Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

הערכת יציבות האחסון של שלפוחיות ומסחטות

Published: May 22, 2019 doi: 10.3791/59584
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Helmholtz Institute for Pharmaceutical Research Saarland (HIPS), Helmholtz Centre for Infection Research (HZI), Biogenic Nanotherapeutics group (BION), 2Department of Pharmacy, Saarland University

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול החלים בקלות כדי להעריך את יציבות האחסון של שלפוחיות ומסחטות, קבוצה של חלקיקים המתרחשים באופן טבעי המיוצר על ידי תאים. שלפוחיות הם טעונים עם glucuronidase כאנזים מודל מאוחסן בתנאים שונים. לאחר האחסון, הפרמטרים הפיזיקליים שלהם והפעילות של האנזים שעברו האנקפסולציה מוערכים.

Abstract

שלפוחיות שלפוחית (EVs) הם מטרות מבטיחות במחקר הנוכחי, לשמש סמים, סוחרי סמים, ו בסמנים. עבור הפיתוח הקליני שלהם, לא רק פעילות התרופות שלהם חשוב, אלא גם הייצור שלהם צריך להיות מוערך. בהקשר זה, המחקר מתמקד בבידוד של EVs, האפיון שלהם, האחסון שלהם. כתב היד הנוכחי שואפת לספק הליך נתיישב להערכת ההשפעה של תנאי אחסון שונים ב-EVs, ללא מניפולציה גנטית או assays פונקציונלי ספציפי. זה מאפשר במהירות לקבל רושם ראשוני של היציבות של EVs תחת מצב אחסון נתון, ו EVs נגזר ממקורות תאים שונים ניתן להשוות בקלות. מידת היציבות מתבססת על הפרמטרים הפיזיקליים של EVs (גודל, ריכוז חלקיקים ומורפולוגיה) ושימור פעילות המטען שלהם. האחרון הוא העריך על ידי saponin בתיווך עטיפת האנזים ביתא-glucuronidase לתוך EVs. Glucuronidase משמשת כפונדקאית ומאפשרת כימות קלה דרך המחשוף של מולקולת כתב פלורסנט. הפרוטוקול הנוכחי יכול להיות כלי עבור חוקרים בחיפוש אחר תנאי אחסון באופן אופטימלי לשמור על מאפייני EV כדי לקדם מחקר EV לקראת יישום קליני.

Introduction

EVs הם חלקיקים מאוגד קרום המיוצר על ידי כל סוגי התא כמעט. עבור תאים ממיונקים, EVs ניתן לחולק לשתי קבוצות עיקריות עם שבילים הפקה ברורים1,2. שלפוחיות ממברנה, עם טווח גודל של בערך 100-1000 ננומטר, מיוצרים על ידי הנצה ישירה מקרום התא. אקסוזומים, בגודל 30-200 ננומטר, נגזרות מגופים רב שנוצרו על ידי הבנה פנימה לתוך אנזומים כי לאחר מכן הפתיל עם קרום התא כדי לשחרר האקסוזומים מרובים בבת אחת. הפונקציה העיקרית של שלפוחיות אלה היא העברת מידע בין תאים3. למטרה זו, מטענים כגון RNA, DNA, ו חלבונים ממוינים באופן פעיל לתוכם. EVs יכול להעביר מגוון של אפקטים על המטרות שלהם, עם השלכות על מצב בריאות ומחלות הן. בצד אחד, הם מתווכים אפקטים חיוביים כגון התחדשות רקמות, אנטיגן מצגת, או תופעות לאנטיביוטיקה, מה שהופך אותם מטרות מוצלחת עבור הפיתוח שלהם כמו therapeutics4,5. בצד השני, EVs יכול לקדם את הגידול vascularization6, לגרום לתופעות העובר בתגובות מתח7, ו עשוי לשחק תפקיד מחלות אוטואימוניות8 ומחלות דלקתיות9. לכן, הם עשויים להיות מרכיב מפתח להבנה טובה יותר של השפעות פתולוגיים רבות. עם זאת, הנוכחות של EVs שונה במחלות סעפת, כגון סרטן10,11,12 והפרעות לב וכלי דם13, ואת הנגישות הקל שלהם בדם ובשתן עושה אותם אידיאלי סמנים. בסופו של דבר, ביולוגית טובה14 שלהם יכולת מיקוד שלהם להפוך EVs מעניין גם לאספקת סמים15. בכתב יד זה אנו מתארים פרוטוקול להערכת יציבות האחסון של EVs שנגזר מתאי מיונקים, מאפיין חשוב שעדיין נחקר מעט.

עבור הפיתוח הקליני של EVs, יש עדיין מכשולים רבים להתגבר על16, כולל הערכה של ההשפעות הטיפוליות שלהם, ייצור, טיהור, ואחסון17. בעוד-80 ° c הוא ראה נרחב כמו תקן זהב עבור EV אחסון18, מקפיאים נדרשים יקרים, ושמירה על שרשרת קר הנדרש מייצור למטופל יכול להיות מאתגר. יתר על כן, דיווחים מסוימים מצביעים על כך אחסון ב-80 ° c עדיין לא אופטימלית שומרת EVs ומשרה הפסד ב-EV פונקציונליות19,20. שיטות אחרות, כגון הקפאת ייבוש21,22 או ספריי ייבוש23, הוצעו כחלופות פוטנציאליות אחסון קפוא של EVs.

הדרך האופטימלית של הערכת יציבות אחסון יהיה לבחון את EVs באופן פונקציונלי או על ידי הערכה של סמן מסוים, למשל, פעילות אנטיבקטריאלי שלהם19. זה אפשרי כאשר ההשפעה הרצויה של שלפוחיות ידוע וכאשר קבוצה אחת שונה של EVs היא ללמוד. אם EVs ממקורות תא שונים יש להשוות (למשל, עבור עטיפת התרופה) או אם אין בדיקה תפקודית ידועה, אין עוד אפשרות להעריך שינויים עקב אחסון באופן ישיר.

מצד שני, פשוט להעריך שינויים בפרמטרים הפיזיקליים שלהם, כגון גודל, שחזור חלקיקים, וריכוז חלבונים, לא תמיד לחזות שינויים בפעילות EV, כפי שמוצג בפטנט האחרון20.

