Summary
ここでは、細胞によって産生される天然ナノ粒子の群である細胞外小胞の貯蔵安定性を評価するために容易に適用可能なプロトコルを提示する。小胞は、モデル酵素としてグルクロニダーゼを搭載し、異なる条件下で保存されます。保存後、それらの物理化学的パラメータおよび封入酵素の活性が評価される。
Abstract
現在の研究では、細胞外小胞 (Ev) が有望な標的であり、薬剤、薬剤、担体、バイオマーカーとして利用されている。臨床開発のためには、その医薬品の活動だけでなく、その生産を評価する必要があります。この文脈では、研究は、EVs の分離、その特徴付け、およびそれらのストレージに焦点を当てています。本稿では、遺伝子操作や特定の機能アッセイを行わずに、さまざまな貯蔵条件が EVs に及ぼす影響を評価するための容易な手順を提供することを目的としています。これにより、所定の貯蔵条件下での Ev の安定性の第一印象を迅速に得ることができ、異なるセル源に由来する EVs を容易に比較することができる。安定性の測定は EVs (サイズ、粒子の集中および形態) の物理化学的な変数および彼らの貨物の活動の保存に基づいている。後者は、Ev への酵素β-グルクロニダーゼのサポニン媒介封入によって評価される。グルクロニダーゼはサロゲートとして機能し、蛍光レポーター分子の切断によって容易に定量化することができます。本プロトコルは、臨床応用に向けた EV 研究を進めるために EV 特性を最適に保持する保存条件を探索する研究者のためのツールとなりうる。
Introduction
EVs は、ほぼすべてのセルタイプによって生成される膜結合ナノ粒子です。哺乳類細胞の場合、EVs は、異なる生産経路1、2を持つ2つの主要なグループに細分化することができます。膜小胞は、およそ100〜 1000 nm の大きさの範囲で、細胞膜からの直接出芽によって産生される。エキソソームは、サイズが 30-200 nm で、その後、細胞膜と融合して一度に複数のエキソソームを放出するエンドソームに、内側の出芽によって形成された多体に由来する。これらの小胞の主な機能は、細胞3間の情報の輸送である。この目的のために、RNA、DNA、タンパク質などの貨物が積極的に選別されます。EVs は、健康と病気の状態の両方の影響で、ターゲットにさまざまな効果を伝えることができます。一方では、組織再生、抗原提示、または抗生物質効果などのポジティブな効果を媒介し、治療薬としての開発の目標となります4,5.反対側では、EVs は、腫瘍血管新生6を促進し、ストレス応答7において傍観効果を誘発し、そして自己免疫疾患8および炎症性疾患9において役割を果たす可能性がある。したがって、彼らは多くの病理学的効果をよりよく理解するための重要なコンポーネントであるかもしれません。しかし、癌10、11、12および心血管障害13などのマニホールド疾患における変化した ev の存在、および血液および尿におけるそれらの容易なアクセス性は、それらを理想的にするバイオ マーカー。最後に、それらの良好な生体適合性14およびその固有のターゲティング能力は、薬物送達15についての EVs も興味深いものにする。本稿では、哺乳動物細胞由来の Ev の保存性を評価するためのプロトコールについて説明するが、未だ検討されていない重要な特性である。
Ev の臨床開発のために、彼らの治療効果、生産、精製、およびストレージ17の評価を含む16を乗り越えるために、まだ多くの障害があります。80° c は EV ストレージ18の金本位として広く見られているが、必要な冷凍庫は高価であり、生産から患者への要求されるコールドチェーンを維持することは困難である可能性がある。さらに、一部の報告では、-80 ° c のストレージはまだ最適に EVs を保持していないし、ev 機能19、20の損失を誘導することを示しています。凍結乾燥21、22 、または噴霧乾燥23などの他の方法が、ev の冷凍保存に潜在的な代替物として提案されている。
貯蔵安定性を評価する最適な方法は、機能アッセイまたは特定のマーカーの評価 (例えば、それらの抗菌活性19) で EVs をテストすることであろう。これは、小胞の所望の効果が知られており、EVs の1つの異なるグループが検討されるときに可能です。異なる細胞源からの EVs を比較する場合 (例えば、薬物封入のため)、または既知の機能的読み出しがない場合、ストレージによる変化を直接的に評価することはもはや不可能である。
一方、最近の特許20で示されているように、単にサイズ、粒子回収、タンパク質濃度などの物理化学的パラメータの変化を評価するだけでは、EV 活性の変化を予測するとは限らない。
ここでは、EVs の貨物のためのサロゲートとしてカプセル化されたβ-グルクロニダーゼ酵素の活性と組み合わせるそれらの物理化学的パラメータを評価することにより、EVs の保存安定性を測定するための容易に適用可能なプロトコルを提供します。酵素の装填はサポニンインキュベーションによって行われ、異なる供給源21、24、25から EVs を用いて確立される穏やかな方法である。サポニンは、EV 膜中の一過性の細孔を形成し、小胞への酵素取り込みを可能にする。不利な保管条件にさらされた場合、酵素はその活性を失う傾向があるので、それらは EVs の機能的な貨物の保存の評価のための理想的サロゲートです。
我々は、ヒト間葉幹細胞 (MSCs)、ヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVECs)、およびヒト腺癌肺胞上皮細胞 (A549) 由来の EVs へのこのプロトコルの適用が実際に大きな差異をもたらすことを実証した。異なる細胞株間の貯蔵安定性は、EV ソース21を選択する際に考慮されるべきである。
