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Neuroscience

एक उपन्यास और अनुवाद चूहा टक्कर के संयोजन बल और रोटेशन के साथ Vivo सेरेब्रल Microdialysis में

Published: July 12, 2019 doi: 10.3791/59585
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 2, 1
1Research Center, Hôpital du Sacré-Cœur de Montréal, 2Research Center, Douglas Institute

Summary

न्यूरोट्रांसमीटर परिवर्तन तंत्रिका रोग का एक तंत्र है कि कंसेशन के बाद होता है और कभी कभी catastrophic दीर्घकालिक परिणामों के लिए योगदान देता है. इस चूहे मॉडल microdialysis को जोड़ती है, vivo न्यूरोट्रांसमीटर परिमाणीकरण में अनुमति देता है, एक वजन ड्रॉप तकनीक तेजी से त्वरण और सिर और धड़, मानव craniocerebral आघात का एक महत्वपूर्ण कारक की मंदी लागू करने के साथ.

Abstract

लगातार संज्ञानात्मक और मोटर लक्षण concussions के ज्ञात परिणाम हैं / हल्के दर्दनाक मस्तिष्क की चोट (mTBIs) कि आंशिक रूप से बदल neurotransmission के लिए कारण हो सकता है. दरअसल, कृन्तकों में सेरेब्रल माइक्रोडायलिसिस अध्ययन आघात के बाद पहले 10 मिनट के भीतर हिप्पोकैम्पस में एक अत्यधिक extracellular ग्लूटामेट रिलीज का प्रदर्शन किया है. Microdialysis vivo न्यूरोट्रांसमीटर निरंतर नमूना में का स्पष्ट लाभ प्रदान करता है, जबकि पशु बलिदान करने के लिए नहीं है. ऊपर उल्लिखित तकनीक के अलावा, एक बंद सिर की चोट मॉडल है कि तेजी से त्वरण और सिर और धड़ की मंदी लागू की जरूरत है, के रूप में इस तरह के एक कारक कई अन्य पशु मॉडल में उपलब्ध नहीं है. वेन राज्य वजन ड्रॉप मॉडल मानव craniocerebral आघात के इस आवश्यक घटक mimics, एक गिरने वजन के साथ एक अनियंत्रित कृंतक के सिर पर एक प्रभाव के प्रेरण की अनुमति. हमारे उपन्यास और translational चूहे मॉडल वेन राज्य वजन ड्रॉप मॉडल के साथ मस्तिष्क microdialysis को जोड़ती है अध्ययन करने के लिए, हल्के anesthetized और अनियंत्रित वयस्क चूहों में, concussion के बाद extracellular न्यूरोट्रांसमीटर के स्तर में तीव्र परिवर्तन. इस प्रोटोकॉल में, microdialysis जांच ब्याज के क्षेत्र के रूप में हिप्पोकैम्पस के अंदर डाला गया था, और प्रभाव में मस्तिष्क में डाला छोड़ दिया गया था. हिप्पोकैम्पस में टर्मिनलों और रिसेप्टर्स का एक उच्च घनत्व है, यह एक प्रासंगिक क्षेत्र बनाने के लिए भ्रम के बाद बदल neurotransmission दस्तावेज़. जब वयस्क Sprague-Dawley चूहों के लिए लागू, हमारे संयुक्त मॉडल प्रेरित पहले 10 मिनट के भीतर हिप्पोकैम्पस ग्लूटामेट सांद्रता में बढ़ जाती है, पहले की सूचना के बाद टक्कर लक्षण विज्ञान के साथ संगत. इस संयुक्त वजन ड्रॉप मॉडल शोधकर्ताओं दोहराव मस्तिष्क की चोट के अलावा concussions के लिए जल्दी चिकित्सीय प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय उपकरण प्रदान करता है, क्योंकि इस प्रोटोकॉल एक बंद सिर हल्के आघात लाती है.

Introduction

इस विधि का उद्देश्य एक विश्वसनीय उपकरण है कि ईमानदारी से मानव craniocerebral आघात के biomechanics पुन: पेश करता है, जबकि concussions के आणविक प्रभाव के अनुदैर्घ्य लक्षण की अनुमति के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करने के लिए है / चोट (mTBIs). इस विधि वेन राज्य वजन ड्रॉप मॉडल के साथ मस्तिष्क microdialysis को जोड़ती है दस्तावेज़ के लिए, हल्के anesthetized और अनियंत्रित वयस्क चूहों में, concussion के बाद extracellular न्यूरोट्रांसमीटर के स्तर में तीव्र परिवर्तन. इस न्यूनतम इनवेसिव विधि के साथ, ग्लूटामेट, गाबा, taurine, ग्लिसिन और serine के रूप में न्यूरोट्रांसमीटर तेजी से और लगातार आघात के बाद मात्रा निर्धारित किया जा सकता है, विवो में, जबकि जानवर का बलिदान करने के लिए नहीं.

टक्कर/mTBI एक pathophysiological व्यवधान है कि एक बाहरी बल तंत्र की वजह से मस्तिष्क के कामकाज को प्रभावित है. टक्कर / mTBI दर्दनाक मस्तिष्क की चोट का सबसे आम रूप है, मामलों के 70-90% के लिए लेखांकन1. एक उलझन के बाद तीव्र कार्यात्मक अवरोधों के अधिकांश एक प्राथमिक और एक माध्यमिक मस्तिष्क की चोट के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है2,3: (1) प्राथमिक मस्तिष्क की चोट तेजी से त्वरण और सिर और धड़ की मंदी से प्रेरित है जो प्रतिक्रिया4,5,6 और (2) के दौरान एक्सॉन ्स्स को खींचने और कतरनों के कतरन ों के बाद संपीड़न द्वारा मस्तिष्क के ऊतकों को नुकसान पहुंचाता है, माध्यमिक मस्तिष्क की चोट आघात के लिए अप्रत्यक्ष सेलुलर प्रतिक्रिया है। यह प्राथमिक मस्तिष्क की चोट के बाद घंटे और दिन जगह लेता है और समय के साथ मनाया मोटर और संज्ञानात्मक हानि में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. इनमें से कई लक्षणों को परिवर्तित न्यूरोट्रांसमिशन के कारण माना जा सकता है , जैसे कि चोटकेबाद पहले 10 मिनट में अत्यधिक कोशिकीय ग्लूटामेट रिलीज 7,8,9. टर्मिनलों और रिसेप्टर्स के अपने उच्च घनत्व को देखते हुए, हिप्पोकैम्पस एक मस्तिष्क संरचना विशेष रूप से चोट के बाद इस excitotoxic प्रतिक्रिया के लिए कमजोर है. संज्ञानात्मक समारोह में भारी शामिल होने के नाते10,11, कृन्तकों में अध्ययन की सूचना दी है कि हिप्पोकैम्पस क्षति कंसेशन के साथ जुड़े डर कंडीशनिंग में हानि के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और स्थानिक स्मृति सीखने12 , 13इस पद्धति का प्राथमिक उद्देश्य वेन राज्य बंद सिर वजन ड्रॉप प्रक्रिया का उपयोग कर प्राथमिक मस्तिष्क की चोट के तंत्र को ईमानदारी से पुन: पेश करने के लिए concussion/mTBI के एक चूहे मॉडल बाहर काम करने के लिए किया गया था, और मस्तिष्क को शामिल माइक्रोडायलिसिस विवो में अध्ययन करने के लिए, एक उलझन के बाद माध्यमिक मस्तिष्क की चोट के कारण तीव्र extracellular न्यूरोट्रांसमीटर परिवर्तन. हमारी विधि के प्रतिनिधि परिणाम के रूप में कार्य करने के लिए हिप्पोकैम्पस में बाह्य ग्लूटामेट और गाबा की सांद्रता को मापा गया था।

पिछले कृंतक अध्ययन microdialysis और चोट के अन्य मॉडल संयुक्त है, इस तरह के खुले-स्कॉल वजन ड्रॉप और नियंत्रित cortical प्रभाव के रूप में, अलग गंभीरता की चोट के बाद extracellular न्यूरोट्रांसमीटर के स्तर में तीव्र परिवर्तन प्रदर्शित करने के लिए डिग्री14,15,16,17. हालांकि, परिवर्तनशीलता के उच्च डिग्री के अलावा, खुले-कपाल वजन ड्रॉप और नियंत्रित cortical प्रभाव की तरह मॉडल के अनुवाद मूल्य 2 कारकों के कारण पारिस्थितिक वैधता का एक अंतर्निहित कमी से बाधित है: (1) इन मॉडलों चोटों को प्रेरित बहुत खेल से संबंधित concussions से अधिक गंभीर मनुष्यों में सामना करना पड़ा, प्रत्यक्ष मस्तिष्क लोड हो रहा है और (2) इन मॉडलों को शामिल एक craniectomy या एक craniotomy की आवश्यकता, कृंतक के सिर पूरी तरह से एक stereotaxic फ्रेम में रोका जा रहा है, तेजी से impeding सिर और धड़ का त्वरण और मंदी, इस प्रकार खराब concussion के biomechanics पुनरुत्पादन.

