Summary
Qui presentiamo un protocollo prontamente applicabile per valutare la stabilità di stoccaggio delle vescicole extracellulari, un gruppo di nanoparticelle naturali prodotte dalle cellule. Le vescicole sono caricate con glucuronidasi come un enzima modello e immagazzinate in condizioni diverse. Dopo la conservazione, vengono valutati i loro parametri fisico-chimici e l'attività dell'enzima incapsulato.
Abstract
Le vescicole extracellulari (EV) sono obiettivi promettenti nella ricerca corrente, da utilizzare come farmaci, portatori di droghe e biomarcatori. Per il loro sviluppo clinico, non solo la loro attività farmaceutica è importante, ma anche la loro produzione deve essere valutata. In questo contesto, la ricerca si concentra sull'isolamento degli EV, sulla loro caratterizzazione e sulla loro conservazione. Il presente manoscritto mira a fornire una facile procedura per la valutazione dell'effetto delle diverse condizioni di conservazione sugli EV, senza manipolazione genetica o saggi funzionali specifici. In questo modo è possibile ottenere rapidamente una prima impressione della stabilità dei veicoli elettrici in una determinata condizione di conservazione e i veicoli elettrici derivati da diverse fonti cellulari possono essere confrontati facilmente. La misurazione della stabilità si basa sui parametri fisico-chimici degli EV (dimensioni, concentrazione delle particelle e morfologia) e sulla conservazione dell'attività del loro carico. Quest'ultimo è valutato dall'incapsulamento mediato da saponina dell'enzima beta-glucuronidasi nel svi. La glucuronidasi agisce come surrogato e consente una facile quantificazione attraverso la scissione di una molecola reporter fluorescente. Il presente protocollo potrebbe essere uno strumento per i ricercatori nella ricerca di condizioni di conservazione che conservino in modo ottimale le proprietà EV per far avanzare la ricerca EV verso l'applicazione clinica.
Introduction
Gli EV sono nanoparticelle legate a membrana prodotte da quasi tutti i tipi di cellule. Per le cellule di mammifero, i veicoli elettrici possono essere suddivisi in due gruppi principali con percorsi di produzione distinti1,2. Le vescicole di membrana, con una gamma di dimensioni da circa 100-1000 Nm, sono prodotte da erba diretta dalla membrana cellulare. Gli esosomi, di dimensioni 30-200 Nm, derivano da corpi multivesicolari formati dall'interno in erba in endosomi che successivamente si fondono con la membrana cellulare per rilasciare più esosomi contemporaneamente. La funzione principale di queste vescicole è il trasporto di informazioni tra le cellule3. A questo scopo, i carichi come RNA, DNA e proteine sono attivamente ordinati in loro. I veicoli elettrici possono trasmettere una varietà di effetti sui loro bersagli, con implicazioni sia per la salute che per lo stato di malattia. Da un lato, essi mediano effetti positivi come la rigenerazione dei tessuti, presentazione di antigene, o effetti antibiotici, che li rende obiettivi propizi per il loro sviluppo come Therapeutics4,5. Dall'altro lato, gli EV possono promuovere la vascolarizzazione tumorale6, indurre gli effetti spettatore nelle risposte di stress7, e potrebbe svolgere un ruolo nelle malattie autoimmuni8 e malattie infiammatorie9. Così, potrebbero essere un componente chiave per una migliore comprensione di molti effetti patologici. Tuttavia, la presenza di EV alterati in molteplici malattie, come il cancro10,11,12 e disturbi cardiovascolari13, e la loro facile accessibilità nel sangue e nelle urine li rende ideali Biomarcatori. Infine, la loro buona biocompatibilità14 e la loro intrinseca capacità di targeting rendono gli EVS anche interessanti per la consegna di farmaci15. In questo manoscritto, descriviamo un protocollo per la valutazione della stabilità di stoccaggio dei veicoli elettrici derivati da cellule di mammiferi, una proprietà importante che è ancora poco indagata.
Per lo sviluppo clinico di EV, ci sono ancora molti ostacoli per superare16, tra cui la valutazione dei loro effetti terapeutici, produzione, purificazione, e stoccaggio17. Mentre-80 ° c è ampiamente visto come il gold standard per lo stoccaggio di EV18, i congelatori necessari sono costosi, e mantenere la catena di freddo necessaria dalla produzione al paziente può essere impegnativo. Inoltre, alcune segnalazioni indicano che la conservazione a-80 ° c non conserva in modo ottimale le SVE e induce una perdita della funzionalità EV19,20. Altri metodi, come la liofilizzazione21,22 o l'essiccazione a spruzzo23, sono stati proposti come potenziali alternative alla conservazione congelata di EVS.
Il modo ottimale per valutare la stabilità dello stoccaggio sarebbe quello di testare i veicoli elettrici in saggi funzionali o la valutazione di un marcatore specifico, ad esempio, la loro attività antibatterica19. Questo è possibile quando l'effetto desiderato delle vescicole è noto e quando un gruppo distinto di EV deve essere studiato. Se i veicoli elettrici provenienti da diverse fonti cellulari devono essere confrontati (ad esempio, per l'incapsulamento dei farmaci) o se non esiste una lettura funzionale nota, non è più possibile valutare le modifiche dovute allo stoccaggio in modo diretto.