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Protocol
1. 細胞培養と細胞馴化培地の製造
- 一般に、それぞれの細胞株に必要な個々の条件下で細胞を培養する。
- 無血清条件下または EV 枯渇胎児ウシ血清 (FBS) を含む培地中で24-72 の細胞を培養する。
注: EV 枯渇 FBS を使用する場合、血清を効率よく枯渇させることが証明された方法を採用し、ウシ血清由来 EVs26による汚染を防止する。 - フラスコから培地を回収する。10分間 300 x gで遠心分離し、細胞をペレットにする。ペレット化された細胞を乱すことなく、慎重に細胞調節培地 (CCM) を収集します。好ましくは、CCM を直接使用したり、4° c で一晩保存したりする。
注: 新鮮な生産された CCM を使用することが常に好ましいです。長期間の保管を回避できない場合は、関連するすべてのパラメータを MISEV2018 ガイドライン26に従って記録し、得られた結果の潜在的なバイアスを考慮に入れる必要があります。 - HUVECs のプロトコルの例
- FBS および他のサプリメントを含む EGM-2 培地中で 120 h の HUVEC 細胞を培養する。
- EBM-2 基礎培地中の任意の追加のサプリメントのない 48 h の HUVEC 細胞を培養します。.
- フラスコから培地を回収し、上記に示したように遠心分離ステップを行う (ステップ 1.3)。通常は、1つの EV 分離に 100 mL の培地を使用します。
2. CCM の超遠心よる
- 超遠心よる (UC) の直前に、3000 x gおよび4° c で15分間、CCM を遠心分離して、細胞破片と大きな凝集体を除去します。
- 慎重に上清を UC チューブに移します。固定角度ローターを使用している場合は、遠心分離機のチューブの向きをマークして、UC 後の EV ペレットの取り出しを容易にします。12万 x gで2時間遠心分離し、k ファクターの259.4 を用いた。
- UC の後に、血清学的 pipet を使用して上清を慎重に廃棄し、ペレット化された Ev の乱れを回避する。
注: ペレットは非表示になっている可能性があります。 - 1番目のチューブに0.2 μ m のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 200 μ l を加え、PBS と残留上澄みを使用してペレットを上下にピペットで再懸濁します。得られた EV 懸濁液をそれぞれのサンプルの次のチューブに移し、再懸濁に使用します。この方法を進めて、サンプルのすべての Ev を、約300-350 μ l の最終容量に再懸濁ます。
- 再懸濁後、ナノ粒子追跡分析 (NTA) によって粒子の存在を確認する。以下の設定など、特定の EV タイプに最適化された設定を使用します (ステップ 2.5.1)。
注意: ガーディナー et al.27および Vestad et al.28の論文には、ev を測定するためのパラメータを最適化する方法に関する貴重な情報が含まれている。- 以下に説明する結果を再現するために、グリーンレーザーを搭載した器具 (例えば、NanoSight LM14) を使用する。1.0 の画面ゲインと13のカメラレベルで30秒の3つのビデオを記録します。分析には、1.0 の画面ゲインと検出しきい値5を使用します。
- 可能であれば、ペレットをすぐに使用してください。それ以外の場合は、一晩4° c で保管してください。
3. Ev へのグルクロニダーゼカプセル化
- 再懸濁したペレットに、1.5 mg/mL の最終濃度にβ-グルクロニダーゼ (PBS 中 10mg/mL) を加え、0.1 mg/mL の最終濃度にサポニン (h2o で 10Mg/ml) を加える。3 s のボルテックスでよく混ぜる。
- チューブを静かにフリックして、連日混合して室温で10分間インキュベートします。インキュベーション後、サイズ排除クロマトグラフィー (SEC) によって直接精製する (第5項参照)。
注: 凍結による酵素の劣化を防ぐため、解凍後にグルクロニダーゼサンプルを refreeze しないでください。
4. リポソーム生産
- Ev との比較のためにリポソームを調製するには、1, 2-dimyristoyl-glycero-3-ホスホコリン (DMPC) と 1, 2-ジパルミトイルヒドロキシプロリン-GLYCERO-ホスホコリン (DPPC) クロロホルム中の2:3 モルの割合で、最終濃度5mm を溶解する。高性能液体クロマトグラフィー (HPLC) バイアルに 1 mL アリコートを準備し、一晩乾燥させて脂質膜を形成します。
注意: クロロホルムは毒性があり、cancerogenic が疑われます。取り扱いに際しては、適切な予防措置を講じます。 - 1.5 mg/mL グルクロニダーゼを含む PBS 1 mL で脂質膜を水分補給する。42° c に加熱し、1分間渦をして押出機アセンブリを42° c に加熱し、200 nm のポリカーボネート膜を通して脂質懸濁11x を押し出します。SEC によって直接浄化されます (セクション5を参照)。
5. SEC による浄化
- 次のプロトコルを使用して SEC 列を準備します。
