Summary
여기서 우리는 세포 밖 소포체의 저장 안정성을 평가 하기 위해 즉시 적용 가능한 프로토콜을 제시 하 고, 세포내에서 생성 되는 자연적으로 발생 하는 나노 입자의 그룹 이다. 소포는 모형 효소로 니드로 적재 되 고 다른 조건 하에서 저장 됩니다. 저장 후,이의 물리 화학적 매개 변수와 캡슐화 된 효소의 활성이 평가 됩니다.
Abstract
세포 밖 소포 (EVs)는 약물, 약물 운반체 및 바이오 마커로 서 사용 되는 현재 연구에서 유망한 표적 이다. 그들의 임상 발달을 위해, 그들의 약 제 활동은 중요 합니다 뿐만 아니라 그들의 생산은 평가 될 필요가 있습니다. 이 맥락에서 연구는 EVs, 특성 및 저장소의 격리에 중점을 둡니다. 본 원고는 유전 조작 또는 특정 기능 분석 없이 EVs에 대 한 다양 한 저장 조건의 효과를 평가 하기 위한 간편한 절차를 제공 하는 것을 목표로 합니다. 이를 통해 주어진 보관 조건 하에서 EVs의 안정성에 대 한 첫 인상을 신속 하 게 얻을 수 있으며, 다른 셀 소스에서 추출한 EVs는 쉽게 비교 가능 합니다. 안정성 측정은 EVs의 물리 화학적 매개 변수 (크기, 입자 농도 및 형태) 및 화물의 활동 보존에 기반 합니다. 후자는 베타-니드 효소의 사포닌 매개 캡슐화에 의해 Ev로 평가 된다. 니드는 대리로 서 작용 하 고 형광 성 리포터 분자의 절단을 통해 쉬운 정량화를 허용 합니다. 본 프로토콜은 임상 적용에 대 한 EV 연구를 진행 하기 위해 EV 특성을 최적으로 유지 하는 저장 조건 검색에서 연구자를 위한 도구가 될 수 있습니다.
Introduction
EVs는 거의 모든 세포 유형에 의해 생성 된 멤브레인 결합 나노 입자입니다. 포유류 세포의 경우, EVs는 별개의 생산 경로1,2로 두 개의 주요 그룹으로 세분 될 수 있습니다. 대략 100-1000 nm에서 크기 범위를 가진 막 소포는, 세포 막에서 직접 신진에 의해 생성 됩니다. 크기 30-200 nm의 엑 소 솜은 내 면으로 형성 되 고, 이어서 세포 막과 융합 하 여 여러 개의 엑 소 좀을 한 번에 방출 하는 다발 골 조직 으로부터 유래한 다. 이 소포의 주요 기능은 세포3사이의 정보 전송입니다. 이 목적을 위해, RNA, DNA 및 단백질과 같은 화물는 활발히 그들로 분류 됩니다. EVs는 건강과 질병 상태 모두에 영향을 미치는 다양 한 효과를 대상에 게 전달할 수 있습니다. 한쪽에는 조직 재생, 항 원 제시 또는 항생제 효과와 같은 긍정적 인 효과를 매개 하 여 치료제4,5로 서의 발달에 대 한 길 조 표적을 만듭니다. 다른 측면에서, Ev는 종양 혈관 신생을 촉진할 수있고, 스트레스 반응7에서 바이 스탠 스 효과를 유도 하 고, 자가 면역 질환8 및 염증 성 질환9에서 역할을 할 수도 있다. 따라서, 그들은 많은 병리학 적 효과의 더 나은 이해에 핵심 구성 요소가 될 수 있습니다. 그러나 암10,11,12 및 심혈 관 질환과 같은 매니 폴드 질환에서 변경 된 EVs가 존재하 고 혈액과 소변에서의 손쉬운 접근이 이상적입니다. 바이오 마커. 마지막으로, 그들의 좋은 생체 적합성14 그리고 그들의 내재 된 표적 능력은 ev도 마약 배달에 대 한 흥미로운 만들기15. 이 원고에서, 우리는 포유류 세포 로부터 유래 된 EVs의 저장 안정성을 평가 하기 위한 프로토콜을 설명 하며, 여전히 거의 조사 되지 않는 중요 한 성질 이다.
EVs의 임상 발달을 위해, 그들의 치료 효과, 생산, 정제 및 저장17의 평가를 포함 하 여 극복16에 많은 장애물이 아직도 있습니다. -80 ° c는 EV 저장 장치 (18)의 표준으로 널리 볼 수 있는 반면, 필요한 냉동 고는 비용이 많이 들며, 생산에서 요구 되는 콜드 체인을 환자에 게 유지 하는 것은 쉽지 않은 일입니다. 또한 일부 보고서는-80 ° c에서 스토리지가 EVs를 최적으로 유지 하지 못하고 ev 기능19,20에서 손실을 유발 한다고 표시 합니다. 동결 건조 (21),22 또는 분무 건조 (23)와 같은 다른 방법은 EVs의 냉동 저장에 대 한 잠재적인 대체물로 제안 되었다.
저장 안정성을 평가 하는 최적의 방법은 기능적 분석에서 EVs를 테스트 하거나 특정 마커의 평가 (예를 들어, 항균 활성19)를 검사 하는 것입니다. 이것은 소포에 대 한 원하는 효과가 알려져 있을 때 그리고 하나의 별개의 EVs 그룹이 연구 될 때 가능 합니다. 상이한 세포 공급원 으로부터의 EVs가 비교 될 경우 (예를 들어, 약물 캡슐화) 또는 알려진 기능적 판독 기능이 없는 경우, 저장에의 한 변화를 직접적으로 평가할 수 없게 된다.
한편, 최근 특허20에 나타난 바와 같이, 크기, 입자 회수 및 단백질 농도와 같은 물리 화학적 파라미터의 변화를 평가 하는 것 만으로도 EV 활성의 변화를 항상 예측 하는 것은 아니다.
여기에서, 우리는 EVs의 화물을 위한 대리로 캡슐화 된 베타-니드 효소의 활동과 결합 된 물리 화학적 매개 변수를 평가 함으로써 EVs의 저장 안정성을 측정 하는 즉시 적용 가능한 프로토콜을 제공 합니다. 효소의 로딩은 상이한 공급원21,24,25로부터의 EVs와 함께 확립 된 온화한 방법으로 사포닌 배양에 의해 이루어진다. 사포닌은 EV 막에 과도 기공을 형성 하 여 소포에 효소 흡수를 허용 합니다. 효소는 불리 한 저장 조건을 복종 하는 경우에 그들의 활동을 분실 하는 경향이 있기 때문에, 그들은 EVs의 기능적인 화물의 보전의 평가를 위한 이상적인 대리입니다.
우리는 인간 간 엽 줄기 세포 (MSCs), 인간 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVECs) 및 인간 선 암 폐 포 상피 세포 (A549) 로부터 유도 된 EVs에이 프로토콜을 적용 하는 것이 실제로 큰 차이를 초래 한다는 것을 입증 했습니다 EV 소스 (21)를 선택할 때 고려해 야 할 다른 셀 라인 사이의 저장 안정성.
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Protocol
1. 세포 배양 및 세포 컨디셔닝 배지 생산
- 일반적으로, 각 세포 줄에 필요한 개별적인 조건 하에서 세포를 육성 한다.
- 무 혈 청 조건에서 또는 EV-고갈 된 태아 소 혈 청 (FBS)을 포함 하는 매체에서 24-72 h를 위한 세포를 경작 하십시오.
참고: EV-고갈 된 FBS 사용 되는 경우, 혈 청을 효율적으로 고갈 시키기 위해 입증 된 방법을 채택 하 여 소 세럼 파생 EVs26으로 오염을 방지 하십시오. - 플라스 크에서 배지를 수집 합니다. 원심 분리기를 300 x g 에서 10 분간 세포를 펠 렛 합니다. 모 깎기 된 세포를 방해 하지 않고 셀 컨디셔닝 배지 (CCM)를 조심 스럽게 수집 하십시오. 바람직하게는, CCM을 직접 사용 하거나 4°c에서 밤새 보관 한다.
참고: 항상 신선 하 게 생산 된 CCM을 사용 하는 것이 좋습니다. 더 긴 기간 동안 스토리지를 우회할 수 없는 경우, 모든 관련 매개 변수는 MISEV2018 가이드라인26에 따라 기록해 야 하며 획득 한 결과의 잠재적 편향이 고려 되어야 합니다. - HUVECs에 대 한 프로토콜 예제
- FBS 및 기타 보조 제를 포함 하는 egm-2 배지에 huvec 120 세포 배양.
- 추가 보충제를 무료로 EBM-2 기초 배지에서 48 h에 대 한 HUVEC 세포를 육성.
- 플라스 크 로부터 배지를 수집 하 고 상기에 나타난 바와 같이 원심 분리 단계를 수행 한다 (단계 1.3). 일반적으로 1 EV-격리에 100 mL의 매체를 사용 합니다.
2. CCM의 초 원심 분리
- 초 원심 분리 직전에, 3000 x g 및 4°c에서 15 분 동안 CCM을 원심 분리 하 여 세포 파편과 큰 응집 체를 제거 한다.
- 상층 액을 UC 튜브에 조심 스럽게 옮겨 준다. 고정 각도 회전자를 사용 하는 경우, UC 후 EV 펠 릿의 검색을 용이 하 게 하기 위해 원심 분리기에서 튜브의 방향을 표시 합니다. 12만 x g에서 2 시간 동안 원심 분리기로 259.4의 k-팩터를 사용 합니다.
- UC를 한 후에, 정 학 피 펫을 사용 하 여 상층 액을 조심 스럽게 버리고, 펠 릿 한 EVs의 교란을 피하십시오.
참고: 펠 릿이 보이지 않을 수 있습니다. - 추가 200 µ L 0.2의 µm 여과 된 인산 완충 식 염 수 (PBS)를 제 1 튜브에 첨가 하 고 PBS 및 잔류 상층 액을 사용 하 여 피 펫 팅을 통해 펠 렛의 위/아래를 소생 시킵니다. 얻어진 EV 현 탁 액을 각각의 샘플의 다음 튜브로 옮겨 소생에 사용 하십시오. 이 방법을 진행 하 여 샘플의 모든 EVs를 약 300-350 µ L의 최종 볼륨으로 소생 시킵니다.
- 소생 후에는 나노 입자 추적 분석 (NTA)에 의해 입자가 존재 하는지 확인 합니다. 아래 설정과 같이 지정 된 EV 유형에 최적화 된 설정을 사용 합니다 (단계 2.5.1).
참고:가 디너 & 알27 과 베 스타드 외28 의 논문에는 EVs 측정을 위한 매개 변수를 최적화 하는 방법에 대 한 유용한 정보가 들어 있습니다.- 아래에 설명 된 결과를 재현 하려면 녹색 레이저가 장착 된 계측기 (예: NanoSight LM14)를 사용 하십시오. 1.0의 화면 이득 및 카메라 레벨 13의 30 초 동영상 3 개를 녹화 합니다. 분석을 위해 1.0의 화면 이득과 감지 임계값 5를 사용 합니다.
- 가능한 경우 즉시 펠 렛을 사용 하십시오. 그렇지 않으면 밤새 4°c에 보관 하십시오.
3. EVs에 캡슐화를 니드
- 재현 탁 펠 렛에 니드의 최종 농도로 1.5 mg/ml 및 사포닌 (10mg/ml)을 최종 농도의 0.1 mg/ml에 첨가 하 여 최종적으로 pml/ml을 추가 하였다. 3 초 동안 잘 섞어 줍니다.
- Intermitted 혼합 하 여 실 온에서 10 분간 배양 한 후 튜브를 가볍게 쓸으 십시오. 인큐베이션 후에, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 직접 정화 한다 (제 5 항 참조).
참고: 동결로 인 한 효소 분해를 방지 하기 위해 한 번 해 동 한 후 니드 샘플을 리프레시 하지 마십시오.
4. 리 포 좀 생산
- EVs와 비교 하기 위해 리 포 좀을 준비 하려면 2:3에 클로로 폼의 1, 2-dimyristoyl-글 리세 리드 포스 포 콜린) 및 1, 2 dipalmitoylsn-글 리 세로 3 포스 포 콜린 (dmpc)를 용 해 시키고 최종 농도 5mm로 합니다. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 바이 알에 1Ml의 분 취 액을 준비 하 고 밤새 건조 시켜 지질 막을 형성 합니다.
주의: 클로로 포 름은 독성이 있으며 cancerogenic 것으로 의심 됩니다. 취급 시에는 적절 한 주의를 기울여야 합니다. - 1.5 mg/mL 니드를 함유 하는 1 mL의 PBS로 지질 막을 재 수화물. 42 ° c로가 열 하 고 1 분 동안 소용돌이. 압출 기 어셈블리를 42 ° c로가 열 하 고 200 nm 폴 리카 보 네이트 멤브레인을 통해 지질 현 탁 액 11x를 돌출 시킵니다. SEC에 의해 직접 정화 (5 항 참조).
5. SEC에의 한 정화
- 다음 프로토콜을 사용 하 여 SEC 열을 준비 합니다.
- 신선한 정제 수와 갓 준비 된 완충만을 사용 하십시오. 0.2 µm 멤브레인 필터를 통해 모든 버퍼를 필터링 하 고 열에 기포의 형성을 방지 하기 위해 그들을 탈 가스.
- SEC 컬럼의 제조를 위해, 아가 로스 겔 여과 기반 매트릭스 (예: 세파 로즈 Cl-2b) 또는 단백질 불순물과 과잉 효소 로부터 EVs와 리 포 좀을 분리 하기에 적합 한 다른 SEC 배지를 사용 하십시오. 먼저, 배지에 저장 된 20%에 토 에이치 용액을 제거 하 고, 칼럼에서 기포 형성을 방지 한다. 이를 위해, SEC 배지를 10 분 동안 3000 x g 에서 원심 분리 하 고,에 토를 제거 하 고, 탈 기 된 물로 교체 한다.
- 유리 기둥 (내부 지름 10mm)을 SEC 배지와 15ml 마크에 채웁니다.
참고: 차원이 다른 열에 대해서는 볼륨이 다릅니다. 젤이 완전히 가라앉을 수 있도록 하십시오. - 실행 하기 전에, PBS의 적어도 두 개의 컬럼 볼륨으로 컬럼을 평형 화 합니다. 컬럼을 저장 하려면 먼저 1 개의 컬럼 체적의 물로 세척 한 다음 적어도 두 열 체적의 20%에 토를가 합니다. 저장 후에는 PBS로 equilibrating 전에 1 열 부피의 물을 먼저 세척 하십시오.
- 하나의 분리에서 최대 400 µ L의 EV 또는 리 포 좀 현 탁 액을 사용 하십시오. 1 mL의 분 획을 수집 합니다. SEC 이후 정제 된 Ev (섹션 7 참조)를 저장 하거나 니드 분석에 적용 하십시오 (6 항 참조).
- EVs와 리 포 좀의 분리가 단백질과 자유 니드을 오염 시키는 것을 확인 합니다. 이를 위해, 수집 된 분 획의 입자 농도와 단백질 농도 및 니드 활성을 상관 한다.
- NTA에의 한 입자 농도 평가 (2.5 참조)
- 비 인산 (BCA) 분석 법 또는 다른 적합 한 단백질 정량 분석에 의해 단백질 함량을 평가 한다. 제조업체의 프로토콜에 따라 분석을 수행 합니다.
- 니드 분석 법에 의해 니드 활성을 평가 한다 (제 6 항 참조).
- 선택적으로, 투과 전자 현미경 (TEM) 및 주사 전자 현미경 (SEM)에 의해 EV 형태학을 평가 한다.
- TEM 샘플의 제조를 위해, TEM 그리드에 10 µ L의 EV 현 탁 액을 추가 하 고 10 분 동안 배양 한 다음 여과 지를 사용 하 여 과잉 액체를 털어 냅니다. 10 µ의 4% 파라 포름알데히드를 사용 하 여 10 분 동안 고정을 수행 하 고 초과 하는 것을 닦아 냅니다. 3 배를 물로 씻으십시오. 1% 형광체-텅스텐 산 수화물을 30 µ의 인큐베이션로 소포를 얼룩. 과량으로 블 롯 한 후, 하룻밤 동안 소포를 건조 시키십시오. TEM으로 시각화 합니다.
주의: 포스 포 텅스텐 산은 높은 부식성; 따라서 피부와 눈을 보호 하십시오. - SEM의 경우, 이전에 준비 된 TEM 샘플을 카본 디스크에 고정 하 고 50 nm 두께의 골드 레이어로 스퍼터 링 합니다. SEM으로 시각화 합니다.
- TEM 샘플의 제조를 위해, TEM 그리드에 10 µ L의 EV 현 탁 액을 추가 하 고 10 분 동안 배양 한 다음 여과 지를 사용 하 여 과잉 액체를 털어 냅니다. 10 µ의 4% 파라 포름알데히드를 사용 하 여 10 분 동안 고정을 수행 하 고 초과 하는 것을 닦아 냅니다. 3 배를 물로 씻으십시오. 1% 형광체-텅스텐 산 수화물을 30 µ의 인큐베이션로 소포를 얼룩. 과량으로 블 롯 한 후, 하룻밤 동안 소포를 건조 시키십시오. TEM으로 시각화 합니다.
6. 니드 분석
- 입자 수와 효소 활성을 상호 연관 시 킴으로써 상이한 샘플 및 저장 조건 간의 비교를 허용 하기 위해, 먼저 NTA에의 한 샘플의 입자 농도를 측정 한다 (2.5 단계 참조).
- PBS의 199 µ L에 화합물 10mg/ml)을 1 µ 첨가 하 여 형광 디 β-glucuronide의 작동 용액을 제조 하였다. 125 µ L의 정제 된 EVs에 25 µ L을 추가 하 여 8.3 µ의 최종 농도를 얻습니다. 샘플을 검은색 96 웰 플레이트에 넣습니다. 480 nm를 발광 파장으로 여기 및 516 nm로 사용 하 여 플레이트 리더기로 시간 포인트 0 h를 측정 합니다.
- 플레이트를 단단히 덮고 (예: PCR 플레이트에 사용 되는 투명 한 플라스틱 호 일) 37 ° c에서 18 시간 동안 어둠 속에서 증발 및 배양을 최소화 합니다. 6.2 단계에 나열 된 플레이트 리더 파라미터를 사용 하 여 형광 생산을 측정 한다.
7. Ev 및 리 포 좀의 보관
참고: 모든 저장 목적을 위해 저 결합 튜브를 사용 하 여 흡착으로 인 한 EV 손실을 줄이는 것이 좋습니다.
- 이 섹션의 매개 변수를 따라 아래에 제공 된 대표적인 결과를 재현 합니다. EV 서 스 펜 션의 400 µ L로 구성 된 샘플을 사용 하십시오.
- 4°c 또는-80 ° c에서 보관 하거나 아래 나열 된 단계를 진행 하십시오.
- EVs를 동결 건조 합니다.
- 정제 된 EVs에 최종 농도 4mg/ml까지trehalose (40)를 첨가 하십시오. 적어도 1 시간 동안-80 ° c에서 샘플을 동결.
- 다음 매개 변수를 사용 하 여 샘플을 동결 건조 합니다. 메인 건조의 경우, 선반 온도를 15°c로 설정 하 고 압력을 0.180 mbar로 설정한 후 샘플을 46 h의 건조 상태로 둡니다. 최종 건조의 경우, 선반 온도를 25°c로 설정 하 고 압력을 0.0035 mbar로 설정한 후 샘플을 2 시간 동안 건조 시켜 둡니다. 동결 건조 된 샘플을 4°c에서 보관 한다.
- 샘플을 다시 하이드레이션 하려면 시작 부분에있는 EV 서 스 펜 션의 양과 동일 하 게 h2o를 추가 합니다 (일반적으로 400 µ l). 재 수 화를 위해 어떤 완충 제를 사용 하지 마십시오.
8. 저장 후 분석
- 효소 활성을 평가 하기 위해, 먼저 저장 중에 EVs에서 유출 되었을 수 있는 무료 니드를 제거 합니다. 이를 위해 SEC에 의해 수행 되는 정제의 추가 단계 (5 단계 참조) 또는 비대칭 유동 장 유동 분별 (AF4 단계 참조)에 의해이를 달성 한다.
참고: 두 방법 모두 EV 샘플의 희석으로 이어질 수 있음을 알려드립니다. 따라서, NTA 정량 한계 이하로 이동 하는 것을 피하기 위해 저장 전에 충분 한 EV 농도를 사용 한다. SEC 또는 AF4에의 한 입자의 1:10 희석을 기대할 수 있습니다.- SEC 정제의 경우 위에 설명 된 프로토콜을 따르십시오 (5 항 참조).
- AF4 정화를 수행 합니다.
- 350 µm 스페이서와 30kd 분자량 컷오프 셀 룰로 오 스 멤브레인이 있는 작은 채널을 사용 하 여 계측기를 설정 합니다. 0.1 µm 기 공 크기 필터를 HPLC 펌프와 AF4 채널 사이에 배치 합니다. 신선 하 게 준비 된 0.1 µm-여과 된 PBS를 이동 상으로 사용 하 여 광산 산란 검출기의 입자 하중과 소음을 줄입니다.
- 280 nm로 설정 된 UV 검출기를 사용 하 여 단백질을 검출 합니다. 입자를 감지 하려면 레이저를 658 nm로 설정 하 여 다중 각도 광 산란을 사용 합니다.
