Summary
Aquí presentamos un protocolo fácilmente aplicable para evaluar la estabilidad del almacenamiento de las vesículas extracelulares, un grupo de nanopartículas naturales producidas por las células. Las vesículas se cargan con glucuronidasa como una enzima modelo y se almacenan en diferentes condiciones. Después del almacenamiento, se evalúan sus parámetros fisicoquímicos y la actividad de la enzima encapsulada.
Abstract
Las vesículas extracelulares (EVs) son objetivos prometedores en la investigación actual, que se utilizarán como fármacos, portadores de fármacos y biomarcadores. Para su desarrollo clínico, no sólo su actividad farmacéutica es importante, sino también su producción necesita ser evaluada. En este contexto, la investigación se centra en el aislamiento de los EVs, su caracterización y su almacenamiento. El presente manuscrito tiene como objetivo proporcionar un procedimiento fácil para la evaluación del efecto de las diferentes condiciones de almacenamiento en los EVs, sin manipulación genética o ensayos funcionales específicos. Esto hace posible obtener rápidamente una primera impresión de la estabilidad de los EVs bajo una condición de almacenamiento determinada, y los EVs derivados de diferentes fuentes celulares se pueden comparar fácilmente. La medición de la estabilidad se basa en los parámetros fisicoquímicos de los EVs (tamaño, concentración de partículas y morfología) y en la preservación de la actividad de su carga. Este último es evaluado por la encapsulación mediada por saponina de la enzima beta-glucuronidasa en el EVs. La glucuronidasa actúa como sustituto y permite una fácil cuantificación a través de la hendiedad de una molécula reportera fluorescente. El presente Protocolo podría ser una herramienta para los investigadores en la búsqueda de condiciones de almacenamiento que conserven de forma óptima las propiedades de EV para avanzar la investigación de EV hacia la aplicación clínica.
Introduction
Los EVs son nanopartículas ligadas a membranas producidas por casi todos los tipos de células. Para las células de mamíferos, los EVS se pueden subdividir en dos grupos principales con distintas vías de producción1,2. Las vesículas de membrana, con un rango de tamaño de aproximadamente 100-1000 nm, se producen por el brote directo de la membrana celular. Los exosomas, de tamaño 30-200 nm, se derivan de cuerpos multivesiculares formados por la entrada interna en endosomas que posteriormente se fusionan con la membrana celular para liberar múltiples exosomas a la vez. La función principal de estas vesículas es el transporte de información entre las células3. Para este propósito, cargas como el ARN, el ADN y las proteínas se clasifican activamente en ellos. Los EVs pueden transmitir una variedad de efectos sobre sus objetivos, con implicaciones tanto para la salud como para el estado de la enfermedad. En un lado, median efectos positivos como la regeneración de tejido, presentación de antígeno, o efectos antibióticos, lo que los convierte en objetivos auspiciosos para su desarrollo como terapéutica4,5. Por otro lado, los EVs pueden promover la vascularización tumoral6, inducir efectos de transeúnte en las respuestas de estrés7, y podrían desempeñar un papel en las enfermedades autoinmunes8 y enfermedades inflamatorias9. Por lo tanto, pueden ser un componente clave para una mejor comprensión de muchos efectos patológicos. Sin embargo, la presencia de EVS alterados en enfermedades múltiples, como el cáncer10,11,12 y los trastornos cardiovasculares13, y su fácil accesibilidad en la sangre y la orina los hace ideales Biomarcadores. Finalmente, su buena biocompatibilidad14 y su capacidad inherente de focalización hacen que los EVS también sean interesantes para la entrega de fármacos15. En este manuscrito, describimos un protocolo para la evaluación de la estabilidad del almacenamiento de EVs derivado de células de mamíferos, una propiedad importante que todavía es poco investigada.
Para el desarrollo clínico de EVs, todavía hay muchos obstáculos para superar16, incluyendo la evaluación de sus efectos terapéuticos, producción, purificación y almacenamiento17. Mientras que-80 ° c es ampliamente visto como el estándar de oro para el almacenamiento EV18, los congeladores requeridos son caros, y el mantenimiento de la cadena de frío requerida de la producción al paciente puede ser desafiante. Por otra parte, algunos informes indican que el almacenamiento a-80 ° c todavía no preserva de manera óptima el EVS e induce una pérdida en la funcionalidad de EV19,20. Otros métodos, como el liofilizado21,22 o el secado por pulverización23, se han propuesto como posibles alternativas al almacenamiento congelado de EVS.
La forma óptima de evaluar la estabilidad del almacenamiento sería probar los EVs en ensayos funcionales o mediante la evaluación de un marcador específico, por ejemplo, su actividad antibacteriana19. Esto es posible cuando se conoce el efecto deseado de las vesículas y cuando se estudia un grupo diferenciado de EVs. Si se comparan los EVs de diferentes fuentes celulares (p. ej., para la encapsulación de fármacos) o si no hay ninguna lectura funcional conocida, ya no es posible evaluar los cambios debidos al almacenamiento de forma directa.