כאן, אנו מספקים פרוטוקול החלים בקלות למדידת יציבות האחסון של EVs על ידי הערכת הפרמטרים הפיזיקליים שלהם בשילוב עם הפעילות של אנזים בטא glucuronidase כימוע כפונדקאית עבור המטען של EVs. טעינת האנזים נעשית על ידי הדגירה סאפונין, שיטה קלה שהוקמה עם EVs ממקורות שונים21,24,25. Saponin צורות נקבוביות זמניות ב קרום EV, אשר מאפשר ספיגת אנזימים לתוך vesicle. כמו אנזימים נוטים לאבד את פעילותם אם נתון לתנאי אחסון שלילי, הם תחליף אידיאלי להערכת שימור של מטענים פונקציונליים של EVs.

הדגמנו כי היישום של פרוטוקול זה כדי EVs נגזר מתאי גזע האדם mesenchymal (MSCs), הטבור האנושי תאים אנדותל (HUVECs), ו אדנוקרצינומה האדם תאים אפיתל (A549) אכן תוצאה הבדלים גדולים יציבות אחסון בין קווי תאים שונים, אשר יש לקחת בחשבון בעת בחירת מקור EV21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תרבות התא והפקת מדיום ממוזג

  1. בדרך כלל, לטפח תאים תחת התנאים הבודדים הנדרשים לקו התא המתאים.
  2. לטפח את התאים עבור 24-72 h בתנאים ללא סרום או בינוני המכיל סרום העוברי EV מרוקן (FBS).
    הערה: אם משתמשים ב-EV FBS, להעסיק שיטה שהווכחה ביעילות לרוקן את הנסיוב, כדי למנוע זיהום עם סרום בצורת הפרה EVs26.
  3. לאסוף את המדיום מן הצלוחיות. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 10 דקות כדי הגלולה התאים. לאסוף בקפידה את המדיום הממוזג (CCM), מבלי להפריע את התאים הפלטאד. רצוי להשתמש ב-CCM ישירות, או לאחסן אותו בין לילה ב -4 ° c.
    הערה: תמיד עדיף להשתמש ב-CCM שיוצרו בטריות. אם לא ניתן להקיף את האחסון בפרקי זמן ארוכים יותר, יש להקליט את כל הפרמטרים הרלוונטיים בהתאם להנחיות הMISEV2018 של26, ולתוצאות הבדיקה הפוטנציאליות שנרכשו כדי לקחת בחשבון.
  4. פרוטוקול דוגמה עבור HUVECs
    1. לטפח תאים HUVEC עבור 120 h ב EGM-2 בינוני המכיל FBS ותוספי מזון אחרים.
    2. לטפח תאים HUVEC עבור 48 h ב EBM-2 בסיס הבסיס ללא תוספי מזון נוספים.
    3. לאסוף את המדיום מן מבחנות ולבצע את הצעד צנטריפוגה כפי שצוין לעיל (שלב 1.3). בדרך כלל, השתמש 100 mL של בינוני עבור אחד בידוד EV.

2. הארכה של CCM

  1. מיד לפני ההפוגות (UC), צנטריפוגה את ה-CCM למשך 15 דקות ב-3,000 x g ו-4 ° צ' כדי להסיר את הפסולת התאית ואת האגלוגית הגדולה.
  2. העבר בזהירות את הסופרנטאנט לצינורות ה-UC. אם באמצעות רוטור זווית קבוע, לסמן את כיוון הצינורות בצנטריפוגה כדי להקל על האחזור של הגלולה EV לאחר ה-UC. צנטריפוגה עבור 2 h ב 120,000 x g, עם k-פקטור של 259.4.
  3. לאחר ה-UC, להיפטר בזהירות supernatant באמצעות pipet סרולוגית, כדי למנוע את ההפרעה של מEVs.
    הערה: הגלולה עשויה להיות בלתי נראית.
  4. הוסף 200 μL של 0.2 μm-מסוננים פוספט מאגור מלוחים (PBS) לצינור הראשון ולהשתמש PBS ו-supernatant שיורית להשעות את הגלולה על ידי ליטוף למעלה ולמטה. העבר את ההשעיה של EV שהתקבל לצינור הבא של המדגם בהתאמה ולהשתמש בו עבור השעיה מחדש. המשך בדרך זו כדי להשעות מחדש את כל EVs של המדגם בכרך הסופי של כ 300-350 μL.
  5. לאחר השעיה, לאשר את הנוכחות של חלקיקים על ידי ניתוח מעקב ננו-חלקיק (נ. ת. ע). השתמש בהגדרות הממוטבות עבור סוג EV נתון, כגון ההגדרות שלהלן (שלב 2.5.1).
    הערה: העיתונים של גרדינר ואח '27 והvestad ואח '28 מכילים מידע רב ערך אודות אופן המיטוב של הפרמטרים למדידת EVs.
    1. כדי לשחזר את התוצאות המתוארות להלן, להשתמש במכשירים (למשל, ננוראייה LM14) מצויד בלייזר ירוק. להקליט שלושה קטעי וידאו של 30 עם רווח מסך של 1.0 ורמת מצלמה של 13. לניתוח, השתמש ברווח מסך של 1.0 ובסף זיהוי של 5.
  6. השתמשו בגלולה מיד, אם אפשר; אחרת, אחסן אותה ב-4 ° c בלילה.

3. כימוס גלוקורונידאז לתוך EVs

  1. לגלולה resuspended, להוסיף בטא glucuronidase (10 מ"ג/ml ב PBS) לריכוז הסופי של 1.5 mg/ml ו סאפונין (10 מ"ג/ml ב H2O) לריכוז הסופי של 0.1 mg/ml. מערבבים היטב על ידי vortexing עבור 3 s.
  2. דגירה עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר עם intermitted ערבוב ידי בעדינות מצליף בצינור. לאחר הדגירה, לטהר ישירות על ידי כרומטוגרפיה הדרה-גודל (SEC) (ראה סעיף 5).
    הערה: לא להקפיא מחדש דגימות glucuronidase להפשיר, כדי למנוע השפלה אנזימים עקב הקפאה.