- 다음 run 메서드를 사용 합니다. 1 분의 초점 흐름으로 1 분간 사전 초점; 그런 다음 샘플의 300 µ L을 0.2 mL/min의 비율로 주입 하 고 초점 흐름을 10 분 동안 유지 합니다. 주입 후, 시료를 1ml/min에서 용 해 하 고 크로스 플로우를 사용 하지 않고 다른 10 분 동안 2 분에서 0.1 mL/min으로 감소 하는 교차 흐름을 적용 합니다. 12.5 분 후부터 시작 하 여 1 mL의 분 획을 수집 하 고 27 분까지 계속 합니다.
- 전술한 바와 같이 니드 분석을 수행 한다 (제 6 항 참조).
- 크기 및 농도를 평가 하기 위해, 전술한 바와 같이 NTA를 사용 한다 (2.5 단계 참조).
- 필요에 따라 TEM 및 SEM을 수행 하 여 저장 후 EVs의 형태를 평가할 수 있습니다 (5.3 참조).
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Representative Results
그림 1 은 HUVECs에서 격리 된 EVs의 저장소 특성을 표시 합니다. EVs는 UC에 의해 분리 되었고, 니드 캡슐화 되었고, SEC 후에, 정제 된 EVs는 NTA에 의해 그들의 물리 화학적 성질을 평가 하였다. 샘플을 이어서 AF4 정제를 실시 하 고 니드 활성을 측정 하였다.
소포는 4°c 또는-80 ° c에서 7 d, 그리고 4°c에서 동결 건조 된 형태로 저장 하였으며, 후자의 경우 4% trehalose를 첨가 하였다. 저장 후, 소포는 NTA에 의해 다시 측정 되 고, AF4 후에, 입자 당 나머지 니드 활성이 평가 되었다.
AF4의 작동 원리는 AF4 채널의 바닥에 있는 다공성 멤브레인을 통해 층 류 흐름과 직교 교차 흐름의 조합을 기반으로 하며,이는 그 크기에 따라 입자에 차별적으로 영향을 미칩니다 (그림 2). 더 큰 입자는 더 작은 입자가 채널에서 더 위에 위치 하는 동안 막에 가깝게 위치 하는 경향이 있습니다. 층 류 흐름의 포물선 흐름 프로 파일 때문에, 분리 막 으로부터 더 멀리 떨어진 입자가 검출기 쪽으로 더 빠르게 이동 하 여, 입도에의 한 입자 분리를 유도 한다. 전형적인 AF4 실험에서, 주입 된 입자는 막에 먼저 초점을 맞추고, 채널을 통해 길이 흐름 없이 교차 흐름을 적용 한다 (도 2a). 주입 및 초점을 맞춘 후, 용 출은 교차 흐름과 종 방향 흐름을 동시에 적용 하 여 입자의 상이한 서브 세트 (그림 2B)를 석은 하 고, 우리의 경우에는 EVs와 자유 니드을 통해 시작 됩니다.
도 3 은 단백질 및 비 캡슐화 니드 오염 으로부터 나노 입자 (ev 또는 리 포 좀)의 분리를 도시 한다. 그의 제조 후 정제 된 리 포 좀 (도 3a)의 SEC 용 리 프로 파일 (상기 프로토콜의 제 4 항 참조)은 무료 효소 로부터 캡슐화 된 니드 입자 들의 분리를 나타내 었으 며, BCA 분석을 통해 모두 검출 되 고 효소 활성. 본 예에서, 분 획 6 및 7은 가장 높은 입자 농도를 함유 하 고 자유 니드 가능한 오염을 방지 하기 위해 추가 실험을 위해 선택 될 것 이다. AF4는도 3에서 입증 된 것과 같이 무료 니드에서 EVs를 분리 하는 데도 성공 하였으며, SEC 보다 더 높은 수준의 분리를 통해 소포를 포함 하는 분 획의 오염을 덜 가능성이 있습니다.
도 4에서, 소포에 대해 측정 된 효소 활성이 실제로 ev로 니드의 캡슐화에 연결 되었고 효소 응집 체로 인 한 것이 아니라는 것을 확인 하기 위해 대조 실험을 수행 하였다. 이러한 응집은 사포닌과의 니드의 인큐베이션로 인해 형성 되었을 수 있고, 거짓 양성 결과를 초래 한다. 소포가 수 분 되는 부분을 확인 하기 위해, 캡슐화 된 니드 없는 정제 된 EVs는 단지 사포닌 및 효소를 함유 하는 샘플과 동일한 칼럼에서 SEC를 실시 하였다.
니드를 사포닌으로 인큐베이션 하 고 연속적으로 SEC에 의해 정제 하는 경우, 일반적으로 EVs를 함유 하는 분 획 물에서 효소 활성이 발견 되지 않았다. 소량의 입자가 EVs (일반적인 EV 펠 릿에서 회수 된 입자의 < 0.1%를 차지 함)와 동시에 용 출 되는 것을 발견 했지만, 상호 연관 된 효소 활성이 없었다. 이러한 결과는 소포를 포함 하는 분 획에서 회수 된 활성 효소가 그 안에 캡슐화 되었음을 나타낸다.
도 5 는 비 캡슐화 염료를 제거 하기 위해 추가의 AF4 정제 없이 또는 추가적으로 저장 후의 활성 효소의 회수를 비교한 것 이다. AF4 정제를 사용 하면 일반적으로 4 ° c에서의 저장에 가장 높은 효과를 갖는 입자 당 효소의 낮은 회복이 있으며,이 경우 회복은 2/3로 떨어집니다. 따라서,이 추가의 정제 단계를 생략 하면 효소 안정성에 대 한 잘못 된 가정을 초래할 수 있다.
도 6 은-80 ° c에서 동결과 비교 하 여 MSCs, A549 세포 및 리 포 좀 으로부터 유래 된 소포에 대 한 동결 건조를 거치지 않은 냉동의 효과를 보여준다. 입자는 전술한 바와 같이 TEM 및 SEM에 의해 이미지화 되었다 (프로토콜의 5.3 단계 참조). MSCs 및 A549 EVs는 두 가지 저장 조건을 비교 하 여 TEM 이미지의 모양에 큰 차이를 나타내지 않았습니다. 그러나 SEM 사진에는-80 ° c 샘플에서 발견 되지 않은 응집 물이 표시 된 동결 건조 된 샘플이 있다. 리 포 좀은 또한 SEM 사진에 응집 물을 표시 하 고, TEM에서는, 동결 건조가 크기 증가를 유도 하는 것으로 나타났다. Cryoprotectants 없는 동결 건조는 또한 저장 후에 온전한 니드의 회복을 감소 시켰다 (도 7). 냉동 보호 제로 서의 trehalose의 첨가는 활성 효소의 회수를 용량 의존적 방식으로 증가 시켰다.
도 8 은 니드 분석에서 일어나는, 자유 형광에 형광 디 β-glucuronide의 전환을 보여준다. 교육을 516 nm에서 비 형광으로 하는 동안, 형광는이 파장에서 높게 형광 성입니다. 이는 고감도의 간단한 효소 활성 분석을 허용 하였다.
그림 1 : HUVEC ev의 저장 안정성. (A) 저장 전과 비교 하 여, (B) 평균 크기 및 huvecs로부터 분리 한 EVs의 입자 당 정규화 된 니드 활성을 비교한 입자 회수율. 소포는 4% trehalose로 동결 건조 후 4°c에서 4°c 80 및 4°c에서 7d로 저장 하였다. 평균 크기 및 입자 회수율을 NTA에 의해 측정 하였다; 입자 당 니드 활성은 니드 분석의 결과 및 NTA 데이터를 결합 하 여 계산 하 고 저장 하기 전에 표준화 하였다. 평균 ± SD, n=3 < 0.05 ( tukey의 사후 검정을 따르는 단방향 분산 분석). 에서 수정 프랭크 외.21. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : AF4의 작동 원리. (A) ev 및 무료 니드는 교차 흐름을 적용 하 여 주입 후에 집중 됩니다. (B) 이후, ev 및 프리 효소는 채널을 통해 흐름을 교차 흐름으로 결합 하 여 별도로 용 출 된다. 에서 수정 프랭크 외.21. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 무료 니드에서의 ev와 리 포 좀 분리 (A) 니드-로드 된 리 포 좀, 자유 니드 및 단백질 오염 물질의 대표적인 SEC 분리. 그래프는 입자 농도 (적색), 단백질 농도 (청색) 및 니드 활성 (녹색)을 표시 합니다. (B) 무료 니드에서 EVs의 분리에 대 한 시연. 처리 되지 않은 EVs는 0.05 mg/mL 니드, 무료 니드 (0.5 밀리 그램) 및 니드로 로드 된 EVs와 SEC (EV 니드)로 정제 되어 280 nm 및 90 ° 광산 산란에서 UV에 의해 주입 및 분석 되었습니다. Ev와 별도로 무료 효소 용 출. 에서 수정 프랭크 외.21. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 무료 니드에서 EVs의 정화에 대 한 제어 실험. 400의 네이티브 EVs 또는 400 µ L의 1.5 mg/ml 니드의 µ L을 PBS에 10 0.1 분간 인큐베이션 하 여 SEC에 의해 정제 하였다(A) 소포 및 니드의 수집 된 분 획의 입자 농도 및 각각의 효소 활성 정제 된 니드. (B) 동일한 실험에서 측정 한 280 nm에서의 UV 흡수. 니드의 첫 번째 작은 피크는 패널 A의 회색 선과 일치 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : EV 저장 후 추가 정제 단계의 효과. 저장 후 AF4 정제 단계를 추가 하거나 포함 하지 않고 d0에 비해 입자 당 남은 니드 활성. HUVEC EVs는 4°c 또는-80 ° c에서 7d 용으로 저장 하 고 4% trehalose로 동결 건조 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : Ev의 TEM 및 SEM 사진. (A) MSCs 및 (B) A549 세포 및 (C) 리 포 솜 으로부터의 EVs의 TEM 및 SEM 사진. 샘플을 80 ° c에서 14d에 보관 하거나 trehalose의 첨가 없이 동결 건조 하였다. 화살표는 TEM 사진에서 형태학 적으로 변경 된 입자의 존재를 나타내고 SEM 사진에서 응집 한다. 에서 수정 프랭크 외.21. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7 : 동결 건조 후의 효소 회수에 대 한 trehalose 효과. 동결 건조 후 14 일 동안 효소 활성을 비교 하 고, 저장 전에 시료를 0%, 1% 및 4% trehalose. 에서 수정 프랭크 외.21. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8 : 효소 적 분열 형광 디 β-glucuronide 니드. 반응 식에서, 니드의 검출을 기저 하는 반응은 설명 된다. 비 형광 성 형광 디 β-glucuronide는 니드에 의해 절단 됩니다. 설탕 잔류물의 제거를 통해, 형광는 그것의 형광 특성을 다시 얻습니다. 인큐베이션 기간 후에 측정 된 형광은 존재 하는 활성 효소의 양과 상관 되며 니드 분석의 판독 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 원고에서는 다양 한 보관 조건에서 EVs의 안정성을 연구 하기 위한 종합적인 프로토콜을 제시 합니다. 캡슐화 된 니드을 기능적 판독 및 EVs의 물리 화학적 파라미터의 평가와 결합 하 여,이 프로토콜은 EVs의 간단한 저장 안정성 평가와 다른 셀의 EVs 비교를 허용 합니다. 라인. SEM 및 TEM을 보완 방법으로 사용 하면 단일 입자 수준에서 EVs의 변화에 대 한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 여기에 제시 된 결과는 냉동 보호 제 없이 동결 건조로 인해 EVs와 리 포 좀이 응집 되는 경향을 보였다 (도 6). 그러나, 이것은 SEM 실험 에서만 관찰 되었다. EM 이미징은 trehalose로 보존 된 샘플로 진행 되지 않았지만,이 문헌에서는이 냉동 보호 제가 실제로 EVs29의 응집을 감소 시킬 수 있음을 시사 합니다. 주어진 저장 조건이 EV 크기, 회복 속도 및 캡슐화 된 분자에 차별적으로 영향을 미치는 경우에도 평가할 수 있습니다. 이러한 효과는 HUVEC Ev에 대해 얻어진 결과에 의해 예시 된다 (도 1). 4 ° c 및-80 ° c에 대 한 입자 회수율이 동결 건조 된 샘플에 대 한 것 보다 더 나은 반면, 활성 캡슐화 된 니드의 회수는 동결 건조 된 샘플에 대해 가장 적합 하였다. EVs의 동결 건조는 예를 들어 EV 바이오 마커를 분석 할 때 보다 유리한 저장 조건이 될 수 있으며, 여기서 초점은 온전한 소포 보다는 손상 되지 않은 화물을 획득 하 고 보존 하는 데 더 많은 것입니다.