Por otro lado, simplemente evaluar los cambios en sus parámetros fisicoquímicos, como el tamaño, la recuperación de partículas y la concentración de proteínas, no siempre predice los cambios en la actividad del EV, como se ha demostrado en una patente reciente20.
Aquí, proporcionamos un protocolo fácilmente aplicable para medir la estabilidad del almacenamiento de EVs mediante la evaluación de sus parámetros fisicoquímicos combinados con la actividad de una enzima beta-glucuronidasa encapsulada como sustituto de la carga de los EVs. La carga de la enzima se realiza por incubación de saponina, un método suave establecido con EVS de diferentes fuentes21,24,25. La Saponin forma poros transitorios en la membrana EV, lo que permite la captación de enzimas en la vesícula. Como las enzimas son propensas a perder su actividad si se someten a condiciones de almacenamiento desfavorables, son un sustituto ideal para la evaluación de la preservación de las cargas funcionales de los EVs.
Hemos demostrado que la aplicación de este protocolo a los EVs derivados de las células madre mesenquimales humanas (MSCs), las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs) y el adenocarcinoma humano alveolar (A549) de hecho resultan en grandes diferencias en estabilidad de almacenamiento entre diferentes líneas celulares, que deben tenerse en cuenta al elegir la fuente EV21.
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Protocol
1. el cultivo celular y la producción de medio acondicionado con celdas
- En general, cultivar las células en las condiciones individuales requeridas para la línea celular respectiva.
- Cultivar las células durante 24-72 h en condiciones libres de suero o en un medio que contenga suero bovino fetal empobrecido (FBS).
Nota: si se utiliza FBS empobrecido por EV, emplear un método comprobado para agotar eficientemente el suero, para evitar la contaminación con EVs derivados del suero de bovino26. - Recoja el medio de las matraces. Centrifugar a 300 x g durante 10 min para peletiza las células. Recoja cuidadosamente el medio con condicionado celular (CCM), sin perturbar las células granuladas. Preferiblemente, utilice el CCM directamente, o guárdela durante la noche a 4 ° c.
Nota: siempre es preferible utilizar el MCP recién producido. Si no puede eludirse el almacenamiento durante períodos de tiempo más prolongados, todos los parámetros pertinentes deben registrarse de conformidad con las directrices MISEV201826, y es necesario tener en cuenta los posibles sesgos de los resultados adquiridos. - Protocolo de ejemplo para HUVECs
- Cultivar células HUVEC para 120 h en medio EGM-2 que contiene FBS y otros suplementos.
- Cultivar células HUVEC por 48 h en medio basal de EBM-2 sin suplementos adicionales.
- Recoja el medio de los matraces y realice el paso de centrifugación como se indicó anteriormente (paso 1,3). Típicamente, utilice 100 mL de medio para un aislamiento EV.
2. ultracentrifugación de CCM
- Inmediatamente antes de la ultracentrifugación (UC), Centrifugue el MCP durante 15 min a 3.000 x g y 4 ° c para eliminar los desechos celulares y los grandes aglomerados.
- Transfiera con cuidado el sobrenadante a los tubos UC. Si se utiliza un rotor de ángulo fijo, marque la orientación de los tubos en la centrífuga para facilitar la recuperación del pellet de EV después de la UC. Centrifugar por 2 h a 120.000 x g, con un factor k de 259,4.
- Después de la UC, deseche cuidadosamente el sobrenadante utilizando un Pipet serológico, para evitar la perturbación de los EVs pelados.
Nota: el pellet puede ser invisible. - Añadir 200 μL de solución salina filtrada por fosfato de 0,2 μm (PBS) al primer tubo y utilizar PBS y el sobrenadante residual para resuspentar el pellet pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Transfiera la suspensión EV resultante al siguiente tubo de la muestra respectiva y utilítila para la resuspensión. Proceda de esta manera para resuspender todos los EVs de la muestra en un volumen final de aproximadamente 300-350 μL.
- Después de la resuspensión, confirme la presencia de partículas por análisis de rastreo de nanopartículas (NTA). Utilice los ajustes optimizados para el tipo de EV determinado, como los ajustes siguientes (paso 2.5.1).
Nota: los documentos de Gardiner et al.27 y vestad et al.28 contienen información valiosa sobre cómo optimizar los parámetros para medir los EVS.- Para reproducir los resultados descritos a continuación, utilice instrumentos (p. ej., NanoSight LM14) equipados con un láser verde. Graba tres videos de 30 s con una ganancia de pantalla de 1,0 y un nivel de cámara de 13. Para el análisis, utilice una ganancia de pantalla de 1,0 y un umbral de detección de 5.
- Utilice el pellet inmediatamente, si es posible; de lo contrario, guárdelo a 4 ° c durante la noche.