4. ליפומין הייצור

  1. כדי להכין ליפוזומים להשוואה עם EVs, לפזר 1, 2-dimyristoyl-sn-בגליקו-3-פוספולולין (DMPC) ו-1, 2-dimyristoyl-sn--3-פוספיוולין (dppc) ב 2:3 טוחנת של הכלורופורם לריכוז הסופי של 5 מ"מ. הכינו 1 mL בבקבוקונים בעלי ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית והרשו להם להתייבש בן לילה כדי ליצור סרט השומנים.
    התראה: כלורופורם רעיל וחשוד להיות מגנטי הסרטן. נקוט אמצעי זהירות נאותים בעת הטיפול בו.
  2. מחדש את השומנים-סרט עם 1 מ ל של PBS המכיל 1.5 mg/mL glucuronidase. לחמם את זה 42 ° c ו מערבולת עבור 1 דקות. מחממים את ההרכבה הבלטת מכבש ל 42 ° c ו הבלטת הבולם השומנים 11x באמצעות קרום פוליקרבונט ננומטר 200. לטהר באופן ישיר על ידי SEC (ראה סעיף 5).

5. טיהור על ידי שניה

  1. הכן את עמודת ה-SEC באמצעות הפרוטוקול הבא.
    1. השתמשו רק במים נקיים מטוהרים ובמאגרים טריים. לסנן את כל המאגרים באמצעות מסנן ממברנה 0.2 יקרומטר ודגה אותם כדי למנוע את היווצרות בועות אוויר בעמודה.
    2. להכנת עמודת SEC, השתמש במטריצה המבוססת על סינון ג'ל מבוסס (g., ספרד Cl-2b) או מדיום אחר אחר מתאים להפרדת EVs וליפוזומים מחלבון מטוהר ואנזים עודף. ראשית, הסר את הפתרון של 20% אטוח המדיום מאוחסן ב-, כדי למנוע היווצרות בועות אוויר בעמודה. לשם כך, הצנטריפוגה את מדיום ה-SEC ב-3,000 x g במשך 10 דקות, הסר את האטואה והחלף אותו במים מדנסיים.
    3. מלאו עמודת זכוכית (עם קוטר פנימי של 10 מ"מ) עם המדיום של SEC עד לסימן 15 מ"ל.
      הערה: אמצעי אחסון יהיו שונים עבור עמודות במידות שונות. הקפידו לתת לג להתיישב לגמרי.
    4. לפני הפעלה, השווה את העמודה עם לפחות שני כרכים של עמודות של PBS. כדי לאחסן את העמודה, הקודם לשטוף אותו עם נפח עמודה אחת של מים, ואחריו לפחות שני כרכים עמודה של 20% אטוח. לאחר האחסון, שטוף את העמודה תחילה עם נפח עמודה אחד של מים לפני שאתה משווה עם PBS.
    5. להשתמש עד 400 μL של EV או ליפוכמה השעיה בהפרדה אחת. לאסוף שברים של 1 מ ל. לאחר השעה, יש לאחסן את הEVs הטהורה (ראה סעיף 7) או בכפוף להם לאותה שיטת הדבקה (ראה סעיף 6).
  2. אשר את הפרדת הEVs והליזומים מחלבונים מזהם ומגלוקורונידאז חופשי. לשם כך, להתאים את ריכוזי החלקיקים של שברים שנאספו עם ריכוז החלבון ואת פעילות glucuronidase.
    1. הערכת ריכוז החלקיקים על-ידי נ. ת. ע (ראו 2.5)
    2. הערכת תוכן החלבון על-ידי בדיקת חומצה (BCA) או שיטת התאמת חלבון מתאימה אחרת. בצע את הדרישות בהתאם לפרוטוקול היצרן.
    3. הערכת פעילות הglucuronidase באמצעות שיטת גלוקורונידאז (ראה סעיף 6).
  3. באופן אופציונלי, העריכו את מורפולוגיה ה-EV באמצעות שידור אלקטרון מיקרוסקופ (TEM) וסריקת מיקרוסקופ אלקטרוני (SEM).
    1. לקראת הכנת דגימות TEM, להוסיף 10 μL של ההשעיה EV לרשת TEM, דגירה עבור 10 דקות, ולאחר מכן למחוק את כל נוזל עודף באמצעות נייר סינון. בצע את הקיבעון עבור 10 דקות עם 10 μL של 4% פאראמפורמלדהיד ולמחוק את כל עודף. . תשטוף 3 x עם מים כתם שלפוחיות על ידי הדגירה 20 s עם 30 μL של 1% זרחן-tungstic חומצה מימה. , לאחר שהוא מורח את העודף. יבש את השלפוחית הלילה המחשה על ידי TEM.
      התראה: פוספהו-חומצה tungstic מאוד קאוסטית; לכן, להגן על העור והעיניים.
    2. עבור SEM, לתקן את הדוגמאות TEM שהוכנו בעבר על דיסקי פחמן ולמלא אותם עם שכבת זהב 50 ננומטר בעובי. המחשה על ידי SEM.

6. שיטת גלוקורונידאז

  1. כדי לאפשר השוואה בין דגימות שונות ותנאי אחסון על-ידי התייחסות למספר חלקיקים ולפעילות אנזימים, יש למדוד תחילה את ריכוז החלקיקים של המדגם על-ידי נ. ת. ע (ראה שלב 2.5).
  2. להכין פתרון עבודה של fluorescein di-β-D-גלוקורוניאן על ידי הוספת 1 μL של התרכובת (10 מ"ג/mL ב H2O) כדי 199 ΜL של PBS. הוסף 25 μL של פתרון זה כדי 125 μL של EVs מטוהרים כדי לקבל ריכוז סופי של 8.3 μg/mL. ללטף את המדגם לתוך לוחית שחורה 96-ובכן. מדידת זמן נקודה 0 h עם קורא צלחת, באמצעות 480 nm כמו עירור ו 516 nm כמו גל פליטה.
  3. כסו את הצלחת בחוזקה (למשל, עם רדיד פלסטיק שקוף המשמש ללוחות ה-PCR) כדי למזער את האידוי ואת הדגירה בחשיכה במשך 18 שעות ב 37 ° c. למדוד את הייצור fluorescein באמצעות הפרמטרים הקורא לוחית המפורטים בשלב 6.2.

7. אחסנה של EVs וליפוזומים

הערה: עבור כל מטרות האחסון, מומלץ להשתמש צינורות מחייב נמוך כדי להפחית את אובדן EV עקב adsorption.