Microdialysis एक न्यूनतम इनवेसिव विधि है जो इस तरह के ग्लूटामेट, गाबा, taurine, ग्लिसिन और serine के रूप में नमूना न्यूरोट्रांसमीटर का स्पष्ट लाभ प्रदान करता है, विवो में और लगातार आघात के बाद, जबकि पशु का बलिदान करने के लिए नहीं. microdialysis द्वारा की पेशकश की फायदे के अलावा, वेन राज्य विश्वविद्यालय एक बंद-स्कॉल वजन ड्रॉप मॉडल विकसित (के रूप में अन्य मॉडलों से खुले-स्कॉल के विरोध में), जो एक हल्के anesthetized और अनियंत्रित कृंतक पर एक MTBI के प्रेरण की अनुमति देता है, इस प्रकार सिर और धड़ 18 केतीव्र त्वरण और मंदी की अनुमति . जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, सिर और धड़ के त्वरण और मंदी खेल से संबंधित concussions के एक मुख्य biomechanical विशेषता है कि पिछले कृंतक mTBI मॉडल पता करने में विफल रहे हैं मनुष्यों में देखा. वजन ड्रॉप प्रक्रिया बहुत जल्दी किया जा सकता है और किसी भी पूर्व सर्जरी या खोपड़ी चीरा की आवश्यकता नहीं है. कंसेशन को शामिल करने के बाद, कृन्तक ों को लगभग सहज रूप से सही पलटा ठीक हो जाता है और एक प्रभाव के बाद पक्षाघात, दौरे या श्वसन संकट का अनुभव नहीं होता है। इंट्राक्रैनियल रक्तस्राव और खोपड़ी फ्रैक्चर दुर्लभ हैं, और कृन्तकों में मोटर समन्वय में केवल मामूली कमी की सूचना मिली है। इस चूहे मॉडल आसान करने के लिए उपयोग, सस्ती है और प्रभाव के दौरान microdialysis जांच को हटाने के बिना एक भ्रम के बाद तीव्र चरण में जारी न्यूरोट्रांसमीटर के परिमाण की सुविधा.

हमारे चूहे मॉडल microdialysis और concussion के संयोजन के लिए लंबे समय तक concussion के आणविक प्रभाव की विशेषता की मांग शोधकर्ताओं के लिए उपयुक्त है और चिकित्सकीय अध्ययन की एक विस्तृत विविधता में इस्तेमाल किया जा सकता है. वास्तव में, अनुसंधान के कई वर्षों और एक भारी जरूरत के बावजूद, concussions के दीर्घकालिक प्रभाव को रोकने के लिए कोई दवा नैदानिक परीक्षण चरण19पारित कर दिया है. इन विफलताओं के लिए संभावित कारणों में से एक पशु मॉडल है कि ईमानदारी से मनुष्य द्वारा अनुभव के रूप में concussions के दर्दनाक biomechanical बलों को पुन: पेश नहीं का उपयोग हो सकता है. यहां प्रस्तुत विधि मानव आक्षेपों की परिभाषा को पूरा करती है जो यह निर्दिष्ट करती है कि मस्तिष्क की प्राथमिक चोट एक कुंद प्रभाव के साथ - साथ तेजी से त्वरण और सिर और धड़2,3की मंदी से प्रेरित होती है .

इसके अलावा, हमारे संयुक्त मॉडल बार-बार हल्के दर्दनाक मस्तिष्क की चोट के प्रभाव का अध्ययन शोधकर्ताओं के लिए उपयुक्त है (rmTBI) अपनी प्रमुख विशेषताओं में से एक है कि यह कंसेशन के अन्य पशु मॉडल से अलग सेट के बाद से यह है कि यह संभव बनाता है प्रेरित करने के लिए दोहराया, एक ही मामले में हल्के चोटों18. मनुष्यों में, rmTBI अधिक गंभीर पोस्ट-ट्रैमेटिक लक्षण, लंबे समय तक वसूली बार, और बढ़ मोटर और संज्ञानात्मक हानि है कि समय20,21के साथ फैल जाते हैं के साथ जुड़ा हुआ है। अन्य प्रासंगिक पशु मॉडल भी rmTBI22,23,24,25,26,27 के पोस्ट-ट्रैमेटिक पैथोफिजियोलॉजी को बेहतर ढंग से समझने के लिए संभव बना दिया है . 24 एच अंतराल पर कम से कम 5 mTBI के बाद कृन्तकों में मस्तिष्क भेद्यता में वृद्धि का प्रदर्शन किया गया है। न्यूरोसूजन का अनुभवी एमटीबीआई की संख्या के साथ बढ़ता है और न्यूरोडिजेनरेशन के मार्कर28दिखाई देते हैं . बार-बार एम टी बी आई माइक्रोग्लिया के संक्रमण को प्रोइंफ्लेमेटरी मोड से वसूली के सामान्य मोड में रोक देगा, जिसके परिणामस्वरूप लंबे समय तक एक्सीटॉक्सिक गतिविधि और न्यूरोडिजेनेटिव तंत्र 29को सक्रिय किया जा सकता है। हमारे मॉडल के साथ, चूहों के लिए उजागर किया जा सकता है 1 प्रति दिन प्रभाव की अवधि में 1 सप्ताह की कुल के लिए 5 जोखिम. इस पशु मॉडल की सादगी को देखते हुए, यह तीव्र अंधाधुंध न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज के संचयी प्रभाव की विशेषता की सुविधा सकता है एक mTBI के तुरंत बाद उत्पन्न होता है.

इस मॉडल को भी जानवरों को आसानी से प्रति दिन 2 प्रभावों को उजागर करने की अनुमति देता है, जिससे यह और भी गंभीर स्थितियों का अध्ययन करना संभव हो जाता है जैसे कि जब एक एथलीट को पहले झटका30से कम समय के भीतर एक और दर्दनाक प्रभाव प्राप्त होता है . के रूप में एक पिछले अध्ययन में प्रदर्शन31, सिर के लिए एक दूसरे झटका के समय नाटकीय रूप से संवहनी और axonal क्षति को प्रभावित कर सकते हैं. करीब दूसरा झटका पहला झटका है, और अधिक हानिकारक परिणाम. इस मॉडल की जांच कैसे इस विशेष हालत extracellular न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज को प्रभावित करता है के लिए उपयुक्त है.

इस विधि में, हिप्पोकैम्पस को कंसेशन अनुसंधान में इसकी प्रासंगिकता के कारण ब्याज के क्षेत्र के रूप में इस्तेमाल किया गया था, लेकिन माइक्रोडायलिसिस के नमूने ब्याज के अन्य क्षेत्रों से भी एकत्र किए जा सकते हैं। हालांकि, किसी भी अन्य मस्तिष्क क्षेत्र के लिए गाइड cannula से प्रभाव साइट द्वारा छोड़ दिया अंतरिक्ष के कारण विचार किया जाना है, यह आसपास के दंत सीमेंट सहित, चूहे के सिर पर अंतरिक्ष की एक काफी राशि ले जा सकते हैं. इस के अलावा, microdialysis पैरामीटर इस विधि में प्रस्तुत इस तरह के झिल्ली आणविक वजन में कटौती और सक्रिय लंबाई के रूप में, नमूना समय अंतराल और प्रवाह दर का अध्ययन अणु के प्रकार के अनुसार समायोजित किया जा सकता है. समर्थक भड़काऊ cytokines के कुशल संग्रह concussions में शामिल, उदाहरण के लिए, एक बहुत बड़ा pores आकार के साथ एक झिल्ली की आवश्यकता होगी.