D'altra parte, semplicemente valutando i cambiamenti nei loro parametri fisico-chimici, come la dimensione, il recupero delle particelle, e la concentrazione proteica, non sempre prevedere i cambiamenti nell'attività EV, come è stato dimostrato in un recente brevetto20.
Qui, forniamo un protocollo prontamente applicabile per misurare la stabilità di stoccaggio dei veicoli elettrici valutando i loro parametri fisico-chimici combinati con l'attività di un enzima beta-glucuronidasi incapsulato come surrogato per il carico dei veicoli elettrici. Il carico dell'enzima è fatto da incubazione di saponina, un metodo delicato stabilito con EVS da diverse fonti21,24,25. La saponina forma i pori transitori nella membrana EV, che consente l'assorbimento enzimatico nella vescicola. Poiché gli enzimi sono inclini a perdere la loro attività se sottoposti a condizioni di conservazione sfavorevoli, sono un surrogato ideale per la valutazione della conservazione dei carichi funzionali dei veicoli elettrici.
Abbiamo dimostrato che l'applicazione di questo protocollo agli EVs derivati da cellule staminali mesenchimali umane (MSC), cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVECs) e cellule epiteliali alveolari dell'adenocarcinoma umano (A549) si traducono in grandi differenze nel stabilità di stoccaggio tra le diverse linee cellulari, che dovrebbe essere presa in considerazione quando si sceglie la sorgente EV21.
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Protocol
1. coltura cellulare e produzione di supporti cellulari condizionati
- In genere, coltivare le cellule nelle condizioni individuali necessarie per la rispettiva linea cellulare.
- Coltivare le cellule per 24-72 h in condizioni prive di siero o in media contenenti siero bovino fetale impoverito EV (FBS).
Nota: se si utilizza FBS EV-impoverito, impiegare un metodo provato a esaurire efficacemente il siero, per prevenire la contaminazione con i bovini derivati da siero bovino26. - Raccogli il supporto dalle palloni. Centrifugare a 300 x g per 10 min per pellet le cellule. Raccogliere con cautela il fluido cellulare condizionato (CCM), senza disturbare le cellule pellettate. Preferibilmente, utilizzare direttamente la CCM o conservarla durante la notte a 4 ° c.
Nota: è sempre preferibile utilizzare CCM appena prodotto. Se la conservazione per periodi di tempo più lunghi non può essere aggirata, tutti i parametri pertinenti devono essere registrati in conformità alle linee guida MISEV201826e i potenziali pregiudizi dei risultati acquisiti devono essere presi in considerazione. - Protocollo di esempio per HUVECs
- Coltivare le cellule HUVEC per 120 h nel mezzo EGM-2 contenente FBS e altri supplementi.
- Coltivare le cellule HUVEC per 48 h in medio basale EBM-2 privo di eventuali supplementi aggiuntivi.
- Raccogliere il supporto dalle palloni ed eseguire la fase di centrifugazione come sopra indicato (passo 1,3). In genere, utilizzare 100 mL di mezzo per un isolamento EV.
2. ultracentrifugazione della CCM
- Immediatamente prima dell'ultracentrifugazione (UC), centrifugare la CCM per 15 minuti a 3.000 x g e 4 ° c per rimuovere i detriti cellulari e i grandi agglomerati.
- Trasferire con cautela il supernatante ai tubi UC. Se si utilizza un rotore ad angolo fisso, contrassegnare l'orientamento dei tubi nella centrifuga per facilitare il recupero del pellet EV dopo l'UC. Centrifugare per 2 h a 120.000 x g, con un fattore k di 259,4.
- Dopo UC, eliminare con cautela il supernatante utilizzando un Pipet sierologico, per evitare il disturbo dei EV pellettati.
Nota: il pellet potrebbe essere invisibile. - Aggiungere 200 μL di soluzione salina tamponata con fosfato di 0,2 μm (PBS) al primo tubo e utilizzare PBS e il surnatante residuo per risospendere il pellet pipettando su e giù. Trasferire la sospensione EV risultante al tubo successivo del rispettivo campione e utilizzarlo per la risospensione. Procedere in questo modo per risospendere tutte le EVs del campione in un volume finale di circa 300-350 μL.
- Dopo la risospensione, confermare la presenza di particelle mediante analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA). Utilizzare le impostazioni ottimizzate per il tipo di EV specificato, ad esempio le impostazioni riportate di seguito (passaggio 2.5.1).
Nota: le carte di Gardiner et al.27 e vestad et al.28 contengono preziose informazioni su come ottimizzare i parametri per la misurazione degli svi.- Per riprodurre i risultati descritti di seguito, utilizzare strumenti (ad esempio, NanoSight LM14) dotati di un laser verde. Registra tre video di 30 s con un guadagno dello schermo di 1,0 e un livello di fotocamera di 13. Per l'analisi, utilizzare un guadagno dello schermo di 1,0 e una soglia di rilevamento di 5.
- Utilizzare il pellet immediatamente, se possibile; in caso contrario, conservarlo a 4 ° c durante la notte.
