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Bioengineering

बाह्य पुटिका के भंडारण स्थिरता का मूल्यांकन

Published: May 22, 2019 doi: 10.3791/59584
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Helmholtz Institute for Pharmaceutical Research Saarland (HIPS), Helmholtz Centre for Infection Research (HZI), Biogenic Nanotherapeutics group (BION), 2Department of Pharmacy, Saarland University

Summary

यहाँ हम एक सहज लागू प्रोटोकॉल extracellular vesicles के भंडारण स्थिरता का आकलन करने के लिए प्रस्तुत, स्वाभाविक रूप से घटनेवाला नैनोकणों के एक समूह कोशिकाओं द्वारा उत्पादित. पुटिकाओं एक मॉडल एंजाइम के रूप में glucuronidase के साथ भरी हुई है और विभिन्न परिस्थितियों में संग्रहीत किया जाता है । भंडारण के बाद उनके भौतिकोरासायनिक मापदंडों और समझाया एंजाइम की गतिविधि का मूल्यांकन कर रहे हैं ।

Abstract

Extracellular पुटिकाओं (evs) वर्तमान अनुसंधान में आशाजनक लक्ष्य हैं, दवाओं के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए, दवा वाहक, और biomarkers. उनके नैदानिक विकास के लिए, न केवल उनकी दवा गतिविधि महत्वपूर्ण है, लेकिन यह भी उनके उत्पादन के लिए मूल्यांकन की जरूरत है । इस संदर्भ में, अनुसंधान EVs के अलगाव, उनके लक्षण वर्णन, और उनके भंडारण पर केंद्रित है । वर्तमान पांडुलिपि का उद्देश्य आनुवंशिक हेरफेर या विशिष्ट कार्यात्मक assays बिना evs पर विभिंन भंडारण शर्तों के प्रभाव के मूल्यांकन के लिए एक फेसियल प्रक्रिया प्रदान करना है । यह जल्दी से एक दिया भंडारण हालत के तहत EVs की स्थिरता की पहली छाप पाने के लिए संभव बनाता है, और विभिन्न सेल स्रोतों से व्युत्पंन EVs आसानी से तुलना की जा सकती है. स्थिरता माप EVs (आकार, कण एकाग्रता, और आकारिकी) और उनके कार्गो की गतिविधि के संरक्षण के भौतिकोरासायनिक मापदंडों पर आधारित है । बाद के द्वारा मूल्यांकन किया जाता है saponin-mediated एंजाइम बीटा-glucuronidase EVs में. Glucuronidase एक किराए के रूप में कार्य करता है और एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर अणु की दरार के माध्यम से एक आसान मात्रा के लिए अनुमति देता है । वर्तमान प्रोटोकॉल भंडारण की स्थिति की खोज में शोधकर्ताओं के लिए एक उपकरण हो सकता है जो नैदानिक अनुप्रयोग की ओर ev अनुसंधान को उन्नत करने के लिए EV संपत्तियों को बेहतर बनाए रखते हैं ।

Introduction

EVs झिल्ली से बंधे नैनोकणों लगभग सभी प्रकार के सेल द्वारा उत्पादित कर रहे हैं । स्तनधारी कोशिकाओं के लिए, evs अलग उत्पादन रास्ते1,2के साथ दो मुख्य समूहों में subdivided किया जा सकता है । झिल्ली vesicles, लगभग 100-1000 एनएम से एक आकार सीमा के साथ, सीधे कोशिका झिल्ली से नवोदित द्वारा उत्पादित कर रहे हैं । Exosomes, 30-200 एनएम आकार, आवक द्वारा गठित multivesicular निकायों से व्युत्पंन है endosomes में है कि बाद में सेल झिल्ली के साथ फ्यूज के लिए एक बार में एकाधिक exosomes जारी । इन पुटिकाओं के मुख्य समारोह कोशिकाओं3के बीच सूचना के परिवहन है । इस उद्देश्य के लिए, आरएनए, डीएनए, और प्रोटीन जैसे कार्गोस सक्रिय रूप से उन में हल कर रहे हैं । EVs अपने लक्ष्य पर प्रभाव की एक किस्म है, दोनों स्वास्थ्य और रोग राज्य के लिए निहितार्थ के साथ व्यक्त कर सकते हैं । एक तरफ, वे ऊतक पुनर्जनन, प्रतिजन प्रस्तुति, या एंटीबायोटिक प्रभाव, जो उंहें चिकित्सा विज्ञान के रूप में उनके विकास के लिए शुभ लक्ष्य बनाता है के रूप में सकारात्मक प्रभाव मध्यस्थता4,5। दूसरी तरफ, evs ट्यूमर वाहिकीयकरण6को बढ़ावा देने के कर सकते हैं, तनाव प्रतिक्रिया7में दर्शक प्रभाव को प्रेरित, और स्व-प्रतिरक्षित रोग8 और भड़काऊ रोगों9में एक भूमिका निभा सकता है । इस प्रकार, वे कई रोग प्रभाव की एक बेहतर समझ के लिए एक महत्वपूर्ण घटक हो सकता है । हालांकि, कई गुना रोगों में बदल evs की उपस्थिति, जैसे कैंसर10,11,12 और हृदय विकारों13, और रक्त और मूत्र में उनकी आसान पहुँच उन्हें आदर्श बनाता है Biomarkers. अंत में, उनकी अच्छी biocompatibility14 और उनके अंतर्निहित लक्ष्यीकरण क्षमता evs भी दवा वितरण15के लिए दिलचस्प बनाते हैं । इस पांडुलिपि में, हम स्तनधारी कोशिकाओं से व्युत्पंन EVs के भंडारण स्थिरता के मूल्यांकन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन, एक महत्वपूर्ण संपत्ति है कि अभी भी थोड़ा जांच की है ।

Evs के नैदानिक विकास के लिए, वहां अब भी कर रहे है कई बाधाओं को16जीतना, उनके उपचारात्मक प्रभाव, उत्पादन, शुद्धि, और भंडारण के मूल्यांकन सहित17। जबकि-८० ° c EV संग्रहण के लिए स्वर्ण मानक के रूप में व्यापक रूप से देखा जाता है18, आवश्यक फ्रीजर महंगे हैं, और उत्पादन से रोगी के लिए आवश्यक शीत श्रृंखला को बनाए रखने चुनौतीपूर्ण हो सकता है । इसके अलावा, कुछ रिपोर्टों से संकेत मिलता है कि पर भंडारण-८० डिग्री सेल्सियस अभी भी इष्टतम evs को बरकरार रखता है और EV कार्यशीलता में एक नुकसान लाती19,20। अंय तरीकों, जैसे फ्रीज-सुखाने21,22 या स्प्रे सुखाने23, evs के जमे हुए भंडारण के लिए संभावित विकल्प के रूप में प्रस्तावित किया गया है ।

