Summary
Burada, hücre tarafından üretilen doğal Nano opartiküllerden oluşan bir grup olan ekstrüllüler veziküller için depolama kararlılığını değerlendirmek üzere kolayca uygulanabilir bir protokol sunuyoruz. Veziküller bir model enzim olarak glukuronidaz ile yüklenir ve farklı koşullarda saklanır. Depodan sonra, fizikokimyasal parametreleri ve kapsüllenmiş enzimin aktivitesi değerlendirilir.
Abstract
Ekstrelüler veziküller (EVs), ilaç, uyuşturucu taşıyıcıları ve Biyomarkörler olarak kullanılmak üzere mevcut araştırmalarda umut verici hedeflerdir. Onların klinik gelişimi için, sadece onların ilaç aktivitesi önemli değil, aynı zamanda üretim değerlendirilmesi gerekir. Bu bağlamda araştırma, EVs yalıtımına, onların karakterizasyonu ve depolarına odaklanır. Mevcut el yazısı, genetik manipülasyon veya spesifik fonksiyonel etkileri olmadan, EVs üzerinde farklı depolama koşullarının etkisini değerlendirmek için bir facile prosedürü sağlamayı amaçlamaktadır. Bu mümkün hızlı bir şekilde belirli bir depolama koşulu altında EVs istikrarı bir ilk izlenim almak için yapar, ve farklı hücre kaynaklarından türetilen EVs kolayca karşılaştırılabilir. Kararlılık ölçümü, EVs (boyut, parçacık konsantrasyonu ve morfoloji) ve onların kargo aktivitesinin korunması fizikokimyasal parametrelerine dayanır. İkincisi, EVS içine enzim Beta-glukuronidaz saponin-aracılı kapsülleme tarafından değerlendirilir. Glukuronidaz bir vekil olarak davranır ve bir floresan muhabir molekül bölünmesini ile kolay bir kantifikasyon sağlar. Mevcut protokol, klinik uygulamaya doğru EV araştırmalarını ilerletmek için EV özelliklerini en iyi şekilde korumak için depolama koşulları arayışında araştırmacılar için bir araç olabilir.
Introduction
EVs membran bağlı nanopartiküller neredeyse tüm hücre türleri tarafından üretilmektedir. Memeli hücreler için, EVS farklı üretim yolları1,2ile iki ana gruba ayrılabilir. Membran veziküller, yaklaşık 100-1000 Nm boyutunda bir boyutla, hücre zarından doğrudan tomurcuklanma tarafından üretilmektedir. Exosomes, ölçekli 30-200 Nm, daha sonra aynı anda birden fazla exosomes serbest bırakmak için hücre membranı ile sigorta endosomes içine içeri tomurcuklanan tarafından oluşturulan multiveziküler organları türetilmiştir. Bu veziküllerin ana fonksiyonu hücreler arasında bilgi taşımacılığında3. Bu amaçla RNA, DNA ve proteinler gibi kargolar aktif olarak onlara sıralanmaktadır. EVs, hem sağlık hem de hastalık durumunun etkileri ile hedefleri üzerinde çeşitli efektler iletebilir. Bir tarafta, onlar tedavi olarak gelişimi için onları uğurlu hedefler kılan doku rejenerasyon, antijen sunumu veya antibiyotik etkileri gibi olumlu etkileri Arabulmak4,5. Diğer tarafta, EVs tümör vaskülarizasyonu teşvik edebilir6, stres tepkiler7seyirci etkileri, ve otoimmün hastalıklarda rol oynayabilir8 ve inflamatuar hastalıklar9. Böylece, birçok patolojik etkinin daha iyi anlaşılması için önemli bir bileşen olabilirler. Ancak, manifold hastalıklarında değiştirilmiş EVS varlığı, kanser gibi10,11,12 ve kardiyovasküler bozukluklar13, ve kan ve idrar kolay erişilebilirlik onları ideal hale getirir biyolojik. Son olarak, onların iyi biyouyumluluk14 ve onların içsel hedefleme yeteneği EVS de ilaç teslim15için ilginç hale. Bu yazıda, hala az incelenmiş önemli bir özellik olan memeliler hücrelerinden elde edilen EVs 'nin depolama kararlılığının değerlendirilmesi için bir protokol açıklanmaktadır.
EVs 'nin klinik gelişimi için, tedavi edici etkileri, üretim, arıtma ve depolama17' nin değerlendirilmesi de dahil olmak üzere16' nın üzerinde hala birçok engel vardır. Süre-80 ° c, EV depolama18için altın standart olarak yaygın olarak görülür, gerekli dondurucular pahalıdır ve üretim hasta için gerekli soğuk zincir korumak zor olabilir. Dahası, bazı raporlar, depolama-80 °c ' de hala en iyi şekilde EVS koruymaz ve ev işlevselliği19,20bir kayıp indükler gösterir. Freeze-kurutma21,22 veya sprey-kurutma23gibi diğer yöntemler, EVS dondurulmuş depolama için potansiyel alternatifler olarak önerilmiştir.
Depolama stabilitesini değerlendirmesinin en uygun yolu, EVs 'i fonksiyonel testlerle veya belirli bir işaretçinin değerlendirilmesiyle, örneğin antibakteriyel aktivitesi19' a test etmek olacaktır. Bu veziküller istenen etkisi bilindiğinde ve bir ayrı grup EVs incelenecek olduğunda mümkündür. Farklı hücre kaynaklarından EVs karşılaştırıldığında (örneğin, ilaç Kapsülleme için) veya bilinen işlevsel bir okuma yoksa, artık değişiklikleri doğrudan bir şekilde depolama nedeniyle değerlendirmek mümkün değildir.
Öte yandan, sadece kendi fizikokimyasal parametrelerinde değişiklikleri değerlendirmek, boyut gibi, parçacık kurtarma, ve protein konsantrasyonu, her zaman değişiklikler tahmin etmez EV aktivite, son patent gösterildiği gibi20.