3. incapsulamento della glucuronidasi in EVs
- Al pellet risospeso, aggiungere la beta-glucuronidasi (10 mg/mL in PBS) ad una concentrazione finale di 1,5 mg/mL e saponina (10 mg/mL in H2O) a una concentrazione finale di 0,1 mg/ml. Mescolare bene con vortex per 3 s.
- Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente con miscelazione intermitted agitando delicatamente il tubo. Dopo l'incubazione, purificare direttamente per cromatografia di esclusione dimensionale (SEC) (vedere paragrafo 5).
Nota: non ricongelare i campioni di glucuronidasi una volta scongelati, per prevenire la degradazione enzimatica a causa del congelamento.
4. produzione di liposoma
- Per preparare i liposomi per il confronto con EVs, sciogliere 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-foshocholine (DMPC) e 1,2-dipalmitoyl-sn-glicerolo-3-FOSHOCHOLINE (DPPC) in una razione molare 2:3 in cloroformio a una concentrazione finale di 5 mm. Preparare le aliquote da 1 mL nei flaconcini di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e lasciarle asciugare durante la notte per formare un film lipidico.
Attenzione: il cloroformio è tossico e sospettato di essere cancerogeno. Prendere le dovute precauzioni durante la manipolazione. - Reidratare il film lipidico con 1 mL di PBS contenente 1,5 mg/mL di glucuronidasi. Riscaldalo a 42 ° c e vortice per 1 min. riscaldare il gruppo estrusore a 42 ° c ed estungere la sospensione lipidica 11x attraverso una membrana in policarbonato 200 Nm. Purificare direttamente da SEC (vedere paragrafo 5).
5. purificazione per SEC
- Preparare la colonna SEC utilizzando il seguente protocollo.
- Utilizzare solo acqua depurata fresca e tamponi appena preparati. Filtrare tutti i buffer attraverso un filtro a membrana 0,2 μm e Degas per evitare la formazione di bolle d'aria nella colonna.
- Per la preparazione di una colonna SEC, utilizzare una matrice a base di filtrazione in gel di agarosio (ad es. Sepharose CL-2B) o un altro mezzo SEC idoneo a separare gli EV e i liposomi dalle impurità proteiche e dall'enzima in eccesso. In primo luogo, rimuovere la soluzione di EtOH 20% il mezzo è memorizzato in, per evitare la formazione di bolle d'aria nella colonna. A tal fine, centrifugare il mezzo SEC a 3.000 x g per 10 min, togliere l'ETOH e sostituirlo con acqua degassata.
- Riempire una colonna di vetro (con un diametro interno di 10 mm) con il SEC medio al segno 15 mL.
Nota: i volumi saranno diversi per le colonne con dimensioni diverse. Assicuratevi di lasciare che il gel si deposita completamente. - Prima di una corsa, equilibrare la colonna con almeno due volumi di colonna di PBS. Per memorizzare la colonna, prima lavarla con un volume di colonna di acqua, seguita da almeno due volumi di colonna del 20% EtOH. Dopo lo stoccaggio, lavare la colonna prima con un volume di colonna di acqua prima di equilibrare con PBS.
- Utilizzare fino a 400 μL di sospensione EV o liposoma in una sola separazione. Raccogli frazioni da 1 mL. Dopo la SEC, conservare i EV purificati (vedere paragrafo 7) o sottoporre a un saggio glucuronidasi (vedere paragrafo 6).
- Confermare la separazione di EVs e liposomi dalle proteine contaminanti e dalla glucuronidasi libera. A tal fine, correlare le concentrazioni di particelle delle frazioni raccolte con la concentrazione proteica e l'attività glucuronidasi.
- Valutare la concentrazione di particelle mediante NTA (vedere 2,5)
- Valutare il contenuto proteico con un saggio di acido bicinchoninico (BCA) o un altro saggio di quantificazione delle proteine appropriato. Eseguire il test secondo il protocollo del produttore.
- Valutare l'attività della glucuronidasi mediante il saggio glucuronidasi (vedere paragrafo 6).
- Facoltativamente, valutare la morfologia EV mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e microscopia elettronica a scansione (SEM).
- Per la preparazione dei campioni TEM, aggiungere 10 μL di sospensione EV a una griglia TEM, incubare per 10 minuti, quindi asciugare il liquido in eccesso utilizzando una carta filtrante. Eseguire la fissazione per 10 min con 10 μL di 4% paraformaldeide e cancellare qualsiasi eccesso. Lavare 3x con acqua. Macchia le vescicole di incubazione 20 s con 30 μL di acido fosforoso-tungstico 1% idrato. Dopo aver blotting via l'eccesso, asciugare le vescicole durante la notte. Visualizza per TEM.
Attenzione: l'acido FoSho-tungstico è altamente caustico; quindi, proteggere la pelle e gli occhi. - Per SEM, fissare i campioni TEM precedentemente preparati su dischi di carbonio e polverizzazione catodica con uno strato di oro di spessore 50 Nm. Visualizza di SEM.
- Per la preparazione dei campioni TEM, aggiungere 10 μL di sospensione EV a una griglia TEM, incubare per 10 minuti, quindi asciugare il liquido in eccesso utilizzando una carta filtrante. Eseguire la fissazione per 10 min con 10 μL di 4% paraformaldeide e cancellare qualsiasi eccesso. Lavare 3x con acqua. Macchia le vescicole di incubazione 20 s con 30 μL di acido fosforoso-tungstico 1% idrato. Dopo aver blotting via l'eccesso, asciugare le vescicole durante la notte. Visualizza per TEM.
