist der Transport von Informationen zwischen denZellen 3. Dazu werden Ladungen wie RNA, DNA und Proteine aktiv in sie einsortiert. EVs können eine Vielzahl von Auswirkungen auf ihre Ziele vermitteln, mit Auswirkungen auf Gesundheit und Krankheitszustand. Auf der einen Seite vermitteln sie positive Effekte wie Geweberegeneration, Antigen-Präsentation oder Antibiotika-Effekte, die sie zu günstigen Zielen für ihre Entwicklung als Therapeutika4,5machen. Auf der anderen Seite können Elektrofahrzeuge die Tumorvasskularisierung 6fördern, bei Stressreaktionen 7 zu Nebenwirkung von Gegensenzeneffektenführenund bei Autoimmunerkrankungen 8 und Entzündungskrankheiten 9 eine Rolle spielen. Sie könnten daher eine Schlüsselkomponente für ein besseres Verständnis vieler pathologischer Effekte sein. Das Vorhandensein von veränderten Elektroautos bei vielfältigen Erkrankungen, wie Krebs10, 11,12undHerz-Kreislauf-Erkrankungen 13,und ihre einfache Zugänglichkeit in Blut und Urin macht sie ideal Biomarker. Schließlich machen ihre gute Bioverträglichkeit 14 und ihre ihm innewohnende Targeting-FähigkeitEVs auch für die Medikamentenzufuhr 15 interessant. In diesem Manuskript beschreiben wir ein Protokoll zur Bewertung der Speicherstabilität von Elektrofahrzeugen, die von Säugetierzellen abgeleitet werden, eine wichtige Eigenschaft, die noch wenig erforscht ist.
Für die klinische Entwicklung von Elektrofahrzeugen gibt es noch viele Hindernisse für die Übermontage 16, einschließlich der Bewertung ihrer therapeutischen Wirkungen, Produktion, Reinigung und Lagerung17. Während-80 ° C weithin als Goldstandardfürdie EV-Lagerung 18 angesehen wird, sind die benötigten Gefrierschränke teuer, und die Aufrechterhaltung der benötigten Kühlkette von der Produktion bis zum Patienten kann eine Herausforderung sein. Darüber hinaus deuten einige Berichte darauf hin, dass die Lagerung bei-80 ° C den Elektro-und Restbetrag noch nicht optimal bewahrt und einen Verlust an EV-Funktionalität19,20verursacht. Andere Methoden, wie das Gefriertrocknen 21,22 oder die Spritztrocknung 23, wurden als mögliche Alternativen zur Tiefkühllagerung von Elektrofahrzeugen vorgeschlagen.
Die optimale Möglichkeit, die Speicherstabilität zu beurteilen, wäre, die EVs in funktionellen Assays zu testen oder durch die Auswertung eines bestimmten Markers, zum Beispiel ihrer antibakteriellenAktivität 19. Dies ist möglich, wenn die gewünschte Wirkung der Bläschen bekannt ist und eine bestimmte Gruppe von Elektrofahrzeugen untersucht werden soll. Wenn Elektro-und Zellquellen verglichen werden sollen (z.B. für die Medikamentenverkapselung) oder wenn es keine funktionelle Auslesung gibt, ist es nicht mehr möglich, Veränderungen aufgrund der Lagerung direkt zu beurteilen.
Auf der anderen Seite prognostiziert die einfache Bewertung von Veränderungen ihrer physikalisch-chemischen Parameter, wie Größe, Partikelwiederherstellung und Proteinkonzentration, nicht immer Veränderungen in der EV-Aktivität, wie in einem kürzlichveröffentlichten Patent 20 gezeigt wurde.
Hier stellen wir ein leicht anwendbares Protokoll zur Messung der Lagerstabilität von Elektrofahrzeugen zur Verfügung, indem wir ihre physikalisch-chemischen Parameter in Kombination mit der Aktivität eines verkapselten Beta-Glucuronidase-Enzyms als Ersatz für die Ladung der Elektrofahrzeuge bewerten. Die Belastung des Enzyms erfolgt durch Saponin-Inkubation, eine milde Methode,die mit EVs aus verschiedenen Quellen 21,24,25hergestelltwird. Saponin bildet in der EV-Membran vergängliche Poren, die die Enzymaufnahme in die Bläschen ermöglichen. Da Enzyme dazu neigen, ihre Aktivität zu verlieren, wenn sie ungünstigen Lagerbedingungen ausgesetzt sind, sind sie ein idealer Ersatz für die Bewertung der Erhaltung der Funktionsgüter der Elektrofahrzeuge.
Wir haben gezeigt, dass die Anwendung dieses Protokolls auf alle, die von menschlichen mesenchymalen Stammzellen (MSCs), menschlichen Nabelvein-Endothelzellen (HUVECs) und menschlichen Adenokarzinomen alveolare Epithelzellen (A549) abgeleitet werden, tatsächlich zu großen Unterschieden in der Speicherstabilität zwischen verschiedenen Zelllinien, die bei der Auswahl der EV-Quelle 21 berücksichtigt werden sollte.
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Protocol
1. Zellkultur und die Produktion von zellkonditionierten Medium
- In der Regel werden Zellen unter den für die jeweilige Zelllinie erforderlichen individuellen Bedingungen kultiviert.
- Die Zellen 24-72 h in serumfreien Bedingungen oder in Medium mit EV-abgereichertem fetalen Rinderserum (FBS) für 24-72 h kultivieren.