3. encapsulado de glucuronidasa en EVs
- Para el pellet resuspendido, añadir beta-glucuronidasa (10 mg/mL en PBS) a una concentración final de 1,5 mg/mL y saponina (10 mg/mL en H2O) a una concentración final de 0,1 mg/ml. Mezclar bien por vórtex para 3 s.
- Incubar durante 10 min a temperatura ambiente con mezcla intermitida deslizando suavemente el tubo. Después de la incubación, purificar directamente por cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) (ver sección 5).
Nota: no recongelar las muestras de glucuronidasa una vez descongeladas, para evitar la degradación enzimática debida a la congelación.
4. la producción de liposome
- Para preparar liposomas para la comparación con EVs, disolver 1, 2-Dimyristoyl-SN-glycero-3-fosfocholine (DMPC) y 1, 2-Dipalmitoyl-SN-glycero-3-FOSFOCHOLINE (DPPC) en una ración de 2:3 molar en cloroformo a una concentración final de 5 mm. Prepare alícullitas de 1 mL en viales de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y déjelos secar durante la noche para formar una película lipídica.
PRECAUCIÓN: el cloroformo es tóxico y se sospecha que es cancerógeno. Tome las precauciones adecuadas al manipularlo. - Rehidratar la película lipídica con 1 mL de PBS que contiene 1,5 mg/mL de glucuronidasa. Calentar a 42 ° c y vórtice durante 1 min. calentar el ensamblaje del extrusor a 42 ° c y Extruir la suspensión lipídica 11x a través de una membrana de policarbonato de 200 nm. Purificar directamente por SEC (ver sección 5).
5. purificación por SEC
- Prepare la columna SEC con el siguiente protocolo.
- Utilice únicamente agua purificada fresca y amortiguadores recién preparados. Filtre todos los buffers a través de un filtro de membrana de 0,2 μm y desgaseelos para evitar la formación de burbujas de aire en la columna.
- Para la preparación de una columna SEC, utilice una matriz basada en filtración de gel de agarosa (p. ej., Sepharose CL-2B) u otro medio SEC adecuado para separar EVs y liposomas de impurezas de proteínas y exceso de enzimas. En primer lugar, retire la solución de 20% EtOH en la que se almacena el medio, para evitar la formación de burbujas de aire en la columna. Con este fin, Centrifugue el medio SEC a 3.000 x g durante 10 min, extraiga el EtOH y reemplácelo por agua desgasizada.
- Llenar una columna de vidrio (con un diámetro interior de 10 mm) con el medio SEC a la marca de 15 mL.
Nota: los volúmenes variarán para las columnas con diferentes dimensiones. Asegúrese de dejar que el gel se asientan completamente. - Antes de una carrera, equilibrar la columna con al menos dos volúmenes de columna de PBS. Para almacenar la columna, primero lávela con un volumen de agua de columna, seguida de al menos dos volúmenes de columna del 20% de EtOH. Después del almacenamiento, lave la columna primero con un volumen de agua de columna antes de equilibrar con PBS.
- Utilice hasta 400 μL de suspensión de EV o liposoma en una separación. Recoger fracciones de 1 mL. Después de la SEC, almacene los EVs purificados (ver sección 7) o someta a un ensayo glucuronidasa (ver sección 6).
- Confirme la separación de EVs y liposomas de proteínas contaminantes y glucuronidasa libre. Con este fin, correlacionar las concentraciones de partículas de las fracciones recogidas con la concentración proteica y la actividad glucuronidasa.
- Evaluar la concentración de partículas por NTA (ver 2,5)
- Evaluar el contenido de proteína por el ensayo de ácido bicinchonínico (BCA) u otro ensayo de cuantificación de proteínas adecuado. Realice el ensayo de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Evaluar la actividad de la glucuronidasa mediante ensayo glucuronidasa (ver sección 6).
- Opcionalmente, evalúe la morfología del EV mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) y microscopía electrónica de barrido (SEM).
- Para la preparación de muestras TEM, añadir 10 μL de suspensión EV a una rejilla TEM, incubar durante 10 min, y luego borrar cualquier exceso de líquido utilizando un papel de filtro. Realizar la fijación durante 10 min con 10 μL de 4% de paraformaldehído y borrar cualquier exceso. Lavar 3x con agua. Manchar las vesículas por 20 s de incubación con 30 μL de 1% de ácido fosforoso-tungstico hidratado. Después de haber borrado el exceso, seque las vesículas durante la noche. Visualizar por TEM.
PRECAUCIÓN: el ácido fosfo-tungstico es altamente cáustico; así, proteger la piel y los ojos. - Para SEM, fije las muestras TEM previamente preparadas en discos de carbono y tartamudo va con una capa de oro de 50 nm de espesor. Visualizar por SEM.
- Para la preparación de muestras TEM, añadir 10 μL de suspensión EV a una rejilla TEM, incubar durante 10 min, y luego borrar cualquier exceso de líquido utilizando un papel de filtro. Realizar la fijación durante 10 min con 10 μL de 4% de paraformaldehído y borrar cualquier exceso. Lavar 3x con agua. Manchar las vesículas por 20 s de incubación con 30 μL de 1% de ácido fosforoso-tungstico hidratado. Después de haber borrado el exceso, seque las vesículas durante la noche. Visualizar por TEM.
6. ensayo glucuronidasa
- Para permitir una comparación entre diferentes muestras y condiciones de almacenamiento correlacionando el número de partículas y la actividad enzimática, mida primero la concentración de partículas de la muestra por NTA (ver paso 2,5).
- Preparar una solución de trabajo de fluoresceina di-β-D-glucurótida añadiendo 1 μL del compuesto (10 mg/mL en H2O) a 199 ΜL de PBS. Añadir 25 μL de esta solución a 125 μL de EVs purificados para obtener una concentración final de 8,3 μg/mL. Pipet la muestra en una placa de pozo negro de 96. Mida el punto de tiempo 0 h con un lector de placas, utilizando 480 nm como excitación y 516 nm como longitud de onda de emisión.
- Cubra la placa firmemente (por ejemplo, con una lámina de plástico transparente utilizada para las placas de PCR) para minimizar la evaporación e incubar en la oscuridad durante 18 h a 37 ° c. Mida la producción de fluoresceína utilizando los parámetros del lector de placas enumerados en el paso 6,2.
7. almacenamiento de EVs y liposomas
Nota: para todos los fines de almacenamiento, es aconsejable utilizar tubos de baja unión para reducir la pérdida de EV debido a la adsorción.
- Siga los parámetros de esta sección para reproducir los resultados representativos que se indican a continuación. Utilice muestras compuestas por 400 μL de suspensión EV.
- Conservar a 4 ° c o-80 ° c o proceder a los pasos indicados a continuación.
- Liofilizar los EVs.
- Añadir trehalosa (40 mg/mL en H2O) hasta una concentración final de 4 mg/ml a los EVS purificados. Congelar las muestras a-80 ° c durante al menos 1 h.
- Liofilizar las muestras utilizando los siguientes parámetros. Para el secado principal, fije la temperatura del estante a 15 ° c y la presión a 0,180 mbar y deje las muestras secar por 46 h. Para el secado final, fije la temperatura del estante a 25 ° c y la presión a 0,0035 mbar y deje las muestras secar durante 2 h. Almacene las muestras liofilizadas a 4 ° c.
- Para rehidratar las muestras, Añadir H2O, igual a la cantidad de suspensión EV presente al principio (típicamente, 400 μL). No utilice ningún tampón para la rehidratación.
8. análisis después del almacenamiento
- Para evaluar la actividad enzimática, primero quite la glucuronidasa libre, que puede haberse filtrado de los EVs durante el almacenamiento. Lograr esto mediante un paso adicional de purificación que se lleva a cabo ya sea por SEC (véase el paso 5) o fraccionamiento del flujo de campo asimétrico (AF4) (ver paso 8.1.2).
Nota: tenga en cuenta que ambos métodos conducen a una dilución de la muestra EV; por lo tanto, utilice suficientes concentraciones de EV antes del almacenamiento para evitar moverse por debajo del límite de cuantificación de NTA. Esperar una dilución de 1:10 de las partículas debido a la SEC o AF4.- Para la purificación de la SEC, siga el protocolo descrito anteriormente (ver sección 5).
- Realizar purificación AF4.
- Configure el instrumento utilizando un canal pequeño con un espaciador de 350 μm y una membrana de celulosa de corte de peso molecular de 30 kD. Coloque un filtro de tamaño de poro de 0,1 μm entre la bomba HPLC y el canal AF4. Utilice PBS recién preparado con filtro de 0,1 μm como la fase móvil para reducir la carga de partículas y el ruido en los detectores de dispersión de luz.
- Detecte proteínas utilizando un detector UV establecido en 280 nm. Para detectar partículas, utilice dispersión de luz multiángulo con el láser establecido en 658 nm.
- Utilice el siguiente método de ejecución. Pre-enfoque durante 1 min con un flujo de enfoque de 1 mL/min; a continuación, inyectar 300 μL de la muestra a una velocidad de 0,2 mL/min y mantener el flujo de enfoque durante 10 min. Después de la inyección, eluyen la muestra a 1 ml/min mientras se aplica un flujo cruzado que disminuye de 2 ml/min a 0,1 ml/min en el transcurso de 8 min. eluyen durante otros 10 minutos sin flujo cruzado. Recoger fracciones de 1 mL, comenzando después de 12,5 min y continuando hasta 27 min.
- Realizar el ensayo glucuronidasa como se describió anteriormente (ver sección 6).
- Para evaluar el tamaño y la concentración, utilice el NTA como se describió anteriormente (véase el paso 2,5).
- Opcionalmente, realice TEM y SEM para evaluar la morfología de los EVs después del almacenamiento (véase 5,3).
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Representative Results
La figura 1 muestra las características de almacenamiento de EVS aislados de HUVECs. Los EVs fueron aislados por la UC, la glucuronidasa fue encapsulada, y después de la SEC, los EVs purificados fueron evaluados por sus propiedades fisicoquímicas por NTA. Una muestra de las vesículas fue sometida posteriormente a la purificación de AF4 y se midió la actividad de la glucuronidasa.
Las vesículas se almacenaron entonces para 7 d a 4 ° c o-80 ° c y a 4 ° c en forma liofilizada, en este último caso con la adición de trehalosa al 4%. Después del almacenamiento, las vesículas se midieron de nuevo por NTA, y después de AF4, se evaluó la actividad glucuronidasa restante por partícula.
El principio de funcionamiento de AF4 se basa en la combinación de flujo laminar y un flujo transversal ortogonal a través de la membrana porosa en la parte inferior del canal AF4, que afecta de forma diferenciada a las partículas según su tamaño (figura 2). Las partículas más grandes tienden a estar situadas más cerca de la membrana, mientras que las partículas más pequeñas se encuentran más arriba en el canal. Debido al perfil de flujo parabólico del flujo laminar, las partículas más lejos de la membrana viajan más rápido hacia el detector, lo que conduce a una separación de partículas por tamaño. En un experimento típico de AF4, las partículas inyectadas se centran primero en la membrana, aplicando un flujo cruzado sin un flujo longitudinal a través del canal (figura 2a). Después de la inyección y el enfoque, la elución comienza aplicando simultáneamente un flujo transversal y un flujo longitudinal para fraccionar y eluir los diferentes subconjuntos de partículas (figura 2B), que, en nuestro caso, fueron EVS y glucuronidasa libre.
La figura 3 ilustra la separación de nanopartículas (EVS o liposomas) de proteínas contaminantes y glucuronidasa no encapsulada. El perfil de elución de la SEC de los liposomas (figura 3A) purificados después de su preparación (ver sección 4 del Protocolo) mostraron la separación de las partículas con la glucuronidasa encapsulada de la enzima libre, detectada tanto a través del ensayo de BCA como actividad enzimática. En el presente ejemplo, se elegirían las fracciones 6 y 7 para experimentos adicionales, ya que contenían las concentraciones de partículas más elevadas y para prevenir posibles contaminaciones con glucuronidasa libre. AF4 también tuvo éxito en separar los EVs de la glucuronidasa libre como se demostró en la figura 3B, con un mayor grado de separación que sec, haciendo menos probable la contaminación de las fracciones que contienen vesículas.
En la figura 4, se realizó un experimento de control para garantizar que la actividad enzimática medida para las vesículas se vinculaba de hecho a la encapsulación de glucuronidasa en EVS y no causada por agregados enzimáticos. Estos agregados podrían haber sido formados debido a la incubación de glucuronidasa con saponina y conducen a resultados falsos positivos. Para verificar las fracciones en las que las vesículas eluirían, los EVs purificados sin glucuronidasa encapsulada fueron sometidos a SEC en la misma columna que la muestra que contiene la saponina y la enzima.
Cuando la glucuronidasa fue incubada con saponina y posteriormente purificada por la SEC, no se encontró ninguna actividad enzimática en las fracciones que normalmente contenían EVs. Si bien se descubrió que pequeñas cantidades de partículas se eludía al mismo tiempo que los EVs (lo que constituye < 0,1% de las partículas recuperadas de un pellet típico de EV), no hubo actividad enzimática correlacionada. Estos resultados indican que la enzima activa recuperada en las fracciones que contienen vesículas se encapsuló en ellas.
La figura 5 compara la recuperación de la enzima activa después del almacenamiento con o sin purificación adicional de AF4 para eliminar el tinte no encapsulado. Con la purificación de AF4, generalmente hay una recuperación más baja de la enzima por partícula, con el efecto más alto para el almacenamiento a 4 ° c, donde la recuperación desciende en dos tercios. Por lo tanto, omitir este paso de purificación adicional puede conducir a suposiciones equivocadas sobre la estabilidad de la enzima.
La figura 6 muestra el efecto de la liofilización sin un crioprotector en vesículas derivadas de MSCS, células A549 y liposomas, en comparación con la congelación a-80 ° c. Las partículas fueron fotografiadas por TEM y SEM como se describió anteriormente (véase el paso 5,3 del Protocolo). Los MSCs y A549 EVs no exhibió grandes diferencias de forma en las imágenes TEM, comparando las dos condiciones de almacenamiento. Sin embargo, en las imágenes SEM, las muestras liofilizadas muestran agregados que no se encuentran en las muestras de-80 ° c. Los liposomas también muestran agregados en la imagen SEM, mientras que en TEM, la liofilización pareció inducir un aumento del tamaño de los liposomas. La liofilización sin crioprotectores también redujo la recuperación de glucuronidasa intacta después del almacenamiento (figura 7). La adición de trehalosa como un crioprotector aumentó la recuperación de la enzima activa de una manera dependiente de la dosis.
La figura 8 demuestra la conversión de fluoresceina di-β-D-Glucurótida a fluoresceina libre, que se lleva a cabo en el ensayo glucuronidasa. Mientras que la educt era no fluorescente a 516 nm, la fluoresceína es altamente fluorescente en esta longitud de onda. Esto permitió un ensayo de actividad enzimática sencillo con alta sensibilidad.
Figura 1 : Estabilidad de almacenamiento de HUVEC EVS. (A) recuperación de partículas en comparación con antes del almacenamiento, (B) tamaño medio, y (C) la actividad de glucuronidasa normalizada por partícula de EVS aislado de huvecs. Las vesículas se almacenaron durante 7 d a 4 ° c y-80 ° c y a 4 ° c después de la liofilización con un 4% de trehalosa. El tamaño medio y la recuperación de partículas fueron medidos por NTA; la actividad glucuronidasa por partícula se calculó combinando datos NTA y los resultados del ensayo glucuronidasa y se normalizó hasta antes del almacenamiento. Media ± SD, n = 3, *p < 0,05 (ANOVA de una vía seguida de la prueba post hoc de Tukey). Modificado de Frank et al.21. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Principio de funcionamiento del AF4. (A) los EVS y la glucuronidasa libre se centran después de la inyección aplicando un flujo cruzado. (B) posteriormente, los EVS y la enzima libre se eluyan por separado combinando el flujo a través del canal con un flujo cruzado. Modificado de Frank et al.21. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Separación de EVS y liposomas de glucuronidasa libre. (A) separación de la SEC representativa de liposomas cargados con glucuronidasa, glucuronidasa libre y contaminantes proteicos. El gráfico muestra la concentración de partículas (rojo), la concentración de proteínas (azul) y la actividad de glucuronidasa (verde). (B) demostración de la separación de EVS de la glucuronidasa libre. Los EVS no tratados, los EVs con 0,05 mg/mL de glucuronidasa, la glucuronidasa libre (0,5 mg/mL) y los EVs cargados con glucuronidasa y purificados por SEC (glucuronidasa EV) fueron inyectados y analizados por UV a 280 nm y a 90 ° de dispersión de luz. Enzima libre elutida por separado de EVs. Modificado de Frank et al.21. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Controle los experimentos para la purificación de EVS a partir de glucuronidasa libre. 400 μL de EVs nativos o 400 μL de 1,5 mg/mL de glucuronidasa en PBS incubado durante 10 min con 0,1 mg/mL de saponina fueron purificados por SEC. (A) concentraciones de partículas de las fracciones recolectadas de vesículas y glucuronidasa, respectivamente, y la actividad enzimática de la glucuronidasa purificada. (B) absorción UV a 280 nm medida en el mismo experimento. El primer pico pequeño para la glucuronidasa corresponde A la línea gris en el panel A. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : El efecto de los pasos de purificación adicionales después del almacenamiento EV. Actividad glucuronidasa restante por partícula en comparación con d0 con o sin un paso de purificación AF4 adicional después del almacenamiento. HUVEC EVs se almacenó durante 7 d a 4 ° c o-80 ° c y liofilizado con 4% de trehalosa. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 : Imágenes TEM y SEM de EVS. Imágenes TEM y SEM de EVs de (a) MSCS y (B) A549 cells y (C) liposomas. Las muestras se almacenaron durante 14 d a-80 ° c o liofilizadas sin la adición de trehalosa. Las flechas indican la presencia de partículas alteradas morfológicamente en las imágenes TEM y agregados en las imágenes SEM. Modificado de Frank et al.21. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7 : Efecto de la trehalosa en la recuperación enzimática después de la liofilización. Comparación de la actividad enzimática después de la liofilización durante 14 días, con 0%, 1% y 4% de trehalosa con la muestra antes del almacenamiento (0 días). Modificado de Frank et al.21. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8 : La hendiedad enzimática de fluoresceina di-β-D-glucuronida por glucuronidasa. En el esquema, se explica la reacción subyacente a la detección de glucuronidasa. La fluoresceina no fluorescente di-β-D-glucurótida se escinde por glucuronidasa. A través de la eliminación de los residuos de azúcar, fluoresceína recupera sus propiedades fluorescentes. La fluorescencia medida después del período de incubación se correlaciona con la cantidad de enzima activa presente y es la lectura del ensayo glucuronidasa. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este manuscrito, presentamos un protocolo integral para estudiar la estabilidad de los EVs en diferentes condiciones de almacenamiento. Con la combinación de la glucuronidasa encapsulada como una lectura funcional y la evaluación de los parámetros fisicoquímicos de los EVs, el protocolo permite una evaluación directa de la estabilidad del almacenamiento de EVs y la comparación de EVs de diferentes células Líneas. SEM y TEM como métodos complementarios permiten una visión de los cambios de los EVs en el nivel de una sola partícula. Los resultados presentados aquí mostraron una tendencia de los EVs y los liposomas a ser agregados debido a la liofilización sin un crioprotector (figura 6). Sin embargo, esto sólo se observó en los experimentos SEM. Mientras que las imágenes EM no se realizaron con muestras que fueron preservadas con trehalosa, la literatura sugiere que este crioprotector podría de hecho reducir la agregación de EVs29. También es posible evaluar si una condición de almacenamiento determinada afecta de forma diferenciada el tamaño del EV, la tasa de recuperación y las moléculas encapsuladas. Tal efecto se ejemplifica con los resultados obtenidos para HUVEC EVs (figura 1). Mientras que la recuperación de partículas para 4 ° c y-80 ° c era mejor que para las muestras liofilizadas, la recuperación de la glucuronidasa encapsulada activa era mejor para las muestras liofilizadas. La liofilización de EVs podría ser la condición de almacenamiento más favorable, por ejemplo, al analizar biomarcadores EV, donde el enfoque es más en la obtención y preservación de carga intacta en lugar de en vesículas intactas.