- 新鮮な精製水と新しく調製した緩衝液のみを使用してください。0.2 μ m の膜フィルターを通してすべてのバッファーを濾過し、カラム内の気泡の形成を防ぐためにそれらを脱気します。
- SEC カラムの調製には、アガロースゲル濾過ベースのマトリックス (例えば、セファロース Cl-2b) または別の SEC 媒体を使用して、タンパク質の不純物および過剰な酵素から EVs とリポソームを分離するのに適しています。まず、培地が保存されている 20% Etoh 中溶液を取り出し、カラム内の気泡形成を防止する。このため、SEC 培地を 3000 x gに10分間遠心し、etoh 中を除去し、脱気水に交換します。
- (内径 10 mm) のガラス柱に、SEC 培地を 15 mL マークに充填します。
注: 異なる寸法のカラムでは、ボリュームが異なります。ジェルが完全に落ち着くようにしてください。 - ランの前に、平衡化は PBS の少なくとも2つのカラム量を持つカラムを使用します。カラムを保存するには、まず1列の水量で洗浄し、その後に 20% の Etoh 中の少なくとも2つのカラム容量を続けます。保管後、PBS で平衡化する前にカラムを1列の水で最初に洗ってください。
- 1回の分離で最大400μ l の EV またはリポソーム懸濁液を使用できます。1Ml の端数を収集します。SEC の後、精製された EVs を保存するか (セクション7を参照)、またはそれらをグルクロニダーゼアッセイに適用します (セクション6を参照)。
- EVs とリポソームの混入タンパク質と遊離グルクロニダーゼの分離を確認します。この目的のために、収集されたフラクションの粒子濃度をタンパク質濃度およびグルクロニダーゼ活性と相関させる。
- NTA による粒子濃度の評価 (2.5 を参照)
- Bicinchoninic 酸 (BCA) アッセイまたは別の適切なタンパク質定量アッセイによってタンパク質含有量を評価します。メーカーのプロトコルに従ってアッセイを行ってください。
- グルクロニダーゼアッセイによってグルクロニダーゼ活性を評価します (セクション6を参照)。
- 必要に応じて、透過型電子顕微鏡 (TEM) および走査電子顕微鏡 (SEM) により EV 形態を評価する。
- TEM サンプルの調製のために、10μ l の EV 懸濁液を TEM グリッドに添加し、10分間インキュベートし、次いで、濾過紙を使用して余分な液体を除去する。10μ l の 4% パラホルムアルデヒドで10分間固定を行い、過剰をブロットします。水で3倍洗ってください。1% 蛍光体-tungstic 酸ハイドレートの30μ l で 20 s インキュベーションすることにより小胞を染色する。過剰を吸い取り、一晩で小胞を乾かす。TEM で可視化する。
注意: ホスホ-tungstic 酸は高度に苛性です。したがって、皮膚や目を保護します。 - SEM の場合は、あらかじめ用意されていた TEM サンプルをカーボンディスク上に固定し、50 nm 厚の金層でスパッタします。SEM による視覚化。
- TEM サンプルの調製のために、10μ l の EV 懸濁液を TEM グリッドに添加し、10分間インキュベートし、次いで、濾過紙を使用して余分な液体を除去する。10μ l の 4% パラホルムアルデヒドで10分間固定を行い、過剰をブロットします。水で3倍洗ってください。1% 蛍光体-tungstic 酸ハイドレートの30μ l で 20 s インキュベーションすることにより小胞を染色する。過剰を吸い取り、一晩で小胞を乾かす。TEM で可視化する。
6. グルクロニダーゼアッセイ
- 粒子数と酵素活性とを相関させることによって異なるサンプルと貯蔵条件との間の比較を可能にするために、まず NTA による試料の粒子濃度を測定する (ステップ2.5 を参照)。
- フルオレセイン-β-D-グルクロニドの実用的なソリューションを調製する化合物の1μ l (H2o/mL で 10ML) PBS の199μ l を添加します。この溶液の25μ l を精製 EVs の125μ l に加え、8.3 μ g/mL の最終濃度を得る。サンプルを黒の96ウェルプレートに Pipet ます。480 nm を励起と 516 nm を発光波長として使用し、プレートリーダーで時間点 0 h を測定します。
- 蒸発を最小限に抑え、37° c で 18 h の暗所でインキュベートするために、プレートをしっかりと覆います (例えば、PCR プレートに使用される透明なプラスチック箔で)。ステップ6.2 にリストされているプレートリーダーのパラメータを使用して、フルオレセイン生産を測定します。
EVs およびリポソームの貯蔵
注: すべての保管目的のために、吸着による EV 損失を低減するために、低結合チューブを使用することをお勧めします。
- 以下の代表的な結果を再現するには、このセクションのパラメータに従ってください。400μ l の EV 懸濁液からなるサンプルを使用します。
- 4° c または-80 ° c で保管するか、下記の手順に進んでください。
- Ev を Lyophilize。
- 最後の濃度 4 mg/mL までのトレハロース (40 Mg/Ml の h2o) を精製された ev に添加します。サンプルを1時間以上-80 ° c で凍らせます。
- 次のパラメータを使用してサンプルを Lyophilize します。主乾燥のために、棚温度を15° c に設定し、圧力 0.180 mbar に 46 h のために乾燥するためにサンプルを残してください。最終的な乾燥のためには、棚温度を25° c に、圧力を 0.0035 mbar に設定し、サンプルを2時間乾燥させたままにしておきます。凍結乾燥したサンプルを4° c で保管してください。