Burada, EVS 'in kargo için bir vekil olarak bir kapsüllü Beta-glukuronidaz enziminin aktivitesi ile birlikte fizikokimyasal parametrelerini değerlendirerek, ailelerinin depolama kararlılığını ölçmek için kolayca uygulanabilir bir protokol sağlıyoruz. Enzim yükleme saponin inkübasyon tarafından yapılır, farklı kaynaklardan EVS ile kurulan hafif bir yöntem21,24,25. Saponin, EV membranında enzim alımı sağlayan geçici gözenekleri oluşturur. Enzimlerin etkinliğini kaybetmek eğilimli olduğu gibi olumsuz depolama koşullarına tabi, onlar EVs fonksiyonel kargoların korunması değerlendirilmesi için ideal bir vekil vardır.
Bu protokol uygulamasının insan mezenkimal kök hücrelerinden (MSCS), insan göbek ven endotel hücrelerinden (huvecs) ve insan adenokarsinoma alveolar epitelyal hücrelerden (A549) elde edilmesi, gerçekten de büyük farklılıklar ortaya koyduğunu göstermiştir EV kaynak21seçerken dikkate alınmalıdır farklı hücre hatları arasında depolama stabilitesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hücre kültürü ve hücre-Klima orta üretim
- Genellikle, ilgili hücre hattı için gerekli bireysel koşullar altında hücreleri yetiştirmek.
- Serum-serbest koşullarda veya orta içeren EV-tükenmiş fetal sığır serumu (FBS) 24-72 h için hücreleri yetiştirmek.
Not: EV-depleted FBS kullanılırsa, sığır serumu türeyen EVs26ile kontaminasyonu önlemek için serumu verimli bir şekilde arındırma konusunda kanıtlanmış bir yöntem kullanın. - Flasks orta toplayın. 300 x g 'de santrifüjler, hücreleri Pelet etmek için 10 dakika. Pelleted hücreleri rahatsız etmeden, hücre-Klima Orta (CCM) dikkatle toplayın. Tercihen, CCM 'yi doğrudan kullanın veya 4 °C ' de gece saklayın.
Not: her zaman taze üretilen CCM kullanmak için tercih edilir. Daha uzun zaman dilimlerinin saklanması kaçınılamıyor, tüm ilgili parametreler MISEV2018 yönergelerine uygun olarak kaydedilmelidir ve elde edilen sonuçlarınpotansiyel önyargıları dikkate alınmalıdır. - HUVECs için örnek protokol
- FBS ve diğer takviyeleri içeren EGM-2 orta 120 h için HUVEC hücreleri yetiştirmek.
- Ek takviyeleri ücretsiz EBM-2 bazal orta 48 h için HUVEC hücreleri yetiştirmek.
- Flsordan orta toplayın ve yukarıda belirtildiği gibi santrifüjleme adımını gerçekleştirin (adım 1,3). Genellikle, 100 mL orta bir EV-yalıtım için kullanın.
2. CCM 'nin ultracentasması
- Hemen önce (UC), 3.000 x g ve 4 °c ' de 15 dakika santrifüjler, hücre enkaz ve büyük agglomerates çıkarmak için santrifüj.
- Dikkatle UC tüpler için süpernatant aktarın. Sabit açılı rotor kullanıyorsanız, UC sonra EV Pelet alınmasını kolaylaştırmak için santrifüjdeki tüpler yönünü işaretleyin. Santrifüjlü 2 h at 120.000 x g, bir k-faktörü 259,4.
- UC sonra, özenle bir serolojik pipet kullanarak süpernatant atın, pelleted EVS rahatsızlık önlemek için.
Not: Pelet görünmez olabilir. - Ekleme 200 μL 0,2 μm-filtrelenmiş fosfat-tamponlu tuz (PBS) ilk tüp ve kullanmak PBS ve kalıntı süpernatant yukarı ve aşağı pipetleme tarafından Pelet pelletini. Elde edilen EV süspansiyonunu ilgili numunenin bir sonraki tüpüne aktarın ve Resuspension için kullanın. Yaklaşık 300-350 μL son hacminde numunenin tüm EVS yeniden pelletini bu şekilde devam edin.
- Resuspension sonra, nano madde izleme analizi (NTA) ile partiküllerin varlığını onaylayın. Aşağıdaki ayarlar gibi verilen EV türü için en iyi duruma getirilmiş ayarları kullanın (adım 2.5.1).
Not: Gardiner ve al.27 ve vestad et al.28 ' ın kağıtları, EVS ölçümleri için parametrelerin optimizasyonu hakkında değerli bilgiler içerir.- Aşağıda açıklanan sonuçları yeniden oluşturmak için, yeşil lazer ile donatılmış enstrümanları (örneğin, NanoSight LM14) kullanın. 1,0 ekran kazanç ve 13 kamera seviyesi ile 30 s üç video kaydedin. Analiz için 1,0 bir ekran kazanç ve 5 algılama eşik kullanın.
- Mümkünse Pelet hemen kullanın; Aksi takdirde, gece 4 °C ' de saklayın.
3. EVs içine glucuronidase kapsülleme
- Resuspended Pellet, eklemek Beta-glukuronidaz (10 mg/mL PBS) son konsantrasyon 1,5 mg/mL ve saponin (10 mg/mL H2O) son konsantrasyon 0,1 mg/ml. 3 s için vortekslenir tarafından iyi karıştırın.
- Tüp hafifçe Flicking ile inter, karıştırma ile Oda sıcaklığında 10 dk için inkübe. Kuluçlantıktan sonra, boyut-dışlama Kromatografi (SEC) ile doğrudan arındırın (Bölüm 5 ' e bakın).
Not: bir kez çözülmüş glukuronidaz örnekleri refreeze etmeyin, donma nedeniyle enzim bozulması önlemek için.
4. Liposome üretimi
- EVs ile karşılaştırıldığında lipozomlar hazırlamak için, 1, 2-dimyristoyl-sn-glisero-3-fosfokolin (dmpc) ve 1, 2-Dipalmitoyl-sn-glisero-3-FOSFATKOLIN (DPPC) 5 mm son konsantrasyonuna kloroform bir 2:3 molar rasyon çözülür. Yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) şişeleri 1 ml plakaya hazırlamak ve onları bir lipid film oluşturmak için bir gecede kuru izin.