Protocol

इस परियोजना के लिए पशु प्रोटोकॉल पशु देखभाल पर कनाडा परिषद के दिशा निर्देशों के अनुपालन में Hopital du Sacre-Cur डे मॉन्ट्रियल के पशु देखभाल समिति से अनुमोदन प्राप्त किया.

नोट: अनुसंधान प्रोटोकॉल की एक योजनाबद्ध रूपरेखा चित्र 1में प्रस्तुत किया गया है।

1. पशु तैयारी

  1. आदेश Sprague-Dawley चूहों एक मानक प्रयोगशाला पशु आपूर्तिकर्ता से 43 और 50 दिनों की उम्र के बीच और 151 और 200 ग्राम के बीच एक वजन पर वितरित किया जाएगा.
  2. 12:12 एच प्रकाश के एक चक्र में व्यक्तिगत रूप से सभी चूहों घर: अंधेरे, पानी और भोजन के लिए विज्ञापन libitum उपयोग के साथ 24-26 डिग्री सेल्सियस पर.
  3. प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले 2 सप्ताह के दौरान, शोधकर्ताओं के साथ संपर्क में उनकी आदत की सुविधा के लिए एक दैनिक आधार पर 5 मिनट के लिए चूहों को संभाल. चूहे की आयु लगभग 10 सप्ताह पुरानी होनी चाहिए और उनका वजन कंसेशन या शर्म की चोट प्रेरण के समय 295 और 351 ग्राम के बीच होना चाहिए।

2. माइक्रोडायलिसिस गाइड कैनुला इम्प्लांटेशन सर्जरी

  1. बाँझ शर्तों के तहत सर्जरी प्रदर्शन. प्रक्रिया के दौरान बाँझ दस्ताने, एक बाल बोनट और एक सर्जिकल मुखौटा पहनें। ऑटोक्लेव और सभी सामग्री और शल्य चिकित्सा उपकरणों पहले से बाँझ। इथेनॉल (70%) के समाधान के साथ कार्य क्षेत्र और स्टीरियोटैक्सिक तंत्र को साफ और कीटाणुरहित करें।
  2. केटामाइन (70 मिलीग्राम/किग्रा) और जाइलज़ीन (10 मिलीग्राम/किग्रा) का कॉकटेल इंजेक्शन लगाकर पशुओं को एन्सथेट करना। एक अंगुली चुटकी करने के लिए पलटा परीक्षण द्वारा संवेदनाहारी गहराई का आकलन करता है.
  3. बिजली के क्लिपर का उपयोग कर जानवर के सिर से फर निकालें। 2% आइसोप्रोपिल अल्कोहल और 2% क्लोरहेक्सिडाइन ग्लूकोनेट (3 बार) के समाधान का उपयोग करके साफ मुंडा सिर। सूखापन को रोकने के लिए संज्ञाहरण के दौरान चिकनाई नेत्र मरहम लागू करें।
  4. शल्य चिकित्सा क्षेत्र को ड्रेप-ऑफ करें ताकि केवल जानवर का सिर उजागर हो। एक stereotaxic तंत्र में चूहे के सिर प्लेस, महान देखभाल के साथ कान नहरों में कान सलाखों डालने तो नाक दबाना कस. स्टीरियोटैक्सिक उपकरण पर धारक हाथ के लिए एक 26 जी स्टेनलेस स्टील गाइड cannula को ठीक करें।
  5. स्थानीय रूप से bupivacaine (1.5 mg/kg) और lidocaine (1.5 mg/kg) के एक संवेदनाहारी कॉकटेल इंजेक्शन से पहले सिर पर subcutaneously इंजेक्ट करें.
  6. सोडियम आइसोफ्लुरेन (2.5%) वितरित करके पूरी प्रक्रिया के दौरान संज्ञाहरण बनाए रखें एक नाक शंकु के साथ 0.5 L/min ऑक्सीजन प्रवाह पर.
  7. खोपड़ी के साथ खोपड़ी के साथ एक मिडलाइन चीरा (3 सेमी) बनाएं। चीरा के आसपास 4 clamps स्थापित करके खोपड़ी स्पष्ट छोड़ दें.
  8. ब्रेग्मा और लैम्ब्डा टांके दिखाई देने तक एक सर्जिकल ब्लेड के साथ खोपड़ी से पेरिओस्टेम को मजबूती से स्क्रैप करें। खून बह रहा है, तो एक धुंध पैड या कपास टिप applicator के साथ खोपड़ी पर फर्म दबाव बनाए रखें।
  9. यदि खोपड़ी सही ढंग से Bregma और Lambda टांके के dorsoventral निर्देशांक की तुलना करके स्टीरियोटैक्सिक तंत्र पर गठबंधन किया है की पुष्टि करें। गाइड कैनुला के निर्देशांक के लिए संदर्भ बिंदुओं के रूप में ब्रेग्मा सीवन के एंट्रोपोस्टर, औसतदर्जे और डोर्सोवेन्ट्रल निर्देशांकों की पहचान करें।
  10. संदर्भ के रूप में Bregma सीवन निर्देशांक ले रही है, हिप्पोकैम्पस में गाइड cannula प्रत्यारोपण साइट के निर्देशांक की गणना.
    नोट: निम्नलिखित निर्देशांक पैक्सिनोस और वाटसन से चूहे मस्तिष्क एटलस के अनुसार निर्धारित किए गए थे (एंटीरोपोस्टर: -0.60 सेमी; मध्यपार्श्व: $0.58 सेमी; डोर्सोवेन्ट्रल: -0.16 सेमी, चित्रा 2ए)32.
  11. मार्कर का उपयोग करके सटीक प्रत्यारोपण साइट चिह्नित करें.
  12. गाइड कैनुला के लक्ष्य स्थल पर कपाल के माध्यम से एक 0.5 मिमी छेद ड्रिल. ड्रिल 3 अन्य छेद लगभग 5 मिमी इस बिंदु के आसपास धागा करने के लिए 3 लंगर शिकंजा खोपड़ी में है कि एक्रिलिक दंत सीमेंट लागू किया जाता है के बाद cannula ठोस होगा.
  13. कैनुला को हिप्पोकैम्पस में डालें और इसे दंत सीमेंट के साथ ठीक करें। इस cannula ब्याज के क्षेत्र में जांच डालने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा 7 दिन बाद microdialysis प्रक्रिया के दौरान. साइट जहां वजन गिरा दिया जाएगा चारों ओर अतिरिक्त दंत सीमेंट फैल नहीं के रूप में सावधान रहें.
  14. 2 मिनट के लिए सूखी सीमेंट छोड़ दो, तो cannula से धारक हाथ हटा दें. मस्तिष्कमेरु द्रव रिसाव और संक्रमण के जोखिम से बचने के लिए कैनुला में एक स्टेनलेस स्टील हटाने योग्य obturator डालें।
  15. 4 clamps निकालें, वापस ले लिया त्वचा खींच और यह एक शल्य सीवन धागा 4-0 के साथ सिलाई.
  16. उपकरण से चूहे को निकालें और दर्द का इलाज करने के लिए ब्यूप्रेनोर्फिन को उप-जोड़कर इंजेक्ट करें (0.05 मिलीग्राम/किग्रा, सर्जरी के बाद फिर अगले 2 दिनों के दौरान दिन में एक बार)। के तहत एक हीटिंग पैड के साथ अपने पिंजरे में कृंतक वापस प्लेस जब तक यह होश में हो जाता है, तो यह करीब निगरानी के तहत एक 7 दिन वसूली अवधि के लिए पशु देखभाल की सुविधा के लिए वापस.