- サンプルを水分補給するには、最初に存在する EV 懸濁液の量 (通常は400μ l) に等しい h2o を追加します。水分補給のためにバッファを使用しないでください。
8. 保管後の分析
- 酵素活性を評価するために、まず、貯蔵中に EVs から漏出した可能性のある遊離グルクロニダーゼを除去する。SEC (ステップ5参照) または非対称フローフィールドフロー分別 (AF4) によって行われる精製の追加ステップによってこれを達成してください (ステップ8.1.2 を参照)。
注: 両方の方法は、EV サンプルの希釈につながることをお勧めします。したがって、NTA 定量化限界を下回るのを避けるために、保管前に十分な EV 濃度を使用してください。秒または AF4 による粒子の1:10 希釈を期待してください。- SEC の精製については、前述のプロトコルに従ってください (セクション5を参照)。
- AF4 精製を行う。
- 350μ m スペーサーと 30 kD 分子量カットオフセルロース膜を備えた小型チャンネルを使用して装置をセットアップします。HPLC ポンプと AF4 チャネルの間に0.1 μ m の細孔サイズフィルターを設置します。新規に調製した0.1 μ m フィルタ PBS を移動相として使用し、光散乱検出器の粒子負荷とノイズを低減します。
- 280 nm に設定された UV 検出器を使用してタンパク質を検出します。粒子を検出するには、レーザーを 658 nm に設定したアングル光散乱を使用します。
- 次の run メソッドを使用します。1ミリリットル/分のフォーカスフローで1分間プレフォーカス;その後、0.2 mL/min のレートでサンプルの300μ l を注入し、焦点フローを10分間維持します。注射後、8分間にわたって 2 mL/min から 0.1 mL/min に減少するクロスフローを適用しながら、1 mL/min でサンプルを溶出します。クロスフローなしでさらに10分溶出します。12.5 分後に開始し、27分まで継続1ml の端数を収集します。
- 上述のようにグルクロニダーゼアッセイを実施する (第6項参照)。
- サイズおよび濃度を評価するために、上述のように NTA を使用する (ステップ2.5 を参照)。
- 任意に、貯蔵後の Ev の形態を評価するために TEM および SEM を実行する (5.3 を参照のこと)。
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Representative Results
図 1は、HUVECs から分離された EVs のストレージ特性を示しています。EVs は、UC によって単離され、グルクロニダーゼは封入され、SEC の後、精製された EVs は NTA による物理化学的特性の評価を受けました。小胞のサンプルをその後 AF4 精製に供し、グルクロニダーゼ活性を測定した。
次いで、小胞体を4° c または-80 ° c で 7 d、凍結乾燥形態で4° c で保存し、後者の場合は 4% のトレハロースを添加した。貯蔵後、小胞は NTA によって再び測定され、AF4 後、粒子ごとの残りのグルクロニダーゼ活性が評価された。
AF4 の動作原理は、層流と AF4 チャネルの下部にある多孔質膜を通る直交 crossflow の組み合わせに基づいており、そのサイズに応じて粒子に影響を与えます (図 2)。より大きな粒子は膜の近くに位置する傾向があり、より小さい粒子はチャネルのさらに上に配置されます。層流の放物線状の流れプロファイルのために、膜からさらに離れた粒子は検出器に向かってより速く移動し、サイズによる粒子分離をもたらす。典型的な AF4 実験では、注入された粒子は、最初に膜に焦点を合わせ、チャネルを通して長手方向の流れなしにクロスフローを適用する (図 2a)。射出および集束後、溶出は分画にクロスフローと長手方向の流れを同時に適用することによって開始され、粒子の異なるサブセットを溶出させる (図 2B)、これは、我々の場合には、ev および遊離グルクロニダーゼであった。
図 3は、汚染タンパク質および nonencapsulated グルクロニダーゼからのナノ粒子 (ev またはリポソーム) の分離を図示する。リポソームの SEC 溶出プロファイル (図 3A) は、それらの調製後に精製し (プロトコルのセクション4を参照)、遊離酵素からカプセル化されたグルクロニダーゼを有する粒子の分離を示し、BCA アッセイを介して両方で検出し酵素活性。現在の例では、画分6と7は、最高の粒子濃度を含んでいて、遊離グルクロニダーゼで可能な汚染を防ぐために、さらなる実験のために選ばれるでしょう。AF4 は、図 3Bに示すようにフリーグルクロニダーゼから ev を分離することにも成功し、SEC よりも分離度が高く、小胞を含む画分の汚染が起こりにくい。
図 4では、小胞のために測定された酵素活性が、実際に EVs へのグルクロニダーゼの封入に関連しており、酵素凝集体によって引き起こされていないことを確認するための制御実験を行った。これらの凝集体は、サポニンとグルクロニダーゼのインキュベーションのために形成されている可能性があり、偽陽性の結果につながります.小胞が溶出するフラクションを確認するために、グルクロニダーゼを封入しない精製された Ev を、サポニンおよび酵素を含む試料と同じカラム上で SEC に供した。