6. dosaggio di glucuronidasi
- Per consentire un confronto tra i diversi campioni e le condizioni di conservazione correlando il numero di particelle e l'attività enzimatica, misurare prima la concentrazione di particelle del campione per NTA (vedere il passo 2,5).
- Preparare una soluzione funzionante di fluoresceina di-β-D-glucuronide aggiungendo 1 μL di composto (10 mg/mL in H2O) a 199 ΜL di PBS. Aggiungere 25 μL di questa soluzione a 125 μL di EVs purificati per ottenere una concentrazione finale di 8,3 μg/mL. Pipet il campione in una piastra nera 96-pozzetto. Misurare il punto di tempo 0 h con un lettore di piastre, utilizzando 480 nm come eccitazione e 516 nm come lunghezza d'onda di emissione.
- Coprire saldamente la piastra (ad es. con pellicola di plastica trasparente utilizzata per le piastre PCR) per minimizzare l'evaporazione e incubare al buio per 18 ore a 37 ° c. Misurare la produzione di fluoresceina utilizzando i parametri del lettore di piastre elencati al punto 6,2.
7. conservazione di EVs e liposomi
Nota: per tutti gli scopi di stoccaggio, è consigliabile utilizzare tubi a bassa legatura per ridurre la perdita di EV dovuta all'adsorbimento.
- Seguire i parametri in questa sezione per riprodurre i risultati rappresentativi riportati di seguito. Utilizzare campioni costituiti da 400 μL di sospensione EV.
- Conservare a 4 ° c o-80 ° c o procedere ai passaggi elencati di seguito.
- Lyophilize gli EVs.
- Aggiungere trealosio (40 mg/mL in H2O) fino ad una concentrazione finale di 4 mg/ml per i EV purificati. Congelare i campioni a-80 ° c per almeno 1 ora.
- Lyophilize i campioni utilizzando i seguenti parametri. Per l'essiccazione principale, impostare la temperatura del ripiano a 15 ° c e la pressione a 0,180 mbar e lasciare asciugare i campioni per 46 h. Per l'essiccazione finale, impostare la temperatura del ripiano a 25 ° c e la pressione a 0,0035 mbar e lasciare asciugare i campioni per 2 h. conservare i campioni liofilizzati a 4 ° c.
- Per reidratare i campioni, aggiungere H2O, uguale alla quantità di sospensione EV presente all'inizio (tipicamente, 400 μl). Non utilizzare alcun tampone per la reidratazione.
8. analisi dopo lo stoccaggio
- Per valutare l'attività enzimatica, rimuovere prima la glucuronidasi libera, che può essere trapelato dagli EV durante lo stoccaggio. Raggiungere questo scopo con un ulteriore passaggio di purificazione che viene effettuato sia da SEC (vedere passo 5) o flusso asimmetrico campo-flusso frazione (AF4) (vedere passo 8.1.2).
Nota: si prega di notare che entrambi i metodi portano ad una diluizione del campione EV; quindi, utilizzare concentrazioni EV sufficienti prima dello stoccaggio per evitare di muoversi al di sotto del limite di quantificazione NTA. Aspettatevi una diluizione 1:10 delle particelle dovute a SEC o AF4.- Per la purificazione SEC, seguire il protocollo sopra descritto (vedere paragrafo 5).
- Eseguire la purificazione AF4.
- Impostare lo strumento utilizzando un piccolo canale con un distanziatore 350 μm e una membrana di cellulosa cut-off di peso molecolare 30 kD. Collocare un filtro di dimensione pori 0,1 μm tra la pompa HPLC e il canale AF4. Utilizzare PBS appena preparato 0,1 μm-filtrato come la fase mobile per ridurre il carico di particelle e il rumore nei rivelatori luce-dispersione.
- Rilevare le proteine utilizzando un rilevatore UV impostato a 280 Nm. Per rilevare le particelle, utilizzare la dispersione della luce multiangolare con il laser impostato a 658 nm.
- Utilizzare il seguente metodo di esecuzione. Pre-messa a fuoco per 1 min con un flusso di messa a fuoco di 1 mL/min; quindi, iniettare 300 μL del campione ad una velocità di 0,2 mL/min e mantenere il flusso di messa a fuoco per 10 min. Dopo l'iniezione, eluire il campione a 1 ml/min durante l'applicazione di un flusso trasversale che diminuisce da 2 ml/min a 0,1 ml/min nel corso di 8 min. eluire per altri 10 min senza flusso incrociato. Raccogliere frazioni di 1 mL, iniziando dopo 12,5 minuti e continuando fino a 27 min.
- Eseguire il saggio glucuronidasi come descritto sopra (vedere paragrafo 6).
- Per valutare le dimensioni e la concentrazione, utilizzare l'NTA come descritto sopra (vedere il passo 2,5).
- Facoltativamente, eseguire TEM e SEM per valutare la morfologia degli EV dopo lo stoccaggio (vedere 5,3).