3. माइक्रोडायलिसिस प्रक्रिया

  1. माइक्रोडायलिसिस प्रक्रिया करते समय, बाँझ दस्ताने, एक बाल बोनट और एक सर्जिकल मास्क पहनते हैं। कैनुला प्रत्यारोपण सर्जरी के बाद सात दिन, सोडियम isoflurane के साथ चूहे एनेस्थेटाइज (2.5%) पर 0.5 L/min ऑक्सीजन प्रवाह.
  2. कैनुला से obturator निकालें और धीरे धीरे एक microdialysis जांच डालने, कृत्रिम मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी तरल पदार्थ (ACSF) के साथ perfused (26 mmol/L NaHCO3, 3 mmol/L NaH2PO4, 1.3 Mmol/L MgCl2, 2.3 mmol/L CaCl2, 3.0 mmol/L KCl, 126 mmol/L NaCl, 0.2 mmol/L-Ascorbic एसिड), कैनुला के माध्यम से हिप्पोकैम्पस या ब्याज के अन्य क्षेत्र में।
    नोट: चूहों को केवल obturator को हटाने और microdialysis जांच डालने के दौरान, और कंसेशन या शर्म की चोट के प्रेरण के दौरान केवल एनेस्थेटाइज किया जाना चाहिए। यहाँ इस्तेमाल की जाने वाली जांच प्रयोगशाला-निर्मित, मैं-आकार की होती है, और इसमें जुड़े हुए पक्ष-दर-साइड सिलिका इनलेट-आउटलेट लाइनें [आंतरिक व्यास (आईडी): पॉलीथीन ट्यूबिंग (आईडी: 0.58-0.38 मिमी) में शामिल हैं। कैनुला का अंत पुनर्जीवित खोखले सेलूलोज़ झिल्ली की लंबाई के साथ सुरक्षित है [आण्विक वजन कट-ऑफ: 13 केडीए, बाहरी व्यास (ओडी): 216 डिग्री सेल्सियस; आईडी: 200 [m] cyanoacrylate चिपकने वाला और टिप epoxy के साथ सील का उपयोग कर. सक्रिय झिल्ली हिप्पोकैम्पस में प्रत्यारोपण के लिए 2.5 मिमी उपाय लेकिन ब्याज के क्षेत्र की गहराई के अनुसार समायोजित किया जा सकता है. जांच के लिए चूहे के indwelling cannula के कनेक्शन एक फिट, पिरोया स्टेनलेस स्टील कॉलर के साथ सुरक्षित है.
  3. एक स्टेनलेस स्टील वसंत एक तरल कुंडा और काउंटर संतुलन लीवर हाथ एक अंगूठी स्टैंड और clamps के साथ पिंजरे के ऊपर निलंबित करने के लिए tethered करने के लिए जांच विधानसभा को ठीक इतना है कि जानवर अपने पिंजरे के भीतर स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित कर सकते हैं। Tethered चूहों पानी और भोजन के लिए ad libitum उपयोग के साथ microdialysis प्रक्रिया की पूरी अवधि खर्च करते हैं.
  4. जांच करने के लिए perfusate भेजने के लिए एक microinfusion पंप का उपयोग करें, और जुड़े सिलिका आउटलेट लाइन से डायलिससेट इकट्ठा (मृत मात्रा: 0.79 $L).
  5. प्रक्रिया शुरू होने से पहले कम से कम 1 h और 30 मिनट, जांच को अपने काम के प्रवाह की दर (1 $L/ सत्यापित करें कि जांच के प्रवाह की दर एक पिपेट के साथ समय के साथ मात्रा को मापने के द्वारा संगत है.
    नोट: प्रवाह दर अधिक या कम न्यूरोट्रांसमीटर नमूना और ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्र के आधार पर हो सकता है. डायलिसिस के नमूने से पहले लिया जाता है, के दौरान, और concussion या शर्म चोट प्रेरण के बाद. नमूना अंतराल ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्र पर निर्भर करता है, न्यूरोट्रांसमीटर विश्लेषण किया जा रहा है, विश्लेषण विश्लेषण के डायलिससेट सांद्रता, और विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान उपकरणों की संवेदनशीलता का इस्तेमाल किया. ग्लूटामेट और गाबा नमूने के लिए हिप्पोकैम्पस में यहां किए गए संग्रह चरण इस प्रकार हैं:
    1. आधार रेखा: प्रयोग की शुरुआत में, 60 मिनट के लिए 10 मिनट के अंतराल पर डायलिसिस के नमूने एकत्र.
    2. पोस्ट-कंसेशन या शर्म की चोट: कंसेशन या शर्म की चोट के बाद, एक अतिरिक्त 90 मिनट (9 नमूने) के लिए नमूने इकट्ठा।
  6. एनालाइट निम्नीकरण को रोकने के लिए 0ण्25 मोल/एल परक्लोरिक अम्ल के 1 $L के साथ पहले लोड किए गए एक अंश शीशी में प्रत्येक डायलिसेट नमूने को एकत्र करें। बाद के विश्लेषण के लिए नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें।
  7. पिछले डायलिससेट नमूने के संग्रह के बाद, एक नाक शंकु सोडियम isoflurane पहुंचाने के साथ चूहे को फिर से एनेस्थेट करना (2.5%) पर 0.5 L/min ऑक्सीजन प्रवाह.
  8. कैनुला से माइक्रोडायलिसिस जांच निकालें, ऑबटूरकोटर को फिर से डालें और फिर चूहे को पशु देखभाल सुविधा में वापस करें।

4. टक्कर उपकरण स्थापना

  1. प्रक्रिया के प्रारंभ से पहले, ठोस पीतल से कंसेशन (19 मिमी व्यास में) को दंड देने के लिए इस्तेमाल किया जाने वाला वजन 450 ग्राम का द्रव्यमान प्राप्त करने के लिए पीतल के वजन के शीर्ष पर एक धातु लूप डालें। एक ऊर्ध्वाधर polyvinyl क्लोराइड (पीवीसी) गाइड ट्यूब के अंदर 1.0 मीटर की दूरी पर प्रारंभिक ड्रिल छेद।
  2. एक तेज उस्तरा ब्लेड के साथ एक एल्यूमीनियम शीट भट्ठा. slotted एल्यूमीनियम शीट पीतल के वजन से सिर प्रभाव के बाद अपने शरीर के त्वरण के साथ हस्तक्षेप के बिना चूहे (295 से 351 ग्राम) के वजन का समर्थन करना चाहिए.
  3. एक यू के आकार Plexiglas फ्रेम करने के लिए कसकर slotted एल्यूमीनियम शीट टेप (38 सेमी लंबी x 27 सेमी चौड़ा x 30 सेमी गहरा, चित्रा 3A,B)कि एक फोम कुशन शामिल (37 सेमी लंबी x 26 सेमी चौड़ा x 12 सेमी गहरा).
  4. एक पीवीसी गाइड ट्यूब (20 मिमी व्यास x 1.5 मीटर लंबाई) के तहत Plexiglas फ्रेम स्थिति.
  5. स्लॉटेड एल्यूमीनियम के ऊपर 3.5 सेमी एक क्लैम्प स्टैंड के साथ पीवीसी गाइड ट्यूब को जगह में पकड़ो।
  6. धातु पाश के माध्यम से एक नायलॉन मक्खी मछली पकड़ने लाइन (9.1 किलो, 0.46 मिमी व्यास की क्षमता) संलग्न करें ताकि वजन के नीचे स्लॉटेड एल्यूमीनियम पर 2.5 सेमी लटका हुआ है क्योंकि चूहे के प्रभाव के बाद फोम कुशन पर गिर रहा है जब कई हिट को रोकने के लिए।
  7. नाइलॉन मक्खी मछली पकड़ने लाइन दबाना स्टैंड के लिए संलग्न करें।
  8. नायलॉन मक्खी मछली पकड़ने लाइन के साथ पीवीसी ट्यूब के माध्यम से वजन ऊपर खींचो तो 1.0 मीटर पर प्रारंभिक drilled छेद के माध्यम से एक हेक्स कुंजी डालने से जगह में रहते हैं।

5. टक्कर प्रेरण

  1. डायलिसिस के नमूने संग्रह के आधारभूत चरण के बाद, एक नाक शंकु सोडियम आइसोफ्लुरेन (2.5% आइसोफ्लुरेन 0.5 एल/मिन ऑक्सीजन प्रवाह पर) को रखकर चूहे को हल्के से हल्का करके फिर से एनेस्थेटाइज करें, जब तक कि यह एक अंगुली चुटकी के लिए कोई प्रतिक्रिया नहीं के रूप में (जैसा कि खंड 3.1 में उल्लेख किया गया है)।
  2. जानवर को उसकी छाती पर स्लॉटेड एल्यूमीनियम शीट पर रखें ताकि उसका सिर सीधे पीतल के वजन के रास्ते में स्थित हो (चित्र 3C,D)। यह सुनिश्चित करने के लिए कि चूहा वजन से पहले चलने या जगा नहीं है, नाक शंकु के साथ संज्ञाहरण बनाए रखें।
  3. नाक शंकु निकालें और हेक्स कुंजी खींच. वजन पीवीसी ट्यूब के माध्यम से खड़ी गिर जाएगी और चूहे के सिर को प्रभावित. चूहे में तेजी से 180 डिग्री की वृद्धि होगी और इसकी पीठ पर भूमि होगी (चित्र 3ई) .
  4. फोम कुशन से चूहे निकालें और इसे अपने पिंजरे में अपनी पीठ पर रखें।
  5. वसूली और चोट गंभीरता का एक संकेत के रूप में सही पलटा समय को मापने के लिए एक डिजिटल टाइमर का प्रयोग करें. सही पलटा समय प्रभाव से कुल समय है जब तक कृन्तकों जाग और सहज रूप से सही खुद को सुपाच्य स्थिति से प्रवण स्थिति के लिए, या चलना शुरू करते हैं. मृत्यु, फ्रैक्चर, या रक्तस्राव के किसी भी लक्षण को नोट करें।
    नोट: प्रक्रिया को बार-बार concussions के लिए अलग अलग समय अंक पर एक ही विषय पर दोहराया जा सकता है.