  1. בצע את הפרמטרים בסעיף זה כדי לשכפל את התוצאות הייצוגיות הניתנות להלן. דגימות השימוש המורכב של 400 μL של השעיית EV.
    1. החנות ב-4 ° צ' או-80 ° צ' או המשיכו לשלבים המפורטים להלן.
    2. . ליאופליז, הEVs
      1. הוסף טרהלוז (40 mg/ml ב H2O) עד לריכוז הסופי של 4 מ"ג/ml EVs מטוהרים. הקפא את הדגימות ב-80 ° c לפחות 1 h.
      2. ליזוליז הדגימות באמצעות הפרמטרים הבאים. לייבוש הראשי, להגדיר את טמפרטורת המדף ל 15 ° צ' ולחץ 0.180 mbar ולהשאיר את הדגימות יבש עבור 46 h. לייבוש הסופי, להגדיר את טמפרטורת המדף ל 25 ° צ' ולחץ 0.0035 mbar ולהשאיר את הדגימות כדי לייבש 2 h. לאחסן את הדגימות ליוה, ב 4 ° c.
      3. כדי לשחזר את הדגימות, להוסיף H2O, שווה את כמות EV ההשעיה נוכח בתחילת (בדרך כלל, 400 μl). אין להשתמש במאגר לצורך מימוש חוזר.

8. ניתוח לאחר אחסנה

  1. כדי להעריך את פעילות האנזים, ראשית להסיר את glucuronidase חינם, אשר ייתכן דלף מן EVs במהלך אחסון. השג זאת באמצעות שלב נוסף של טיהור הנערך על-ידי SEC (ראה שלב 5) או שבירה של זרימת שדה זרימה אסימטרית (AF4) (ראה שלב 8.1.2).
    הערה: שימו לב ששתי השיטות מובילות לדילול דגימת EV; לכן, להשתמש בריכוזים EV מספיק לפני האחסון כדי למנוע מעבר מתחת למגבלת הכמת של נ. ת. ע. צפו 1:10 דילול של החלקיקים עקב SEC או AF4.
    1. עבור טיהור שניה, בצע את הפרוטוקול המתואר לעיל (ראה סעיף 5).
    2. בצע טיהור AF4.
      1. הגדר את המכשיר באמצעות ערוץ קטן עם מרווח 350 יקרומטר ו-30 משקל מולקולרי kD לגזור ממברנה תאית. מניחים מסנן גודל 0.1 יקרומטר של הנקבוביות בין משאבת הAF4 לערוץ. השתמש טרי מוכן 0.1 μm-מסוננים PBS כשלב הנייד כדי להפחית את עומס חלקיקים ורעש גלאי פיזור אור.
      2. זיהוי חלבונים באמצעות גלאי UV להגדיר ל 280 ננומטר. כדי לזהות חלקיקים, השתמש בפיזור אור רב זווית עם הלייזר להגדיר ל 658 ננומטר.
      3. השתמש בשיטת ההפעלה הבאה. מיקוד מראש עבור 1 דקות עם תזרים מיקוד של 1 מ"ל/min; אז, להזריק 300 μL של המדגם בקצב של 0.2 mL/min ולשמור על זרימת המוקד עבור 10 דקות. לאחר ההזרקה, המדגם בדגם 1 mL/min תוך החלת זרימה צולבת הפוחתת מ-2 מ"ל/min ל-0.1 mL/min במהלך 8 דקות. אליוט לעוד 10 דקות ללא זרימה צולבת. לאסוף שברים של 1 מ ל, החל אחרי 12.5 דקות וממשיך עד 27 דקות.
    3. בצעו את שיטת הגלוקורונידאז כפי שתוארה לעיל (ראו סעיף 6).
  2. כדי להעריך את הגודל והריכוז, השתמש ב-נ. ת. ע כפי שמתואר לעיל (ראה שלב 2.5).
  3. באופן אופציונלי, לבצע TEM ו-SEM כדי להעריך את המבנה של EVs לאחר האחסון (ראה 5.3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 מציג את מאפייני האחסון של EVs מבודדים מ-HUVECs. EVs היו מבודדים על ידי ה-UC, glucuronidase היה אנקפסולציה, ואחרי שניות, EVs מטוהרים הוערכו על המאפיינים הפיזיקליים שלהם על ידי נ. ב. א. מדגם של שלפוחיות היה נתון לאחר מכן לטיהור AF4 ופעילות glucuronidase נמדד.

השלפוחיות אוחסנו לאחר מכן ל -7 מעלות ב -4 ° צ' או-80 ° c ו-4 ° c בצורת ליאופפיהן, במקרה האחרון עם תוספת של 4% trehalose. לאחר האחסון, שלפוחיות היתר נמדדו שוב על ידי נ. ת. ע, ולאחר AF4, פעילות הglucuronidase שנותרה לכל חלקיק הוערך.

עקרון העבודה של AF4 מתבסס על שילוב של זרימה למינרית וזרימה אורתוגונלית דרך הקרום הנקבובי בתחתית הערוץ AF4, אשר משפיע באופן מהותי על חלקיקים לפי גודלם (איור 2). חלקיקים גדולים נוטים להיות ממוקם קרוב הקרום בעוד חלקיקים קטנים ממוקמים יותר למעלה בערוץ. בשל פרופיל הזרימה הפרבולית של הזרימה המיבינדית, החלקיקים רחוקים יותר מהקרום לנוע מהר יותר לכיוון הגלאי, ומובילים להפרדה בין חלקיקים לגודל. בניסוי AF4 אופייני, החלקיקים המוזרקים מתמקדים תחילה בקרום, על ידי החלת זרימה צולבת ללא זרימה לאורך דרך הערוץ (איור 2א). לאחר הזרקה והתמקדות, הימנעות מתחיל על ידי במקביל החלת זרימה האורך ואת זרימת לאנגיופלסטיקה ו elute מערכות המשנה השונות של חלקיקים (איור 2B), אשר, במקרה שלנו, היו EVs ו-glucuronidase חינם.