DIKKAT: Chloroform toksik ve kancerogenic olduğundan şüpheleniliyor. İşlerken uygun önlemler alın. - 1,5 mg/mL glukuronidaz içeren 1 mL PBS ile lipid-film rehydrate. 42 °C ' ye ısı ve 1 dak. Ekstruder montajını 42 °C ' ye ısıtın ve bir 200 Nm Polikarbonat membrandan lipid süspansiyonu 11x ekstrüze edilir. Doğrudan SEC tarafından arındırır (bkz. Bölüm 5).
5. SEC tarafından arıtma
- Aşağıdaki protokolü kullanarak SEC sütununu hazırlayın.
- Sadece taze arıtılmış su ve taze hazırlanmış tamponlar kullanın. Bir 0,2 μm membran filtresi ile tüm tamponları filtreleyin ve sütunda hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için onları Degas.
- Bir sec sütun hazırlanması için, agaroz jel filtrasyon tabanlı matris (örneğin, Sepharose CL-2B) veya başka bir sec orta protein kirleri ve aşırı enzim EVS ve lipozomlar ayırmak için uygun kullanın. İlk olarak, orta saklanır% 20 EtOH solüsyonu kaldırmak, sütunda hava kabarcık oluşumu önlemek için. Bu amaçla, SEC orta 3.000 x g 10 dakika Santrifüjü, EtOH kaldırmak ve gaz su ile değiştirin.
- Bir cam sütunu (10 mm iç çapı ile) SEC orta ile 15 mL işaretine doldurun.
Not: birimler farklı ölçümlendirmelere sahip sütunlar için farklılık gösterecektir. Jel tamamen yerleşmek izin emin olun. - Bir çalıştırmadan önce, sütunu en az iki sütun hacmine sahip PBS ile dengelenmiş olarak ayarlayın. Sütun saklamak için, önce su bir sütun hacmi ile yıkayın, en az iki sütun hacimleri tarafından takip 20% EtOH. Depodan sonra, ilk olarak PBS ile dengelenmiş önce bir sütun hacmi su ile sütun yıkayın.
- En fazla 400 μL 'ye kadar kullanın. 1 mL fraksiyonları toplayın. SEC sonra, ya saf EVs saklamak (Bölüm 7 bakın) veya bir glukuronidase tahlil onları konu (Bölüm 6 bakın).
- EVs ve lipozomların kontaminasyon proteinlerini ve ücretsiz glukuronidaz ayrılması onaylayın. Bu amaçla, toplanan fraksiyonlar partikül konsantrasyonlarını protein konsantrasyonu ve glukuronidaz aktivitesi ile ilişkilendirir.
- NTA tarafından partikül konsantrasyonunu değerlendir (bkz. 2,5)
- Protein içeriği bicinchoninik asit (BCA) tahlil veya başka bir uygun protein ölçüm tahlil tarafından değerlendirmek. Üreticinin protokolüne göre tahlil gerçekleştirin.
- Glukuronidase etkinliğini glucuronidase assay ile değerlendir (bkz. Bölüm 6).
- İsteğe bağlı olarak, iletim elektron mikroskobu (TEM) ve Tarama elektron mikroskobu (SEM) ile EV morfolojisi değerlendirin.
- TEM örneklerinin hazırlanması için, bir TEM ızgarasına 10 μL EV süspansiyon ekleyin, 10 dakika boyunca inküye yapın ve ardından filtre kağıdı kullanarak aşırı sıvıyı uzaklaştırın. 10 μL% 4 paraformaldehit ile 10 dak için sabitleme ve herhangi bir fazlalıktan uzakta leke gerçekleştirin. 3x su ile yıkayın. 30 μL% 1 phosphor-Tungstic asit hidrat ile 20 s inkübasyon ile veziküller leke. Aşırı uzakta Blot sonra, bir gecede veziküller kuru. TEM ile görselleştirin.
DIKKAT: Phospho-Tungstic asit son derece kostik; Böylece, cilt ve gözleri korumak. - SEM için, daha önce hazırlanan TEM örneklerini karbon disklerine düzeltin ve 50 nm kalınlığında altın tabakaya sahip onları sputter. SEM tarafından görselleştirin.
- TEM örneklerinin hazırlanması için, bir TEM ızgarasına 10 μL EV süspansiyon ekleyin, 10 dakika boyunca inküye yapın ve ardından filtre kağıdı kullanarak aşırı sıvıyı uzaklaştırın. 10 μL% 4 paraformaldehit ile 10 dak için sabitleme ve herhangi bir fazlalıktan uzakta leke gerçekleştirin. 3x su ile yıkayın. 30 μL% 1 phosphor-Tungstic asit hidrat ile 20 s inkübasyon ile veziküller leke. Aşırı uzakta Blot sonra, bir gecede veziküller kuru. TEM ile görselleştirin.
6. glukuronidaz tahlil
- Parçacık numarası ve enzim aktivitesini ilişkilendirerek farklı numune ve depolama koşulları arasında bir karşılaştırmaya izin vermek için, ilk olarak NTA tarafından numunenin parçacık konsantrasyonunu ölçün (bkz. Adım 2,5).
- 1 μL bileşik (10 mg/mL H2O) 199 ΜL PBS ekleyerek fluorcein di-β-D-glukuronid çalışma çözeltisi hazırlayın. 8,3 μg/mL 'Lik son bir konsantrasyon elde etmek için 125 μL 'yi saflaştırılmış EVs 'e eklemek için bu çözümün 25 μL değerini ekleyin. Numuneyi siyah 96-kuyu plakasına pipet. Ölçmek zaman noktası 0 h bir plaka okuyucu ile, kullanarak 480 uyarma olarak nm ve 516 emisyon dalga boyu olarak Nm.
- Plakayı sıkı bir şekilde (örn., PCR plakaları için kullanılan şeffaf plastik folyo ile) buharlaşmaya en aza indirmek ve 37 °C ' de 18 saat boyunca karanlıkta inkübasyon yapın. 6,2 adımda listelenen plaka okuyucu parametrelerini kullanarak floresan üretimini ölçün.