6. शाम प्रेरण

  1. डायलिसिस के नमूने संग्रह के आधारभूत चरण के बाद, एक नाक शंकु सोडियम isoflurane पहुंचाने (2.5%) देकर चूहे को हल्के से हल्के से फिर से anesthetize पर 0.5 L/min ऑक्सीजन प्रवाह जब तक यह एक अंगुली चुटकी के लिए कोई प्रतिक्रिया के रूप में (जैसा कि अनुभाग 3.1 में उल्लेख किया है).
  2. जानवर को स्लॉटेड एल्यूमीनियम शीट पर अपनी छाती पर रखें ताकि उसका सिर पीतल के वजन के रास्ते में सीधे दे। सुनिश्चित करें कि चूहे कदम या जगा नहीं है बनाने के लिए नाक शंकु के साथ संज्ञाहरण बनाए रखें।
  3. नाक शंकु निकालें और हेक्स कुंजी खींच के बिना एल्यूमीनियम शीट से जानवर को हटा दें। चूहे एक तेजी से 180 डिग्री रोटेशन से गुजरना नहीं होगा.
  4. चूहे को पिंजरे में अपनी पीठ पर रखें।
  5. न्यूरोलॉजिक बहाली के एक संकेतक के रूप में सही समय को मापने के लिए एक डिजिटल टाइमर का उपयोग करें।

7. उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी

  1. न्यूरोट्रांसमीटर के स्तर का निर्धारण (यानी, ग्लूटामेट और गाबा) precolumn derivatization द्वारा तेजी से जुदाई फ्लोरोसेंट का पता लगाने के साथ उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर, और एक तेजी से जुदाई autosampler और एक युग्मित पंप से मिलकर एक प्रणाली एक 3.0 x 50 मिमी 5 डिग्री मीटर विश्लेषणात्मक स्तंभ के लिए।
  2. 100 mmol/L सोडियम फॉस्फेट डाइबेसिक (Na2HPO4), 3.5% एसीटोनिल और 20% मेथनॉल के साथ एक मोबाइल चरण तैयार करें। फॉस्फोरिक एसिड के साथ 6.7 पीएच को समायोजित करें (85%) जरूरत के रूप में.
  3. प्रवाह दर को 0.5 mL/min पर सेट करें.
  4. स्टॉक समाधानों से नए दैनिक व् युतीकरण अभिकर्मकों और कार्य मानकों (100 एनजी/एमएल) तैयार करें। उन्हें नमूनों के साथ एक रेफ्रिजरेटेड (10 डिग्री सेल्सियस) तेजी से जुदाई autosampler में लोड.
  5. प्रत्येक अंश को क्रमिक रूप से विश्लेषणात्मक कॉलम में 3-मेरकैप्टोप्रोपिओनिक अम्ल (0.071 मोल/एल) के 20 डिग्री सेल्सियस के साथ मिलाकर एच2ओ और ओ-फ्थैल्डिहाइड के 20 डिग्री सेल्सियस (0ण्0143 मोल/एल) के साथ पतला 0.1 मोल/एल सोडियम टेट्राबोरेट के साथ पतला किया गया है। मिश्रण प्रतिक्रिया करने के लिए 10 मिनट की अनुमति दें.
  6. अगले नमूनों के संदूषण को रोकने के लिए, प्रत्येक इंजेक्शन के बाद मेथनॉल (20%) के साथ इंजेक्शन लूप को फ्लश करें।
    नोट: ग्लूटामेट प्रतिधारण समय का होगा 1 मिनट लगभग इस प्रोटोकॉल में, प्रत्येक नमूने के लिए 30 मिनट की कुल रन समय के लिए.
  7. क्रोमैटोग्राफी चोटियों के विश्लेषण के दौरान, ज्ञात मानकों से प्रतिधारण के समय के अनुसार मिलान नमूनों का उपयोग कर अज्ञात चोटियों की पहचान. analytes के एक्सप्रेस स्तर के रूप में $g/

8. ऊतक विज्ञान

  1. माइक्रोडायलिसिस प्रक्रिया और कंसेशन या शर्म से चोट को शामिल करने के एक महीने बाद, केटामाइन (70 मिलीग्राम/किग्रा) और जाइलेज़ीन (10 मिलीग्राम/किग्रा) का कॉकटेल इंजेक्शन लगाकर जानवरों को एनेस्थेटाइज करें और उन्हें पैराफॉर्मेल्डिहाइड (4%) द्वारा यूथेनाइज करें। और लवण इंट्राकार्डियक भ्रम।
  2. कृन्तकों को नष्ट कर ते जाते हैं, फिर दिमाग को काट देते हैं।
  3. मस्तिष्क को पैराफॉर्मेल्डिहाइड में संग्रहीत करें (4%) और बाद में उन्हें sucrose (30%) के समाधान में cryoprotect.
  4. एक cryostat के साथ 50 डिग्री मीटर के कोरोनल वर्गों में दिमाग स्लाइस.
  5. चोट और जांच प्लेसमेंट (निस्ल धुंधला) के हिस्टोलॉजिकल सत्यापन के लिए क्रेसिल वायलेट के साथ मस्तिष्क स्लाइस दाग।

Representative Results

कंसेशन के हमारे मॉडल का उपयोग करना जो विवो सेरेब्रल माइक्रोडायलिसिस में बल और रोटेशन को जोड़ती है, तीव्र एक्स्ट्रासेलुलर ग्लूटामेट और गाबा एक कंसेशन या शर्म की चोट के बाद समय के साथ परिवर्तन 21 पुरुष, वयस्क, Sprague-Dawley चूहों में जांच की गई हिप्पोकैम्पस के CA1 क्षेत्र में एक गाइड कैनुला का प्रत्यारोपण।

जांच प्लेसमेंट और चोट का हिस्टोलॉजिकल सत्यापन
cresyl बैंगनी के साथ दाग वर्गों पर हिप्पोकैम्पस ऊतक क्षति के हिस्टोलॉजिकल सत्यापन के बाद इस तरह के बड़े पैमाने पर इंट्रासेब्रल हेमोरेज या contusions के रूप में कोई रूपात्मक परिवर्तन की सूचना दी गई। गाइड cannula प्रत्यारोपण और microdialysis जांच प्रविष्टि प्रेरित मामूली और घायल और शर्म के मामलों के बीच इसी तरह के नुकसान. इसके अलावा, शम चोट या कंसेशन प्रेरण से ठीक पहले जांच को हटाने से कोई भेद हिप्पोकैम्पस ऊतक क्षति नहीं हुई जैसा कि क्रमशः एक माइक्रोस्कोप के तहत देखा गया था (चित्र 2 बी,सी, क्रमशः, जांच की झिल्ली के साथ अभी भी बरकरार है बाद में (चित्र 2 डी,ई)। टक्कर और शर्म की चोट दिमाग paraformaldehyde के साथ perfused (4%) 1 महीने के बाद microdialysis प्रक्रियाओं दृश्य निरीक्षण पर अविवेच्य हैं (चित्र 2 F,जी)

राइटिंग रिफ्लेक्स समय
घायल समूह से पशु औसत बनाम शर्म मामलों पर एक काफी बढ़ सही समय था (छात्र के टी परीक्षण, p $ 0.042801) (चित्र 4) और होश में आ गया पर दंग रह गए. कंसेशन समूह से 10 मामलों में से, एक जानवर वजन ड्रॉप के बाद प्रभाव साइट के तहत खून बह रहा के मामूली लक्षण दिखाया. खोपड़ी फ्रैक्चर या इंट्राक्रैनियल रक्तस्राव के कोई अन्य लक्षण नहीं पाए गए।

विवो सेरेब्रल माइक्रोडायलिसिस में
हमारी विधि के प्रतिनिधि परिणामों के रूप में कार्य करने के लिए, डायलिसेट के पंद्रह 10 डिग्री एल नमूने हिप्पोकैम्पस से निकाले गए थे, विवो में, 10 मिनट के अंतराल पर और 1 $L/min. ग्लूटामेट और गाबा के अतिरिक्त कोशिका स्तर आधार रेखा के दौरान 6 नमूनों से मापा गया था ( 60 मिनट) और 9 नमूनों से शम चोट या कंसेशन (90 मिनट) के प्रेरण के बाद.