איור 3 ממחיש את ההפרדה של חלקיקי חלקיקים (EVs או ליפוזומים) מפני מזהם חלבונים וglucuronidase. פרופיל ליפוזומים (איור 3A) מטוהרים לאחר הכנתו (ראה סעיף 4 של הפרוטוקול) הראה את הפרדת החלקיקים עם glucuronidase כימוס מן האנזים החופשי, זיהה הן באמצעות שיטת bca ו פעילות אנזימים. בדוגמה הנוכחית, שבר 6 ו -7 ייבחרו לניסויים נוספים כאשר הם הכילו את ריכוזי החלקיקים הגבוהים ביותר וכדי למנוע הזהום אפשרי עם glucuronidase חינם. AF4 היה גם מוצלח בהפרדת EVs מן glucuronidase חינם כפי שמתואר באיור 3B, עם מידה גבוהה יותר של הפרדה מאשר שניות, ביצוע זיהום של השברים המכילים שלפוחיות פחות סביר.

באיור 4, ניסוי בקרה התבצע כדי להבטיח כי פעילות האנזים שנמדד עבור השלפוחיות הייתה קשורה באמת לעטיפת הglucuronidase לתוך EVs ולא נגרמת על ידי אגרגטים אנזימים. אגרגטים אלה עשויים להיווצר עקב הדגירה של glucuronidase עם סאפונין ולהוביל תוצאות חיוביות שווא. כדי לאמת את השברים שבהם הייתי שלפוחיות, EVs מטוהרים ללא כדור השדרה היו חשופים לשנייה על אותה עמודה כמו המדגם רק המכיל סאפונין ואת האנזים.

כאשר glucuronidase היה מודב עם סאפונין ולאחר מכן מטוהרים על ידי SEC, לא נמצאה פעילות אנזים בשברים המכילים בדרך כלל EVs. בעוד כמויות קטנות של חלקיקים נמצאו להיט באותו זמן כמו EVs (לפצות < 0.1% של החלקיקים התאושש מתוך גלולה EV אופייני), לא היתה פעילות אנזים הקשורות. תוצאות אלה מצביעות על כך שאנזים פעיל ששוחזר בשברים המכילים שלפוחיות בתוכם.

איור 5 משווה את ההתאוששות של אנזים פעיל לאחר אחסון עם או בלי AF4 נוסף טיהור כדי להסיר צבע שאינו כימוס. עם AF4 טיהור, יש בדרך כלל התאוששות נמוכה יותר של אנזים לכל חלקיק, עם ההשפעה הגבוהה ביותר עבור אחסון ב 4 ° c, שבו התאוששות טיפות על ידי שני שלישים. כך, השמטת שלב זה טיהור נוסף יכול להוביל הנחות שגויות על יציבות האנזים.

איור 6 מראה את השפעת הליאופליזציה ללא כימיות על שלפוחיות שנגזרו מMSCs, A549 תאים וליפוזומים, לעומת הקפאה ב-80 ° c. החלקיקים נוצרו על ידי TEM ו-SEM כפי שמתואר לעיל (ראה שלב 5.3 של הפרוטוקול). MSCs ו A549 EVs לא הפגין הבדלים גדולים בצורה תמונות TEM, השוואת שני תנאי אחסון. עם זאת, בתמונות ה-SEM, הדגמים המוצגים מוצגים בדוגמאות שלא נמצאו ב-80 מעלות צלזיוס. ליפוזומים גם הציגו אגרגטים בתמונת ה-SEM, ואילו ב-TEM, הופיע ליאופליטיזציה כדי לגרום לעלייה בגודל של ליפוזומים. ליטוליזציה ללא cryoprotectants גם הקטינה את ההתאוששות של הglucuronidase שלמים לאחר האחסון (איור 7). הוספת טרהלז ככימיות הגדילה את ההתאוששות של האנזים הפעיל בצורה תלוית-מינון.

איור 8 מדגים את ההמרה של fluorescein di-β-D-glucuronide כדי חינם fluorescein, מתרחש בתוך הטיפול גלוקורונידאז. בעוד החנך היה פלורסנט ב 516 ננומטר, fluorescein הוא פלורסנט מאוד באורך הגל הזה. זה מותר על הצורך בפעילות אנזים פשוט עם רגישות גבוהה.