グルクロニダーゼをサポニンと共にインキュベートし、その後 SEC で精製したところ、通常は Ev を含むフラクション内に酵素活性は認められなかった。Ev と同時に少量の粒子が溶出することが分かったが (通常の EV ペレットから回収した粒子の 0.1% <)、酵素活性を相関させることはなかった。これらの結果は、小胞を含むフラクション内で活性な酵素回収がそれらに封入されたことを示す。
図 5は、nonencapsulated 染料を除去するために追加の AF4 精製の有無にかかわらず保存後の活性酵素の回収率を比較する。AF4 精製では、一般に粒子当たりの酵素回収率が低く、4° c での保存には最大の効果があり、回収率は3分の2で低下します。したがって、この追加の精製工程を省略することは、酵素の安定性に関する誤った仮定をもたらす可能性がある。
図 6は、-80 ° c での凍結と比較して、MSCs、A549 細胞、およびリポソーム由来の小胞に凍結保護剤を伴わない凍結乾燥の効果を示す。上記のように TEM および SEM により粒子を画像化した (プロトコルのステップ5.3 を参照)。MSCs と A549 Ev は、2つの保管条件を比較して TEM 像の形状に大きな違いを示さなかった。SEM 写真では、しかし、表示された凍結乾燥サンプルは、-80 ° c のサンプルには見られません。リポソームはまた、SEM 画像中に凝集体を表示し、一方 TEM では、凍結乾燥がリポソームのサイズ増加を誘導するように見えた。Cryoprotectants を伴わない凍結乾燥は、保存後の無傷グルクロニダーゼの回収も減少させた (図 7)。凍結保護剤としてのトレハロースの添加は、用量依存的に活性酵素の回収率を増加させた。
図 8は、フルオレセイン-β-D-グルクロニドをフリー蛍光化し、グルクロニダーゼアッセイにおいて行われる変換を示す。遊離体は 516 nm で nonfluorescent したが、フルオレセインはこの波長で蛍光性が高い。これにより、高感度で簡単な酵素活性アッセイが可能になりました。
図 1: HUVEC ev の保存安定性(A) 貯蔵前と比較した粒子回収率は、(B) 平均サイズ、および (C) HUVECs から単離された EVs の粒子あたりのグルクロニダーゼ活性を正規化する。4% のトレハロースで凍結乾燥後4° c および-80 ° c で 7 d 用に小胞体を保存した。平均サイズおよび粒子回復は NTA によって測定された。粒子あたりのグルクロニダーゼ活性は、NTA データとグルクロニダーゼアッセイの結果を組み合わせて、保存前に正規化して計算しました。平均値± SD, n = 3, *p < 0.05 (一方向 ANOVA に続いて、テューキーの事後テスト)。フランク et al.21から修正した。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: AF4 の動作原理。(A) EVs とフリーグルクロニダーゼは、クロスフローを適用することにより、注入後に焦点を当てています。(B) その後、チャネルを通る流れとクロスフローを組み合わせることにより、ev と遊離酵素が別々に溶出する。フランク et al.21から修正した。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: 自由グルクロニダーゼからの EVs とリポソームの分離。(A) グルクロニダーゼを搭載したリポソームの代表的な SEC 分離、遊離グルクロニダーゼ、およびタンパク質汚染物質。グラフには、粒子濃度 (赤)、タンパク質濃度 (青色)、およびグルクロニダーゼ活性 (緑色) が表示されます。(B) フリーグルクロニダーゼからの ev の分離のデモンストレーション。未処理の Ev は、0.05 mg/mL のグルクロニダーゼ、遊離グルクロニダーゼ (0.5 mg/mL) でスパイクされ、グルクロニダーゼを装填した EVs (EV グルクロニダーゼ) を 280 nm および90°の光散乱で UV により注入し分析した。Ev とは別に溶出する遊離酵素。フランク et al.21から修正した。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: フリーグルクロニダーゼから EVs を精製するための制御実験。0.1 mg/ml のサポニンを用いて10分間インキュベートした PBS 中のグルクロニダーゼ/ml の400μ l のネイティブ Ev または400μ 1.5 l を SEC で精製した(A) 収集した小胞のフラクションおよびグルクロニダーゼの粒子濃度をそれぞれ、および酵素活性精製グルクロニダーゼ。(B) 同じ実験で測定した 280 nm での UV 吸収。グルクロニダーゼの最初の小さなピークは、パネルAの灰色の線に対応しています。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5: EV 保存後の追加精製工程の効果。1つのパーティクルに対する残りのグルクロニダーゼアクティビティは、ストレージ後の追加の AF4 精製ステップの有無にかかわらず、d0 と比較します。HUVEC Ev は、4° c または-80 ° c で 7 d 用に保存し、4% のトレハロースで凍結乾燥した。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6: Ev の TEM と SEM 写真。(A) MSCs および (B) A549 細胞および (C) リポソームからの EVs の TEM および SEM 写真。