7. EVs ve lipozomların depolanması
Not: tüm depolama amaçları Için, düşük bağlayıcı tüpler adsorpsiyon nedeniyle EV kaybı azaltmak için kullanılması tavsiye edilir.
- Aşağıda verilen temsili sonuçları yeniden oluşturmak için bu bölümdeki parametreleri izleyin. 400 μL 'nin EV süspansiyonunu içeren örnekleri kullanın.
- 4 °C veya-80 °C ' de saklayın veya aşağıda belirtilen adımlara geçin.
- EVs 'e lyophilize.
- Trehaloz Ekle (40 mg/ml H2O) son konsantrasyon kadar 4 mg/ml arıtılmış EVS için. Numuneleri-80 °C ' de en az 1 saat dondurur.
- Aşağıdaki parametreleri kullanarak örnekleri lyophilize. Ana kurutma için, raf sıcaklığını 15 °C ' ye ayarlayın ve 0,180 mbar 'a baskı yapın ve örnekleri 46 h için kurumaya bırakın. Son kurutma için, raf sıcaklığını 25 °c ' ye ayarlayın ve 0,0035 mbar 'a baskı yapın ve numuneleri 2 saat boyunca kurumaya bırakın. liyofilize numuneleri 4 °c ' de saklayın.
- Numuneleri yeniden nemlendirmek için H2O, başlangıç olarak ev süspansiyonu miktarına eşit (genellikle 400 μL) ekleyin. Rehydration için herhangi bir arabellek kullanmayın.
8. depolama sonrası analiz
- Enzim etkinliğini değerlendirmek için, önce depolama sırasında EVs sızdırılmış olabilir ücretsiz glukuronidaz, çıkarın. Bu, SEC (bkz. Adım 5) veya asimetrik akış alanı-akış fraksiyonasyonu (AF4) (bkz. Adım 8.1.2) tarafından gerçekleştirilen arıtma ek bir adım ile elde edin.
Not: her iki yöntemin de EV örneğinin seyreltilmesine yol açmaları önerilir; Böylece, NTA miktarlandırma sınırının altına taşınmamak için depolama öncesinde yeterli EV konsantrasyonları kullanın. SANIYE veya AF4 nedeniyle parçacıkların bir 1:10 seyreltme bekliyoruz.- SEC arıtma için yukarıda açıklanan protokolü izleyin (bkz. Bölüm 5).
- AF4 arıtma gerçekleştirin.
- 350 μm spacer ve 30 kD molekül ağırlığı kesilmiş selüloz membranlı küçük bir kanal kullanarak cihazı ayarlayın. HPLC pompası ve AF4 kanalı arasında 0,1 μm gözenek boyutu filtresi yerleştirin. Hafif saçılma dedektörlerinde parçacık yükünü ve gürültüyü azaltmak için taze hazırlanmış 0,1 μm-filtrelenmiş PBS 'i mobil faz olarak kullanın.
- 280 nm olarak ayarlanan bir UV dedektörü kullanarak proteinleri algılayın. Parçacıkları algılamak için, 658 nm 'ye kadar lazer seti ile multiangle ışık saçılma kullanın.
- Aşağıdaki Run yöntemini kullanın. 1 mL/dak netleme debisi ile 1 dakika ön odak; daha sonra 0,2 mL/dak hızında örnek 300 μL enjekte edin ve odak akışını 10 dakika tutun. Enjeksiyondan sonra, numuneyi 1 mL/dak 'da 2 mL/dk 'dan 0,1 mL/dk 'dan 8 dk. arası akımlı bir çapraz akış uygularken 10 dk. çapraz akış olmadan başka bir on dakika için elute. 12,5 dk sonra başlayan ve 27 dakika kadar devam 1 mL kesirler toplayın.
- Yukarıda açıklandığı gibi glucuronidase tahlil gerçekleştirin (Bölüm 6 bakın).
- Boyutu ve konsantrasyonu değerlendirmek için, yukarıda açıklandığı gibi NTA kullanın (bkz. Adım 2,5).
- İsteğe bağlı olarak, depolama sonrası EVs morfolojisi değerlendirmek için TEM ve SEM gerçekleştirin (bkz. 5,3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 , huvecs 'den Izole edilen EVS 'nin depolama özelliklerini görüntüler. EVs UC tarafından izole edildi, glukuronidaz kapsüllenmiş, ve SEC sonra, saflaştırılmış EVs NTA tarafından Fizikokimyasal özellikleri için değerlendirildi. Veziküllerin bir örneği daha sonra AF4 arıtılmasına maruz kalmıştır ve glukuronidaz aktivitesi ölçülmüştür.
Veziküller daha sonra 4 °C veya-80 °C ' de 7 d ve likofilize formda 4 °C ' de, ikinci durumda ise% 4 trehalose eklenmesiyle saklanır. Depodan sonra, veziküller tekrar NTA ile ölçüldü ve AF4 sonra, Parçacık başına kalan glukuronidaz aktivitesi değerlendirildi.
AF4 'nin çalışma prensibi, partiküllerin boyutuna göre türevlerini etkileyen AF4 kanalın altındaki gözenekli membrandan laminar akımının ve ortogonal bir Crossflow kombinasyonuna dayanmaktadır (Şekil 2). Daha küçük parçacıklar kanalda daha fazla yer alırken daha büyük parçacıklar membran daha yakın yer almak eğilimindedir. Laminar akımının parabolik akış profili sayesinde, membrandan daha uzağa gelen partiküller Dedektör yönüne doğru daha hızlı hareket ederek partikül ayrımı boyutuna kadar yol tutar. Tipik bir AF4 denemede, enjekte edilen parçacıklar ilk önce membran üzerinde duruluyor, kanal üzerinden uzunlamasına bir akış olmadan çapraz akış uygulayarak (Şekil 2a). Enjeksiyon ve odaklama işleminden sonra, elüsyon aynı anda bir çapraz akış ve uzunlamasına bir akış uygulayarak başlar ve partiküllerin farklı alt setleri (Şekil 2B), bizim durumumuzda, EVS ve ücretsiz glukuronidaz idi.