Hinweis: Wenn EV-erschöpfte FBS verwendet wird, verwenden Sie eine Methode, die nachweislich das Serum effizient erschöpft, um eine Kontamination mit Rinder-Serum-abgeleiteten EVs 26 zu verhindern. - Sammeln Sie das Medium aus den Flaschen. Zentrifuge bei 300 x g für 10 min, um die Zellen zu pustieren. Sammeln Sie vorsichtig das zellkonditionierte Medium (CCM), ohne die Pellezellen zu stören. Am besten nutzen Sie das CCM direkt oder lagern es über Nacht bei 4 ° C.
Hinweis: Es ist immer besser, frisch produzierte CCM zu verwenden. Wenn die Speicherung über längere Zeiträume nicht umgangen werden kann, sollten alle relevanten Parameter nach den MISEV2018-Richtlinien26erfasst werden, wobei die möglichen Vorurteile der erworbenen Ergebnisse zu berücksichtigen sind. - Beispielprotokoll für HUVECs
- Anbau von HUVEC-Zellen für 120 h in EGM-2-Medium, das FBS und andere Nahrungsergänzungsmittel enthält.
- Anbau von HUVEC-Zellen für 48 h im EBM-2-Basalmedium ohne Zusatzstoffe.
- Sammeln Sie das Medium aus den Flaschen und führen Sie den Zentrifugationsschritt wie oben angegeben durch (Schritt 1.3). In der Regel verwenden Sie 100 ml Medium für eine EV-Isolierung.
2. Ultraentrifugation of CCM
- Unmittelbar vor der Ultrakentrifugation (UC), zentrifugen Sie das CCM für 15 Minuten bei 3.000 x g und 4 ° C, um Zellschutt und große Agglomerate zu entfernen.
- Übertragen Sie das Supernatant vorsichtig auf die UC-Rohre. Wenn Sie einen festen Winkelrotor verwenden, markieren Sie die Ausrichtung der Rohre in der Zentrifuge, um das Abrufen des EV-Pellets nach dem UC zu erleichtern. Zentrifuge für 2 h bei 120.000 x g,mit einem k-Faktor von 259,4.
- Nach dem UC den Supernatanten vorsichtig mit einem serologischen Piptier ablegen, um eine Störung der pellenden EVs zu vermeiden.
Achtung: Das Pellet ist unsichtbar. - 200 μL von 0,2 μm gefilterter Phosphat-gepufferten Saline (PBS) in die erste Röhre geben und PBS und das Restsupernatant verwenden, um das Pellet durch Pipetting auf und ab zu reanimieren. Die daraus resultierende EV-Federung auf das nächste Rohr der jeweiligen Probe übertragen und für die Wiederbelebungsrente verwenden. Gehen Sie auf diese Weise fort, um alle EVs der Probe in einem Endvolumen von etwa 300-350 μL wiederzubeleben.
- Nach der Wiedererlangung bestätigen Sie das Vorhandensein von Partikeln durch Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA). Verwenden Sie die Einstellungen, die für den angegebenen EV-Typ optimiert sind, wie die folgenden Einstellungen (Schritt 2.5.1).
Hinweis: Die Papiere von Gardiner et al. 27 und Vestadet al. 28 enthalten wertvolle Informationen darüber, wie die Parameter für die Messung von Elektrofahrzeugen optimiert werden können.- Um die unten beschriebenen Ergebnisse zu reproduzieren, verwenden Sie Instrumente (z.B. NanoSight LM14), die mit einem grünen Laser ausgestattet sind. Nehmen Sie drei Videos von 30 s mit einem Bildschirmgewinn von 1,0 und einem Kamerastand von 13 auf. Für die Analyse verwenden Sie einen Bildschirmgewinn von 1,0 und eine Erfassungsschwelle von 5.
- Verwenden Sie das Pellet sofort, wenn möglich; Ansonsten bei 4 ° C über Nacht lagern.
3. Glucuronidase-Verkapselung in EVs
- In das wiederaufgebrachte Pellet, Beta-Glucuronidase (10 mg/mL in PBS) zu einer Endkonzentration von 1,5 mg/mL und Saponin (10 mg/mL in H2 O)zu einer Endkonzentration von 0,1 mg/mL hinzufügen. Gut vermischen durch Wirbeln für 3 s.
- Inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur mit durchmischtem Mischen durch sanftes Flimieren der Röhre. Nach der Inkubation direkt durch die Größe-Ausschlusschromatographie (SEC) reinigen (siehe Abschnitt 5).
Hinweis: Glucuronidase-Proben nach dem Auftauen nicht wieder einfrieren, um eine Enzymabbauung durch das Einfrieren zu verhindern.
4. Liposomproduktion
- Zur Vorbereitung der Liposome für den Vergleich mit Elektrofahrzeugen, 1, 2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (DMPC) und 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (DPPC) in einer 2:3 Molarenform in Chloroform auf eine Endkonzentration von 5 mM auflösen. Bereiten Sie 1 mL Aliquots in Hochleistungs-Flüssigchromatographien (HPLC) vor und lassen Sie sie über Nacht zu einem Lipidfilm trocknen.
CAUTION: Chloroform ist giftig und vermutet, dass es sich um eine Cancerogenik handelt. TNeine Vorsichtsmaßnahmen bei der Handhabung. - Die Lipidfolie mit 1 mL PBS mit 1,5 mg/mL Glucuronidase erniedrigen. Die Extrudermontage auf 42 ° C erhitzen und die Lipidaufhängung 11x durch eine 200 nm Polycarbonatmembran extrudieren. Direkt durch SEC reinigen (siehe Abschnitt 5).