Figure 1
איור 1 : יציבות האחסון של HUVEC EVs. (א) התאוששות החלקיקים לעומת לפני האחסון, (ב) ממוצע הגודל, ו (ג) הפעילות המנורמלת glucuronidase לכל חלקיק של EVs מבודד huvecs. שלפוחיות שאוחסנו עבור 7 ד ב -4 ° צ' ו-80 ° c ו-4 ° c לאחר ליטליזציה עם 4% trehalose. הגודל הממוצע ושחזור החלקיקים נמדדו על-ידי נ. ת. ע; פעילות glucuronidase לכל חלקיק היה מחושב שילוב נתונים נ. ת. ע ואת התוצאות של שיטת glucuronidase ומנורמל לפני האחסון. ממוצע ± SD, n = 3, *p < 0.05 (ANOVA בכיוון אחד ואחריו הבדיקה הפוסט-הוק של tukey). השתנה מפרנק ואח '. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2 : עקרון העבודה של AF4. (א) EVs והglucuronidase חינם ממוקדים לאחר ההזרקה על ידי החלת זרימה צולבת. (ב) לאחר מכן, EVs ואנזים חופשי משוחררים בנפרד על ידי שילוב הזרימה דרך הערוץ עם זרימה צולבת. השתנה מפרנק ואח '. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3 : הפרדת EVs וליפוזומים מן הגלוקורונידאז החופשי. (א) נציג שניה של הפרדה של גלוקורניג-ליפוזומים שנטענו, גלוקורניג חופשי, ומזהמים בחלבון. הגרף מציג את ריכוז החלקיקים (אדום), ריכוז חלבונים (כחול) ופעילות גלוקורונידאז (ירוק). (ב) הפגנה של הפרדת הEVs מגלוקוונידאז החופשי. EVs מטופל, EVs עם 0.05 mg/mL glucuronidase, חינם הדבקי (0.5 mg/ml), ו EVs טעון עם glucuronidase ומטוהרים על ידי שניה (EV glucuronidase) הוזרקו ונותחו על ידי UV ב 280 nm ו 90 מעלות פיזור אור. . אנזים חופשי משוחרר בנפרד מEVs השתנה מפרנק ואח '. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4 : שליטה ניסויים לטיהור של EVs מן הglucuronidase חינם. 400 μl של יליד EVs או 400 μl של 1.5 mg/ml glucuronidase ב-PBS במשך 10 דקות עם 0.1 mg/ml סאפונין שהיו מטוהרים על ידי SEC. (א) ריכוזי חלקיקים של שברים שנאספו של שלפוחיות וגלוקורונידאז, בהתאמה, ואת פעילות האנזים של . הגלוקורונידאז הטהור (ב) קליטת UV ב 280 ננומטר נמדד באותו ניסוי. הפסגה הקטנה הראשונה עבור הglucuronidase תואמת את הקו האפור בלוח A. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5 : ההשפעה של שלבי טיהור נוספים לאחר אחסון EV. פעילות glucuronidase נותרת לכל חלקיק בהשוואה ל-d0 עם או בלי מAF4 נוסף לטיהור האחסון. HUVEC EVs אוחסנו במשך 7 ד' ב -4 ° c או-80 ° c וליאופהודי עם 4% trehalose. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6 : התמונות TEM ו-SEM של EVs. TEM ו SEM תמונות של EVs מ (א) MSCs ו (ב) A549 תאים ו (ג) ליפוזומים. הדגימות אוחסנו עבור 14 ד ב-80 ° צ' או ליאופדי ללא תוספת של טרהלז. חיצים מציינים את נוכחותם של חלקיקים משתנים מורפולוגית בתמונות TEM ובאגרגטים בתמונות ה-SEM. השתנה מפרנק ואח '. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7 : ההשפעה של טרהלז על שחזור אנזימים לאחר ליטוליזציה. השוואה בין פעילות האנזים לאחר ליטוליזציה עבור 14 ימים, עם 0%, 1%, ו 4% טרהלוז עם המדגם לפני האחסון (0 ימים). השתנה מפרנק ואח '. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8 : המחשוף האנזימטי של פלואורואסעין די-β-D-גלוקוראונידה על ידי גלוקוונידאז. בערכה, התגובה הבסיסית של גילוי הglucuronidase מוסבר. Fluoresconiβ-D-פלורסנט לא ממוקם על ידי גלוקורוניאן באמצעות הסרת שאריות הסוכר, fluorescein חוזר למאפייני הפלורסנט שלה. הזריחה נמדד לאחר תקופת הדגירה המקבילה עם כמות האנזים הפעיל נוכח והוא הבדיקה של השיטת הגלוקורונידאז. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בכתב יד זה, אנו מציגים פרוטוקול מקיף לחקר יציבותה של EVs תחת תנאי אחסון שונים. עם שילוב של glucuronidase כדורית כבדיקה תפקודית והערכה של הפרמטרים הפיסיוכימיים של EVs, הפרוטוקול מאפשר הערכה ברורה של יציבות האחסון של EVs והשוואה של EVs מתא שונים קווים. SEM ו-TEM כשיטות משלימות מאפשרים תובנה לשינויים של EVs על רמת חלקיק יחיד. התוצאות המוצגות כאן הראו נטייה של EVs וליפוזומים לצבור עקב הליאופליזציה ללא כימיות (איור 6). עם זאת, זה נצפה רק בניסויים SEM. בעוד הדמיה EM לא נערך עם דגימות שנשמרו עם trehalose, הספרות עולה כי כימיות זה עשוי להפחית את הצבירה של EVs29. ניתן גם להעריך, אם תנאי אחסון נתון משפיע באופן מהותי על גודל EV, שיעור ההחלמה ומולקולות שעברו אנקפסולציה. השפעה כזאת היא לידי ביטוי על ידי התוצאות שהתקבלו עבור HUVEC EVs (איור 1). בעוד שחזור החלקיקים עבור 4 ° צ' ו-80 ° c היה טוב יותר מאשר הדגימות הלישיות, ההתאוששות של הגלוקורונידאז הפעילה הייתה הטובה ביותר לדגימות הלינויום. ליטוליזציה של EVs יכול להיות מצב אחסון נוח יותר, למשל, בעת ניתוח ביורים EV, שבו המוקד הוא יותר על השגת ושמירה על מטענים שלמים ולא על שלפוחיות שלמות.

במאמר האחרון שלהם על הליאופליזציה של EVs22, הצ והצ. הלכו בדרך דומה. לגבי הפרמטרים הפיזיקליים, הם התמקדו במדד הפולידיפיטיות (PDI) ובפוטנציאל הזטה, כאשר השינויים בפוטנציאל הזטה יכולים להתאים ליציבות הקולאידית הקטנה. עם זאת, פוטנציאל הזטה אינו יכול להסביר באופן בלעדי את השינויים הנצפים ביציבות30, אשר גם השתקף בתוצאות שלהם. הם גם השוו את החלבון ואת התוכן של ה-RNA של EVs מאוחסן על ידי האלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילמיד. טכניקה זו יכולה גם להצביע על שינויים ניכרים בתוכן החלבון או הרנ של השלפוחיות. עם זאת, היא דורשת כמויות גדולות יותר של חומר מהשיטה המוצגת כאן. כדי להעריך את ההשפעה של האחסון על מטען EV, צ'רכריכין ואח ' הטרולוגיסט הביע באופן מיני אנזים ו-DNA מינים כל אחד בתור שלהם EV מפיק תא ופיקוח על פעילותם ויושרה ב EVs. עם זאת, ביטוי הטרוולוגי כזה אינו מתאים אם EVs ממקורות שונים הם להיות מושווים, כפי שהוא דורש כמות משמעותית של זמן עבור כל קו התא החדש, בעוד מעטיפת saponin בתיווך פשוט ניתן להחיל בקלות.

חשוב להסיר כל אנזים שאינו מחושב, כפי שמוצג באיור 3. הglucuronidase-EV מגיב הרבה יותר לאט עם המצע שלה מאשר אנזים חופשי בפתרון, המוביל להערכת יתר של היעילות אנקפסולציה. הפרדה נקיה חשובה במיוחד עבור ניתוח לאחר אחסון, כמו תנאי אחסון עשוי להשפיע על הפעילות של glucuronidase חינם במדגם באופן שונה ועלול לגרום לדליפה מEVs פגום. זה היה ברור בניסויים שלנו (איור 5), כיישום של AF4 לפני הניסוי glucuronidase הצליח להסיר את הצבע לא כימוס בתוך שלפוחיות. לפיכך, זה התאפשר לקבל תוצאות ברורות על ההשפעה של שיטות האחסון שנדונו כאן, בעוד ללא AF4, אובדן הפעילות בשל האחסון היה להמעיט.