ग्लूटामेट की बाह्य सांद्रता
शम चोट की तुलना में आघात को शामिल करने के बाद पहले 10 मिनट के दौरान हिप्पोकैम्पस के सीए 1 क्षेत्र में बाह्य ग्लूटामेट सांद्रता में महत्वपूर्ण वृद्धि देखी गई (मैन-व्हिटनी यू टेस्ट, पी $ 0.009175) (चित्र 5)। किसी भी अन्य समय बिंदु पर समूहों के बीच ग्लूटामेट सांद्रता में कोई अन्य अंतर नहीं देखा गया।

गाबा के extracellular सांद्रता
गाबा सांद्रता में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं देखा गया हिप्पोकैम्पस के CA1 क्षेत्र में पहले 10 मिनट के दौरान आघात के प्रेरण के बाद शर्म की चोट की तुलना में (मैन-व्हिटनी यू टेस्ट, p ] 0.943861) (चित्र 6) . कंसेशन मामलों और शर्म की चोट के मामलों के बीच किसी भी अन्य समय बिंदु पर गाबा सांद्रता में कोई अन्य महत्वपूर्ण अंतर नहीं था.

Figure 1
चित्र 1: अनुसंधान प्रोटोकॉल की योजनाबद्ध रूपरेखा। यह आंकड़ा IO Masse 2018 से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: जांच प्लेसमेंट और चोट का हिस्टोलॉजिकल सत्यापन। (ए) माइक्रोडायलिसिस जांच का कोरोनल दृश्य और पाक्सिनोस और वाटसन के स्टीरियोटैक्सिक एटलस का उपयोग करके हिप्पोकैम्पस में कैनुला प्लेसमेंट साइट का मार्गदर्शन करें। (बी) हिप्पोकैम्पस ऊतक क्षति के प्रतिनिधि फोटोमाइक्रोग्राफ (क्रेसिल वायलेट) एक माइक्रोडायलिस जांच द्वारा उत्पादित और एक शर्म की चोट के मामले से cannula गाइड. (ग) हिप्पोकैम्पस ऊतक क्षति (क्रेसिल वायलेट) के प्रतिनिधि फोटोमाइक्रोग्राफ एक माइक्रोडायलिस जांच द्वारा उत्पादित और एक भ्रम के मामले से cannula गाइड. (घ) कंसेशन को शामिल करने से पहले माइक्रोडायलिसिस जांच का प्रतिनिधि फोटोमाइक्रोग्राफ। (ई) कंसेशन को शामिल करने के बाद माइक्रोडायलिसिस जांच का प्रतिनिधि फोटोमाइक्रोग्राफ। झिल्ली अभी भी बरकरार है. (एफजी) . एक शर्म की बात है (एफ) और concussion (जी) के प्रतिनिधि photomicrograph 4% paraformaldehyde के साथ भ्रम के बाद मस्तिष्क को चोट या concussion प्रक्रिया के बाद 1 महीने में घायल. दृश्य निरीक्षण पर, 2 दिमाग अविवेच्य हैं. यह आंकड़ा IO Masse 2018 से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: टक्कर तंत्र और microdialysis उपकरणों आवश्यक घटक चित्रण. (ए) चूहे के स्तर के ऊपर स्थित गिरने वाले वजन के लिए एक ऊर्ध्वाधर पॉलीविनाइल क्लोराइड (पीवीसी) गाइड ट्यूब, Plexiglas फ्रेम, फोम कुशन, कंप्यूटर नियंत्रित माइक्रोइन्फ्यूजन पंप, गैसटाइट सिरिंज, तरल के लिए एक ऊर्ध्वाधर polyvinyl क्लोराइड (पीवीसी) गाइड ट्यूब के शामिल पूरे विधानसभा की एक तस्वीर कुंडा, और साथ-साथ जुड़े सिलिका इनलेट-आउटच लाइनों। (बी) सभी प्रासंगिक आयामों के साथ Plexiglas फ्रेम और फोम कुशन के Schematic प्रतिनिधित्व. (सी) एल्यूमीनियम पन्नी के स्लॉटेड टुकड़े की एक तस्वीर जो फोम कुशन के ऊपर चूहे चरण के रूप में कार्य करती है। (घ) गिरते वजन से सिर के प्रभाव से ठीक पहले मंच पर चूहे की स्थिति को दर्शाने वाली एक तस्वीर। (ई) एक तस्वीर सिर के प्रभाव के बाद चूहे दिखा, सिर प्रभाव और आगामी त्वरण और रोटेशन के बाद चूहे के शरीर के 180 डिग्री क्षैतिज रोटेशन का चित्रण. यह आंकड़ा IO Masse 2018 से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: सही समय. चूहों द्वारा लिए गए समय के हिस्टोग्राम अभ्यावेदन संवेदनाहारी से जागृत होने के लिए और सुपाच्य स्थिति से प्रवण स्थिति में फ्लिप करने के लिए या कंसेशन (लाल हीरे, n ] 10) या शर्म की चोट (नीले वर्गों, n ] 11) के बाद चलना शुरू करते हैं। कंसेशन समूह से चूहे काफी लंबे समय तक खुद को सही करने के लिए शर्म की चोट समूह की तुलना में ले लिया. माध्य मान प्रत्येक ग्राफ़ में क्षैतिज रेखा के रूप में प्रदर्शित होते हैं। * पी और 0.05, * पी और lt; 0.01, * * पी और lt; 0.001. यह आंकड़ा IO Masse 2018 से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: ग्लूटामेट की बाह्य सांद्रता। बेसलाइन (60 मिनट) के दौरान हिप्पोकैम्पस में माइक्रोडायलिसिस द्वारा मापा जाने वाला ग्लूटामेट (जेडजी/एमएल) की अंतरकोशिका सांद्रता का मतलब और कंसेशन (लाल हीरे, n $ 10) या शर्म की चोट (नीले वर्गों, n ] 11) शर्तों (90 मिनट) के बाद। त्रुटि पट्टियाँ माध्य की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं. * पी एंड एलटी; 0.05, * * पी एंड एलटी; 0.01, * * पी एंड एलटी; 0.001। यह आंकड़ा IO Masse 2018 से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: गाबा के अतिरिक्त कोशिकीय सांद्रता. आधार रेखा के दौरान हिप्पोकैम्पस में माइक्रोडायलिसिस द्वारा मापा गया गाबा (जेडजी/एमएल) की अंतरकोशिका सांद्रता का मतलब (60 मिनट) और कंसेशन के बाद (लाल हीरे, n $ 10) या शर्म की चोट (नीले वर्गों, n $ 11) शर्तों (90 मिनट)। त्रुटि पट्टियाँ माध्य की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं. * पी एंड एलटी; 0.05, * * पी एंड एलटी; 0.01, * * पी एंड एलटी; 0.001। यह आंकड़ा IO Masse 2018 से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम
विश्वसनीय परिणामों के उत्पादन के लिए, इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम विशेष ध्यान देने की आवश्यकता है. कैनुला प्रत्यारोपण सर्जरी के दौरान, आवश्यक से अधिक सीमेंट का उपयोग करने से बचें, खासकर जब यह प्रभाव साइट पर फैल को रोकने के लिए बहुत तरल है। प्रत्यारोपण साइट को अवरोधित करने से बचने के लिए, एक obturator कि cannula के रूप में एक ही लंबाई है का उपयोग करें. माइक्रोडायलिसिस प्रक्रिया के दौरान, जांच को कैनुला में धीरे-धीरे डालें और सुनिश्चित करें कि इसे पूरी तरह से डायलिससेट नमूने के लिए डाला गया है। कंसेशन प्रेरण से पहले, सुनिश्चित करें कि एल्यूमीनियम शीट ठीक से एक तेज उस्तरा ब्लेड के साथ slotted है. अन्यथा, पीतल के वजन से प्रभाव एल्यूमीनियम शीट चीर करने के लिए पर्याप्त नहीं होगा और चूहे एक 180 डिग्री रोटेशन के दौर से गुजर रहा है और उसकी पीठ पर उतरने के बजाय छाती नीचे रहेगा. यदि यह मामला है, प्रेरित चोटों कुंद प्रभाव से परिणाम होगा, नहीं विपरीत क्या खुले-स्कॉल वजन ड्रॉप मॉडल में देखा जाता है और काफी अधिक गंभीर हो. कंसेशन प्रेरण के दौरान, वजन के साथ कैनुला को प्रभावित करने से बचें क्योंकि इससे चूहे की खोपड़ी को गंभीर नुकसान होगा। प्रयोग के दौरान हेरफेर त्रुटियों को प्रतिबंधित करने के लिए 2 की टीमों में काम करने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है।