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Representative Results
Nella Figura 1 sono visualizzate le caratteristiche di memorizzazione degli EVS isolate da HUVECs. Gli EV sono stati isolati da UC, la glucuronidasi è stata incapsulata e, dopo la SEC, le EVs purificate sono state valutate per le loro proprietà fisico-chimiche da parte della NTA. Un campione delle vescicole è stato successivamente sottoposto a purificazione AF4 e l'attività glucuronidasi è stata misurata.
Le vescicole sono state poi conservate per 7 d a 4 ° c o-80 ° c e a 4 ° c in forma liofilizzata, in quest'ultimo caso con l'aggiunta del 4% di trealosio. Dopo lo stoccaggio, le vescicole sono state nuovamente misurate da NTA e dopo AF4, è stata valutata la restante attività glucuronidasi per particella.
Il principio di funzionamento di AF4 si basa sulla combinazione di flusso laminare e un flusso incrociato ortogonale attraverso la membrana porosa nella parte inferiore del canale AF4, che colpisce in modo differenziato le particelle in base alle loro dimensioni (Figura 2). Le particelle più grandi tendono ad essere situate più vicine alla membrana, mentre le particelle più piccole si trovano più in alto nel canale. A causa del profilo di flusso parabolico del flusso laminare, le particelle più lontane dalla membrana viaggiano più velocemente verso il rivelatore, portando ad una separazione delle particelle per dimensione. In un tipico esperimento AF4, le particelle iniettate sono prima concentrate sulla membrana, applicando un flusso incrociato senza un flusso longitudinale attraverso il canale (Figura 2a). Dopo l'iniezione e la messa a fuoco, l'eluizione inizia applicando simultaneamente un flusso trasversale e un flusso longitudinale per Frare e eluire i diversi sottogruppi di particelle (Figura 2B), che, nel nostro caso, erano EVS e glucuronidasi libera.
La Figura 3 illustra la separazione delle nanoparticelle (EVS o liposomi) dalle proteine contaminanti e dalla glucuronidasi non incapsulata. Il profilo di eluizione SEC dei liposomi (Figura 3A) purificato dopo la loro preparazione (vedere paragrafo 4 del protocollo) ha mostrato la separazione delle particelle con glucuronidasi incapsulata dall'enzima libero, rilevata sia attraverso il saggio BCA che dell'attività enzimatica. Nel presente esempio, le frazioni 6 e 7 sarebbero state scelte per ulteriori esperimenti in quanto contenevano le più alte concentrazioni di particelle e per prevenire possibili contaminazioni con glucuronidasi libera. AF4 ha anche avuto successo nel separare gli EV dalla glucuronidasi libera, come dimostrato nella Figura 3B, con un grado più elevato di separazione rispetto al secondo, rendendo meno probabile la contaminazione delle frazioni contenenti vescicole.
Nella Figura 4, è stato eseguito un esperimento di controllo per garantire che l'attività enzimatica misurata per le vescicole sia stata effettivamente legata all'incapsulamento della glucuronidasi in EVS e non causata da aggregati enzimatici. Questi aggregati potrebbero essere stati formati a causa dell'incubazione di glucuronidasi con saponina e portare a risultati falsi positivi. Per verificare le frazioni in cui le vescicole verrebbero eluite, i veicoli elettrici purificati senza glucuronidasi incapsulati sono stati sottoposti a SEC sulla stessa colonna del campione contenente solo saponina e l'enzima.
Quando glucuronidasi è stato incubato con saponina e successivamente purificato da SEC, nessuna attività enzimatica è stata trovata nelle frazioni tipicamente contenenti EV. Mentre piccole quantità di particelle sono state trovate a eluto allo stesso tempo come EVs (che compongono < 0,1% delle particelle recuperate da un tipico pellet EV), non c'era alcuna attività enzimatica correlazione. Questi risultati indicano che l'enzima attivo recuperato nelle frazioni contenenti vescicole è stato incapsulato in essi.
La Figura 5 confronta il recupero dell'enzima attivo dopo lo stoccaggio con o senza purificazione aggiuntiva AF4 per rimuovere il colorante non incapsulato. Con la purificazione AF4, c'è generalmente un minor recupero di enzima per particella, con l'effetto più alto per lo stoccaggio a 4 ° c, dove il recupero scende di due terzi. Pertanto, omettendo questa ulteriore fase di purificazione può portare a ipotesi errate sulla stabilità enzimatica.
Figura 6 Mostra l'effetto della liofilizzazione senza un crioprotectant sulle vescicole derivate da MSCS, cellule A549, e liposomi, rispetto al congelamento a-80 ° c. Le particelle sono state iminvecchiate da TEM e SEM come descritto sopra (vedere il passo 5,3 del protocollo). Le MSCs e A549 EVs non hanno esposto grandi differenze di forma nelle immagini TEM, confrontando le due condizioni di conservazione. Nelle immagini SEM, tuttavia, i campioni liofilizzati visualizzati aggregati non trovati nel-80 ° c campioni. I liposomi hanno anche mostrato aggregati nell'immagine SEM, mentre in TEM, la liofilizzazione sembrava indurre un aumento delle dimensioni dei liposomi. La liofilizzazione senza crioprotectants ha anche ridotto il recupero della glucuronidasi intatta dopo la conservazione (Figura 7). L'aggiunta di trealosio come crioprotectant ha aumentato il recupero dell'enzima attivo in modo dose-dipendente.