그들의 최근 논문에서 EVs22의 동결 건조에 관한 것 이다. 이 화학적 매개 변수에 관해서는, 제타 전위의 변화는 콜 로이드 안정성 감소와 상관관계가 있기 때문에 다 분산 지 index (PDI)와 제타 전위에 초점을 맞추고 있습니다. 그러나, 제타 전위는 안정성 (30)의 관찰 된 변화를 전적으로 설명할 수 없으며, 그 결과에도 반영 되었다. 그들은 또한 폴 리 아크릴 아 미드 겔 전기 영동에 의해 저장 된 EVs의 단백질 및 RNA 함량을 비교 했습니다. 이 기술은 소포의 단백질 또는 RNA 함량의 실질적인 변화를 매우 잘 나타낼 수 있습니다. 그러나 여기에 제시 된 방법 보다 훨씬 더 많은 양의 재료가 필요 합니다. EV 화물에 대 한 저장의 효과를 평가 하기 위해, 차 른 비리 야 쿨 외. 각각의 EV 생산자 세포 라인에서 효소와 DNA 종을 이성애 적으로 발현 하 고 EVs에서의 활동과 무결성을 모니터링 했다. 그러나, 이러한 이종 발현은 상이한 공급원 으로부터의 EVs가 비교 될 경우에는 적합 하지 않으며, 각각의 새로운 세포 라인에 대해 상당한 시간을 필요로 하기 때문에, 단순한 사포닌 매개 캡슐화가 용이 하 게 적용 될 수 있다.
그림 3과 같이 캡슐화 되지 않은 효소를 제거 하는 것이 중요 합니다. EV-캡슐화 된 니드은 캡슐화 효율에 대 한과 대 평가를 이끌어 내는 용액에서 자유 효소 보다 기질에 훨씬 느리게 반응 합니다. 저장 조건이 시료의 자유로운 니드 활동에 영향을 미칠 수 있고 손상 된 EVs 로부터 누출 될 수 있으므로, 저장 후에는 깨끗 한 분리가 분석에 특히 중요 합니다. 이것은 우리의 실험에서 명백 하 게 (도 5), 니드 분석 전에 AF4의 적용으로 서 소포에 캡슐화 되지 않은 염료를 제거 하는 것으로 관리 되었다. 따라서, 여기에서 논의 된 저장 방법의 효과에 대 한 명확한 결과를 얻을 수 있게 되었고, AF4 없이, 저장으로 인 한 활동 손실은 과소 평가 되었을 것입니다.
또 다른 중요 한 고려 사항은 안정성 테스트를 위한 EVs의 분리 및 특성 분석입니다. 설명 된 기술은 다른 소스의 EVs를 비교 하는 것을 가능 하 게 하지만 결과가 왜곡 되지 않도록 동일한 격리 방법으로 모든 것을 준비 하는 경우에만 가능 합니다.18,31,32. 이 맥락에서, 세포 배양 조건은 고립 된 EVs33의 양과 생물 활성에 영향을 미칠 수 있으므로 또한 고려해 야 합니다. 다른 출판 된 결과와 비교할 수 있는 결과를 얻기 위해, EV 연구26의 조화를 위한 지침이 포함 된 최근 업데이트 된 "세포 밖 소포체 연구를 위한 최소한의 정보"를 참조 하는 것이 좋습니다.
여기에 제시 된 프로토콜에서, 우리는 저장 후에 자유 효소를 제거 하기 위한 SEC 또는 AF4를 사용 하였다. 그라데이션 초 원심 분리, UC 또는 한 외 여과34와 같은 다른 방법을 적용할 수 있습니다. 원심 방법과 비교 했을 때 SEC 및 AF4는 시간 소모적인 (예: 열 평형 화와 그라데이션 UC에 대 한 최대 16h)을 포함 한 SEC의 경우 약 1.5) 그리고 일반 UC와 비교 하 여 EVs에서 무료 단백질을 완전히 분리할 수 있습니다. 펠 렛에는 항상 잔류 상층 액이 남아 있습니다. 또한 SEC15 및 AF435 는 약한 방법으로 EVs의 전단 응력을 덜 유발 합니다. 이에 비해 UC 중 EVs에 부과 되는 힘은34,36크기의 응집 및 변경과 같은 입자의 변형을 초래할 수 있습니다.