5. Reinigung durch SEC
- Bereiten Sie die SEC-Spalte mit dem folgenden Protokoll vor.
- Verwenden Sie nur frisches gereinigtes Wasser und frisch zubereitete Puffer. Alle Puffer durch einen 0,2 μm Membranfilter filtern und entgas geben, um die Bildung von Luftblasen in der Säule zu verhindern.
- Für die Herstellung einer SEC-Säule verwenden Sie eine agarose Gel-Filtrationsmatrix (z.B. Sepharose Cl-2b) oder ein anderes SEC-Medium, das geeignet ist, Elektro-und Liposome von Proteinverunreinigungen und überschüssigem Enzym zu trennen. Entfernen Sie zunächst die 20% EtOH-Lösung, in der das Medium gespeichert ist, um eine Luftblasenbildung in der Säule zu verhindern. Zu diesem Zweck zentrifugen Sie das SEC-Medium bei 3.000 x g für 10 min, entfernen Sie die EtOH und ersetzen Sie es durch entgiftetes Wasser.
- Füllen Sie eine Glassäule (mit einem Innendurchmesser von 10 mm) mit dem SEC-Medium auf die 15 mL-Marke.
Hinweis: Die Lautare unterscheiden sich bei Spalten mit unterschiedlichen Abmessungen. Achten Sie darauf, dass sich das Gel vollständig ansiedeln lässt. - Vor einem Durchlauf die Spalte mit mindestens zwei Spaltenbänden PBS ausgleichen. Um die Säule zu lagern, waschen Sie sie zuerst mit einem Säulenvolumen Wasser, gefolgt von mindestens zwei Säulenbänden von 20% EtOH. Nach der Lagerung die Säule zuerst mit einem Säulenvolumen Wasser waschen, bevor Sie mit PBS ausgleichen.
- Verwenden Sie bis zu 400 μL EV oder Liposomaufhängung in einer Trennung. Sammeln Sie Bruchteile von 1 mL. Nach SEC lagern Sie entweder die gereinigten Elektrofahrzeuge (siehe Abschnitt 7) oder unterziehen sie einem Glucuronidase-Test (siehe Abschnitt 6).
- Bestätigen Sie die Trennung von Elektro-und Liposomen von kontaminierenden Proteinen und freier Glucuronidase. Dazu korrelieren die Partikelkonzentrationen der gesammelten Bruchteile mit der Proteinkonzentration und der Glucuronidase-Aktivität.
- Die Partikelkonzentration durch NTA bewerten (siehe 2.5)
- Bewerten Sie den Proteingehalt anhand von Bicinchoninsäure-Assay (BCA) oder einem anderen geeigneten Proteinquantifizierungs-Test. Führen Sie den Test nach dem Herstellerprotokoll durch.
- Bewerten Sie die Glucuronidase-Aktivität durch Glucuronidase-Assay (siehe Abschnitt 6).
- Bewerten Sie optional die EV-Morphologie durch die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und die Rasterelektronenmikroskopie (SEM).
- Für die Vorbereitung von TEM-Proben, 10 μL EV-Aufhängung in ein TEM-Gitter, Inkubat für 10 min, und dann mit einem Filterpapier überschüssige Flüssigkeit wegzublättern. Führen Sie die Fixierung für 10 min mit 10 μL von 4% Paraformaldehyd und blot away von überschüssigem. 3x mit Wasser waschen. Mit 30 μL von 1% Phosphor-Zungsiesäure-Hydrat werden die Bläschen um 20 s inkubiert. Nach dem Abblenden die Exzesse, trocknen Sie die Bläschen über Nacht. Visualisieren durch TEM.
CAUTION: Phospho-Täsensäure ist hochgradig ätzend; So schützen Haut und Augen. - Für SEM die zuvor vorbereiteten TEM-Proben auf Carbon-Scheiben fixieren und mit einer 50 nm dicken Goldschicht ausspülen. Visualisieren durch SEM.
- Für die Vorbereitung von TEM-Proben, 10 μL EV-Aufhängung in ein TEM-Gitter, Inkubat für 10 min, und dann mit einem Filterpapier überschüssige Flüssigkeit wegzublättern. Führen Sie die Fixierung für 10 min mit 10 μL von 4% Paraformaldehyd und blot away von überschüssigem. 3x mit Wasser waschen. Mit 30 μL von 1% Phosphor-Zungsiesäure-Hydrat werden die Bläschen um 20 s inkubiert. Nach dem Abblenden die Exzesse, trocknen Sie die Bläschen über Nacht. Visualisieren durch TEM.
6. Glucuronidase Assay
- Um einen Vergleich zwischen verschiedenen Proben und Lagerbedingungen durch die Korrelation von Partikelzahl und Enzymaktivität zu ermöglichen, messen Sie zunächst die Partikelkonzentration der Probe durch NTA (siehe Schritt 2.5).
- Bereiten Sie eine funktionierende Lösung für Fluorescein di-β-D-Glucuronide vor, indem Sie 1 μL der Verbindung (10 mg/mL in H2 O)auf 199 μL von PBS hinzufügen. Um eine endgültige Konzentration von 8,3 μg/mL zu erhalten, können Sie 25 μL dieser Lösung auf 125 μL gereinigte Elektroautos hinzufügen. Die Probe in eine schwarze 96-Wellplatte pikieren. Messen Sie den Zeitpunkt 0 h mit einem Plattenleser, mit 480 nm als Anregung und 516 nm als Emissionswellenlänge.