संशोधन और समस्या निवारण
माइक्रोडायलिसिस प्रक्रिया के दौरान, प्रवाह स्थिर होना चाहिए और जांच पंप से जुड़ा होने के बाद, अपफ्यूजन की दर के लिए उपयुक्त मात्रा प्राप्त करना चाहिए। कम मात्रा में जांच या लाइनों में हवा के बुलबुले की झिल्ली में clogging की उपस्थिति का संकेत कर सकते हैं. बंद करने के मामले में, जांच को खारिज कर दिया जाना चाहिए और बदल दिया जाना चाहिए। हालांकि, हवा के बुलबुले लाइनों में ACSF घूम द्वारा निकाला जा सकता है. यदि कोई clogging या हवा बुलबुले उल्लेख किया है और वहाँ अभी भी कोई प्रवाह नहीं है, अंत करने के लिए निकटतम बहिर्वाह ट्यूब का एक छोटा सा हिस्सा काटा जा सकता है.

विधि की सीमाएं
वेन स्टेट यूनिवर्सिटी वेट-ड्रॉप का उपयोग करने वालेअन्य अध्ययनों में कुछ मूलभूत संरचनात्मक और आण्विक परिवर्तनों का मूल्यांकन किया गया है। हालांकि, एक अधिक व्यापक जांच इस प्रक्रिया की वैधता बनाए रखने होगा. जैविक और neuroanatomic परिवर्तन है कि epigenetic और सेलुलर स्तर पर जगह लेने के बारे में जानकारी आगे हमारी विधि के विश्वसनीय और translational मूल्य ठोस होगा. इसके अलावा, संज्ञानात्मक समारोह का मूल्यांकन कृंतक मॉडल33में एमटीबीआई से संबंधित परिणाम का एक विश्वसनीय उपाय है। जबकि समय-से-सही इस प्रोटोकॉल में मापा गया था और शर्म मामलों की तुलना में घायल मामलों में काफी देरी हो गई थी, भविष्य में अध्ययन व्यवस्थित कृन्तकों में आघात प्रेरण के बाद संज्ञानात्मक समारोह को मापने पर ध्यान केंद्रित करना चाहिए.

मौजूदा/वैकल्पिक तरीकों के संबंध में विधि का महत्व।
विधि का मुख्य महत्व दो गुना है: सबसे पहले, यह वेन राज्य विश्वविद्यालय प्रक्रिया है, जो तेजी से त्वरण और सिर और धड़ की मंदी की अनुमति देता है के साथ एक भ्रम के सफल प्रेरण की अनुमति देता है. इस विधि के साथ, कार्डियोरेस्पेरेटरी गिरफ्तारी, खोपड़ी फ्रैक्चर, उच्च मृत्यु दर और प्रभाव स्थल पर दृश्य मस्तिष्क contusions के लक्षण के रूप में गंभीर चोट परिणामों से बचा गया. दूसरे, इस माइक्रोडायलिसिस तकनीक को सफलतापूर्वक दोहराया गया है कि पहले तीव्र और अल्पजीवी एक्स्ट्रासेलुलर ग्लूटामेट रिलीज को आघात प्रेरण14,16के बाद पहले 10 मिनट के भीतर किया जा रहा था। इसके अलावा, पूरी प्रक्रिया में डाला जांच रखने में काफी MTBI के प्रति संवेदनशील रक्त मस्तिष्क बाधा दोहराया microdialysis जांच प्रविष्टि34से जुड़े को नुकसान inducing की संभावना को कम कर देता है.

भविष्य अनुप्रयोगों या विधि के निर्देश.
वेन राज्य विश्वविद्यालय वजन ड्रॉप प्रक्रिया के आसान करने के लिए उपयोग पहलुओं और तीव्र extracellular न्यूरोट्रांसमीटर स्तर microdialysis द्वारा मापा परिवर्तन को देखते हुए, हमारे चूहे मॉडल microdialysis और कंसेशन के संयोजन शोधकर्ताओं को एक विश्वसनीय प्रदान करता है उपकरण ईमानदारी से मानव craniocerebral आघात के biomechanics पुन: पेश करता है और longitudinally concussions के आणविक प्रभाव की विशेषता. हमारे चूहे मॉडल भी चिकित्सकीय अध्ययन की एक विस्तृत विविधता में इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में यह तंत्र और vivo में फार्माकोलॉजिक एजेंटों की प्रभावकारिता का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान अवसर प्रदान करता है, लगातार और जानवर का बलिदान करने के लिए बिना. इसके अलावा, इस तरह के एक यहाँ प्रस्तुत के रूप में एक चूहे मॉडल की उपलब्धता बहुत न्यूरोट्रांसमीटर असंतुलन और concussions के व्यवहार परिणामों के बीच संबंधों की बेहतर समझ की सुविधा सकता है.