En su reciente artículo sobre la liofilización de EVs22, charoenviriyakul et al. siguió un enfoque comparable. En cuanto a los parámetros fisicoquímicos, se centraron en el índice de polidispersidad (PDI) y el potencial zeta, ya que los cambios en el potencial zeta pueden correlacionarse con una estabilidad coloidal reducida. Sin embargo, el potencial zeta no puede explicar únicamente los cambios observados en la estabilidad30, que también se reflejó en sus resultados. También compararon el contenido de proteína y ARN de los EVs almacenados mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. Esta técnica puede muy bien indicar cambios sustanciales en el contenido de proteína o ARN de las vesículas. Sin embargo, requiere cantidades mucho mayores de material que el método presentado aquí. Para evaluar el efecto del almacenamiento en el cargamento de vehículos eléctricos, Charoenviriyakul et al expresó heterologíamente una enzima y una especie de ADN cada una en su línea celular de productor de EV y supervisó su actividad e integridad en los EVs. Sin embargo, tal expresión heteróloga no es adecuada si se comparan EVs de diferentes fuentes, ya que requiere una cantidad sustancial de tiempo para cada nueva línea celular, mientras que la encapsulación simple mediada por saponina se puede aplicar fácilmente.
Es crucial eliminar cualquier enzima no encapsulada, como se muestra en la figura 3. La glucuronidasa con encapsulado EV reacciona mucho más lentamente con su sustrato que la enzima libre en solución, lo que lleva a una sobreestimación de la eficiencia de encapsulación. La separación limpia es especialmente importante para el análisis después del almacenamiento, ya que las condiciones de almacenamiento pueden afectar la actividad de la glucuronidasa libre en la muestra de forma diferente y pueden provocar fugas de EVs dañados. Esto fue evidente en nuestros experimentos (figura 5), ya que la aplicación de AF4 antes del ensayo glucuronidasa logró eliminar el tinte no encapsulado en las vesículas. Por lo tanto, hizo posible obtener resultados claros sobre el efecto de los métodos de almacenamiento discutidos aquí, mientras que sin AF4, la pérdida de actividad debido al almacenamiento habría sido subestimada.
Otra consideración importante es el aislamiento y la caracterización de los EVs que se probarán para su estabilidad. Aunque la técnica descrita permite la comparación de EVS de diferentes fuentes, esto sólo es posible si todos ellos son preparados por el mismo método de aislamiento por lo que los resultados no se distorsionan18,31,32. En este contexto, las condiciones de cultivo celular deben tenerse en cuenta también, ya que pueden afectar a la cantidad y bioactividad de los EVs aislados33. Para obtener resultados que se puedan comparar con otros resultados publicados, es aconsejable consultar la recientemente actualizada "información mínima para estudios de vesículas extracelulares" que contiene pautas para la armonización de la investigación EV26.
En el protocolo presentado aquí, usamos SEC o AF4 para eliminar la enzima libre después del almacenamiento. Se podrían aplicar otros métodos, como la ultracentrifugación de gradiente, la UC o la ultrafiltración34. En comparación con los métodos centrífugos, SEC y AF4 consumen menos tiempo (p. ej., aproximadamente 1,5 h para SEC, incluido el equilibrado de columnas versus hasta 16 h o más para el gradiente de UC) y pueden separar completamente las proteínas libres de los EVs en comparación con la UC normal, donde siempre queda sobrenadante residual con el pellet. Por otra parte, SEC15 y AF435 son métodos leves, que inducen menos tensión de cizallamiento en el EVS. En comparación, las fuerzas impuestas sobre EVS durante la UC podrían provocar alteraciones de las partículas, como la agregación y las alteraciones en el tamaño34,36.
Una desventaja de SEC y AF4 es la dilución de las muestras. Por lo tanto, se requiere aislar cantidades suficientes de EVs para mantener las concentraciones requeridas para las mediciones de NTA después de múltiples pasos de purificación. Las fracciones EV pueden ser concentradas usando Filtros centrífugos pero, dependiendo del material filtrante y del Protocolo, podría haber una pérdida de vesículas37.