La Figura 8 illustra la conversione della fluoresceina di-β-D-glucuronide in fluorescenza libera, che si svolge nel saggio glucuronidasi. Mentre l'distillati era non fluorescente a 516 nm, la fluoresceina è altamente fluorescente a questa lunghezza d'onda. Questo ha permesso un saggio di attività enzimatica semplice con alta sensibilità.
Figura 1 : Stabilità dello storage di HUVEC EVs. (A) recupero delle particelle rispetto a prima dello stoccaggio, (B) dimensione media e (C) l'attività glucuronidasi normalizzata per particella di EVS isolata da HUVECs. Le vescicole sono state conservate per 7 d a 4 ° c e-80 ° c e a 4 ° c dopo la liofilizzazione con il 4% di trealosio. La dimensione media e il recupero delle particelle sono stati misurati da NTA; l'attività glucuronidasi per particella è stata calcolata combinando i dati NTA e i risultati del saggio glucuronidasi e normalizzato prima dello stoccaggio. Media ± SD, n = 3, *p < 0,05 (ANOVA unidirezionale seguita dal test post hoc di Tukey). Modificato da Frank et al.21. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 2 : Principio di funzionamento del AF4. A) i veicoli elettrici e la glucuronidasi libera sono concentrati dopo l'iniezione applicando un flusso incrociato. B) in seguito, gli EV e l'enzima libero vengono eluiti separatamente combinando il flusso attraverso il canale con un flusso trasversale. Modificato da Frank et al.21. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 3 : Separazione di EVs e liposomi dalla glucuronidasi libera. A) la separazione rappresentativa della sec dei liposomi caricati con glucuronidasi, della glucuronidasi libera e dei contaminanti proteici. Il grafico mostra la concentrazione delle particelle (rosso), la concentrazione proteica (blu) e l'attività della glucuronidasi (verde). B) dimostrazione della separazione dei veicoli elettrici dalla glucuronidasi libera. EVs non trattati, SVE a spillo con 0,05 mg/mL di glucuronidasi, glucuronidasi libera (0,5 mg/mL), ed EVs caricati con glucuronidasi e purificati da SEC (EV glucuronidasi) sono stati iniettati e analizzati da UV a 280 nm e 90 ° dispersione della luce. Enzima libero eluito separatamente dagli EVs. Modificato da Frank et al.21. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 4 : Controllare gli esperimenti per la purificazione degli EV dalla glucuronidasi libera. 400 μL di EVs nativi o 400 μL di 1,5 mg/mL di glucuronidasi in PBS incubati per 10 minuti con 0,1 mg/mL di saponina sono stati purificati da SEC.a) concentrazioni di particelle delle frazioni di vescicole e glucuronidasi raccolte, rispettivamente, e l'attività enzimatica di la glucuronidasi purificata. B) assorbimento UV a 280 Nm misurato nello stesso esperimento. Il primo piccolo picco per la glucuronidasi corrisponde alla linea grigia nel pannello a. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 5 : L'effetto di ulteriori fasi di purificazione dopo l'accumulo EV. Rimanente attività glucuronidasi per particella rispetto a D0 con o senza un ulteriore passo di purificazione AF4 dopo lo stoccaggio. Gli EVs di HUVEC sono stati conservati per 7 d a 4 ° c o-80 ° c e liofilizzati con il 4% di trealosio. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 6 : Immagini TEM e SEM di EVs. Immagini TEM e SEM di EVs da (A) MSCS e (B) A549 celle e (C) liposomi. I campioni sono stati conservati per 14 d a-80 ° c o liofilizzato senza l'aggiunta di trealosio. Le frecce indicano la presenza di particelle morfologicamente alterate nelle immagini TEM e aggregati nelle immagini SEM. Modificato da Frank et al.21. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 7 : L'effetto di trealosio sul recupero enzimatico dopo la liofilizzazione. Confronto dell'attività enzimatica dopo liofilizzazione per 14 giorni, con 0%, 1%, e 4% trealosio con il campione prima della conservazione (0 giorni). Modificato da Frank et al.21. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 8 : Il clivaggio enzimatico di fluoresceina di-β-D-glucuronide da glucuronidasi. Nello schema, viene spiegata la reazione alla base della rilevazione di glucuronidasi. La fluorescenza non fluorescente di-β-D-glucuronide viene sfalsata dalla glucuronidasi. Attraverso la rimozione dei residui di zucchero, la fluoresceina riprende le sue proprietà fluorescenti. La fluorescenza misurata dopo il periodo di incubazione è correlata alla quantità di enzima attivo presente ed è la lettura del saggio glucuronidasi. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
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Discussion
In questo manoscritto, presentiamo un protocollo completo per studiare la stabilità dei veicoli elettrici in diverse condizioni di conservazione. Con la combinazione di glucuronidasi incapsulata come lettura funzionale e la valutazione dei parametri fisico-chimici degli EV, il protocollo consente una semplice valutazione della stabilità dello stoccaggio dei veicoli elettrici e il confronto di EVs da diverse cellule Linee. SEM e TEM come metodi complementari consentono una panoramica dei cambiamenti dei veicoli elettrici a livello di singola particella. I risultati qui presentati hanno mostrato una tendenza degli EVs e dei liposomi ad aggregarsi a causa della liofilizzazione senza un crioprotectant (Figura 6). Tuttavia, questo è stato osservato solo negli esperimenti SEM. Mentre l'imaging EM non è stato condotto con campioni che sono stati conservati con trealosio, la letteratura suggerisce che questo crioprotectant potrebbe effettivamente ridurre l'aggregazione di EVs29. È anche possibile valutare, se una determinata condizione di conservazione influisce differenzialmente sulle dimensioni EV, sul tasso di recupero e sulle molecole incapsulate. Tale effetto è esemplificato dai risultati ottenuti per gli EVs di HUVEC (Figura 1). Mentre il recupero delle particelle per 4 ° c e-80 ° c era migliore rispetto ai campioni liofilizzati, il recupero della glucuronidasi incapsulata attiva era migliore per i campioni liofilizzati. La liofilizzazione di EVs potrebbe essere la condizione di conservazione più favorevole, ad esempio, quando si analizzano i biomarcatori EV, dove l'attenzione è più su come ottenere e preservare il carico intatto piuttosto che sulle vescicole intatte.