- Die Platte fest bedecken (z.B. mit transparenter Kunststofffolie, die für PCR-Platten verwendet wird), um die Verdunstung zu minimieren und im Dunkeln 18 h bei 37 ° C zu inkubieren. Messen Sie die Fluoreszen-Produktion mit den in Schritt 6.2 aufgeführten Plattenleserparametern.
7. Lagerung von Elektro-und Liposomen
NOTE: Für alle Speicherzwecke ist es ratsam, mit niedrig bindenden Rohren den EV-Verlust durch Adsorption zu reduzieren.
- Befolgen Sie die Parameter in diesem Abschnitt, um die unten angegebenen repräsentativen Ergebnisse zu reproduzieren. Verwenden Sie Proben, die aus 400 μL EV-Aufhängung bestehen.
- Bei 4 ° C oder-80 ° C aufbewahren oder zu den unten aufgeführten Schritten gehen.
- Lyophilize die EVs.
- Trehalose (40 mg/mL in H2 O)bis zu einer Endkonzentration von 4 mg/mL zu den gereinigten Elektrofahrzeugen hinzufügen. Die Proben bei-80 ° C mindestens 1 Stunde einfrieren.
- Lyophilisieren Sie die Proben mit den folgenden Parametern. Für die Haupttrocknung die Regaltemperatur auf 15 ° C und den Druck auf 0,180 mbar stellen und die Proben 46 h trocknen lassen. Für die abschließende Trocknung die Regaltemperatur auf 25 ° C und den Druck auf 0,0035 mbar stellen und die Proben 2 Stunden trocknen lassen.
- Um die Proben zu rehydrieren, fügen Sie H2 O hinzu, was der Menge der EV-Aufhängung entspricht, die am Anfang vorhanden ist (typischerweise 400 μL). Verwenden Sie keinen Puffer für die Rehydratation.
8. Analyse nach der Lagerung
- Um die Enzymaktivität zu beurteilen, entfernen Sie zuerst die freie Glucuronidase, die während der Lagerung aus dem EVs durchgesickert sein kann. Dies wird durch einen zusätzlichen Reinigungsschritt erreicht, der entweder von SEC (siehe Schritt 5) oder asymmetrischer Strömungsfeldfraktionierung (AF4) durchgeführt wird (siehe Schritt 8.1.2).
Hinweis: Bitte beachten Sie, dass beide Methoden zu einer Verdünnung der EV-Probe führen; Verwenden Sie also ausreichend EV-Konzentrationen vor der Speicherung, um zu vermeiden, dass Sie sich unterhalb der NTA-Quantifizierungsgrenze bewegen. Erwarten Sie eine 1:10 Verdünnung der Partikel durch SEC oder AF4.- Für die SEC-Reinigung folgen Sie dem oben beschriebenen Protokoll (siehe Abschnitt 5).
- Die AF4-Reinigung durchführen.
- Das Instrument mit einem kleinen Kanal mit einem 350 μm-Abstandshalter und einer 30 kD-Molekularen Gewichtsabschnitt-Zellulose-Membran einrichten. Legen Sie einen 0,1 μm Porengrößenfilter zwischen der HPLC-Pumpe und dem AF4-Kanal. Verwenden Sie frisch zubereitete 0,1 μm gefilterte PBS als mobile Phase, um die Partikelbelastung und Geräusche in den lichtstreubenden Detektoren zu reduzieren.
- Erkennen Sie Proteine mit einem UV-Detektor auf 280 nm. Um Partikel zu erkennen, verwenden Sie die Mehrwinkellichtstreuung mit dem Laser-Set auf 658 nm.
- Verwenden Sie die folgende Laufmethode. Vorfokus für 1 min mit einem Fokusfluss von 1 mL/min; Dann 300 μL der Probe mit einer Geschwindigkeit von 0,2 mL/min einspritzen und den Fokusfluss 10 min hochhalten. Nach der Injektion wird die Probe bei 1 mL/min bei einem Kreuzfluss, der von 2 mL/min auf 0,1 mL/min im Verlauf von 8 min abnimmt, abgeltzt. Sammeln Sie Bruchteile von 1 mL, beginnend nach 12,5 min und fortgesetzt bis 27 Minuten.
- Führen Sie den Glucuronidase-Test wie oben beschrieben durch (siehe Abschnitt 6).
- Um die Größe und Konzentration zu beurteilen, verwenden Sie die NTA wie oben beschrieben (siehe Schritt 2.5).
- Optional können TEM und SEM durchgeführt werden, um die Morphologie des EVitens nach der Lagerung zu beurteilen (siehe 5.3).
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt die Speichereigenschaften von von HUVECs isolierten Elektrofahrzeugen. Die EVs wurden von UC isoliert, die Glucuronidase gekapselt, und nach SEC wurden die gereinigten Elektrofahrzeuge von NTA auf ihre physikalisch-chemischen Eigenschaften hin bewertet. Eine Probe der Bläschen wurde anschließend einer AF4-Reinigung unterzogen und die Glucuronidase-Aktivität gemessen.
Die Bläschen wurden dann für 7 d bei 4 ° C oder-80 ° C und bei 4 ° C in lyophilisierter Form gelagert, im letzteren Fall mit 4% Trehalose. Nach der Lagerung wurden die Bläschen wieder von NTA gemessen, und nach AF4 wurde die verbleibende Glucuronidase-Aktivität pro Partikel bewertet.