La limitación del protocolo discutido aquí es que sólo monitorea la actividad enzimática de la glucuronidasa encapsulada de forma exógena, ni teniendo en cuenta el ARN encapsulado y el ADN ni las proteínas superficiales del EV que podrían ser importantes para la funcionalidad18 . Para la investigación de la nueva terapéutica EV, esta técnica no puede reemplazar los ensayos sobre la funcionalidad, sino complementarlos y dar una indicación sobre la estabilidad de las vesículas. Podría ser de gran uso si, por ejemplo, los EVs derivados de los biofluides se almacenen para un análisis posterior del contenido de las vesículas.
En el futuro, el alcance de este protocolo podría ampliarse para incluir también EVs derivados de otros organismos, por ejemplo, vesículas bacterianas de membrana externa. Otro próximo paso interesante sería probar la encapsulación de ácidos nucleicos por incubación de saponina y también mirar en la estabilidad de las cargas de ADN o ARN.
En conclusión, este procedimiento ofrece un método sencillo para la evaluación de la estabilidad del almacenamiento de EVs de diversas fuentes celulares de mamíferos mediante la integración de una lectura fisicoquímica y funcional. Este protocolo detallado permitirá a los investigadores de EV una clara determinación de las condiciones de almacenamiento adecuadas para sus vesículas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El programa de investigación NanoMatFutur Junior del Ministerio Federal de educación e investigación, Alemania (Grant Number 13XP5029A) apoyó esta labor. Maximilian Richter fue apoyado por la Studienstiftung des Deutschen Volkes (Fundación alemana de becas académicas) a través de una beca de doctorado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC) | Sigma-Aldrich | P2663-25MG | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC) | Sigma-Aldrich | P4329-25MG | |
| 225 cm² cell culture flasks | Corning | 431082 | Used with 25 ml of medium |
| 30 kDa regenerated cellulose membrane | Wyatt Technology Europe | 1854 | |
| 350 µm spacer | Wyatt Technology Europe | ||
| Automated fraction collector | Thermo Fisher Scientific | ||
| Beta-glucuronidase | Sigma-Aldrich | G7646-100KU | |
| Chloroform | Fisher scientific | C/4966/17 | |
| Column oven | Hitachi High-Technologies Europe | ||
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T9531-10G | |
| DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector | Wyatt Technology Europe | ||
| Durapore Membrane filter, PVDF, 0,1 µm, 47 mm | Merck | VVLP04700 | Used for the preparation of buffers for AF4 |
| EBM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3156 | Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells |
| Eclipse dualtec | Wyatt Technology Europe | ||
| EGM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3162 | Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells |
| ELISA Plate Sealers | R&D Systems | DY992 | used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay |
| Ethanol | Fisher scientific | E/0665DF/17 | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids | 610000-1EA | |
| Filter support | Avanti Polar Lipids | 610014-1EA | used for liposome preparation |
| Fluorescein di-β-D-glucoronide | Thermo Fisher Scientific | F2915 | |
| Gibco PBS-tablets+CA10:F36 | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | |
| Hettich Universal 320 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Used for pelleting cells at 300 g | |
| Hettich Rotina 420 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Used for pelleting larger debris at 3000 g | |
| HUVEC cells | Lonza Verviers, S.p.r. | C2517A | |
| Kimble FlexColumn 1X30CM | Kimble | 420401-1030 | |
| Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC | Christ | ||
| Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR international | 525-0255 | the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery |
| Nanosight LM14 equipped with a green laser | Malvern Pananalytical | ||
| Nanosight-software version 3.1 | Malvern Pananalytical | ||
| Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes | Whatman/GE Healthcare | 110406 | used for liposome preparation |
| PEEK Inline filter holder | Wyatt Technology Europe | ||
| Phosphotungstic acid hydrate | Sigma-Aldrich | 79690-25G | |
| Polycarbonate bottles for ultracentrifugation | Beckman Coulter | 355622 | |
| QuantiPro BCA Assay Kit | Sigma-Aldrich | QPBCA-1KT | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15 | Carl Zeiss AG | ||
| Sepharose Cl-2b | GE Healthcare | 17014001 | |
| SEM copper grids with carbon film | Plano | S160-4 | |
| Small AF4 channel | Wyatt Technology Europe | ||
| Sputter-coater Q150R ES | Quorum Technologies | ||
| Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011 | Oxford Instruments | ||
| Type 45 Ti ultracentrifugation rotor | Beckman Coulter | 339160 | |
| Ultimate 3000 Dionex autosampler | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex isocratic pump | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K | Beckman Coulter | ||
| UV detector | Thermo Fisher Scientific | ||
| Whatman 0.2 µm pore size mixed cellulose filter | Whatman/GE Healthcare | 10401712 | Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC |
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