Şekil 3 , Nanopartiküllerin (EVS veya lipozomların) kirlilikleri ve Nonencapsulated glukuronidaz ile ayrımı gösterir. Lipozomların sec elüsyon profili (Şekil 3A) hazırlandıktan sonra saflaştırılmış (protokol Bölüm 4 ' e bakın) serbest enzim kapsüllenmiş glukuronidaz ile partiküllerin ayrılması göstermiştir, hem BCA tahlil ve tespit Enzim aktivitesi. Bu örnekte, kesirli 6 ve 7 en yüksek parçacık konsantrasyonlarını içerdikleri ve ücretsiz glukuronidaz ile olası kontaminasyonlar önlemek için daha fazla deneyler için seçilir. AF4 aynı zamanda, Şekil 3B'de gösterildiği gibi ücretsiz glukuronidaz EVS AYıRARAK başarılı oldu, saniyeye oranla daha yüksek bir ayrılık derecesi ile, veziküller içeren fraksiyonlar kontaminasyonu daha az olası.
Şekil 4' te, veziküller için ölçülen enzim aktivitesinin gerçekten EVS içine glukuronidaz kapsülleme ile bağlantılı ve enzim agregaları tarafından neden değil emin olmak için bir kontrol deneyi yapıldı. Bu toplamları saponin ile glukuronidaz inkübasyon nedeniyle oluşturulmuş olabilir ve yanlış olumlu sonuçlara yol. Veziküllerin ellenen kesirleri doğrulamak için, kapsüllenmiş glukuronidaz olmadan saflaştırılmış EVs, sadece saponin ve enzim içeren örnekle aynı sütunda SANIYEYE tabi tutulmuştur.
Glukuronidaz saponin ile inkübe edildiğinde ve daha sonra SEC tarafından temizleşmiş olduğunda, genellikle EVs içeren Kesirlerde hiçbir enzim aktivitesi bulunamadı. Küçük miktarlarda parçacıklar EVs aynı anda elute bulundu iken (< 0.1% tipik bir EV Pellet kurtarılan parçacıklar), hiçbir ilişkili enzim aktivitesi vardı. Bu sonuçlar, veziküller içeren fraksiyonlar içinde kurtarılan aktif enzim onları kapsüllenmiş olduğunu gösterir.
Şekil 5 depolama sonra veya ek Af4 arıtma olmadan kapsüllenmiş boya kaldırmak için aktif enzim kurtarma karşılaştırır. AF4 arıtma ile, genellikle Parçacık başına enzim daha düşük bir kurtarma, 4 °C ' de depolama için en yüksek etkiye sahip, nerede kurtarma üçte iki düşer. Böylece, bu ek arıtma adımı atlayarak enzim istikrar hakkında yanlış varsayımlar yol açabilir.
Şekil 6 , msc 'Ler, A549 hücreleri ve lipozomlar tarafından türetilen veziküller üzerinde bir kriyoprotektan olmadan lyophilization etkisini gösterir-80 °c ' de donma ile karşılaştırıldığında. Parçacıklar, yukarıda açıklandığı gibi TEM ve SEM tarafından görüntülenmiş (protokol 5,3 adımına bakın). MSCs ve A549 EVs iki depolama koşullarını karşılaştırarak, TEM görüntülerde şekil büyük farklılıklar sergilemiyor. Ancak SEM resimlerinde,-80 °C örneklerinde bulunan likofilized numuneler gösterilir. Lipozomlar da SEM resimde toplamları gösterilen, TEM iken, lyophilization lipozomların bir boyut artışı teşvik ortaya çıktı. Kriyokoruyucular içermeyen lyophilization, depolama sonrası bozulmamış glukuronidaz iyileşmesini de azaltmıştır (Şekil 7). Bir kriyoprotektan olarak Trehaloz eklenmesi, doz bağımlı bir şekilde aktif enzimin iyileşmesini artırdı.
Şekil 8 , glukuronidaz testinde yer alan fluorcein di-β-D-glukuronidin serbest florükine dönüşümünü gösterir. Educt 516 nm de floresan olmayan iken, florcein bu dalga boyunda yüksek floresan. Bu yüksek hassasiyet ile basit bir enzim aktivite tahlil için izin.