Das Arbeitsprinzip von AF4 basiert auf der Kombination von laminarischem Fluss und orthogonalem Querfluss durch die poröse Membran am unteren Rand des AF4-Kanals, der die Partikel je nach Größe differenziert beeinflusst (Abbildung2). Größere Partikel befinden sich meist näher an der Membran, während sich kleinere Partikel weiter oben im Kanal befinden. Durch das Parabolflussprofil des Laminarflusses bewegen sich Partikel weiter von der Membran entfernt schneller in Richtung Detektor, was zu einer Partikeltrennung nach Größe führt. In einem typischen AF4-Experiment werden die injizierten Partikel zunächst auf die Membran fokussiert, indem ein Querfluss ohne Längsfluss durch den Kanal aufgetragen wird (Abbildung 2A). Nach der Injektion und Fokussierung beginnt die Lösung mit einem gleichzeitigen Auftragen eines Querflusses und eines Längsflusses, um die verschiedenen Teilchen (Abbildung 2 B), die in unserem Fall EVs und freie Glucuronidase waren, zu zerbrechen und zu lösen.
Abbildung 3 veranschaulicht die Trennung von Nanopartikeln (EEDs oder Liposomen) von kontaminierenden Proteinen und nicht verkapselten Glucuronidase. Das SEC-Elassprofil der Liposome(Abbildung3 A), das nach der Zubereitung gereinigt wurde (siehe Abschnitt 4 des Protokolls), zeigte die Trennung der Partikel mit verkapselter Glucuronidase vom freien Enzym, das sowohl durch BCA-Test als auch durch BCA-Test nachgewiesen wurde. Enzymaktivität. Im vorliegenden Beispiel würden für weitere Experimente Bruchteil 6 und 7 ausgewählt, da sie die höchsten Partikelkonzentrationen enthielten und mögliche Verunreinigungen mit freier Glucuronidase verhindern. AF4 war auch erfolgreich bei der Trennung von Elektro-und Freifleckungen, wie sie in Abbildung3B gezeigtwurden, mit einem höheren Grad an Trennung als SEC, wodurch die Kontamination der Bläschen weniger wahrscheinlich wurde.
In Abbildung4 wurde ein Kontrollversuch durchgeführt, um sicherzustellen, dass die für die Bläschen gemessene Enzymaktivität tatsächlich mit der Verkapselung der Glucuronidase in Elektroautos verbunden und nicht durch Enzymaggregate verursacht wurde. Diese Aggregate könnten durch die Inkubation der Glucuronidase mit Saponin entstanden sein und zu falschen positiven Ergebnissen führen. Um die Bruchteile zu überprüfen, in denen Vesikel austreten würden, wurden gereinigte Elektroautos ohne verkapselte Glucuronidase SEC auf der gleichen Säule wie die Probe, die nur Saponin und Enzym enthielt, ausgesetzt.
Wenn die Glucuronidase mit Saponin inkubiert und anschließend von SEC gereinigt wurde, wurde in den Bruchteilen, die in der Regel EVs enthalten, keine Enzymaktivität gefunden. Während kleine Mengen von Partikeln gefunden wurden, um zur gleichen Zeit wie EVs zu entweichen (die lt;0.1% der Partikel aus einem typischen EV-Pellet zurückgewonnen), gab es keine korrelationsbezogene Enzymaktivität. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das aktive Enzym, das sich in den Bläserfraktionen erholt hat, in ihnen eingekapselt wurde.
Abbildung 5 vergleicht die Rückgewinnung des aktiven Enzyms nach der Lagerung mit oder ohne zusätzliche AF4-Reinigung, um nicht verkapselten Farbstoff zu entfernen. Bei der AF4-Reinigung gibt es in der Regel eine geringere Genogenerierung pro Partikel, mit der höchsten Wirkung für die Lagerung bei 4 ° C, wo die Erholung um zwei Drittel sinkt. So kann der Weglassen dieses zusätzlichen Reinigungsschrittes zu falschen Annahmen über die Enzymstabilität führen.
Abbildung 6 zeigt die Wirkung der Lyophilisierung ohne Kryooprotektionsmittel auf Vesikel, die von MSCs, A549 Zellen und Liposomen abgeleitet werden, verglichen mit dem Einfrieren bei-80 ° C. Die Partikel wurden von TEM und SEM wie oben beschrieben abgebildet (siehe Schritt 5.3 des Protokolls). Die MSCs und A549 EVs zeigten keine großen Formunterschiede in TEM-Bildern und verglichen die beiden Lagerbedingungen. In den SEM-Bildern zeigten die lyophilisierten Proben jedoch Aggregate, die in den-80 ° C-Proben nicht zu finden waren. Liposome zeigten auch Aggregate im SEM-Bild, während bei TEM die Lyophilisierung eine Größensteigerung von Liposomen zu bewirken schien. Die Lyophilisierung ohne Kryodoprotektionsmittel reduzierte auch die Rückgewinnung der intakten Glucuronidase nach der Lagerung (Abbildung 7). Durch die Zugabe von Trehalose als Kryodektivant wurde die Genesung des aktiven Enzyms dosisabhängig erhöht.
Abbildung 8 zeigt die Umwandlung von Fluorescein di-β-D-Glucuronid in freie Fluoreszenz, die im Glucuronidase-Test stattfindet. Während das Erziehungsgehren mit 516 nm nicht fluoreszierend war, ist Fluoreszin auf dieser Wellenlänge stark fluoreszierend. Dies ermöglichte einen einfachen Enzym-Aktivitäten-Test mit hoher Empfindlichkeit.