SEC 및 AF4의 단점은 샘플의 희석입니다. 따라서, 여러 정제 단계 후에 NTA 측정에 필요한 농도를 유지 하기 위해 충분 한 양의 EVs를 분리 하는 것이 요구 된다. EV 분 획은 원심 필터를 사용 하 여 농축 될 수 있지만, 필터 물질과 프로토콜에 따라, 소포37의 손실이 있을 수 있다.
여기에서 논의 된 프로토콜의 제한은 캡슐화 된 RNA 및 DNA를 고려 하지 않으며, 기능을 위해 중요할 수 있는 EV 표면 단백질을 고려 하지 않고 니드 캡슐화 된의 효소 활성만을 감시 한다는 것입니다18 . 새로운 EV 치료제의 연구를 위해이 기법은 기능에 대 한 분석을 대체할 수는 없지만 칭찬 하 고 소포 안정성에 대 한 지표를 제공 합니다. 예를 들면, 비 형광에서 파생 된 EVs는 그들의 소포 내용물의 나중 분석을 위해 저장 될 경우에, 중대 한 사용의 수 있습니다.
앞으로,이 프로토콜의 범위는 다른 유기 체 로부터 유래 된 EVs를 포함 하도록 확장 될 수 있다, 예를 들어, 세균 외부 막 소포. 또 다른 흥미로운 다음 단계는 사포닌 배양에의 한 핵 산의 캡슐화를 시험 하 고 또한 DNA 또는 RNA 카 르고 스의 안정성을 살펴 보는 것 이다.
결론적으로이 절차는 물리 화학적 및 기능적 판독을 모두 통합 하 여 다양 한 포유류 세포 공급원 으로부터의 EVs의 저장 안정성을 평가 하는 간단한 방법을 제공 합니다. 이 상세한 프로토콜은 EV 연구자 들이 소포에 대 한 적절 한 보관 조건에 대 한 간단한 결정을 할 수 있게 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
독일 교육 연구 부 (보조금 번호 13XP5029A)의 나노 Matfutur 주니어 연구 프로그램은이 작업을 지원 했다. 막시밀리안 리히터는 박사 펠로 우 십을 통해 유스호스텔 Volkes (독일 학술 장학 재단)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC) | Sigma-Aldrich | P2663-25MG | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC) | Sigma-Aldrich | P4329-25MG | |
| 225 cm² cell culture flasks | Corning | 431082 | Used with 25 ml of medium |
| 30 kDa regenerated cellulose membrane | Wyatt Technology Europe | 1854 | |
| 350 µm spacer | Wyatt Technology Europe | ||
| Automated fraction collector | Thermo Fisher Scientific | ||
| Beta-glucuronidase | Sigma-Aldrich | G7646-100KU | |
| Chloroform | Fisher scientific | C/4966/17 | |
| Column oven | Hitachi High-Technologies Europe | ||
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T9531-10G | |
| DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector | Wyatt Technology Europe | ||
| Durapore Membrane filter, PVDF, 0,1 µm, 47 mm | Merck | VVLP04700 | Used for the preparation of buffers for AF4 |
| EBM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3156 | Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells |
| Eclipse dualtec | Wyatt Technology Europe | ||
| EGM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3162 | Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells |
| ELISA Plate Sealers | R&D Systems | DY992 | used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay |
| Ethanol | Fisher scientific | E/0665DF/17 | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids | 610000-1EA | |
| Filter support | Avanti Polar Lipids | 610014-1EA | used for liposome preparation |
| Fluorescein di-β-D-glucoronide | Thermo Fisher Scientific | F2915 | |
| Gibco PBS-tablets+CA10:F36 | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | |
| Hettich Universal 320 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Used for pelleting cells at 300 g | |
| Hettich Rotina 420 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Used for pelleting larger debris at 3000 g | |
| HUVEC cells | Lonza Verviers, S.p.r. | C2517A | |
| Kimble FlexColumn 1X30CM | Kimble | 420401-1030 | |
| Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC | Christ | ||
| Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR international | 525-0255 | the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery |
| Nanosight LM14 equipped with a green laser | Malvern Pananalytical | ||
| Nanosight-software version 3.1 | Malvern Pananalytical | ||
| Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes | Whatman/GE Healthcare | 110406 | used for liposome preparation |
| PEEK Inline filter holder | Wyatt Technology Europe | ||
| Phosphotungstic acid hydrate | Sigma-Aldrich | 79690-25G | |
| Polycarbonate bottles for ultracentrifugation | Beckman Coulter | 355622 | |
| QuantiPro BCA Assay Kit | Sigma-Aldrich | QPBCA-1KT | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15 | Carl Zeiss AG | ||
| Sepharose Cl-2b | GE Healthcare | 17014001 | |
| SEM copper grids with carbon film | Plano | S160-4 | |
| Small AF4 channel | Wyatt Technology Europe | ||
| Sputter-coater Q150R ES | Quorum Technologies | ||
| Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011 | Oxford Instruments | ||
| Type 45 Ti ultracentrifugation rotor | Beckman Coulter | 339160 | |
| Ultimate 3000 Dionex autosampler | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex isocratic pump | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K | Beckman Coulter | ||
| UV detector | Thermo Fisher Scientific | ||
| Whatman 0.2 µm pore size mixed cellulose filter | Whatman/GE Healthcare | 10401712 | Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC |
References
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