Şekil 1 : HUVEC EVs depolama stabilitesi. (A) depolama önce karşılaştırıldığında parçacık kurtarma, (B) ortalama boyutu, ve (C) huvecs izole EVS Parçacık başına normalleştirilmiş glukuronidaz aktivite. Veziküller 4 °C ve-80 °C ' de 7 d ve% 4 trehalose ile lyophilization sonrası 4 °C ' de saklanır. Ortalama Boyut ve parçacık kurtarma NTA tarafından ölçülmüştür; Partikül başına glucuronidase aktivite NTA veri ve glukuronidaz tahlil sonuçlarını birleştiren ve depolama önce normalleştirilmiş hesaplanır. Ortalama ± SD, n = 3, *p < 0,05 (tek yönlü ANOVA ardından Tukey 'nin geçici testi). Frank ve al.21' den değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : Af4 çalışma prensibi. (A) EVS ve ücretsiz glukuronidaz bir çapraz akış uygulayarak enjeksiyon sonra odaklanmıştır. (B) daha sonra, EVS ve serbest enzimlerin akışını kanal üzerinden çapraz akışla birleştirerek ayrı olarak eller. Frank ve al.21' den değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 : Ücretsiz glukuronidaz EVs ve lipozomların ayrılması. (A) glukuronidaz yüklenmiş lipozomların, serbest glukuronidaz ve protein kirleticilerin temsilci sec ayrımı. Grafik parçacık konsantrasyonu (kırmızı), protein konsantrasyonu (mavi) ve glucuronidase etkinliğini (yeşil) görüntüler. (B) ücretsiz glukuronidaz EVS ayrılması gösterimi. Tedavi edilmeyen EVs, 0,05 mg/mL glukuronidaz, ücretsiz glukuronidaz (0,5 mg/mL) ve glukuronidaz ile yüklenen EVs ve SEC (EV glukuronidaz) tarafından arındırılmış EVS, 280 nm ve 90 ° ışık saçılma ile UV tarafından enjekte edilmiş ve analiz edilmiştir. Ücretsiz enzim EVs 'den ayrı olarak eltilir. Frank ve al.21' den değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4 : Ücretsiz glukuronidaz EVs arıtma Için kontrol deneyler. 400 μL yerel EVs veya 400 μL içinde 1,5 mg/mL glukuronidaz PBS ile 10 dakika boyunca inkübe edilen 0,1 mg/mL saponin ile saflaştırıldı sn. (A) veziküller ve glukuronidaz toplanan fraksiyonları parçacık konsantrasyonları, ve enzim aktivitesi saflaştırılmış glukuronidaz. (B) aynı deneyde ölçülen 280 nm 'de UV emilimi. Glukuronidaz için ilk küçük tepe panel Agri çizgi ile karşılık gelir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5 : Ev depodan sonra ek arıtma adımlarının etkisi. Parçacık başına kalan glukuronidaz aktivitesi, depolama sonrası ek AF4 arıtma adımıyla veya olmadan D0 ile karşılaştırıldığında. HUVEC EVs, 4 °C veya-80 °C ' de 7 d için saklanır ve% 4 trehalose ile likofilize edilmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 6 : Tem ve EVs SEM resimleri. (A) MSCS ve (B) A549 hücreler ve (C) lipozomlar dan EVS Tem ve SEM resimleri. Örnekler 14 d at-80 °c veya trehalose ilavesi olmadan liyofilize için saklanır. Oklar SEM resimleri TEM resimler ve toplamları morfolojik olarak değiştirilmiş partiküllerin varlığını gösterir. Frank ve al.21' den değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 7 : Lyophilization sonrası enzim iyileşmesi üzerine Trehaloz etkisi. Enzimin aktivitesinin lyophilization sonrası 14 gün boyunca karşılaştırılması,% 0,% 1, ve 4% Trehaloz ile örnek depolama önce (0 gün). Frank ve al.21' den değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 8 : Enzimatik bölünme floresan di-β-D-glukuronid glucuronidase tarafından. Şemasında, glukuronidaz tespiti temel reaksiyon açıklanmıştır. Floresan olmayan fluorcein di-β-D-glukuronid, glukuronidaz tarafından bölünür. Şeker kalıntılarının kaldırılması yoluyla, florerin floresan özelliklerine kavuşur. İnkübasyon süresi sonra ölçülen floresan aktif enzim mevcut miktarı ile ilişkilidir ve glukuronidaz tahlil okuma. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda, EVs 'in farklı depolama koşullarında istikrarını incelemek için kapsamlı bir protokol sunuyoruz. Fonksiyonel bir okuma ve EVs fizikokimyasal parametrelerin değerlendirilmesi olarak kapsüllenmiş glukuronidaz kombinasyonu ile, protokol EVs ve farklı hücreden EVs karşılaştırılması basit bir depolama stabilitesi değerlendirilmesi için izin verir Satır. SEM ve TEM, tamamlayıcı yöntemler olarak tek parçacık düzeyinde EVs değişikliklerine ilişkin bir anlayış sağlar. Burada sunulan sonuçlar, EVs ve lipozomların bir kriyoprotektan olmadan lyophilization nedeniyle toplama eğilimi gösterdi (Şekil 6). Ancak bu sadece SEM deneylerinde gözlenmiştir. EM görüntüleme trehalose ile korunmuş örneklerle yürütülürken, literatür bu kriyoprotektan gerçekten EVs29toplama azaltabilir göstermektedir. Belirli bir depolama koşulu, EV boyutunu, iyileşme hızını ve kapsüllenmiş molekülleri farklılaşırsa, değerlendirmek de mümkündür. Böyle bir etki HUVEC EVs için elde edilen sonuçlar tarafından örneklenmiştir (Şekil 1). 4 °c ve-80 °c için partikül kurtarma liyofilize numuneler için daha iyi iken, aktif kapsüllü glukuronidaz kurtarma liyofilize örnekleri için en iyisidir. EVs lyophilization daha uygun depolama durumu olabilir, örneğin, analiz zaman EV biomarkers, odak elde ve bozulmamış veziküller yerine bozulmamış kargo koruyarak daha fazla olduğu.
EVs22' nin lyophilization hakkında yaptığı son yazıda, charoenviriyakul ve ark. karşılaştırılabilir bir yaklaşım izledi. Fizikokimyasal parametrelerle ilgili olarak, Zeta potansiyeline yapılan değişiklikler daha düşük koloidal stabilite ile ilişkilendirilebilir olarak polydispersity indeksi (PDı) ve Zeta potansiyeli üzerinde duruldu. Ancak, Zeta potansiyeli sadece istikrar30, aynı zamanda sonuçları yansıtıldı gözlenen değişiklikleri açıklayamaz. Onlar da polyacrylamid jel elektroforez tarafından saklanan EVs protein ve RNA içeriği karşılaştırıldı. Bu teknik çok iyi protein veya veziküller RNA içeriğinde önemli değişiklikler gösterebilir. Ancak, burada sunulan yöntemin daha çok daha fazla miktarda malzeme gerektirir. Depolama etkisini değerlendirmek için EV kargo, Charoenviriyakul ve al. heterologously her biri bir enzim ve DNA türlerini ifade kendi EV üretici hücre hattı ve EVs kendi aktivite ve bütünlük izleniyor. Basit saponin-aracılı kapsülleme kolayca uygulanabilir iken ancak, bu tür heterolog ifade, her yeni hücre çizgisi için önemli miktarda zaman gerektirdiğinden, farklı kaynaklardan EVS karşılaştırıldığında, uygun değildir.