Nel loro recente documento sulla liofilizzazione di EVs22, charoenviriyakul et al. seguito un approccio comparabile. Per quanto riguarda i parametri fisico-chimici, si sono concentrati sull'indice di polidispersità (PDI) e sul potenziale Zeta, poiché i cambiamenti nel potenziale Zeta possono correlare con una ridotta stabilità colloidale. Tuttavia, il potenziale Zeta non può spiegare solo i cambiamenti osservati nella stabilità30, che si è anche riflesso nei loro risultati. Hanno anche confrontato il contenuto di proteina e RNA di EVs immagazzinati con l'elettroforesi del gel di poliacrilammide. Questa tecnica può benissimo indicare cambiamenti sostanziali nel contenuto di proteina o RNA delle vescicole. Tuttavia, richiede quantità molto più grandi di materiale rispetto al metodo presentato qui. Per valutare l'effetto di stoccaggio sul carico EV, Charoenviriyakul et al. eterologo ha espresso un enzima e specie di DNA ciascuno nella loro linea di cellule di produttore EV e monitorato la loro attività e l'integrità nei ve. Tuttavia, tale espressione eterologa non è adatta se i veicoli elettrici provenienti da fonti diverse devono essere confrontati, in quanto richiede una notevole quantità di tempo per ogni nuova linea cellulare, mentre il semplice incapsulamento mediato da saponina può essere prontamente applicato.
È fondamentale rimuovere qualsiasi enzima non incapsulato, come mostrato nella Figura 3. La glucuronidasi incapsulata in EV reagisce molto più lentamente con il suo substrato rispetto all'enzima libero in soluzione, portando a una sovrastima dell'efficienza di incapsulamento. La separazione pulita è particolarmente importante per l'analisi dopo lo stoccaggio, poiché le condizioni di conservazione potrebbero influenzare l'attività della glucuronidasi libera nel campione in modo diverso e potrebbero causare perdite da EVs danneggiati. Questo è stato evidente nei nostri esperimenti (Figura 5), come l'applicazione di AF4 prima che il saggio glucuronidasi è riuscito a rimuovere colorante non incapsulato nelle vescicole. Così, ha reso possibile ottenere risultati chiari sull'effetto dei metodi di archiviazione discussi qui, mentre senza AF4, la perdita di attività a causa di stoccaggio sarebbe stato sottovalutato.
Un'altra considerazione importante è l'isolamento e la caratterizzazione degli EV da testare per la loro stabilità. Anche se la tecnica descritta consente il confronto di EVS da fonti diverse, questo è possibile solo se tutti sono preparati con lo stesso metodo di isolamento in modo che i risultati non sono distorti18,31,32. In questo contesto, anche le condizioni della coltura cellulare devono essere prese in considerazione, in quanto possono influire sulla quantità e sulla bioattività degli EVs isolati33. Per ottenere risultati che possono essere paragonati ad altri risultati pubblicati, si consiglia di consultare il recente aggiornamento "informazioni minime per studi di vescicole extracellulari" che contiene linee guida per l'armonizzazione della ricerca EV26.
Nel protocollo qui presentato, abbiamo usato SEC o AF4 per rimuovere l'enzima libero dopo lo stoccaggio. Potrebbero essere applicati altri metodi, come gradiente ultracentrifugazione, UC o ultrafiltrazione34. Rispetto ai metodi centrifughi, SEC e AF4 sono meno dispendiosi in termini di tempo (ad esempio, circa 1,5 h per SEC, compreso l'equilibrazione delle colonne rispetto a 16 h o più per la pendenza UC) e possono separare completamente le proteine libere dai veicoli elettrici rispetto alle normali UC, dove rimane sempre il supernatante residuo con il pellet. Inoltre, SEC15 e AF435 sono metodi miti, che inducono meno stress da taglio sui veicoli elettrici. In confronto, le forze inflitte al svi durante UC potrebbero portare a alterazioni delle particelle, come l'aggregazione e le alterazioni di dimensioni34,36.