Bild 1 : Lagerstabilität von HUVEC EVs. (A) Partikelrückgewinnung im Vergleich zur Vorspeicherung, (B) Mittelgröße, und (C) die normalisierte Glucuronidase-Aktivität pro Partikel von EVs isoliert von HUVECs. Die Bläschen wurden für 7 d bei 4 ° C und-80 ° C und bei 4 ° C nach der Lyophilisierung mit 4% Trehalose gelagert. Die mittlere Größe und die Partikelwiederherstellung wurden durch NTA gemessen; Die Glucuronidase-Aktivität pro Partikel wurde berechnet, indem die UTA-Daten und die Ergebnisse des Glucuronidase-Tests kombiniert und vor der Speicherung normalisiert wurden. Mean ± SD, n = 3, *p < 0.05 (One-way ANOVA, gefolgt von Tukey es Post-hoc-Test). Von Frank et al. 21. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Bild 2 : Arbeitsprinzip der AF4. (A) EVs und freie Glucuronidase werden nach der Injektion durch einen Querfluss fokussiert. (B) Danach werden Elektro-und Freienzyme separat durch die Kombination des Durchflusses durch den Kanal mit einem Querfluss ausgelöst. Von Frank et al. 21. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Bild 3 : Trennung von Elektro-und Liposomen von freier Glucuronidase. A) repräsentative SEC-Trennung von Glucuronidase-belasteten Liposomen, freier Glucuronidase und Proteinverunreinigungen. Die Grafik zeigt die Partikelkonzentration (rot), die Proteinkonzentration (blau) und die Glucuronidase-Aktivität (grün). B) Demonstration der Trennung von Elektrofahrzeugen von freier Glucuronidase. Unbehandelter Unwesen, EVs, die mit 0,05 mg/mL Glucuronidase, freier Glucuronidase (0,5 mg/mL) und mit Glucuronidase beladen und von SEC (EV-Glucuronidase) gereinigt und gereinigt wurden, wurden mit UV mit 280 nm und 90 ° Lichtstreuung injiziert und analysiert. Freies Enzym, das getrennt von der EVs elüsiert. Von Frank et al. 21. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Bild 4 : Steuerungsexperimente zur Reinigung von Elektrofahrzeugen aus freier Glucuronidase. 400 μL von einheimischen EVs oder 400 μL von 1,5 mg/mL Glucuronidase in PBS inkubiert für 10 min mit 0,1 mg/mL Saponin wurden von SEC gereinigt.A) Partikelkonzentrationen der gesammelten Bruchteile von Bläschen und Glucuronidase bzw. der Enzymaktivität der Die gereinigte Glucuronidase. B) UV-Absorption bei 280 nm, gemessen im selben Experiment. Der erste kleine Peak für Glucuronidase entspricht der grauen Linie inder Platte A. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Bild 5 : Die Wirkung zusätzlicher Reinigungsschritte nach der EV-Speicherung. Restaktivität pro Partikel im Vergleich zu d0 mit oder ohne zusätzlichen AF4-Reinigungsschritt nach der Lagerung. HUVEC EVs wurden für 7 d bei 4 ° C oder-80 ° C gelagert und mit 4% Trehalose lyphilisiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Bild 6 : TEM und SEM-Bilder von EVs. TEM und SEM-Bilder von Elektroautos aus (A) MSCs und (B) A549 Zellen und (C) Liposomen. Die Proben wurden für 14 d bei-80 ° C gelagert oder ohne Trehalose lyphilisiert. Pfeile zeigen das Vorhandensein von morphologisch veränderten Partikeln in den TEM-Bildern und Aggregaten in den SEM-Bildern. Von Frank et al. 21. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Bild 7 : Die Wirkung von Trehalose auf die Enzym-Erholung nach der Lyophilisierung. Vergleich der Enzymaktivität nach der Lyophilisierung für 14 Tage, mit 0%, 1% und 4% Trehalose mit der Probe vor der Lagerung (0 Tage). Von Frank et al. 21. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Bild 8 : Die enzymatische Spaltung von Fluoreszein di-β-D-Glucuronid Die Glucuronidase. Im Schema wird die Reaktion, die der Erkennung von Glucuronidase zugrunde liegt, erläutert. Nicht fluoreszierendes Fluoreszenzfluoreszum di-β-D-Glucuronid wird durch Glucuronidase geklebt. Durch die Entfernung der Zuckerrückstände gewinnt Fluoreszin seine fluoreszierenden Eigenschaften zurück. Die Fluoreszenz, die nach der Inkubationszeit gemessen wird, korreliert mit der Menge des vorhandenen aktiven Enzyms und ist die Auslesung des Glucuronidase-Assays. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
In diesem Manuskript stellen wir ein umfassendes Protokoll vor, um die Stabilität von Elektrofahrzeugen unter verschiedenen Lagerbedingungen zu untersuchen. Mit der Kombination aus verkapselter Glucuronidase als funktioneller Auslesung und der Auswertung der physikalisch-chemischen Parameter der EVs ermöglicht das Protokoll eine einfache Speicherstabilitätsbewertung von Elektroautos und den Vergleich von Elektrofahrzeugen aus verschiedenen Zellen text. SEM und TEM als komplementäre Methoden ermöglichen einen Einblick in Veränderungen des EVitens auf der Einteilchenebene. Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigten eine Tendenz der EVs und Liposome, sich aufgrund der Lyophilisierung ohne Kryooprotektionsmittel zu aggregieren (Abbildung6). Das wurde aber erst in den SEM-Experimenten beobachtet. Während die EM-Bildgebung nicht mit Proben durchgeführt wurde, die mit Trehalose aufbewahrt wurden, deutet die Literatur darauf hin, dass dieses Kryockectanttatsächlichdie Aggregation von EVs 29 reduzieren könnte. Es ist auch möglich, zu beurteilen, ob eine bestimmte Speicherbedingung die EV-Größe, die Wiederherstellungsrate und die verkapselten Moleküle differenziert beeinflusst. Ein solcher Effekt wird durch die Ergebnisse für HUVEC-EALs (Abbildung 1) veranschaulicht. Während die Partikelwiedergewinnung bei 4 ° C und-80 ° C besser war als bei den lyophilisierten Proben, war die Rückgewinnung der aktiven verkapselten Glucuronidase für die lyophilisierten Proben am besten geeignet. Die Lyophilisierung von Elektrofahrzeugen könnte der günstigere Lagerzustand sein, zum Beispiel bei der Analyse von UV-Biomarkern, bei denen der Fokus mehr auf der Gewinnung und Erhaltung intakter Ladung als auf intakten Bläschen liegt.
In ihrem jüngsten Beitrag über die Lyophilisierung von EVs22 verfolgteCharoenviriyakul et al. einen vergleichbaren Ansatz. In Bezug auf die physikalisch-chemischen Parameter konzentrierten sie sich auf den Polydispersitätsindex (PDI) und das Zeta-Potenzial, da Veränderungen des Zeta-Potenzials mit einer reduzierten kolloidalen Stabilität korrelieren können. Das Zeta-Potenzial kann jedoch nicht allein zu beobachtenden Veränderungen in der Stabilität30erklären, die sich auch in ihren Ergebnissen niederschlagen. Sie verglichen auch den Protein-und RNA-Gehalt der gespeicherten EVs mit Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese. Diese Technik kann sehr gut auf wesentliche Veränderungen im Protein-oder RNA-Gehalt der Vesikel hindeuten. Es erfordert aber viel größere Mengen an Material als die hier vorgestellte Methode. Um die Wirkung der Lagerung auf die UV-Fracht zu beurteilen, drückte Charoenviriyakul et al. heterologisch ein Enzym und DNA-Arten in ihrer EV-Herstellerzelllinie aus und überwachte ihre Aktivität und Integrität in den EVs. Ein solcher heterologischer Ausdruck ist jedoch nicht geeignet, wenn Elektroautos aus verschiedenen Quellen verglichen werden sollen, da er für jede neue Zelllinie eine erhebliche Zeit benötigt, während die einfache Saponin-vermittelte Verkapselung leicht angewendet werden kann.
Es ist wichtig, ein nicht gekapseltes Enzym zu entfernen, wie in Abbildung3 gezeigt. Die mit EV-gekapselten Glucuronidase reagiert mit ihrem Substrat viel langsamer als das freie Enzym in der Lösung, was zu einer Überschätzung der Verkapselungseffizienz führt. Eine saubere Trennung ist besonders wichtig für die Analyse nach der Lagerung, da die Lagerbedingungen die Aktivität der freien Glucuronidase in der Probe unterschiedlich beeinflussen und zu Leckagen durch beschädigte Elektrogeräte führen können. Dies wurde in unseren Experimentendeutlich (Abbildung5), wie die Anwendung von AF4 vor dem Glucuronidase-Test es schaffte, Farbstoff zu entfernen, die nicht in den Bläschen eingekapselt sind. So ermöglichte es, klare Ergebnisse über die Wirkung der hier diskutierten Speichermethoden zu erzielen, während ohne AF4 der Aktivitätsverlust durch die Lagerung unterschätzt worden wäre.
Eine weitere wichtige Überlegung ist die Isolierung und Charakterisierung der zu prüfenden EVs auf ihre Stabilität. Obwohl die beschriebene Technik den Vergleich von Elektrofahrzeugen aus verschiedenen Quellen ermöglicht, ist dies nur möglich, wenn sie alle mit der gleichen Isolationsmethode vorbereitet sind, so dass die Ergebnissenicht 18,31,32verzerrtwerden. In diesem Zusammenhang müssen auch die Bedingungen der Zellkultur berücksichtigt werden, da sie die Menge und die Bioaktivität der isolierten EVs 33 beeinflussen können. Um Ergebnisse zu erhalten, die mit anderen veröffentlichten Ergebnissen verglichen werden können, ist es ratsam, die kürzlich aktualisierten "Minimal-Informationen für Studien über extrazelluläre Bläschen" zu konsultieren, die Richtlinien fürdie Harmonisierung der EV-Forschung 26 enthalten.
In dem hier vorgestellten Protokoll haben wir SEC oder AF4 verwendet, um das freie Enzym nach der Speicherung zu entfernen. Es könnten andere Methoden angewendet werden, wie die Gradientenultraktrifugation, UC oder Ultrafiltration34. Im Vergleich zu Zentrifugalmethoden sind SEC und AF4 weniger zeitaufwendig (z.B. ca. 1,5 Stunden für SEC inklusive Säulengleichgewicht versus bis zu 16 Stunden oder mehr für Gradienten UC) und sie können im Vergleich zum normalen UC freie Proteine vollständig vom EV trennen, wo Es bleibt immer Restsupernatant mit dem Pellet. Darüber hinaus sind SEC 15 und AF435 milde Methoden, die weniger Scherspannung auf den Elektro-und Scheren verursachen. Im Vergleich dazu könnten die Kräfte, die während des UC den Elektrofahrzeugen auferlegt werden, zu Veränderungen der Teilchen führen, wie zum Beispiel Aggregationen und Veränderungen in der Größe34, 36.
Ein Nachteil von SEC und AF4 ist die Verdünnung der Proben. Daher ist es erforderlich, genügend EVs zu isolieren, um die für NTA-Messungen erforderlichen Konzentrationen nach mehreren Reinigungsschritten zu erhalten. EV-Brüche können mit Zentrifugalfiltern konzentriert werden, aber je nach Filtermaterial und Protokoll kann es zu einem Verlust von Vesikeln 37kommen.
Die Einschränkung des hier diskutierten Protokolls besteht darin, dass es nur die Enzymaktivität der exogen verkapselten Glucuronidase überwacht, wobei weder die verkapselte RNA und DNA noch die EV-Oberflächenproteine berücksichtigt werden, die für die Funktionalität wichtig sein könnten 18 . Für die Erforschung neuer EV-Therapeutika kann diese Technik nicht die Funktionsstörungen ersetzen, sondern sie ergänzen und einen Hinweis auf die Bläserstabilität geben. Es könnte von großem Nutzen sein, wenn zum Beispiel von Biofluiden abgeleitete EVs für eine spätere Analyse ihres Blätteninhalts gespeichert werden sollen.
In Zukunft könnte der Anwendungsbereich dieses Protokolls auch auf EVitale erweitert werden, die von anderen Organismen abgeleitet werden, zum Beispiel bakterielle äußere Membranbläschen. Ein weiterer interessanter nächster Schritt wäre, die Verkapselung von Nukleinsäuren durch Saponin-Inkubation zu testen und auch die Stabilität von DNA oder RNA-Ladungen zu untersuchen.
Zusammenfassend bietet dieses Verfahren eine einfache Methode zur Beurteilung der Speicherstabilität von Elektrofahrzeugen aus verschiedenen Säugetierzellquellen, indem sowohl ein physikalisch-chemisches als auch ein funktionelles Auslesen integriert werden. Dieses detaillierte Protokoll ermöglicht es den EV-Forschern, die geeigneten Lagerbedingungen für ihre Bläschen zu bestimmen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Das NanoMatFutur Junior Research Programm des Bundesministeriums für Bildung und Forschung (Fördernummer 13XP5029A) unterstützte diese Arbeit. Maximilian Richter wurde von der Studienstiftung des Deutschen Volkes durch ein Promotionsstipendium unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC) | Sigma-Aldrich | P2663-25MG | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC) | Sigma-Aldrich | P4329-25MG | |
| 225 cm² cell culture flasks | Corning | 431082 | Used with 25 ml of medium |
| 30 kDa regenerated cellulose membrane | Wyatt Technology Europe | 1854 | |
| 350 µm spacer | Wyatt Technology Europe | ||
| Automated fraction collector | Thermo Fisher Scientific | ||
| Beta-glucuronidase | Sigma-Aldrich | G7646-100KU | |
| Chloroform | Fisher scientific | C/4966/17 | |
| Column oven | Hitachi High-Technologies Europe | ||
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T9531-10G | |
| DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector | Wyatt Technology Europe | ||
| Durapore Membrane filter, PVDF, 0,1 µm, 47 mm | Merck | VVLP04700 | Used for the preparation of buffers for AF4 |
| EBM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3156 | Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells |
| Eclipse dualtec | Wyatt Technology Europe | ||
| EGM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3162 | Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells |
| ELISA Plate Sealers | R&D Systems | DY992 | used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay |
| Ethanol | Fisher scientific | E/0665DF/17 | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids | 610000-1EA | |
| Filter support | Avanti Polar Lipids | 610014-1EA | used for liposome preparation |
| Fluorescein di-β-D-glucoronide | Thermo Fisher Scientific | F2915 | |
| Gibco PBS-tablets+CA10:F36 | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | |
| Hettich Universal 320 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Used for pelleting cells at 300 g | |
| Hettich Rotina 420 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Used for pelleting larger debris at 3000 g | |
| HUVEC cells | Lonza Verviers, S.p.r. | C2517A | |
| Kimble FlexColumn 1X30CM | Kimble | 420401-1030 | |
| Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC | Christ | ||
| Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR international | 525-0255 | the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery |
| Nanosight LM14 equipped with a green laser | Malvern Pananalytical | ||
| Nanosight-software version 3.1 | Malvern Pananalytical | ||
| Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes | Whatman/GE Healthcare | 110406 | used for liposome preparation |
| PEEK Inline filter holder | Wyatt Technology Europe | ||
| Phosphotungstic acid hydrate | Sigma-Aldrich | 79690-25G | |
| Polycarbonate bottles for ultracentrifugation | Beckman Coulter | 355622 | |
| QuantiPro BCA Assay Kit | Sigma-Aldrich | QPBCA-1KT | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15 | Carl Zeiss AG | ||
| Sepharose Cl-2b | GE Healthcare | 17014001 | |
| SEM copper grids with carbon film | Plano | S160-4 | |
| Small AF4 channel | Wyatt Technology Europe | ||
| Sputter-coater Q150R ES | Quorum Technologies | ||
| Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011 | Oxford Instruments | ||
| Type 45 Ti ultracentrifugation rotor | Beckman Coulter | 339160 | |
| Ultimate 3000 Dionex autosampler | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex isocratic pump | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K | Beckman Coulter | ||
| UV detector | Thermo Fisher Scientific | ||
| Whatman 0.2 µm pore size mixed cellulose filter | Whatman/GE Healthcare | 10401712 | Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC |
References
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