Şekil 3' te gösterildiği gibi herhangi bir kapsüllenmiş enzim kaldırmak için çok önemlidir. EV-kapsüllü glukuronidaz çözeltinin serbest enzim daha substrat ile çok daha yavaş tepki, kapsülleme verimliliği bir aşırı tahminine yol. Depolama koşulları, örnekteki ücretsiz glukuronidaz aktivitesini farklı şekilde etkileyebileceği ve hasarlı EVs 'den sızıntıya yol açabilecek gibi, depolama işleminden sonra analiz için temiz ayrım özellikle önemlidir. Bu bizim deneyler belirgindi (Şekil 5), glukuronidaz tahlil önce uygulama olarak Af4 veziküller içinde kapsüllenmiş değil boya kaldırmak başardı. Böylece, burada tartışılan depolama yöntemlerinin etkisi hakkında net sonuçlar elde etmek mümkün hale geldi, AF4 olmadan, depolama nedeniyle etkinlik kaybı hafife olurdu.
Bir başka önemli göz, stabilitelerinin test edilmesi için EVs 'nin yalıtım ve karakterizasyonu olur. Açıklanan tekniği farklı kaynaklardan EVS karşılaştırılması sağlar, ancak bunların hepsi aynı yalıtım yöntemi tarafından sonuçlar bozulmaz böylece hazırlanmış ise mümkündür18,31,32. Bu bağlamda, hücre kültürü koşulları da dikkate alınması gerekir, onlar izole EVS33miktarı ve biyoaktivite etkileyebilir gibi. Diğer yayımlanan sonuçlara kıyasla olabilir sonuçları elde etmek için, son güncellenen danışmak için tavsiye edilir "hücre dışı veziküller çalışmaları için minimal bilgi" Bu EV araştırma uyum için yönergeler içeren26.
Burada sunulan protokolde, biz depolama sonra ücretsiz enzim kaldırmak için SEC veya AF4 kullanılır. Gradyan ultracent., UC veya Ultrafiltrasyon34gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Santrifüjlü yöntemlerle karşılaştırıldığında, SEC ve Af4 daha az zaman alıcı (örn. saniyede 16 h veya gradyan UC için daha fazla sütun dengelemesinden dahil olmak üzere sec için kabaca 1,5 h) ve onlar tamamen normal UC karşılaştırıldığında EVS ücretsiz proteinleri ayrı olabilir, nerede her zaman Pellet ile kalan süpernatant kalır. Dahası, SEC15 ve Af435 , EVS 'de daha az kayma gerilimi sağlayan hafif yöntemlerdir. Buna karşılık, UC sırasında EVS üzerine uygulanan kuvvetler,34,36cinsinden toplama ve değişiklikler gibi partiküllerin değişimlerine yol açabilir.
SEC ve AF4 bir dezavantajı numunelerin seyreltme olduğunu. Böylece, birden fazla arıtma adımlarını sonra NTA ölçümleri için gerekli konsantrasyonları korumak için EVs yeterli miktarda yalıtmak için gereklidir. EV fraksiyonları Santrifüjlü filtreler kullanılarak konsantre olabilir, ancak filtre malzemesine ve protokole bağlı olarak, veziküller37kaybı olabilir.
Burada tartışılan protokolün sınırlaması, sadece eksojen kapsüllü glukuronidaz enzim aktivitesini izler, ne hesap kapsüllü RNA ve DNA ya da işlevsellik için önemli olabilir EV yüzey proteinleri alma18 . Yeni ev terapilerini araştırma için, bu teknik işlevsellik üzerinde deneyleri yerini alamaz ama onlara iltifat ve vezikül istikrar hakkında bir belirti vermek. Örneğin, biofluidlerden türetilen EVs, vezikül içeriğinin daha sonra analizi için depolanacak ise, bu büyük bir kullanım olabilir.
Gelecekte, bu protokol kapsamı aynı zamanda diğer organizmalardan türetilen EVs dahil etmek için Genişletilebilir, örneğin, bakteriyel dış membran veziküller. Başka bir ilginç sonraki adım saponin kuluçka tarafından nüksik asitlerin kapsülleme test etmek ve aynı zamanda DNA veya RNA kargoları istikrarı içine bakmak olacaktır.
Sonuç olarak, bu prosedür hem fizikokimyasal hem de fonksiyonel bir okumaları entegre ederek çeşitli memeliler hücre kaynaklarından EVs 'in depolama kararlılığını değerlendirmek için basit bir yöntem sunar. Bu ayrıntılı protokol, EV araştırmacılarının veziküller için uygun depolama koşullarının basit bir şekilde belirlenmesi sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı NanoMatFutur küçük araştırma programı, Almanya (Grant numarası 13XP5029A) bu işi destekliyor. Maximilian Richter, Doktora Bursu ile Studienstiftung des Deutschen Volkes (Alman Akademik Burs Vakfı) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC) | Sigma-Aldrich | P2663-25MG | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC) | Sigma-Aldrich | P4329-25MG | |
| 225 cm² cell culture flasks | Corning | 431082 | Used with 25 ml of medium |
| 30 kDa regenerated cellulose membrane | Wyatt Technology Europe | 1854 | |
| 350 µm spacer | Wyatt Technology Europe | ||
| Automated fraction collector | Thermo Fisher Scientific | ||
| Beta-glucuronidase | Sigma-Aldrich | G7646-100KU | |
| Chloroform | Fisher scientific | C/4966/17 | |
| Column oven | Hitachi High-Technologies Europe | ||
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T9531-10G | |
| DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector | Wyatt Technology Europe | ||
| Durapore Membrane filter, PVDF, 0,1 µm, 47 mm | Merck | VVLP04700 | Used for the preparation of buffers for AF4 |
| EBM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3156 | Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells |
| Eclipse dualtec | Wyatt Technology Europe | ||
| EGM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3162 | Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells |
| ELISA Plate Sealers | R&D Systems | DY992 | used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay |
| Ethanol | Fisher scientific | E/0665DF/17 | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids | 610000-1EA | |
| Filter support | Avanti Polar Lipids | 610014-1EA | used for liposome preparation |
| Fluorescein di-β-D-glucoronide | Thermo Fisher Scientific | F2915 | |
| Gibco PBS-tablets+CA10:F36 | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | |
| Hettich Universal 320 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Used for pelleting cells at 300 g | |
| Hettich Rotina 420 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Used for pelleting larger debris at 3000 g | |
| HUVEC cells | Lonza Verviers, S.p.r. | C2517A | |
| Kimble FlexColumn 1X30CM | Kimble | 420401-1030 | |
| Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC | Christ | ||
| Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR international | 525-0255 | the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery |
| Nanosight LM14 equipped with a green laser | Malvern Pananalytical | ||
| Nanosight-software version 3.1 | Malvern Pananalytical | ||
| Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes | Whatman/GE Healthcare | 110406 | used for liposome preparation |
| PEEK Inline filter holder | Wyatt Technology Europe | ||
| Phosphotungstic acid hydrate | Sigma-Aldrich | 79690-25G | |
| Polycarbonate bottles for ultracentrifugation | Beckman Coulter | 355622 | |
| QuantiPro BCA Assay Kit | Sigma-Aldrich | QPBCA-1KT | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15 | Carl Zeiss AG | ||
| Sepharose Cl-2b | GE Healthcare | 17014001 | |
| SEM copper grids with carbon film | Plano | S160-4 | |
| Small AF4 channel | Wyatt Technology Europe | ||
| Sputter-coater Q150R ES | Quorum Technologies | ||
| Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011 | Oxford Instruments | ||
| Type 45 Ti ultracentrifugation rotor | Beckman Coulter | 339160 | |
| Ultimate 3000 Dionex autosampler | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex isocratic pump | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K | Beckman Coulter | ||
| UV detector | Thermo Fisher Scientific | ||
| Whatman 0.2 µm pore size mixed cellulose filter | Whatman/GE Healthcare | 10401712 | Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC |
References
- Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Controlled Release. 244, Part B 167-183 (2016).
- Fuhrmann, G., Herrmann, I. K., Stevens, M. M. Cell-derived vesicles for drug therapy and diagnostics: Opportunities and challenges. Nano Today. 10 (3), 397-409 (2015).
- Goes, A., Fuhrmann, G. Biogenic and Biomimetic Carriers as Versatile Transporters To Treat Infections. ACS Infectious Diseases. 4 (6), 881-892 (2018).
- György, B., Hung, M. E., Breakefield, X. O., Leonard, J. N. Therapeutic Applications of Extracellular Vesicles: Clinical Promise and Open Questions. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 439-464 (2015).
- Schulz, E., et al. Biocompatible bacteria-derived vesicles show inherent antimicrobial activity. Journal of Controlled Release. 290, 46-55 (2018).
- Feng, Q., et al. A class of extracellular vesicles from breast cancer cells activates VEGF receptors and tumour angiogenesis. Nature Communications. 8, 14450 (2017).
- Bewicke-Copley, F., et al. Extracellular vesicles released following heat stress induce bystander effect in unstressed populations. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1340746 (2017).
- Xu, Y., et al. Macrophages transfer antigens to dendritic cells by releasing exosomes containing dead-cell-associated antigens partially through a ceramide-dependent pathway to enhance CD4(+) T-cell responses. Immunology. 149 (2), 157-171 (2016).
- Buzas, E. I., György, B., Nagy, G., Falus, A., Gay, S. Emerging role of extracellular vesicles in inflammatory diseases. Nature Reviews Rheumatology. 10, 356 (2014).
- Rajappa, P., et al. Malignant Astrocytic Tumor Progression Potentiated by JAK-mediated Recruitment of Myeloid Cells. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 23 (12), 3109-3119 (2017).
- Umezu, T., et al. Exosomal miR-135b shed from hypoxic multiple myeloma cells enhances angiogenesis by targeting factor-inhibiting HIF-1. Blood. 124 (25), 3748-3757 (2014).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
- Boulanger, C. M., Loyer, X., Rautou, P. -E., Amabile, N. Extracellular vesicles in coronary artery disease. Nature Reviews Cardiology. 14, 259 (2017).
- Zhu, X., et al. Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from HEK293T cells. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324730 (2017).
- Vader, P., Mol, E. A., Pasterkamp, G., Schiffelers, R. M. Extracellular vesicles for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 106, Part A 148-156 (2016).
- Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. J., Kwon, Y. J. Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery. Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).
- Gimona, M., Pachler, K., Laner-Plamberger, S., Schallmoser, K., Rohde, E. Manufacturing of Human Extracellular Vesicle-Based Therapeutics for Clinical Use. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1190 (2017).
- Jeyaram, A., Jay, S. M. Preservation and Storage Stability of Extracellular Vesicles for Therapeutic Applications. The AAPS Journal. 20 (1), 1 (2017).
- Lőrincz, ÁM., et al. Effect of storage on physical and functional properties of extracellular vesicles derived from neutrophilic granulocytes. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25465 (2014).
- Processes for producing stable exosome formulations. US patent. Kreke, M., Smith, R., Hanscome, P., Peck, K., Ibrahim, A. , Beverly Hills, CA. WO/2016/090183 (2016).
- Frank, J., et al. Extracellular vesicles protect glucuronidase model enzymes during freeze-drying. Scientific Reports. 8 (1), 12377 (2018).
- Charoenviriyakul, C., Takahashi, Y., Nishikawa, M., Takakura, Y. Preservation of exosomes at room temperature using lyophilization. International Journal of Pharmaceutics. 553 (1), 1-7 (2018).
- Kusuma, G. D., et al. To Protect and to Preserve: Novel Preservation Strategies for Extracellular Vesicles. Frontiers in Pharmacology. 9 (1199), (2018).
- Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
- Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect of porphyrins. Journal of Controlled Release. 205, 35-44 (2015).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 19671 (2013).
- Vestad, B., et al. Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087 (2017).
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6, 36162 (2016).
- Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential - What they are and what they are not. Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).
- Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24858 (2014).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
- Patel, D. B., et al. Impact of cell culture parameters on production and vascularization bioactivity of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles. Bioengineering & Translational Medicine. 2 (2), 170-179 (2017).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).
- Zhang, H., et al. Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation. Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).
- Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 29509 (2015).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).