Uno svantaggio di SEC e AF4 è la diluizione dei campioni. Pertanto, è necessario isolare quantità sufficienti di EVs per mantenere le concentrazioni necessarie per le misurazioni NTA dopo più fasi di purificazione. Le frazioni EV possono essere concentrate utilizzando filtri centrifughi ma, a seconda del materiale filtrante e del protocollo, potrebbe esserci una perdita di vescicole37.
La limitazione del protocollo qui discusso è che monitora solo l'attività enzimatica della glucuronidasi incapsulata in modo esogeno, né tenendo conto dell'RNA e del DNA incapsulati, né delle proteine superficiali dell'EV che potrebbero essere importanti per la funzionalità18 . Per la ricerca di nuove terapie EV, questa tecnica non può sostituire i saggi sulla funzionalità, ma complimentarli e dare un'indicazione sulla stabilità della vescicola. Potrebbe essere di grande uso se, ad esempio, i veicoli elettrici derivati da biofluidi devono essere conservati per un'analisi successiva del loro contenuto di vescicole.
In futuro, l'ambito di questo protocollo potrebbe essere ampliato per includere anche gli EV derivati da altri organismi, ad esempio, le vescicole della membrana esterna batterica. Un altro interessante passo successivo sarebbe quello di testare l'incapsulamento degli acidi nucleici mediante l'incubazione di saponina e di esaminare anche la stabilità del DNA o degli RNA Cargos.
In conclusione, questa procedura offre un metodo semplice per la valutazione della stabilità di stoccaggio di EV da varie fonti di cellule di mammiferi integrando sia una lettura fisico-chimica che funzionale. Questo protocollo dettagliato consentirà ai ricercatori EV una semplice determinazione delle condizioni di conservazione appropriate per le loro vescicole.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Il programma di ricerca di NanoMatFutur Junior del Ministero federale dell'istruzione e della ricerca, Germania (Grant Number 13XP5029A) ha sostenuto questo lavoro. Maximilian Richter è stato sostenuto dalla Studienstiftung des deutschen Volkes (Fondazione tedesca per le borse accademiche) attraverso una borsa di studio di dottorato.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC) | Sigma-Aldrich | P2663-25MG | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC) | Sigma-Aldrich | P4329-25MG | |
| 225 cm² cell culture flasks | Corning | 431082 | Used with 25 ml of medium |
| 30 kDa regenerated cellulose membrane | Wyatt Technology Europe | 1854 | |
| 350 µm spacer | Wyatt Technology Europe | ||
| Automated fraction collector | Thermo Fisher Scientific | ||
| Beta-glucuronidase | Sigma-Aldrich | G7646-100KU | |
| Chloroform | Fisher scientific | C/4966/17 | |
| Column oven | Hitachi High-Technologies Europe | ||
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T9531-10G | |
| DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector | Wyatt Technology Europe | ||
| Durapore Membrane filter, PVDF, 0,1 µm, 47 mm | Merck | VVLP04700 | Used for the preparation of buffers for AF4 |
| EBM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3156 | Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells |
| Eclipse dualtec | Wyatt Technology Europe | ||
| EGM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3162 | Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells |
| ELISA Plate Sealers | R&D Systems | DY992 | used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay |
| Ethanol | Fisher scientific | E/0665DF/17 | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids | 610000-1EA | |
| Filter support | Avanti Polar Lipids | 610014-1EA | used for liposome preparation |
| Fluorescein di-β-D-glucoronide | Thermo Fisher Scientific | F2915 | |
| Gibco PBS-tablets+CA10:F36 | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | |
| Hettich Universal 320 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Used for pelleting cells at 300 g | |
| Hettich Rotina 420 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Used for pelleting larger debris at 3000 g | |
| HUVEC cells | Lonza Verviers, S.p.r. | C2517A | |
| Kimble FlexColumn 1X30CM | Kimble | 420401-1030 | |
| Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC | Christ | ||
| Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR international | 525-0255 | the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery |
| Nanosight LM14 equipped with a green laser | Malvern Pananalytical | ||
| Nanosight-software version 3.1 | Malvern Pananalytical | ||
| Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes | Whatman/GE Healthcare | 110406 | used for liposome preparation |
| PEEK Inline filter holder | Wyatt Technology Europe | ||
| Phosphotungstic acid hydrate | Sigma-Aldrich | 79690-25G | |
| Polycarbonate bottles for ultracentrifugation | Beckman Coulter | 355622 | |
| QuantiPro BCA Assay Kit | Sigma-Aldrich | QPBCA-1KT | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15 | Carl Zeiss AG | ||
| Sepharose Cl-2b | GE Healthcare | 17014001 | |
| SEM copper grids with carbon film | Plano | S160-4 | |
| Small AF4 channel | Wyatt Technology Europe | ||
| Sputter-coater Q150R ES | Quorum Technologies | ||
| Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011 | Oxford Instruments | ||
| Type 45 Ti ultracentrifugation rotor | Beckman Coulter | 339160 | |
| Ultimate 3000 Dionex autosampler | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex isocratic pump | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K | Beckman Coulter | ||
| UV detector | Thermo Fisher Scientific | ||
| Whatman 0.2 µm pore size mixed cellulose filter | Whatman/GE Healthcare | 10401712 | Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC |
References
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