サンプルを80° c で 14 d に保存し、トレハロースを添加せずに凍結乾燥した。矢印は、TEM 写真中の形態的に改変された粒子の存在を示し、SEM 写真中で凝集する。フランク et al.21から修正した。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 7: 凍結乾燥後の酵素回収に対するトレハロースの効果凍結後14日間の酵素活性の比較は、保存前の試料で 0%、1%、及び 4% トレハロースで (0 日) とした。フランク et al.21から修正した。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 8: 酵素的切断のフルオレセインダイ-β-D-グルクロニドグルクロニダーゼによって。スキームでは、グルクロニダーゼの検出の基礎となる反応が説明される。Nonfluorescent フルオレセイン di-β-D-グルクロニドは、グルクロニダーゼにより切断される。糖残基の除去により、フルオレセインは、その蛍光特性を取り戻す。インキュベーション期間の後に測定された蛍光は、存在する活性酵素の量と相関し、グルクロニダーゼアッセイの読み出しである。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本稿では、異なる貯蔵条件下での Ev の安定性を研究するための包括的なプロトコルを紹介する。機能読み出しと EVs の物理化学的なパラメータの評価としてカプセル化されたグルクロニダーゼの組み合わせにより、プロトコルは、EVs の簡単な保存安定性評価と異なるセルからの EVs の比較を可能にします行。SEM および TEM は相補的な方法として、単粒子レベルでの EVs の変化についての洞察を可能にする。ここで示した結果は、凍結保護剤のない凍結乾燥により Ev とリポソームを凝集させる傾向があった (図 6)。しかし、これは SEM 実験でのみ観察された。この凍結保護剤はトレハロースで保存されたサンプルでは行われなかったが、この文献では実際に EVs29の凝集が減少する可能性があることを示唆している。また、特定の貯蔵条件が EV サイズ、回収率および封入された分子に影響する場合は、評価することも可能です。このような効果は、HUVEC Ev について得られた結果によって例示される (図 1)。4° c および-80 ° c のための粒子の回復は凍結乾燥させたサンプルのためよりよい間、活動的な封入されたグルクロニダーゼの回復は凍結乾燥されたサンプルのために最もよい。Ev の凍結乾燥は、例えば、EV バイオマーカーを分析する際に、そのインタクトな小胞ではなく、無傷の貨物を入手して保存することに重点を置き、より有利な貯蔵条件である可能性があります。
EVs22の凍結乾燥に関する最近の論文では、Charoenviriyakul et al. は同等のアプローチに従った。物理化学的パラメータに関しては、それらは多分散指数 (PDI) およびゼータ電位に着目し、ゼータ電位の変化はコロイド安定性の低下と相関することができる。しかしながら、ゼータ電位は安定性30の観察された変化を単に説明することができず、その結果にも反映していた。彼らはまた、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって貯蔵された Ev のタンパク質と RNA 含有量を比較した。この技術は、小胞のタンパク質または RNA 含量における実質的な変化を非常によく示すことができる。ただし、ここで紹介する方法よりもはるかに大量の材料が必要になります。EV 貨物への貯蔵の影響を評価するために、Charoenviriyakul et al. heterologously は、それぞれの EV 生産者の細胞株で酵素および DNA 種を発現し、Ev におけるそれらの活性と完全性を監視した。しかしながら、このような異種発現は、異なる供給源からの Ev が比較されるべきである場合、各新しい細胞株に対して相当な量の時間を必要とするので、単純なサポニン媒介封入を容易に適用することができる。
図 3に示すように、任意の nonencapsulated 酵素を除去することが重要です。EV-封入グルクロニダーゼは、溶液中の遊離酵素よりもその基質で非常に遅く反応し、封入効率の過大評価をもたらす。保管条件がサンプル中の遊離グルクロニダーゼの活性に異なる影響を及ぼし、損傷した Ev からの漏出につながる可能性があるため、クリーン分離は、保管後の分析にとって特に重要です。これは、我々の実験において明らかであった (図 5)、グルクロニダーゼアッセイ前の AF4 の適用が、小胞に封入されていない色素を除去するために管理した。これにより、ここで議論した記憶方法の効果についての明確な結果を得ることが可能になり、一方、AF4 を伴わずに、貯蔵による活動損失が過小評価されることになる。
もう1つの重要な考慮事項は、安定性をテストする Ev の分離と特性評価です。記載された技術は、異なるソースからの ev の比較を可能にするが、これは、それらのすべては、結果が歪んでいないので、同じ分離方式によって調製された場合にのみ可能である18,31,32。この文脈では、細胞培養条件は、分離された EVs33の量および生物活性に影響を与えることができるので、また考慮に入れる必要がある。他の公表結果と比較できる結果を得るためには、最近更新された「細胞外小胞の研究のための最小限の情報」を参考に、EV 研究26の調和のためのガイドラインを記載しておくことが望ましい。
ここで紹介したプロトコルでは、保存後に遊離酵素を除去するために SEC または AF4 を使用しました。グラデーション超遠心よる、UC、限外濾過34などの他の方法を適用することができます。遠心方式と比較すると、SEC と AF4 は時間がかかりません (例えば、SEC の場合、約 1.5 h、カラム平衡化、勾配 UC では最大 16 h 以上)、通常の UC と比較して、無料のタンパク質を EVs から完全に分離することができます。ペレットには常に残留上澄みが残っています。さらに、SEC15および AF435は、ev 上のせん断応力をより少なく誘導する軽度の方法である。比較して、UC の間に EVs に課される力はサイズ34、36の凝集そして変更のような粒子の変更に、導くかもしれない。
SEC と AF4 の欠点は、サンプルの希釈です。従って、多重精製工程後の NTA 測定に必要な濃度を維持するために十分な量の Ev を分離することが求められている。EV フラクションは、遠心フィルターを使用して濃縮することができるが、フィルター材料およびプロトコルに応じて、小胞37の損失があり得る。
ここで議論されるプロトコルの限界は、外因的封入されたグルクロニダーゼの酵素活性を監視するだけであり、カプセル化 RNA および DNA も機能性にとって重要であり得る EV 表面タンパク質も考慮に入れていない。.新しい EV 治療薬の研究では、この技術は機能上のアッセイを置き換えることはできませんが、それらを補完し、小胞の安定性についての指標を与えます。例えば、biofluids に由来する EVs が、そのベシクル含有量の後の分析のために保存されるべきである場合、それは大きな使用の可能性があります。
将来的には、このプロトコルの範囲は、他の生物に由来する EVs、例えば細菌の外膜小胞も含むように拡張することができる。もう一つの興味深い次のステップは、サポニンインキュベートによる核酸の封入を試験し、また DNA または RNA 貨物の安定性を調べることである。
結論として、この手順は、物理化学的および機能的読み出しの両方を統合することにより、様々な哺乳類細胞源からの Ev の貯蔵安定性の評価のための簡単な方法を提供する。この詳細なプロトコルにより、EV 研究者は、小胞に適した貯蔵条件を簡単に決定することができます。
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Disclosures
作者は何も開示することはありません。
Acknowledgments
ドイツ連邦教育研究省からの NanoMatFutur ジュニア研究プログラム (グラント番号 13XP5029A) は、この作業をサポートしました。マクシミリアン・リヒターは、Studienstiftung ・デ・ Deutschen Volkes (ドイツのアカデミック奨学財団) によって、博士課程のフェローシップを通じてサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC) | Sigma-Aldrich | P2663-25MG | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC) | Sigma-Aldrich | P4329-25MG | |
| 225 cm² cell culture flasks | Corning | 431082 | Used with 25 ml of medium |
| 30 kDa regenerated cellulose membrane | Wyatt Technology Europe | 1854 | |
| 350 µm spacer | Wyatt Technology Europe | ||
| Automated fraction collector | Thermo Fisher Scientific | ||
| Beta-glucuronidase | Sigma-Aldrich | G7646-100KU | |
| Chloroform | Fisher scientific | C/4966/17 | |
| Column oven | Hitachi High-Technologies Europe | ||
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T9531-10G | |
| DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector | Wyatt Technology Europe | ||
| Durapore Membrane filter, PVDF, 0,1 µm, 47 mm | Merck | VVLP04700 | Used for the preparation of buffers for AF4 |
| EBM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3156 | Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells |
| Eclipse dualtec | Wyatt Technology Europe | ||
| EGM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3162 | Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells |
| ELISA Plate Sealers | R&D Systems | DY992 | used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay |
| Ethanol | Fisher scientific | E/0665DF/17 | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids | 610000-1EA | |
| Filter support | Avanti Polar Lipids | 610014-1EA | used for liposome preparation |
| Fluorescein di-β-D-glucoronide | Thermo Fisher Scientific | F2915 | |
| Gibco PBS-tablets+CA10:F36 | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | |
| Hettich Universal 320 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Used for pelleting cells at 300 g | |
| Hettich Rotina 420 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Used for pelleting larger debris at 3000 g | |
| HUVEC cells | Lonza Verviers, S.p.r. | C2517A | |
| Kimble FlexColumn 1X30CM | Kimble | 420401-1030 | |
| Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC | Christ | ||
| Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR international | 525-0255 | the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery |
| Nanosight LM14 equipped with a green laser | Malvern Pananalytical | ||
| Nanosight-software version 3.1 | Malvern Pananalytical | ||
| Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes | Whatman/GE Healthcare | 110406 | used for liposome preparation |
| PEEK Inline filter holder | Wyatt Technology Europe | ||
| Phosphotungstic acid hydrate | Sigma-Aldrich | 79690-25G | |
| Polycarbonate bottles for ultracentrifugation | Beckman Coulter | 355622 | |
| QuantiPro BCA Assay Kit | Sigma-Aldrich | QPBCA-1KT | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15 | Carl Zeiss AG | ||
| Sepharose Cl-2b | GE Healthcare | 17014001 | |
| SEM copper grids with carbon film | Plano | S160-4 | |
| Small AF4 channel | Wyatt Technology Europe | ||
| Sputter-coater Q150R ES | Quorum Technologies | ||
| Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011 | Oxford Instruments | ||
| Type 45 Ti ultracentrifugation rotor | Beckman Coulter | 339160 | |
| Ultimate 3000 Dionex autosampler | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex isocratic pump | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K | Beckman Coulter | ||
| UV detector | Thermo Fisher Scientific | ||
| Whatman 0.2 µm pore size mixed cellulose filter | Whatman/GE Healthcare | 10401712 | Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC |
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