שיקול חשוב נוסף הוא הבידוד והאפיון של הEVs שייבדקו למען יציבותו. למרות הטכניקה המתוארת מאפשרת השוואה של EVs ממקורות שונים, זה אפשרי רק אם כולם מוכנים על ידי אותה שיטת בידוד כך התוצאות אינן מעוותות18,31,32. בהקשר זה, תנאי תרבות התא צריך להילקח בחשבון גם, כפי שהם יכולים להשפיע על הכמות ואת הביופעילות של EVs מבודדים33. כדי להשיג תוצאות שניתן להשוותן לתוצאות אחרות שפורסמו, מומלץ להתייעץ עם מידע מינימלי שעודכן לאחרונה עבור מחקרים של שלפוחיות ושלפוחית המידע המכיל הנחיות להרמוניה של מחקר EV26.

בפרוטוקול שהוצג כאן, השתמשנו ב-SEC או AF4 להסרת האנזים החופשי לאחר האחסון. ניתן להחיל שיטות אחרות, כגון מעבר הדרגתי, UC, או בדיקת אולטרה-סינון34. בהשוואה לשיטות צנטריפוגליים, SEC ו-AF4 פחות זמן (למשל, בערך 1.5 h עבור SEC, כולל שימוש בטור לעומת עד 16 h או יותר עבור UC מעבר הדרגתי) והם יכולים להפריד לחלוטין חלבונים מEVs בהשוואה ל-UC רגיל, שבו תמיד יש שרידי משקעים. עם הגלולה יתר על כן, שניות15 ו AF435 הם שיטות מתון, אשר לגרום פחות להדגיש להטות על EVs. לעומת זאת, הכוחות המוטלים על EVs במהלך ה-UC עשויים להוביל לשינויים של החלקיקים, כגון צבירה ושינויים בגודל34,36.

חיסרון של SEC ו AF4 הוא דילול הדגימות. כך, הוא נדרש כדי לבודד כמויות מספיקות של EVs כדי לשמור על הריכוזים הדרושים עבור נ. ת. ע מדידות לאחר שלבי טיהור מרובים. שברים EV עשוי להיות מרוכז באמצעות מסננים צנטריפוגלי, אבל, בהתאם לחומר הסינון ואת הפרוטוקול, יכול להיות אובדן של שלפוחיות37.

המגבלה של הפרוטוקול שנדונה כאן היא שזה רק מפקחת על פעילות האנזים של הglucuronidase באופן משמעותי, לא לקחת בחשבון RNA ו-DNA או חלבונים משטח EV שעשויים להיות חשובים עבור פונקציונליות18 . למחקר של חדש EV therapeutics, טכניקה זו אינה יכולה להחליף בחני על הפונקציונליות אבל להחמיא להם ולתת אינדיקציה על יציבות שלפוחית. זה יכול להיות שימוש גדול אם, למשל, EVs נגזר של ביולואידים להיות מאוחסנים לניתוח מאוחר יותר של תוכן שלפוחית השמש שלהם.

בעתיד, ניתן להרחיב את היקף הפרוטוקול כדי לכלול גם EVs שנגזר מאורגניזמים אחרים, למשל, הקרום החיצוני חיידקי שלפוחיות. עוד צעד מעניין הבא יהיה לבדוק את האנקפסולציה של חומצות גרעין ידי סאפונין דגירה וגם להסתכל לתוך היציבות של ה-DNA או RNA cargos.

לסיכום, הליך זה מציע שיטה פשוטה להערכת יציבות האחסון של EVs ממקורות שונים של תאי היונקים על ידי שילוב שני פיזיקליים ומכשיר פונקציונלי. פרוטוקול מפורט זה יאפשר לחוקרי EV קביעה ישירה של תנאי אחסון מתאימים לשלפוחיות שלהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