भंडारण स्थिरता का आकलन करने का इष्टतम तरीका कार्यात्मक assays हैं या एक विशिष्ट मार्कर के मूल्यांकन से EVs परीक्षण करने के लिए किया जाएगा, उदाहरण के लिए, उनके जीवाणुरोधी गतिविधि19. यह संभव है जब पुटिकाओं के वांछित प्रभाव जाना जाता है और जब evs के एक विशिष्ट समूह का अध्ययन किया जाना है । यदि अलग सेल स्रोतों से EVs (उदाहरण के लिए, दवा encapsulation के लिए) की तुलना में हो रहे है या यदि कोई ज्ञात कार्यात्मक readout है, यह अब एक प्रत्यक्ष तरीके से भंडारण के कारण परिवर्तन का आकलन संभव है ।

दूसरी ओर, बस अपने भौतिक मापदंडों में परिवर्तन का मूल्यांकन, जैसे आकार, कण वसूली, और प्रोटीन एकाग्रता, हमेशा EV गतिविधि में परिवर्तन की भविष्यवाणी नहीं करता है, के रूप में हाल ही में एक पेटेंट20में दिखाया गया है ।

यहां, हम evs के भंडारण स्थिरता को मापने के लिए एक आसानी से लागू प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए evs के कार्गो के लिए एक किराए के रूप में एक समझाया बीटा glucuronidase एंजाइम की गतिविधि के साथ संयुक्त उनके भौतिक मापदंडों का आकलन । एंजाइम की लोडिंग सैपोनिन ऊष्मायन द्वारा किया जाता है, एक हल्के विभिंन स्रोतों से evs के साथ स्थापित विधि21,24,25। सैपोनइन में ईवी झिल्ली में क्षणिक रंध्र होते हैं, जो एंजाइम को पुटिका में ले जाने की अनुमति देता है । के रूप में एंजाइमों को अपनी गतिविधि खो यदि प्रतिकूल भंडारण की स्थिति के अधीन प्रवण हैं, वे evs के कार्यात्मक कारगुजारियों के संरक्षण के मूल्यांकन के लिए एक आदर्श किराए रहे हैं ।

हमने यह प्रदशत किया है कि इस प्रोटोकोल का प्रयोग मानव मध्योतक स्टेम सेल (एमएससीएस), मानव नाभि शिरा एन्डोथीलियल कोशिकाओं (ह्यूवीसेक), और मानव एडेनोकार्सिनोमा एल्वीकोलर उपकला कोशिकाओं (A549) से प्राप्त ईएचएस के लिए वास्तव में बहुत अंतर में परिणाम विभिंन सेल लाइनों, जो ध्यान में रखा जाना चाहिए जब EV स्रोत21का चयन के बीच भंडारण स्थिरता ।

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Protocol

1. सेल संस्कृति और सेल के उत्पादन-वातानुकूलित माध्यम

  1. आम तौर पर, संबंधित सेल लाइन के लिए आवश्यक व्यक्तिगत परिस्थितियों के तहत कोशिकाओं खेती ।
  2. सीरम मुक्त स्थितियों में या मध्यम में EV-समाप्त भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त (FBS) में 24-72 एच के लिए कोशिकाओं की खेती ।
    नोट: यदि EV-समाप्त FBS प्रयोग किया जाता है, एक विधि को कुशलतापूर्वक सीरम को समाप्त करने के लिए, गोजातीय सीरम के साथ संदूषण को रोकने केलिए साबित रोजगार
  3. माध्यम से ले लीजिए flasks है । ३०० एक्स जी में 10 मिनट के लिए गोली कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र । पेलेटेड कोशिकाओं को परेशान किए बिना, सावधानीपूर्वक सेल-कंडीशन मीडियम (सीसीएम) को इकट्ठा करें । अधिमानतः, CCM सीधे उपयोग करें, या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर की दुकान ।
    नोट: यह हमेशा हौसले से उत्पादित CCM का उपयोग करने के लिए बेहतर है । यदि अधिक समय अवधियों के लिए संग्रहण को दरकिनार नहीं किया जा सकता, तो सभी प्रासंगिक पैरामीटर MISEV2018 दिशानिर्देशों के अनुसार रिकॉर्डकिए जाने चाहिए, और प्राप्त किए गए परिणामों के संभावित पूर्वाग्रह को ध्यान में रखने की आवश्यकता है ।
  4. HUVECs के लिए उदाहरण प्रोटोकॉल
    1. EGM में १२० एच के लिए HUVEC कोशिकाओं की खेती-2 FBS और अन्य की खुराक युक्त माध्यम.
    2. किसी भी अतिरिक्त की खुराक से मुक्त EBM-2 बेसल माध्यम में ४८ एच के लिए HUVEC कोशिकाओं खेती ।
    3. फ्लैक्स से माध्यम ले लीजिए और ऊपर संकेत के रूप में (कदम १.३) केंद्रायन कदम प्रदर्शन । सामान्यतया, एक EV-अलगाव के लिए माध्यम के १०० मिलीलीटर का उपयोग करें ।

2. सीसीएम के ultracentrifugation

  1. Ultracentrifugation (यूसी) के तुरंत पहले, ३,००० एक्स जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सीसीएम के लिए सेल मलबे और बड़े agglomerates को हटाने के लिए अपकेंद्रित्र ।
  2. ध्यान से सुपरनेटंट को यूसी ट्यूब्स में ट्रांसफर कर लें । एक निश्चित कोण रोटर का उपयोग करते हैं, तो यू सी के बाद EV गोली की पुनर्प्राप्ति की सुविधा के लिए अपकेंद्रित्र में ट्यूबों के अभिविन्यास चिह्नित । १२०,००० एक्स जीमें 2 एच के लिए अपकेंद्रित्र, २५९.४ के एक कश्मीर कारक के साथ ।
  3. UC के बाद, ध्यान से supernatant एक सीरम विज्ञानी pipet का उपयोग कर त्यागने, pelleted EVs की अशांति से बचने के लिए ।
    नोट: गोली अदृश्य हो सकता है ।
  4. पहले ट्यूब के लिए ०.२ μm फ़िल्टर फॉस्फेट-buffered खारा (PBS) के २०० μL जोड़ें और PBS का उपयोग करें और अवशिष्ट supernatant ऊपर और नीचे pipetting द्वारा गोली resuspend करने के लिए । संबंधित नमूने के अगले ट्यूब के लिए परिणामी EV निलंबन हस्तांतरण और इसे पुनः निलंबन के लिए उपयोग करें । इस तरह से लगभग 300-350 μL की एक अंतिम मात्रा में नमूना के सभी EVs resuspend करने के लिए आगे बढ़ें ।
  5. पुन: निलंबन के बाद, नैनोकणों ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए) द्वारा कण की उपस्थिति की पुष्टि करें । दिए गए EV प्रकार के लिए ऑप्टिमाइज़ की गई सेटिंग का उपयोग करें, जैसे नीचे दी गई सेटिंग (चरण 2.5.1) ।
    नोट: Gardiner एट al.27 और vestad एट अल.28 के कागजात कैसे evs को मापने के लिए मापदंडों का अनुकूलन करने पर बहुमूल्य जानकारी होती है ।
    1. नीचे वर्णित परिणामों को पुन: उत्पन्न करने के लिए, उपकरणों का उपयोग करें (उदाहरण के लिए, NanoSight LM14) एक हरे रंग की लेजर के साथ सुसज्जित. १.० के एक स्क्रीन लाभ और 13 के एक कैमरा स्तर के साथ 30 एस के तीन वीडियो रिकॉर्ड । विश्लेषण के लिए, १.० की एक स्क्रीन लाभ और 5 का पता लगाने दहलीज का उपयोग करें ।
  6. यदि संभव हो तो गोली तुरंत उपयोग करें; अंयथा, यह 4 डिग्री सेल्सियस रात भर में स्टोर ।

3. EVs में glucuronidase encapsulation

  1. Resuspended गोली करने के लिए, जोड़ें बीटा-glucuronidase (10 मिलीग्राम/एमएल में pbs) के अंतिम एकाग्रता के लिए १.५ मिलीग्राम/एमएल और सैपोनिन (10 मिलीग्राम/एमएल एच2ओ) में ०.१ मिलीग्राम/ 3 एस के लिए vortexing द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं ।
  2. धीरे से ट्यूब flicking द्वारा intermitted मिश्रण के साथ कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेक्यूबेट । ऊष्मायन के बाद, सीधे आकार-अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी (एसईसी) द्वारा शुद्ध (अनुभाग 5 देखें) ।
    नोट: एक बार thawed, ठंड के कारण एंजाइम गिरावट को रोकने के लिए glucuronidase नमूने refreeze नहीं है ।

4. वसाकु उत्पादन

  1. EVs के साथ तुलना के लिए liposomes तैयार करने के लिए, 1, 2-dimyristoyl-sn-ग्लिसरो-3-phosphocholine (dmpc) और 1, 2-dimyristoyl-sn-ग्लिसरो-3-फॉस्फेट (dppc) क्लोरोफॉर्म में 2:3 मोलर राशन में 5 मिमी की अंतिम एकाग्रता । उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमेटोग्राफी (HPLC) शीशियों में 1 मिलीलीटर aliquots तैयार और उंहें रात भर सूखी एक लिपिड फिल्म बनाने के लिए ।
    चेतावनी: क्लोरोफार्म विषाक्त और कैंसर होने की आशंका है । इसे संभालते समय उचित सावधानी बरतें ।
  2. १.५ मिलीग्राम/एमएल ग्लूकुरनिडेस युक्त PBS के 1 मिलीलीटर के साथ लिपिड-फिल्म rehydrate । यह ४२ ° c और भंवर को 1 मिनट के लिए गर्मी । ४२ ° c करने के लिए extruder विधानसभा गर्मी और एक २०० एनएम पॉलीकार्बोनेट झिल्ली के माध्यम से लिपिड निलंबन 11x extruder । एसईसी द्वारा सीधे शुद्ध (अनुभाग 5 देखें) ।

5. सेक द्वारा शुद्धि

  1. निंन प्रोटोकॉल का उपयोग कर सेकंड स्तंभ तैयार करें ।
    1. केवल ताजा शुद्ध पानी और हौसले से तैयार बफ़र्स का प्रयोग करें । एक ०.२ μm झिल्ली फिल्टर के माध्यम से सभी बफ़र्स फ़िल्टर और स्तंभ में हवा बुलबुले के गठन को रोकने के लिए उन्हें देगास ।
    2. एक एसईसी कॉलम की तैयारी के लिए, agarose जेल छानने का काम-आधारित मैट्रिक्स (उदा, Sepharose Cl-2b) या एक और सेकंड EVs और प्रोटीन दोष और अधिक एंजाइम से liposomes को अलग करने के लिए उपयुक्त माध्यम का उपयोग करें । सबसे पहले, 20% EtOH समाधान माध्यम में संग्रहीत किया जाता है निकालें, स्तंभ में हवा बुलबुला गठन को रोकने के लिए । यह अंत करने के लिए, 10 मिनट के लिए ३,००० x जी में सेकंड मध्यम केंद्राग्रह, etoh हटाने, और यह degassed पानी के साथ बदलें ।
    3. 15 मिलीलीटर के निशान के लिए सेकंड माध्यम के साथ एक ग्लास कॉलम (10 मिमी के एक भीतरी व्यास के साथ) भरें ।
      नोट: विभिन्न आयामों वाले स्तंभों के लिए वॉल्यूम अलग होंगे. जेल पूरी तरह से बसने जाने के लिए सुनिश्चित करें ।
    4. एक रन से पहले, कॉलम को PBS के न्यूनतम दो स्तंभ संस्करणों के साथ equilibrate. स्तंभ को संग्रहीत करने के लिए, पहले इसे एक स्तंभ खंड के पानी से धो लें, और उसके बाद 20% EtOH के कम से दो स्तंभ खंड । भंडारण के बाद, पहले स्तंभ को पानी की एक स्तंभ मात्रा के साथ PBS के साथ equilibrating से पहले धो लें ।
    5. एक जुदाई में EV या liposome के ४०० μL का उपयोग निलंबन । 1 मिलीलीटर के अंशों को एकत्रित करें । एसईसी के बाद, या तो शुद्ध EVs की दुकान (7 अनुभाग देखें) या उंहें एक glucuronidase परख विषय (6 अनुभाग देखें) ।
  2. EVs और liposomes को दूषित प्रोटीन और मुक्त glucuronidase से अलग करने की पुष्टि करें । यह अंत करने के लिए, प्रोटीन एकाग्रता और glucuronidase गतिविधि के साथ एकत्र भागों के कण सांद्रता सहसंबंधित ।
    1. एनटीए द्वारा पार्टिकल सांद्रण का आकलन करें (२.५ देखें)
    2. Bicinchoninic एसिड (बीसीए) परख या किसी अंय उपयुक्त प्रोटीन प्रमात्रीकरण परख द्वारा प्रोटीन सामग्री का आकलन करें । निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार परख प्रदर्शन करते हैं ।
    3. Glucuronidase परख द्वारा glucuronidase गतिविधि का आकलन (6 अनुभाग देखें) ।
  3. वैकल्पिक रूप से, ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (tem) और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) द्वारा EV आकारिकी का आकलन ।
    1. TEM नमूने की तैयारी के लिए, एक TEM ग्रिड को EV निलंबन के 10 μL जोड़ें, 10 मिनट के लिए सेने, और फिर दूर किसी भी अतिरिक्त तरल एक फिल्टर कागज का उपयोग कर दाग । 10 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde के 10 μL के साथ निर्धारण प्रदर्शन और दूर किसी भी अतिरिक्त दाग । 3x को पानी से धोएं । 1% फॉस्फर-टंगस्टिक एसिड हाइड्रेट के 30 μl के साथ 20 एस ऊष्मायन द्वारा पुटिकाओं दाग । दूर अतिरिक्त सोख्ता के बाद, रात भर पुटिकाओं सूखी । TEM द्वारा कल्पना ।
      चेतावनी: फ़ॉस्फोटटंगस्टिक एसिड अत्यधिक कास्टिक है; इस प्रकार, त्वचा और आंखों की रक्षा करना ।
    2. SEM के लिए, कार्बन डिस्क पर पहले से तैयार TEM नमूनों को ठीक और उंहें एक ५० एनएम मोटी सोने की परत के साथ धूम । SEM द्वारा कल्पना ।

6. glucuronidase परख

  1. सहसंबंधित कण संख्या और एंजाइम गतिविधि द्वारा विभिन्न नमूनों और भंडारण की स्थिति के बीच तुलना की अनुमति देने के लिए, सबसे पहले एनटीए द्वारा नमूना के कण एकाग्रता को मापने (चरण २.५ देखें).
  2. यौगिक का 1-ल (10 मिग्रा/मिली ज2हे) से १९९-लीटर पीबीएस जोड़कर फ्लूएसेइन डि-β-D-glucuronide का एक कार्यशील समाधान तैयार करें । ८.३ μg/mL की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए शुद्ध EVs के १२५ μL करने के लिए इस समाधान के 25 μL जोड़ें । एक काले ९६-अच्छी तरह से थाली में नमूना pipet । मापन समय बिंदु 0 ज एक प्लेट रीडर के साथ, ४८० एनएम उत्तेजना के रूप में और ५१६ एनएम उत्सर्जन तरंगदैर्घ्य के रूप में उपयोग ।
  3. थाली कसकर कवर (उदाहरण के लिए, पारदर्शी प्लास्टिक की पन्नी के साथ पीसीआर प्लेटों के लिए इस्तेमाल किया) ३७ डिग्री सेल्सियस पर 18 घंटे के लिए अंधेरे में वाष्पीकरण और इनक्यूबेट को कम करने के लिए । Fluorescein उत्पादन को मापने प्लेट रीडर पैरामीटर चरण ६.२ में सूचीबद्ध का उपयोग कर ।

7. EVs और liposomes के भंडारण

नोट: सभी भंडारण प्रयोजनों के लिए, यह उचित है कि कम बाइंडिंग ट्यूबों का उपयोग करने के लिए अधिशोषण के कारण EV हानि को कम करने के लिए ।

  1. नीचे दिए गए प्रतिनिधि परिणामों को पुन: उत्पंन करने के लिए इस अनुभाग में पैरामीटर्स का पालन करें । EV निलंबन के ४०० μL से मिलकर नमूनों का उपयोग करें ।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस या-८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें या नीचे सूचीबद्ध चरणों में आगे बढ़ें ।
    2. EVs lyophilize ।
      1. Trehalose जोड़ें (४० मिलीग्राम/एच2ओ में एमएल) अप करने के लिए एक अंतिम एकाग्रता 4 मिलीग्राम/ -८० डिग्री सेल्सियस से कम 1 घंटे के लिए नमूने फ्रीज ।
      2. निंनलिखित मापदंडों का उपयोग कर नमूने lyophilize । मुख्य सुखाने के लिए, 15 डिग्री सेल्सियस और ०.१८० mbar के लिए दबाव के लिए शेल्फ तापमान सेट और नमूने छोड़ने के लिए ४६ एच के लिए सूखी । अंतिम सुखाने के लिए, शेल्फ तापमान सेट करने के लिए 25 ° c और दबाव के लिए ०.००३५ mbar और नमूने छोड़ने के लिए शुष्क करने के लिए 2 ज. की दुकान lyophilized नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर.
      3. नमूनों को रीहाइड्रेट करने के लिए, H2O जोड़ें, प्रारंभ में मौजूद EV निलंबन की मात्रा के बराबर (सामांयतया, ४०० μl) । रेजल्यूशन के लिए किसी भी बफर का उपयोग न करें ।

8. भंडारण के बाद विश्लेषण

  1. एंजाइम गतिविधि का आकलन करने के लिए सबसे पहले फ्री ग्लूकुरोनिडेस को हटा दें, जो स्टोरेज के दौरान ईवाएस से लीक हो सकता है । शुद्धि के एक अतिरिक्त कदम है कि या तो सेक द्वारा किया जाता है द्वारा प्राप्त (चरण 5 देखें) या असममित प्रवाह क्षेत्र प्रवाह प्रभाजन (AF4) (चरण 8.1.2 देखें) ।
    नोट: कृपया सलाह दी है कि दोनों तरीकों EV नमूना के एक कमजोर पड़ने के लिए नेतृत्व; इस प्रकार, भंडारण से पहले पर्याप्त EV सांद्रता का उपयोग करने के लिए एनटीए प्रमात्रीकरण सीमा से नीचे जाने से बचें । सेकंड या AF4 के कारण कणों की एक 1:10 कमजोर पड़ने की उंमीद है ।
    1. एसईसी शुद्धि के लिए, ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करें (अनुभाग 5 देखें) ।
    2. AF4 शुद्धि करते हैं ।
      1. एक ३५० μm स्पेसर और एक 30 केडी आणविक वजन कट-ऑफ सेल्युलोज झिल्ली के साथ एक छोटे चैनल का उपयोग कर यंत्र की स्थापना की । HPLC पंप और AF4 चैनल के बीच एक ०.१ μm पोर आकार फिल्टर प्लेस । मोबाइल चरण के रूप में ताजा तैयार ०.१ μm फ़िल्टर PBS का उपयोग करने के लिए प्रकाश बिखरने डिटेक्टरों में कण लोड और शोर को कम करने के लिए ।
      2. २८० एनएम के लिए सेट एक यूवी डिटेक्टर का उपयोग कर प्रोटीन का पता लगाने । कणों का पता लगाने के लिए, लेजर सेट के साथ multiangle प्रकाश बिखरने का उपयोग ६५८ एनएम के लिए ।
      3. निंन चलाएं पद्धति का उपयोग करें । 1 मिलीलीटर/मिनट के फोकस प्रवाह के साथ 1 मिनट के लिए पूर्व-फोकस; फिर, ०.२ मिलीलीटर की दर से नमूना के ३०० μL इंजेक्षन और 10 मिनट के लिए ध्यान प्रवाह रखने के लिए । इंजेक्शन के बाद, एक पार प्रवाह है कि 2 मिलीलीटर/मिनट से कम हो जाती है कि एक क्रॉस फ्लो लागू ०.१ करने के दौरान 1 मिलीलीटर/ 1 मिलीलीटर के अंशों लीजिए, १२.५ मिनट के बाद शुरू करने और 27 मिनट तक जारी है ।
    3. ऊपर वर्णित के रूप में glucuronidase परख प्रदर्शन (6 अनुभाग देखें) ।
  2. आकार और एकाग्रता का आकलन करने के लिए, ऊपर वर्णित के रूप में एनटीए का उपयोग करें (चरण २.५ देखें) ।
  3. वैकल्पिक रूप से, TEM और SEM प्रदर्शन के लिए भंडारण के बाद EVs की आकृति विज्ञान का आकलन (५.३ देखें) ।

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Representative Results

चित्र 1 में हाइवेसेक से अलग evs के भंडारण विशेषताओं को प्रदर्शित करता है । Evs यूसी द्वारा अलग थे, glucuronidase समझाया गया था, और सेकंड के बाद, शुद्ध evs एनटीए द्वारा उनके भौतिक गुणों के लिए मूल्यांकन किया गया. पुटिकाओं का एक नमूना बाद में AF4 शुद्धि के अधीन था और glucuronidase गतिविधि मापा गया था.

पुटिकाओं को 4 ° सेल्सियस या-८० डिग्री सेल्सियस पर 7 डी के लिए और 4% trehalose के अलावा के बाद मामले में, lyophilized रूप में 4C में संग्रहित किया गया । भंडारण के बाद, पुटिकाओं एनटीए द्वारा मापा गया था, और AF4 के बाद, शेष glucuronidase गतिविधि प्रति कण मूल्यांकन किया गया था ।

AF4 का कार्य सिद्धांत पटलीय प्रवाह के संयोजन और AF4 चैनल के तल पर छिद्रित झिल्ली के माध्यम से ओर्थोगोनल क्रॉसफ्लो पर आधारित है, जो उनके आकार के अनुसार कणों को प्रभावित करता है (चित्र 2) । छोटे कणों चैनल में आगे स्थित हैं, जबकि बड़े कणों झिल्ली के करीब स्थित होने के लिए करते हैं । स्तरीय प्रवाह के परवलयिक प्रवाह प्रोफ़ाइल के कारण, झिल्ली से दूर और अधिक तेजी से डिटेक्टर की ओर यात्रा कणों, एक कण-आकार से अलग करने के लिए अग्रणी । एक ठेठ AF4 प्रयोग में, इंजेक्शन कणों पहले झिल्ली पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं, चैनल के माध्यम से एक अनुदैर्ध्य प्रवाह के बिना एक क्रॉस प्रवाह लागू करने से (चित्रा 2a) । इंजेक्शन और ध्यान केंद्रित करने के बाद, क्षालन एक साथ एक क्रॉस प्रवाह और fractionate लिए एक अनुदैर्ध्य प्रवाह लागू करने के द्वारा शुरू होता है (चित्रा 2बी), जो हमारे मामले में, evs और मुक्त glucuronidase थे कणों के विभिन्न सबसेट.

चित्रा 3 नैनोकणों के पृथक्करण (evs या liposomes) को दूषित प्रोटीन और nonencapsulated glucuronidase से दिखाता है । Liposomes के एसईसी क्षालन प्रोफाइल (चित्रा 3ए) उनकी तैयारी के बाद शुद्ध (प्रोटोकॉल की धारा 4 देखें) मुक्त एंजाइम से समझाया glucuronidase के साथ कणों के जुदाई दिखाया, बीसीए परख के माध्यम से दोनों का पता लगाया और एंजाइम गतिविधि । वर्तमान उदाहरण में, भाग 6 और 7 आगे के प्रयोगों के लिए चुना जाएगा के रूप में वे उच्चतम कण सांद्रता निहित है और मुक्त glucuronidase के साथ संभव फ्लूराईड को रोकने के लिए । AF4 भी evs मुक्त glucuronidase से अलग करने में सफल रहा था के रूप में चित्रा 3बीमें प्रदर्शन, सेकंड की तुलना में जुदाई के एक उच्च डिग्री के साथ, कम संभावित पुटिकाओं युक्त भागों के संदूषण बनाने.

चित्र 4में, यह सुनिश्चित करने के लिए एक नियंत्रण प्रयोग किया गया कि पुटिका के लिए मापा गया एंजाइम गतिविधि वास्तव में ईएचएस में ग्लूकुरोनिडेस के encapsulation से जुड़ा हुआ था और एंजाइम समुच्चय के कारण नहीं था । इन समुच्चय का गठन किया गया है के साथ glucuronidase के ऊष्मायन के कारण सैपोनिन और झूठी सकारात्मक परिणाम के लिए सीसा. भागों की पुष्टि करने के लिए जहां पुटिकाओं होगा elute, शुद्ध evs के बिना समझाया glucuronidase एक ही स्तंभ पर नमूना के रूप में सेकंड के अधीन थे सिर्फ सैपोनिन और एंजाइम युक्त.

जब glucuronidase सैपोलिन के साथ इनक्यूबेटिड और बाद में सेकंड से शुद्ध किया गया था, कोई एंजाइम गतिविधि आमतौर पर EVs युक्त अंशों में पाया गया था. जबकि कणों की छोटी मात्रा में EVs के रूप में एक ही समय में elute करने के लिए पाया गया (ऊपर एक ठेठ EV गोली से बरामद कणों का 0.1% < बना), कोई सहसंबद्ध एंजाइम गतिविधि था । इन परिणामों से पता चलता है कि पुटिकाओं युक्त भागों में सक्रिय एंजाइम उन में समझाया गया था ।

चित्रा 5 nonencapsulated डाई को दूर करने के साथ या अतिरिक्त AF4 शुद्धि के बिना भंडारण के बाद सक्रिय एंजाइम की वसूली की तुलना. AF4 शुद्धि के साथ, वहाँ आम तौर पर प्रति कण एंजाइम की कम वसूली, भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस है, जहां दो तिहाई से वसूली बूंदें पर उच्चतम प्रभाव के साथ है । इस प्रकार, इस अतिरिक्त शुद्धि कदम omitting एंजाइम स्थिरता के बारे में गलत मांयताओं के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।

अंक 6 Mscs, A549 कोशिकाओं, और liposomes से व्युत्पंन पर एक cryoprotectant बिना lyophilization के प्रभाव को दर्शाता है, ठंड के साथ तुलना में-८० डिग्री सेल्सियस । कणों TEM और SEM द्वारा imaged के रूप में ऊपर वर्णित (प्रोटोकॉल के चरण ५.३ देखें) थे । MSCs और A549 EVs TEM छवियों में आकार में बड़े अंतर प्रदर्शन नहीं किया, दो भंडारण शर्तों की तुलना । SEM चित्रों में, तथापि, lyophilized नमूनों में नहीं मिला समुच्चय प्रदर्शित-८० ° c नमूने । Liposomes भी SEM चित्र में समुच्चय प्रदर्शित, जबकि TEM में, lyophilization को liposomes के आकार में वृद्धि प्रेरित दिखाई दिया । Cryoprotectants बिना lyophilization भी भंडारण के बाद बरकरार glucuronidase की वसूली कम (चित्रा 7) । एक cryoprotectant के रूप में trehalose के अलावा एक खुराक पर निर्भर तरीके से सक्रिय एंजाइम की वसूली में वृद्धि हुई ।

चित्र 8 में फ्लोरेसिइन डि-β-डी-ग्लूकर्नाइड का रूपांतरण मुक्त फ्लुओर्ससिइन को दर्शाया गया है, जो ग्लुकोरोनिडेस परख में हो रहा है । जबकि educt ५१६ एनएम पर nonफ्लोरोसेंट था, fluorescein इस तरंग दैर्ध्य पर अत्यधिक फ्लोरोसेंट है । यह उच्च संवेदनशीलता के साथ एक सीधा एंजाइम गतिविधि परख के लिए अनुमति दी ।

Figure 1
चित्रा 1 : HUVEC EVs के भंडारण स्थिरता । (क) भंडारण से पहले की तुलना में कण की वसूली, (ख) माध्य आकार, और (ग) Huvecs से अलग evs के प्रति कण सामान्य ग्लूकुरोनिडेज़ गतिविधि । 4% trehalose के साथ lyophilization के बाद 4 ° c और-८० ° c पर और 4 डिग्री सेल्सियस पर 7 डी के लिए बुलबुले का भंडारण किया गया । मतलब आकार और कण वसूली एनटीए द्वारा मापा गया; प्रति कण glucuronidase गतिविधि एनटीए डेटा और glucuronidase परख के परिणाम और भंडारण से पहले करने के लिए सामान्यीकृत के संयोजन की गणना की गई थी । मतलब ± SD, n = 3, *p < ०.०५ (एक तरह का Anova है tukey के बाद तदर्थ परीक्षण के बाद) । फ्रैंक एट अल21से संशोधित । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 : AF4 के काम के सिद्धांत । (क) ईएचएस और फ्री ग्लूकुरोनिडेस को क्रास फ्लो लगाकर इंजेक्शन लगाने के बाद फोकस किया जाता है । (ख) इसके बाद, आर-पार प्रवाह के साथ चैनल के माध्यम से प्रवाह को संयोजित करके ईएचएस और मुक्त एंजाइम को अलग से प्रवेश दिया जाता है । फ्रैंक एट अल21से संशोधित । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 : मुक्त glucuronidase से EVs और liposomes के जुदाई । (क) ग्लुकोरोनिडेस-लोडेड लिपिड, फ्री ग्लूकोनिडेडेस, और प्रोटीन संदूषकों का प्रतिनिधिक सेक पृथक्करण । ग्राफ कण एकाग्रता (लाल), प्रोटीन एकाग्रता (नीला), और glucuronidase गतिविधि (हरा) प्रदर्शित करता है । (ख) मुक्त ग्लूकुरोनिडेस से ईएचएस के पृथक्करण का प्रदर्शन । अनुपचारित EVs, ०.०५ मिलीग्राम/एमएल glucuronidase, मुफ्त glucuronidase के साथ नुकीला EVs (०.५ मिलीग्राम/एमएल), और glucuronidase के साथ भरा EVs और सेकंड (EV glucuronidase) द्वारा शुद्ध इंजेक्शन और २८० एनएम और ९० ° प्रकाश बिखरने पर यूवी द्वारा विश्लेषण किया गया । मुक्त एंजाइम EVs से अलग से eluted । फ्रैंक एट अल21से संशोधित । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4 : मुक्त glucuronidase से EVs के शुद्धिकरण के लिए नियंत्रण प्रयोगों. ४०० μL का मूल EVs या ४०० μL १.५ मिलीग्राम/एमएल glucuronidase PBS में 10 मिनट के लिए इंक्यूबेटिड ०.१ मिलीग्राम/एमएल सैपोलिन के साथ सेकंड द्वारा शुद्ध किया गया था (क) पुटिका और ग्लूकुरोनिडेस के एकत्रित भागों के कण सांद्रता शुद्घ ग्लूकोनिडेडेस । (ख) इसी प्रयोग में २८० एनएम पर यूवी अवशोषण मापा गया । Glucuronidase के लिए पहली छोटी चोटी पैनल एमें ग्रे लाइन के साथ मेल खाती है इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5 : अतिरिक्त शुद्धीकरण के प्रभाव EV भंडारण के बाद कदम । भंडारण के बाद एक अतिरिक्त AF4 शुद्धि कदम के साथ या बिना d0 की तुलना में प्रति कण glucuronidase गतिविधि शेष. HUVEC EVs 7 डी के लिए 4 डिग्री सेल्सियस या-८० डिग्री सेल्सियस और lyophilized 4% trehalose के साथ संग्रहित किया गया । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6 : और EVs के SEM चित्रों Tem । TEM और SEM चित्रों से EVs के (क) mscs और (ख) A549 कोशिकाओं और (ग) liposomes । नमूने के लिए संग्रहित किया गया था 14 डी में-८० ° c या trehalose के अलावा बिना lyophilized । तीर tem चित्रों और SEM चित्रों में समुच्चय में आकृति विज्ञान बदल कणों की उपस्थिति से संकेत मिलता है । फ्रैंक एट अल21से संशोधित । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7 : Lyophilization के बाद एंजाइम वसूली पर trehalose का प्रभाव । 14 दिनों के लिए lyophilization के बाद एंजाइम गतिविधि की तुलना, 0%, 1% के साथ, और 4% trehalose नमूने के साथ भंडारण से पहले (0 दिन) । फ्रैंक एट अल21से संशोधित । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 8
अंक 8 : के एंजाइमी दरार फ्लूरिसेइन डि-β-D-ग्लूकर्नाइड glucuronidase द्वारा । इस योजना में ग्लुकोनोनिडेस का पता लगाने के लिए अंतर्निहित प्रतिक्रिया को समझाया गया है । गैर फ्लोरोसेंट फ्लोरोसेइन di-β-D-glucuronide glucuronidase द्वारा cleaved है । चीनी के अवशेषों को हटाने के माध्यम से, फ्लोरेसेइन अपने फ्लोरोसेंट गुणों को पुनर्स्थित करता है । ऊष्मायन अवधि के बाद मापा प्रतिदीप्ति सक्रिय एंजाइम मौजूद की राशि के साथ संबद्ध है और glucuronidase परख के readout है. इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस पांडुलिपि में, हम विभिंन भंडारण की स्थिति के तहत EVs की स्थिरता का अध्ययन करने के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । एक कार्यात्मक readout के रूप में समझाया glucuronidase के संयोजन और evs के भौतिक मापदंडों के मूल्यांकन के साथ, प्रोटोकॉल evs के एक सरल भंडारण स्थिरता मूल्यांकन और अलग सेल से evs की तुलना के लिए अनुमति देता है लाइनों. SEM और TEM पूरक तरीकों के रूप में एक-कण के स्तर पर EVs के परिवर्तन में एक अंतर्दृष्टि की अनुमति देते हैं । यहां प्रस्तुत परिणाम EVs और liposomes की एक प्रवृत्ति को एक cryoprotectant बिना lyophilization के कारण कुल दिखाया (चित्रा 6) । हालांकि, यह केवल SEM प्रयोगों में मनाया गया । जबकि EM इमेजिंग नमूनों कि trehalose के साथ संरक्षित किया गया के साथ आयोजित नहीं किया गया था, साहित्य पता चलता है कि यह cryoprotectant वास्तव में EVs29के एकत्रीकरण को कम कर सकते हैं । यह भी आकलन करने के लिए संभव है, अगर एक दिया भंडारण हालत व्यवकलीय EV आकार को प्रभावित करता है, वसूली की दर और समझाया अणुओं. इस तरह के एक प्रभाव HUVEC EVs के लिए प्राप्त परिणामों से उदाहरण है (चित्रा 1). जबकि 4 डिग्री सेल्सियस और-८० डिग्री सेल्सियस के लिए कण वसूली lyophilized नमूनों के लिए बेहतर था, सक्रिय समझाया glucuronidase की वसूली lyophilized नमूनों के लिए सबसे अच्छा था । EVs के lyophilization अधिक अनुकूल भंडारण की स्थिति हो सकती है, उदाहरण के लिए, जब EV biomarkers, जहां ध्यान और प्राप्त करने के बजाय बरकरार vesicles पर बरकरार माल के संरक्षण पर अधिक है विश्लेषण ।

EVs22के lyophilization पर अपने हाल के पेपर में, charoenviriyakul एट अल. एक तुलनीय दृष्टिकोण के बाद । भौतिक मापदंडों के बारे में, वे polydispersity सूचकांक (pdi) और जीटा क्षमता पर ध्यान केंद्रित, जीटा क्षमता में परिवर्तन के रूप में कम कोलाइडयन स्थिरता के साथ सहसंबंधित कर सकते हैं. हालांकि, जीटा क्षमता केवल30स्थिरता में मनाया परिवर्तन की व्याख्या नहीं कर सकते, जो भी उनके परिणामों में परिलक्षित किया गया था । उंहोंने यह भी polyacrylamide जेल electrophoresis द्वारा संग्रहीत EVs के प्रोटीन और आरएनए सामग्री की तुलना में । यह तकनीक बहुत अच्छी तरह से vesicles प्रोटीन या आरएनए सामग्री में काफी परिवर्तन का संकेत कर सकते हैं । हालांकि, यह विधि यहां प्रस्तुत की तुलना में बहुत अधिक मात्रा में सामग्री की आवश्यकता है । EV कार्गो पर भंडारण के प्रभाव का आकलन करने के लिए, Charoenviriyakul एट अल. विषमजातीय अपने EV निर्माता सेल लाइन में एक एंजाइम और डीएनए प्रजातियों में से प्रत्येक व्यक्त की और EVs में उनकी गतिविधि और अखंडता पर नजर रखी । हालांकि, इस तरह के heterologous अभिव्यक्ति उपयुक्त नहीं है अगर विभिंन स्रोतों से EVs की तुलना में है, क्योंकि यह प्रत्येक नई कोशिका लाइन के लिए समय की एक पर्याप्त राशि की आवश्यकता है, जबकि सरल saponin-mediated encapsulation आसानी से लागू किया जा सकता है ।

यह किसी भी nonencapsulated एंजाइम को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में चित्र 3में दिखाया गया है । EV-encapsulated glucuronidase अपने सब्सट्रेट के साथ समाधान में मुक्त एंजाइम से बहुत धीमी प्रतिक्रिया करता है, encapsulated दक्षता का एक overestimation के लिए अग्रणी. साफ जुदाई भंडारण के बाद विश्लेषण के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, के रूप में भंडारण की स्थिति अलग नमूने में मुक्त glucuronidase की गतिविधि को प्रभावित कर सकता है और क्षतिग्रस्त EVs से रिसाव के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. यह हमारे प्रयोगों में स्पष्ट था (चित्रा 5), glucuronidase परख से पहले AF4 के आवेदन के रूप में vesicles में समझाया नहीं डाई को हटाने के लिए प्रबंधित. इस प्रकार, यह यहां चर्चा भंडारण तरीकों के प्रभाव पर स्पष्ट परिणाम प्राप्त करने के लिए संभव बनाया है, जबकि AF4 के बिना, गतिविधि भंडारण के कारण नुकसान को कम करके आंका गया होगा ।

एक अंय महत्वपूर्ण विचार अलगाव और EVs के लक्षण वर्णन के लिए उनकी स्थिरता के लिए परीक्षण किया है । हालांकि वर्णित तकनीक विभिंन स्रोतों से evs की तुलना में सक्षम बनाता है, यह केवल अगर उन सभी को एक ही अलगाव विधि द्वारा तैयार कर रहे है तो परिणाम विकृत नहीं कर रहे है संभव है18,31,३२। इस संदर्भ में, सेल संस्कृति शर्तों को भी ध्यान में रखा जाना चाहिए, क्योंकि वे अलग EVs३३की मात्रा और bioactivity को प्रभावित कर सकते हैं । परिणाम है कि अंय प्रकाशित परिणामों की तुलना में किया जा सकता है प्राप्त करने के लिए, यह सलाह दी जाती है हाल ही में अद्यतन "extracellular vesicles के अध्ययन के लिए ंयूनतम जानकारी" कि EV अनुसंधान26के सामंजस्य के लिए दिशानिर्देश शामिल है ।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, हम भंडारण के बाद मुक्त एंजाइम को हटाने के लिए सेकंड या AF4 का इस्तेमाल किया । अंय विधियों, जैसे ग्रैडिएंट ultracentrifugation, UC, या ultraनिस्यंदन३४के रूप में लागू किया जा सकता है । केंद्रापसारक तरीकों की तुलना में, एसईसी और AF4 कम समय लेने वाली है (जैसे, सेकंड के लिए लगभग १.५ घंटे बनाम 16 ज करने के लिए या अधिक ढाल यूसी के लिए अधिक) और वे सामान्य यूसी, की तुलना में EVs से मुक्त प्रोटीन पूरी तरह से अलग कर सकते हैं, जहां वहां हमेशा गोली के साथ अवशिष्ट supernatant रहता है । इसके अलावा,15 सेक और AF4३५ हल्के तरीके, जो evs पर कम कतरनी तनाव प्रेरित कर रहे हैं । इसकी तुलना में, UC के दौरान ईएचएस पर लगाए गए बल कणों के परिवर्तन का कारण बन सकते हैं, जैसे आकार में एकत्रीकरण और परिवर्तन३४,३६।

सेकंड और AF4 के एक नुकसान के नमूनों की कमजोर पड़ने है । इस प्रकार, यह कई शुद्धिकरण कदम के बाद एनटीए माप के लिए आवश्यक सांद्रता को बनाए रखने के लिए EVs की पर्याप्त मात्रा को अलग करने के लिए आवश्यक है । EV भिंनों केंद्रापसारक फिल्टर का उपयोग कर केंद्रित किया जा सकता है लेकिन, फिल्टर सामग्री और प्रोटोकॉल पर निर्भर करता है, वहां पुटिकाओं३७की हानि हो सकती है ।

प्रोटोकॉल की सीमा यहां पर चर्चा की है कि यह केवल exogenously समझाया glucuronidase के एंजाइम गतिविधि पर नज़र रखता है, न तो समझाया आरएनए और डीएनए खाते में ले रही है और न ही EV सतह प्रोटीन है कि कार्यशीलता के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है18 . नए EV चिकित्सा विज्ञान के अनुसंधान के लिए, इस तकनीक की जगह नहीं कर सकते assays कार्यक्षमता पर लेकिन उंहें बधाई देता हूं और आशय स्थिरता के बारे में एक संकेत दे । यह महान उपयोग का हो सकता है अगर, उदाहरण के लिए, biofluids से व्युत्पंन evs उनके आशय सामग्री के बाद में विश्लेषण के लिए संग्रहीत किया जाना है ।

भविष्य में, इस प्रोटोकॉल के क्षेत्र में भी अंय जीवों से व्युत्पंन EVs, उदाहरण के लिए, बैक्टीरियल बाहरी झिल्ली vesicles शामिल करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है । एक और दिलचस्प अगले कदम के लिए सैपोनिन ऊष्मायन द्वारा न्यूक्लिक एसिड के encapsulation परीक्षण और भी डीएनए या आरएनए cargos की स्थिरता में देखने के लिए किया जाएगा ।

अंत में, यह प्रक्रिया एक भौतिक रासायनिक और एक कार्यात्मक readout दोनों को एकीकृत करके विभिन्न स्तनधारी कोशिका स्रोतों से EVs के भंडारण स्थिरता के मूल्यांकन के लिए एक सरल तरीका प्रदान करता है. इस विस्तृत प्रोटोकॉल EV शोधकर्ताओं उनके vesicles के लिए उपयुक्त भंडारण की स्थिति का एक सीधा निर्धारण की अनुमति होगी ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

NanoMatFutur शिक्षा और अनुसंधान, जर्मनी (अनुदान संख्या 13XP5029A) के संघीय मंत्रालय से जूनियर अनुसंधान कार्यक्रम इस काम का समर्थन किया । एक पीएच. डी. फैलोशिप के जरिए maximilian रिक्टर को Studienstiftung des Deutschen Volkes (जर्मन अकादमिक छात्रवृत्ति फाउंडेशन) द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC) Sigma-Aldrich P2663-25MG
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC) Sigma-Aldrich P4329-25MG
225 cm² cell culture flasks Corning 431082 Used with 25 ml of medium
30 kDa regenerated cellulose membrane Wyatt Technology Europe 1854
350 µm spacer Wyatt Technology Europe
Automated fraction collector Thermo Fisher Scientific
Beta-glucuronidase Sigma-Aldrich G7646-100KU
Chloroform Fisher scientific C/4966/17
Column oven Hitachi High-Technologies Europe
D-(+)-Trehalose dihydrate Sigma-Aldrich T9531-10G
DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector  Wyatt Technology Europe
Durapore Membrane filter, PVDF,  0,1 µm, 47 mm Merck VVLP04700 Used for the preparation of buffers for AF4
EBM-2 Lonza Verviers, S.p.r. CC-3156 Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells
Eclipse dualtec Wyatt Technology Europe
EGM-2 Lonza Verviers, S.p.r. CC-3162 Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells
ELISA Plate Sealers R&D Systems DY992 used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay
Ethanol Fisher scientific E/0665DF/17
Extruder Set With Holder/Heating Block Avanti Polar Lipids 610000-1EA
Filter support Avanti Polar Lipids 610014-1EA used for liposome preparation
Fluorescein di-β-D-glucoronide Thermo Fisher Scientific F2915
Gibco PBS-tablets+CA10:F36 Thermo Fisher Scientific 18912014
Hettich Universal 320 R Andreas Hettich GmbH & Co.KG Used for pelleting cells at 300 g
Hettich Rotina 420 R Andreas Hettich GmbH & Co.KG Used for pelleting larger debris at 3000 g
HUVEC cells Lonza Verviers, S.p.r. C2517A
Kimble  FlexColumn 1X30CM Kimble 420401-1030
Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC Christ
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene VWR international 525-0255 the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery
Nanosight LM14 equipped with a green laser Malvern Pananalytical
Nanosight-software version 3.1 Malvern Pananalytical
Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes Whatman/GE Healthcare 110406 used for liposome preparation
PEEK Inline filter holder Wyatt Technology Europe
Phosphotungstic acid hydrate Sigma-Aldrich 79690-25G
Polycarbonate bottles for ultracentrifugation Beckman Coulter 355622
QuantiPro BCA Assay Kit Sigma-Aldrich QPBCA-1KT
Saponin Sigma-Aldrich 47036
Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15 Carl Zeiss AG
Sepharose Cl-2b GE Healthcare 17014001
SEM copper grids with carbon film Plano S160-4
Small AF4 channel Wyatt Technology Europe
Sputter-coater Q150R ES Quorum Technologies
Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011 Oxford Instruments
Type 45 Ti ultracentrifugation rotor Beckman Coulter 339160
Ultimate 3000 Dionex autosampler Thermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Dionex isocratic pump Thermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasser Thermo Fisher Scientific
Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K Beckman Coulter
UV detector Thermo Fisher Scientific
Whatman 0.2 µm pore size mixed cellulose filter Whatman/GE Healthcare 10401712 Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC

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References

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बाह्य पुटिका के भंडारण स्थिरता का मूल्यांकन
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Richter, M., Fuhrmann, K., Fuhrmann, G. Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (147), e59584, doi:10.3791/59584 (2019).

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