Disclosures

कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित मौजूद नहीं हैं।

Acknowledgments

हम पशु देखभाल और रखरखाव के लिए लुई Chiocchio के लिए आभारी हैं, Intracardiac perfusion प्रक्रिया के साथ सहायता के लिए Morgane Regniez, और cryostat के साथ सहायता के लिए डेविड Castonguay. यह काम Universite डे मॉन्ट्रियल LDB को सम्मानित की तीव्र आघात विज्ञान में कैरोलीन Durand फाउंडेशन अध्यक्ष द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Animal Preparation
Sprague Dawley Rats Charles River Laboratories SAS SD 40
Name Company Catalog Number Comments
Microdialysis Guide Cannula Implantation Surgery
Ketamine Hydrochloride (100 mg/ml) Bioniche 1989529
Xylazine Hydrochloride (100 mg/ml) Bimeda 8XYL004C
Solution of Chlorhexidine Gluconate 2% and Isopropyl Alcohol 2% Carefusion 260100C
Lidocaine Hydrochloride Alveda Pharma 0122AG01
Bupivacaine Hydrochloride Hospira 1559
Ophthalmic Ointment Baussh and Lomb inc. 2125706
Stereotaxic Frame Stoelting 51600
Stereotaxic Cannula Holder Arm Harvard Apparatus 72-4837
Drill Dremel 8050-N/18
Suture Thread Coated Vicryl Rapide 4-0 Ethicon VR2297
Dental Acrylic Cement Harvard Apparatus 72-6906
Screws JI Morris Company P0090CE125
Isoflurane Baxter CA2L9100
Cannula Gauge 20 10.55mm HRS Scientific C311G/SPC
Dummy-Cannula 10.55mm HRS Scientific C311DC/1/SPC
Name Company Catalog Number Comments
Microdialysis Procedure
CMA 402 Syringe Pump Harvard Apparatus Canada CMA-8003110
Microsyringe 2.5ml Glass Harvard Apparatus Canada CMA-8309021
Syringe Clip Medium For 1-2.5ml Harvard Apparatus Canada CMA-3408310
Low-Torque Dual Channel Quartz-Lined Swivel Instech Laboratories Inc. 375/D/22QM
GSC Cast Iron Support Ring Stand Fisher Scientifique S13748
Fisherbrand Castaloy Adjustable-Angle Clamps Fisher Scientifique 05769Q
NaHCO3 Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich Canada S5761-500G For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
MgCl2 Magnesium Chloride Sigma-Aldrich Canada M8266-100G For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
NaCl Sodium Chloride Sigma-Aldrich Canada S7653-1KG For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
L-Ascorbic Acid Sigma-Aldrich Canada A5960-25G For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
KCl Potassium Chloride Sigma-Aldrich Canada P9333-500G For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
NaH2PO4 Sodium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich Canada S0751-1KG For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
CaCl2 Calcium Chloride Sigma-Aldrich Canada 383147-100G For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
Lighter Canadian Tire For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Epoxy Glue Canadian Tire For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Super Glue Gel Canadian Tire For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Heat Shrink Tube 0.063" Inner Diameter Gardner Bender Canadian Tire For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Cut-Off Wheels Dremel #409 Canadian Tire For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
BD Needle 26 Gauge 0.5 Inch PrecisionGlide Sterile 305111 Fisher Scientifique 14-826-15 For Laboratory Constructed Probes
BD Needle 21 Gauge 1.5 Inch PrecisionGlide Sterile 305167 Fisher Scientifique 14-826-5B For Laboratory Constructed Probes
26G Stainless Steel Tubing One Foot HRS Scientific SST-26/FT For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/20 .024" OD X .015" ID HRS Scientific C315CT For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/10 .024" OD X .011" ID HRS Scientific C314CT For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/50 .038" OD X .023" ID HRS Scientific C313CT For Laboratory Constructed Probes
30S WIRE ST.ST 0.008X 1’ Long HRS Scientific 008BSH/30S For Laboratory Constructed Probes
Polymicro Technologies Flexible Fused Silica Capillary Tubing Inner Diameter 50µm, Outer Diameter 150µm Molex LLC Polymicro Technologies 106815-0015 For Laboratory Constructed Probes
Spectra Por 132294 Micro-Dialysis Hollow Fiber Membranes 13 kD MWCO Spectrum Labs FSSP9778671 For Laboratory Constructed Probes
Stainless Steel Collar Sirnay In.c 304 For Laboratory Constructed Probes / Custome made
Name Company Catalog Number Comments
Concussion Apparatus
Brass Weight Rapido Métal Inc. Attach metal loop to base
Metal Loop Rona Inc. Available at most hardware stores
PVC Guide Tube Rona Inc. Available at most hardware stores
Alluminum Foil Alcan Available at most grocery stores
Tape Available commercially
GSC Cast Iron Support Ring Stand Fisher Scientifique S13748
U-Shaped Plexiglas Frame Présentoirs PlexiPlus Inc. Custom made
Foam Cushion Mousse D&R Foam Inc. Custom made
Razor Blades VWR International 55411-055
Super Strong Trilene XT 20 lb. Berkley Canadian Tire Available at most hardware stores
Isoflurane Baxter CA2L9100
Stop Watch Available at most sporting goods retailer
Animal Preparation
Sprague Dawley Rats Charles River Laboratories SAS SD 40
Name Company Catalog Number Comments
Microdialysis Guide Cannula Implantation Surgery
Ketamine Hydrochloride (100 mg/ml) Bioniche 1989529
Xylazine Hydrochloride (100 mg/ml) Bimeda 8XYL004C
Solution of Chlorhexidine Gluconate 2% and Isopropyl Alcohol 2% Carefusion 260100C
Lidocaine Hydrochloride Alveda Pharma 0122AG01
Bupivacaine Hydrochloride Hospira 1559
Ophthalmic Ointment Baussh and Lomb inc. 2125706
Stereotaxic Frame Stoelting 51600
Stereotaxic Cannula Holder Arm Harvard Apparatus 72-4837
Drill Dremel 8050-N/18
Suture Thread Coated Vicryl Rapide 4-0 Ethicon VR2297
Dental Acrylic Cement Harvard Apparatus 72-6906
Screws JI Morris Company P0090CE125
Isoflurane Baxter CA2L9100
Cannula Gauge 20 10.55mm HRS Scientific C311G/SPC
Dummy-Cannula 10.55mm HRS Scientific C311DC/1/SPC
Name Company Catalog Number Comments
Microdialysis Procedure
CMA 402 Syringe Pump Harvard Apparatus Canada CMA-8003110
Microsyringe 2.5ml Glass Harvard Apparatus Canada CMA-8309021
Syringe Clip Medium For 1-2.5ml Harvard Apparatus Canada CMA-3408310
Low-Torque Dual Channel Quartz-Lined Swivel Instech Laboratories Inc. 375/D/22QM
GSC Cast Iron Support Ring Stand Fisher Scientifique S13748
Fisherbrand Castaloy Adjustable-Angle Clamps Fisher Scientifique 05769Q
NaHCO3 Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich Canada S5761-500G For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
MgCl2 Magnesium Chloride Sigma-Aldrich Canada M8266-100G For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
NaCl Sodium Chloride Sigma-Aldrich Canada S7653-1KG For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
L-Ascorbic Acid Sigma-Aldrich Canada A5960-25G For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
KCl Potassium Chloride Sigma-Aldrich Canada P9333-500G For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
NaH2PO4 Sodium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich Canada S0751-1KG For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
CaCl2 Calcium Chloride Sigma-Aldrich Canada 383147-100G For Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF)
Lighter Canadian Tire For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Epoxy Glue Canadian Tire For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Super Glue Gel Canadian Tire For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Heat Shrink Tube 0.063" Inner Diameter Gardner Bender Canadian Tire For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
Cut-Off Wheels Dremel #409 Canadian Tire For Laboratory Constructed Probes / Available at most hardware stores
BD Needle 26 Gauge 0.5 Inch PrecisionGlide Sterile 305111 Fisher Scientifique 14-826-15 For Laboratory Constructed Probes
BD Needle 21 Gauge 1.5 Inch PrecisionGlide Sterile 305167 Fisher Scientifique 14-826-5B For Laboratory Constructed Probes
26G Stainless Steel Tubing One Foot HRS Scientific SST-26/FT For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/20 .024" OD X .015" ID HRS Scientific C315CT For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/10 .024" OD X .011" ID HRS Scientific C314CT For Laboratory Constructed Probes
Polyethylene Tubing PE/50 .038" OD X .023" ID HRS Scientific C313CT For Laboratory Constructed Probes
30S WIRE ST.ST 0.008X 1’ Long HRS Scientific 008BSH/30S For Laboratory Constructed Probes
Polymicro Technologies Flexible Fused Silica Capillary Tubing Inner Diameter 50µm, Outer Diameter 150µm Molex LLC Polymicro Technologies 106815-0015 For Laboratory Constructed Probes
Spectra Por 132294 Micro-Dialysis Hollow Fiber Membranes 13 kD MWCO Spectrum Labs FSSP9778671 For Laboratory Constructed Probes
Stainless Steel Collar Sirnay In.c 304 For Laboratory Constructed Probes / Custome made
Name Company Catalog Number Comments
Concussion Apparatus
Brass Weight Rapido Métal Inc. Attach metal loop to base
Metal Loop Rona Inc. Available at most hardware stores
PVC Guide Tube Rona Inc. Available at most hardware stores
Alluminum Foil Alcan Available at most grocery stores
Tape Available commercially
GSC Cast Iron Support Ring Stand Fisher Scientifique S13748
U-Shaped Plexiglas Frame Présentoirs PlexiPlus Inc. Custom made
Foam Cushion Mousse D&R Foam Inc. Custom made
Razor Blades VWR International 55411-055
Super Strong Trilene XT 20 lb. Berkley Canadian Tire Available at most hardware stores
Isoflurane Baxter CA2L9100
Stop Watch Available at most sporting goods retailer

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 149 हल्के दर्दनाक मस्तिष्क की चोट कंसेशन सिर त्वरण विवो में सेरेब्रल माइक्रोडायलिसिस चूहा
एक उपन्यास और अनुवाद चूहा टक्कर के संयोजन बल और रोटेशन के साथ Vivo सेरेब्रल Microdialysis में
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Massé, I. O., Moquin, L.,… More

Massé, I. O., Moquin, L., Provost, C., Guay, S., Gratton, A., De Beaumont, L. A Novel and Translational Rat Model of Concussion Combining Force and Rotation with In Vivo Cerebral Microdialysis. J. Vis. Exp. (149), e59585, doi:10.3791/59585 (2019).

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