תוכנית מחקר זוטר של ננו מהמשרד הפדרלי של החינוך והמחקר, גרמניה (גרנט מספר 13XP5029A) תמך בעבודה זו. מקסימיליאן ריכטר נתמך על ידי סטודיו דה Deutschen Volkes (קרן המלגות האקדמית הגרמנית) באמצעות מלגת דוקטורט.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC) Sigma-Aldrich P2663-25MG
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC) Sigma-Aldrich P4329-25MG
225 cm² cell culture flasks Corning 431082 Used with 25 ml of medium
30 kDa regenerated cellulose membrane Wyatt Technology Europe 1854
350 µm spacer Wyatt Technology Europe
Automated fraction collector Thermo Fisher Scientific
Beta-glucuronidase Sigma-Aldrich G7646-100KU
Chloroform Fisher scientific C/4966/17
Column oven Hitachi High-Technologies Europe
D-(+)-Trehalose dihydrate Sigma-Aldrich T9531-10G
DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector  Wyatt Technology Europe
Durapore Membrane filter, PVDF,  0,1 µm, 47 mm Merck VVLP04700 Used for the preparation of buffers for AF4
EBM-2 Lonza Verviers, S.p.r. CC-3156 Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells
Eclipse dualtec Wyatt Technology Europe
EGM-2 Lonza Verviers, S.p.r. CC-3162 Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells
ELISA Plate Sealers R&D Systems DY992 used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay
Ethanol Fisher scientific E/0665DF/17
Extruder Set With Holder/Heating Block Avanti Polar Lipids 610000-1EA
Filter support Avanti Polar Lipids 610014-1EA used for liposome preparation
Fluorescein di-β-D-glucoronide Thermo Fisher Scientific F2915
Gibco PBS-tablets+CA10:F36 Thermo Fisher Scientific 18912014
Hettich Universal 320 R Andreas Hettich GmbH & Co.KG Used for pelleting cells at 300 g
Hettich Rotina 420 R Andreas Hettich GmbH & Co.KG Used for pelleting larger debris at 3000 g
HUVEC cells Lonza Verviers, S.p.r. C2517A
Kimble  FlexColumn 1X30CM Kimble 420401-1030
Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC Christ
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene VWR international 525-0255 the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery
Nanosight LM14 equipped with a green laser Malvern Pananalytical
Nanosight-software version 3.1 Malvern Pananalytical
Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes Whatman/GE Healthcare 110406 used for liposome preparation
PEEK Inline filter holder Wyatt Technology Europe
Phosphotungstic acid hydrate Sigma-Aldrich 79690-25G
Polycarbonate bottles for ultracentrifugation Beckman Coulter 355622
QuantiPro BCA Assay Kit Sigma-Aldrich QPBCA-1KT
Saponin Sigma-Aldrich 47036
Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15 Carl Zeiss AG
Sepharose Cl-2b GE Healthcare 17014001
SEM copper grids with carbon film Plano S160-4
Small AF4 channel Wyatt Technology Europe
Sputter-coater Q150R ES Quorum Technologies
Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011 Oxford Instruments
Type 45 Ti ultracentrifugation rotor Beckman Coulter 339160
Ultimate 3000 Dionex autosampler Thermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Dionex isocratic pump Thermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasser Thermo Fisher Scientific
Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K Beckman Coulter
UV detector Thermo Fisher Scientific
Whatman 0.2 µm pore size mixed cellulose filter Whatman/GE Healthcare 10401712 Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Controlled Release. 244, Part B 167-183 (2016).
  2. Fuhrmann, G., Herrmann, I. K., Stevens, M. M. Cell-derived vesicles for drug therapy and diagnostics: Opportunities and challenges. Nano Today. 10 (3), 397-409 (2015).
  3. Goes, A., Fuhrmann, G. Biogenic and Biomimetic Carriers as Versatile Transporters To Treat Infections. ACS Infectious Diseases. 4 (6), 881-892 (2018).
  4. György, B., Hung, M. E., Breakefield, X. O., Leonard, J. N. Therapeutic Applications of Extracellular Vesicles: Clinical Promise and Open Questions. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 439-464 (2015).
  5. Schulz, E., et al. Biocompatible bacteria-derived vesicles show inherent antimicrobial activity. Journal of Controlled Release. 290, 46-55 (2018).
  6. Feng, Q., et al. A class of extracellular vesicles from breast cancer cells activates VEGF receptors and tumour angiogenesis. Nature Communications. 8, 14450 (2017).
  7. Bewicke-Copley, F., et al. Extracellular vesicles released following heat stress induce bystander effect in unstressed populations. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1340746 (2017).
  8. Xu, Y., et al. Macrophages transfer antigens to dendritic cells by releasing exosomes containing dead-cell-associated antigens partially through a ceramide-dependent pathway to enhance CD4(+) T-cell responses. Immunology. 149 (2), 157-171 (2016).
  9. Buzas, E. I., György, B., Nagy, G., Falus, A., Gay, S. Emerging role of extracellular vesicles in inflammatory diseases. Nature Reviews Rheumatology. 10, 356 (2014).
  10. Rajappa, P., et al. Malignant Astrocytic Tumor Progression Potentiated by JAK-mediated Recruitment of Myeloid Cells. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 23 (12), 3109-3119 (2017).
  11. Umezu, T., et al. Exosomal miR-135b shed from hypoxic multiple myeloma cells enhances angiogenesis by targeting factor-inhibiting HIF-1. Blood. 124 (25), 3748-3757 (2014).
  12. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
  13. Boulanger, C. M., Loyer, X., Rautou, P. -E., Amabile, N. Extracellular vesicles in coronary artery disease. Nature Reviews Cardiology. 14, 259 (2017).
  14. Zhu, X., et al. Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from HEK293T cells. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324730 (2017).
  15. Vader, P., Mol, E. A., Pasterkamp, G., Schiffelers, R. M. Extracellular vesicles for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 106, Part A 148-156 (2016).
  16. Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. J., Kwon, Y. J. Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery. Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).
  17. Gimona, M., Pachler, K., Laner-Plamberger, S., Schallmoser, K., Rohde, E. Manufacturing of Human Extracellular Vesicle-Based Therapeutics for Clinical Use. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1190 (2017).
  18. Jeyaram, A., Jay, S. M. Preservation and Storage Stability of Extracellular Vesicles for Therapeutic Applications. The AAPS Journal. 20 (1), 1 (2017).
  19. Lőrincz, ÁM., et al. Effect of storage on physical and functional properties of extracellular vesicles derived from neutrophilic granulocytes. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25465 (2014).
  20. Processes for producing stable exosome formulations. US patent. Kreke, M., Smith, R., Hanscome, P., Peck, K., Ibrahim, A. , Beverly Hills, CA. WO/2016/090183 (2016).
  21. Frank, J., et al. Extracellular vesicles protect glucuronidase model enzymes during freeze-drying. Scientific Reports. 8 (1), 12377 (2018).
  22. Charoenviriyakul, C., Takahashi, Y., Nishikawa, M., Takakura, Y. Preservation of exosomes at room temperature using lyophilization. International Journal of Pharmaceutics. 553 (1), 1-7 (2018).
  23. Kusuma, G. D., et al. To Protect and to Preserve: Novel Preservation Strategies for Extracellular Vesicles. Frontiers in Pharmacology. 9 (1199), (2018).
  24. Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
  25. Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect of porphyrins. Journal of Controlled Release. 205, 35-44 (2015).
  26. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  27. Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 19671 (2013).
  28. Vestad, B., et al. Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087 (2017).
  29. Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6, 36162 (2016).
  30. Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential - What they are and what they are not. Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).
  31. Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24858 (2014).
  32. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
  33. Patel, D. B., et al. Impact of cell culture parameters on production and vascularization bioactivity of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles. Bioengineering & Translational Medicine. 2 (2), 170-179 (2017).
  34. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).
  35. Zhang, H., et al. Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation. Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).
  36. Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 29509 (2015).
  37. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).

Tags

ביו-הנדסה סוגיה 147 שלפוחית ושלפוחיות אקסוזומים יציבות אחסון עטיפת אנזים ליפיליזציה הקפאת ייבוש זרימת שדה זרימה אסימטרית
הערכת יציבות האחסון של שלפוחיות ומסחטות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Richter, M., Fuhrmann, K., Fuhrmann, … More

Richter, M., Fuhrmann, K., Fuhrmann, G. Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (147), e59584, doi:10.3791/59584 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter