Summary
نقدم طريقة بسيطة وحساسة إلى حد ما لتحديد كمية دقيقة من كثافة القناة الصفراوية في كبد الماوس. ويمكن أن تساعد هذه الطريقة في تحديد آثار المعدلات الوراثية والبيئية وفعالية العلاجات المحتملة في نماذج الماوس من الأمراض الصفراوية.
Abstract
يستخدم الماوس على نطاق واسع ككائن حي نموذجي لدراسة الأمراض الصفراوية. لتقييم تطور ووظيفة النظام الصفراوية، يتم استخدام تقنيات مختلفة، بما في ذلك كيمياء المصل، والتحليل النسيجي، وتلطيخ المناعة لعلامات محددة. على الرغم من أن هذه التقنيات يمكن أن توفر معلومات هامة حول النظام الصفراوية، فإنها في كثير من الأحيان لا تقدم صورة كاملة من العيوب التنموية القناة الصفراوية (BD) في جميع أنحاء الكبد كله. ويرجع ذلك جزئيا إلى القدرة القوية لكبد الفأر على استنزاف الصفراء حتى في الحيوانات التي لديها ضعف كبير في التنمية الصفراوية. هنا نقدم طريقة بسيطة لحساب متوسط عدد BDs المرتبطة بكل الوريد المدخل (PV) في أقسام تغطي جميع فصوص الفئران متحولة / المعدلة وراثيا. في هذه الطريقة، يتم تركيب الكبد وتقسيمها بطريقة نمطية لتسهيل المقارنة بين مختلف الأنماط الجينية والظروف التجريبية. يتم تحديد BDs عن طريق الفحص المجهري الخفيف للخلايا الصفراوية الملطخة بالسيتوكيراتين، ثم يتم عدها وتقسيمها على العدد الإجمالي للمركبات الكهربائية الموجودة في قسم الكبد. على سبيل المثال، نبين كيف يمكن لهذه الطريقة أن تميز بوضوح بين الفئران البرية ونموذج الماوس لمتلازمة ألاجيل. الطريقة المعروضة هنا لا يمكن أن تحل محل التقنيات التي تصور بنية ثلاثية الأبعاد للشجرة الصفراوية. ومع ذلك، فإنه يوفر وسيلة سهلة ومباشرة لتقييم كمي تطوير BD ودرجة تشكيل رد الفعل القنواتي في الفئران.
Introduction
الشجرة الصفراوية هي جزء حاسم من كبد الثدييات، مما يسمح بمرور الصفراء من خلايا الكبد إلى الأمعاء. تتشكل القنوات الصفراوية داخل الكبد (BDs) من قبل الخلايا الأقنية الصفراوية، والتي تميز عن الخلايا الكبدية ثنائية القدرة من خلال الشق وTGFβ إشارة1،2. المواصفات المناسبة والالتزام من الخلايا الصفراوية وتجميعها في BDs ناضجة حاسمة لتطوير شجرة الصفراوية داخل الكبد. كما ينمو الكبد أثناء النمو أو عند تجديد الجهاز، يحتاج النظام الصفراوية لتطوير على طول الكبد لضمان الصرف الصفراويالسليم. وعلاوة على ذلك، فإن عددا من الأمراض المتلازمية وغير المتلازمية تؤدي إلى ندرة الـ BDs intrahepatic3. بالإضافة إلى ذلك، يؤدي عدد من أمراض الكبد الحادة والمزمنة إلى ما يسمى بردود الفعل القنواتية في الكبد، والتي تعرف بأنها وجود عدد كبير من الخلايا التي تعبر عن علامات الصفراوية ولكنها لا تنشأ بالضرورة من الخلايا الصفراوية أو الشكل براءة اختراعBDs 4. في اضطراب متعدد الأنظمة متلازمة ألاجيل (ALGS)، haploinsufficiency من ligand الشق jagged1 (JAG1) يؤدي إلى تشكيل BD الفقراء وركود صفراوي5،6. وقد أثبت مختبرنا مؤخرًا أن خط الماوس Jag1 heterozygousالذي تم إنشاؤه سابقًا هو نموذج حيواني لندرة BD في ALGS8. في هذا النموذج الماوس من ALGS، الخلايا الأقنية لا تزال موجودة. ومع ذلك، فإنها تفشل في الالتزام بالاندماج في ناضجة، وبراءات الاختراع BDs8. ولذلك، فإن تحليل الكبد في نموذج من ندرة BD يتطلب أكثر من وجود واضح أو غياب الخلايا الأقنية. من المهم تقييم درجة وجود الـ BDs الناضجة في الكبد بدقة.
في علم الأمراض التشريحية ، هناك طرق كمية مقبولة لتقييم ما إذا كان هناك ندرة BD9. على سبيل المثال، الدراسات على ALGS في المرضى البشر غالبا ما تحدد درجة BD إلى نسبة الوريد المدخل (PV) عن طريق تحليل ما لا يقل عن 10 أوعية المدخل لكل خزعة الكبد9،10. تحليل شكل والحضور العام أو عدم وجود BDs براءات الاختراع، جنبا إلى جنب مع كيمياء المصل، يمكن أن توفر معلومات قيمة عن تطوير BD في الفئران11،12،13. ومع ذلك، يمكن أن تفقد الفئران عددا كبيرا من BDs مع زيادة متواضعة فقط في مستوى البيليروبين المصل8. وبناء على ذلك، فإن الطريقة الكمية التي تقيّم عدد الـ BDs الموجودة لكل PV يمكن أن توفر مقياساً مباشراً أكثر لدرجة ندرة BD في الفئران. في تقرير صدر مؤخرا، قمنا بتحديد عدد BDs لكل PV عبر جميع فصوص الكبد وأبلغنا عن انخفاض كبير في نسبة BD إلى PV في Jag1 +/– الحيوانات8. خلال تحليلنا، لاحظنا أنه على الرغم من التباين الكبير في درجة الاستجابة الالتهابية وردود الفعل القنواتية، فإن نسبة BD إلى PV لا تظهر الكثير من التباين8. وعلاوة على ذلك، فإن التحديد الكمي لنسبة BD إلى PV سمح لنا بإثبات أن إزالة نسخة واحدة من جين جليكوسيلترانسفيراز Poglut1 في Jag1+/– يمكن للالحيوانات أن تحسن بشكل كبير من ندرة BD8. في خلفية Jag1+/+ ، يؤدي فقدان Poglut1 المشروط في خلايا العضلات الملساء الوعائية إلى زيادة تدريجية في أعداد BD، وهو أمر متواضع (20-30٪) في P7 ولكن يصبح بارزا في البالغين8. مرة أخرى، سمحت لنا هذه التقنية لإظهار أنه حتى في P7، فإن الزيادة في كثافة BD في هذه الحيوانات كبيرة إحصائيا. وتجدر الإشارة إلى أن زيادة كثافة BD في هذا النمط الجيني في أربعة أشهر من العمر تم التحقق من صحتها من خلال تحليل الراتنج المدلى بها أيضا. 8 هذه الملاحظات وغيرها من التقارير التي تقيس كثافة BD في مختلف نماذج الماوس ALGS14،15 دفعتنا إلى دمج هذه الطريقة في استراتيجيتنا الشاملة لتحليل العيوب الصفراوية في مختلف المتحولين والفئران المعدلة وراثيا.
هنا، ونحن بالتفصيل تقنية واضحة التي يمكن استخدامها لدراسة درجة ندرة BD في نماذج الماوس من أمراض الكبد (الشكل1). في هذه الطريقة، يتم استخدام التلطيخ المشترك مع علامات الخلايا الصفراوية سيتوكيراتين (CK) 8 و CK19 (فيما بعد CK واسعة الطيف، wsCK) لتصور BDs والخلايا الأقنية غير المدمجة في كبد الماوس. يتم إضافة جسم مضاد ضد أكتين العضلات ألفا الملساء (αSMA) إلى تلطيخ لعلامات السفن. التحليل المنهجي لنسبة BD إلى PV في قسم يغطي جميع فصوص الكبد يضمن تحليل عدد كبير من PVs لكل النمط الجيني. وبما أن أسلوبنا يعتمد على قياس الـ BDs وPVs في الصور ذات الأبعاد الـ 2، فإنه ليس مناسبًا لدراسة آثار طفرة معينة على البنية ثلاثية الأبعاد للشجرة الصفراوية أو سلامة القنوات الصفراوية الصغيرة. ومع ذلك، فإنه يوفر استراتيجية بسيطة وموضوعية للمحققين لتقييم التطور الصفراوية في الماوس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إيواء جميع الحيوانات في منشأة حيوانية حاجزة في كلية بايلور للطب وفقاً للمبادئ التوجيهية للجنة رعاية الحيوانات واستخدامها المؤسسية وبموجب بروتوكولات الحيوانات المعتمدة.
1. مجموعة من أنسجة الكبد الماوس
-
إعداد الماوس لحصاد الكبد
- قتل الفأر باستخدام الأيسوفلوران.
- إجراء خلع عنق الرحم للماوس لضمان الوفاة.
- قم بعمل شق عرضي ببوصة واحدة تقريبًا تحت القفص الصدري.
- كشف كامل السطح البطني للكبد.
-
جمع كبد الماوس
- بعناية، مع مقص صغير، وقطع من خلال الأربطة التي تربط الكبد إلى أجهزة أخرى في البطن.
- قطع من خلال BD المشتركة لفصل الكبد من الأمعاء.
- إزالة الكبد بعناية عن طريق التمسك المرارة ووضع على الفور في أنبوب 50 مل شغلها إلى ثلاثة أرباع من قبل 4٪ بارافورمالدهايد (PFA).
2. تثبيت وتضمين الكبد في البارافين
-
تثبيت
- إصلاح أنسجة الكبد لمدة 48 ساعة في 4٪ PFA في 4 درجة مئوية.
- غسل الأنسجة مع EtOH 70٪ لمدة 1 ساعة في 4 درجة مئوية.
- اغسل الأنسجة مرتين مع 95٪ EtOH لمدة 1 ساعة لكل منهما عند 4 درجة مئوية.
- اغسل الأنسجة مرتين مع EtOH 100٪ لمدة 1 ساعة لكل منهما عند درجة حرارة 4 درجة مئوية.
-
مسح
- غسل أنسجة الكبد معوكيل المقاصة (جدول المواد) ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: يجب أن يشعر الكبد جامدة بعد الغسيل الثالث.
- غسل أنسجة الكبد معوكيل المقاصة (جدول المواد) ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة.
-
التضمين في البارافين
- وضع كاسيت الأنسجة في قالب الأنسجة في شمع البارافين لمدة 3 مشهي، 30 دقيقة لكل منهما. يجب تسخين الشمع إلى 60 درجة مئوية.
- ملء قالب الأنسجة مع الشمع البارافين إلى ارتفاع ثلاثة أرباع والحفاظ على كتلة التدفئة في 60 درجة مئوية.
- ضع الكبد في القالب مع الجانب البطني الذي يواجه.
- إزالة بعناية القالب من كتلة التدفئة.
- ضع الجزء العلوي من الكاسيت على القالب وأعلى قبالة مع البارافين السائل الساخن.
- السماح للقالب وكتلة لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
ملاحظة: يمكن الآن تخزين كتل الأنسجة في درجة حرارة الغرفة.
3. تقسيم أنسجة الكبد
-
إعداد الكتلة للتقسيم
- ضع القالب على الثلج لمدة 5 دقائق قبل إزالة الكتلة من القالب.
- وضع كتلة على الجليد مع ورقة الأنسجة مختبر موجودة بين كتلة والجليد.
- الحفاظ على كتلة على الجليد عندما لا تقسيم للحصول على أفضل نتائج تقطيع الأنسجة.
-
تقسيم كتل الكبد
- باستخدام ميكروتومي، تبدأ عن طريق تقسيم من خلال سطحية، الجانب الظهري من الكبد. يجب أن تكون المقاطع 5 ميكرومتر.
- تحقق من المقاطع السطحية تحت مجهر تشريح للتأكد من أن المقاطع لا يتم استئصالها أو طيها.
- خذ قسماً من الكبد يتضمن الفص الكاوي.
ملاحظة: لبعض الكتل، سيكون لديك الفصوص اليسرى، الوسيطة، اليمنى وcaudate على نفس شريحة الأنسجة. - بالنسبة لتلك الكتل حيث جميع الفصوص الأربعة غير موجودة على نفس الشريحة، استمر في تقطيعها حتى توجد الفصوص اليسرى والوسيطة واليمنى على نفس الشريحة.
4. الكيمياء المناعية لwsCK وαSMA
-
معالجة الشرائح للكيمياء المناعية
- حدد شريحة واحدة لكل نمط جيني ليتم تحليلها.
- غسل الشريحة لمدة 15 دقيقة في إكسيلين، 100٪ EtOH، 95٪ EtOH وأخيرا 70٪ EtOH (3 × 5 دقيقة في كل حل).
- غسل الشريحة لمدة 5 دقائق في منزوع الأيونات H2O.
- تزج الشريحة في محلول استرداد مستضد (يستند إلى تريس، وارتفاع درجة الحموضة).
- الحرارة تحت الضغط في طنجرة الضغط لمدة 3 دقائق في 10 رطل لكل بوصة مربعة.
- السماح للشريحة لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة (حوالي 35 دقيقة).
-
حجب أقسام الأنسجة
- باستخدام قلم باب، قم بمخطط للمقاطع على الشريحة.
- تطبيق الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) + 0.1٪ توين لتغطية القسم مرتين، 5 دقائق لكل منهما.
- جعل حظر العازلة عن طريق خلط مصل الماعز العادي (NGS) في 1:50 في PBS + 0.3٪ تريتون. للحصول على المخزن المؤقت الكافي لكل من حظر وتطبيق الأجسام المضادة الأساسي، 100 μL لكل مقطع كافية.
- تطبيق 100 درجة مئوية من حل حظر لكل مقطع.
- احتضان الشرائح المغطاة بمحلول الحظر عند درجة حرارة 4 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
-
تلطيخ لwsCK وαSMA
- تخفيف الأجسام المضادة لمكافحة CK8 ومكافحة CK1916 (الدراسات التنموية Hybridoma البنك، TROMA-I و TROMA-III، على التوالي) 1:20 في حجب العازلة لوصمة عار لwsCK. تمييع الأجسام المضادة لαSMA17 (جدول المواد) إلى 1:200 في نفس المخزن المؤقت.
- تطبيق 100 درجة مئوية من محلول الأجسام المضادة المخففة التي تحتوي على جميع الأجسام المضادة الثلاثة لكل قسم.
- احتضان الشرائح المغطاة بمحلول الأجسام المضادة عند درجة حرارة 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- غسل الشرائح مع PBS + 0.1٪ تريتون ثلاث مرات، 5 دقيقة لكل منهما.
- تمييع الأجسام المضادة الثانوية (المضادة للفئران اليكسا488 ومكافحة الماوس-Cy5) 1:200 في PBS + 0.3٪ تريتون.
- تطبيق 100 درجة مئوية من محلول الأجسام المضادة الثانوي الذي يحتوي على كلا الأجسام المضادة الثانوية على الشرائح.
- الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
-
DAPI تلطيخ نووي وتصاعد
- غسل الشرائح ثلاث مرات، 5 دقائق لكل منهما.
- تطبيق 100 € L من DAPI (1:3000) على كل قسم لمدة 10 دقائق.
- تطبيق Antifade تصاعدالمتوسطة (جدول المواد) على الشرائح ووضع غطاء زجاجي على رأس أقسام الأنسجة. اترك الشرائح عند درجة حرارة 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. أغلق الشرائح في اليوم التالي.
- تخزين الشرائح في 4 درجة مئوية والصورة في غضون أسبوع واحد من تصاعد.
5. التصوير والقياس الكمي للـ BDs
-
تصوير أقسام الكبد
- قبل التصوير، أعمى نفسك إلى النمط الجيني للعينة بمساعدة من عضو المختبر. تأكد من خلو جميع ملفات التصوير من نوع جيني أو معلومات تعريف محددة أخرى إلى جانب رقم الحيوان/العينة.
- باستخدام المجهر الفلورسنت، واتخاذ الصور 20X في التكبير 1X من كل قسم وضمان أن يتم تصوير كل PV عبر الكبد. وتشمل الفصوص اليسرى والوسيطة واليمينية والقوقازية.
ملاحظة: عادة ما نجد 60-90 المسالك المدخل لكل الحيوان اعتمادا على حجم الكبد. - لتحديد هوية PVs، ابحث عن αSMA بالإضافة إلى تلطيخ wsCK. الهياكل التي هي αSMA إيجابية ولكن تفتقر إلى تلطيخ wsCK ليست هياكل المدخل.
-
تحديد وإحصاء الـ BDs
- إنشاء جدول بيانات بالأعمدة التالية: رقم الحيوان/العينة ورقم الصورة وعدد أجهزة المعالجة للنوم وعدد BDs.
- من خلال كل صورة، وتحديد وتسجيل عدد من أجهزة الدفع الرباعي لكل صورة.
- تحديد BDs براءات الاختراع في كل صورة من خلال وجود الخلايا الأقنية (wsCK +) المحيطة لومن قابلة للتحديد. يجب أن تكون الهياكل متميزة ومفصولة من قبل mesenchyme من خلايا wsCK + الأخرى.
- عد كل براءة اختراع BD ووضعها في نفس العمود مثل رقم الصورة.
- قم بذلك لكل صورة مأخوذة من PV.
- حساب مجموع جميع PVs وجميع BDs في عينة الكبد.
- حساب نسبة BD إلى PV لعينة الكبد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
قمنا بتوثيق العيوب الصفراوية في Jag1+/- الحيوانات، نموذج الماوس من ALGS8. لتحديد نسبة BD إلى PV، قمنا بقسم كبد الماوس P30 وشاركفي تلوينها لCK8 و CK19 (wsCK) جنبا إلى جنب مع علامة الأوعية الدموية αSMA. ثم قمنا بتصوير جميع أجهزة الدفع الرباعي في كل فصوص من فصوص الكبد. كما هو موضح في الشكل 2A، قمنا بتعريف PVs على أنها سفن ملطخة αSMA التي لديها تلطيخ wsCK المجاورة (رؤوس الأسهم). كانت الهياكل الملطخة αSMA دون wsCK الأوردة المركزية ولا ينبغي أن تدرج في التحليل (السهم).
وبمجرد تحديد PVs، حددنا BDs براءات الاختراع بشكلها المميز. كما هو مبين في الشكل 3، قنوات براءات الاختراع لديها تجويف واضح الوضوح الذي تحيط به wsCK + الخلايا الأقنية. وعادة ما يتم فصل القنوات من القنوات القريبة أو الخلايا الأقنية من قبل mesenchyme (رأس السهم). لا يتم حساب الخلايا wsCK+ التي لا تحتوي على تجويف قابل للتعريف، أو متصلة بالخلايا المجاورة، أو تظهر في عزلة، نحو العدد الإجمالي للBDs (الأسهم). ويبين الشكل 3A قسم الكبد البرية من نوع مع PV الذي يرتبط مع قناة براءات الاختراع تماما جنبا إلى جنب مع العديد من الخلايا غير المدمجة. الشكل 3B هو قسم الكبد ممثل من P30 Jag1 +/– الحيوان. لا توجد أجهزة BDs براءات الاختراع حول PVs الثلاثة في هذا القسم. جميع خلايا wsCK+ غير مدمجة وبالتالي لا ينبغي حسابها. تسلط هذه الصورة الضوء على أهمية العد الدقيق BD، حيث أن وجود أو غياب خلايا wsCK+ لا يميز Jag1+/- والكبد البري.
كما هو موضح في الشكل 1D، تحليل نسبة BD إلى PV ينطوي على عد كل PV في قسم الكبد جنبا إلى جنب مع العدد الإجمالي لBDs براءات الاختراع الموجودة حول كل PV. أثناء تحليل Jag1 +/– الكبد, لاحظنا أن الفصوص المختلفة لا تتأثر بالضرورة إلى نفس القدر في هذه الحيوانات (البيانات غير المنشورة). لذلك، نحن عادة ما نحسب PVs عبر الفصوص اليسرى والوسيطة واليمينية والقوقازية لضمان تغطية الكبد الكاملة. بعد جدولة إجمالي PVs وBDs، يتم حساب النسبة للمقطع بأكمله.
في الشكل 4، أظهرنا تحليل نسب BD إلى PV لـ 3 من النوع البري و3 Jag1+/- الحيوانات. يوضح هذا الرسم البياني كيف يمكن تمييز النمطين الجينيين بسهولة استنادًا إلى عدد BD. بالإضافة إلى ذلك، توفر هذه الطريقة مقياسا كميا لتحليل درجة الإنقاذ من Jag1 +/- النمط الظاهري عن طريق التلاعب الوراثي، كما ذكر سابقا8.
الشكل 1: مخطط العملية التجريبية. (أ) يتم حصاد الكبد كله من الماوس. (ب) يتم إصلاح عينات الكبد لمدة 48 ساعة، والمجففة وتطهيرها. (C) يتم تضمين أنسجة الكبد في البارافين. يتم إجراء المقاطع ووضعها على الشرائح المشحونة وملطخة لwsCK وαSMA. (D) يتم تصوير الشرائح، ويتم تسجيل عدد أجهزة الدفع الرباعي وBDs. يتم حساب نسبة BD إلى PV (BD:PV) لقسم الكبد بأكمله. HA = الشريان الكبدي. السيرة الذاتية = الوريد المركزي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تمييز الأوردة المركزية عن PVs. (أ) يتم تحديد PV من خلال وجود تلطيخ αSMA والمناطق المحيطة wsCK + الخلايا الأقنية (رؤوس الأسهم). (ب) يتم تحديد الأوردة المركزية من خلال وجود تلطيخ αSMA مع عدم وجود wsCK + الخلايا الأقنية الموجودة حول الهيكل (السهم). (أ' و ب) صور تدرج الرمادي التي تظهر قنوات αSMA من A و B على التوالي. شريط مقياس = 100 درجة مئوية وينطبق على جميع اللوحات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحديد بطاقات التعريف البراءات. (A-A') في P30 البرية من نوع الكبد، ونحن نعول جولة إلى هياكل القطع الناقص مع لومن يمكن تمييزها تحيط بها wsCK + الخلايا الصفراوية كبراءة اختراع BD (رأس السهم). تعتبر الخلايا الصفراوية التي لا تحيط بالتجويف غير مدمجة ولا يتم حسابها (الأسهم). (B-B') في Jag1 +/– الكبد، لا تزال الخلايا الأقنية موجودة (الأسهم). ومع ذلك، فإن معظمها لا يدرج في بطاقات BDs للبراءات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الرسم البياني BD إلى PV من كبد الماوس P30. يتم تحديد الـ BDs وPVs كمياً ويتم إنشاء نسبة BD إلى PV. كما ذكر سابقا8, Jag1 +/– الحيوانات لديها انخفاض مميز وكبير في نسبة BD إلى PV مقارنة مع الحيوانات البرية. للتحليل الإحصائي، تم إجراء اختبار t-في اتجاهين. خطوط أفقية تظهر الوسائل. P<0.001. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تحليل تطوير BD وإصلاح في الفئران هو أداة هامة في دراسة مسببات الأمراض وآلية الاضطرابات الصدغية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تطوير علاجات جديدة يعتمد جزئيا ً على إنشاء نمط ظاهري قابل للاستنساخ ويفضل أن يكون قابلاً للقياس الكمي. النمط الظاهري الحالي في نماذج الماوس عادة ما ينطوي على كيمياء المصل، علم الأنسجة الكبد وتلطيخ المناعة لعلامات محددة من نوع الخلية. وعلى الرغم من أن هذه التقنيات تولد معلومات قيمة عن هيكل ووظيفة النظام الصفراوي، فإنها لا توفر مقياسا مباشرا لآثار التلاعب الجيني على عدد من الـ BDs. في علم الأمراض التشريحية ، يتم تحديد ندرة BD في المرضى البشر من خلال تحليل نسبة BD إلى PV في قسم خزعة9. في حين يستخدم الأطباء تحليل كيمياء المصل لتحديد شدة ركود صفراوي وأمراض الكبد في ALGS وغيرها من الأمراض الكلوستاتيكية18،19، تقييم النسيج في نماذج الماوس أمر بالغ الأهمية لفهم كل من آثار معدلات المرض على تطوير BD وفعالية العلاجات على استعادة تطور القناة الطبيعية. ويرجع ذلك جزئيا إلى أن الفئران يمكن أن يكون لها انخفاض حاد في عدد BDs براءات الاختراع ولكن لا تزال تظهر سوى زيادة متواضعة في مستوى البيليروبين المصل8، على الأرجح بسبب الصرف الصفراوية عالية الكفاءة في كبد الماوس. وقد أظهرت أعمالنا السابقة أن Jag1 heterozygosity يؤدي إلى ضعف نضج BD ولكن ليس عدم وجود cholangcioytes8. وهكذا، لتحليل تطوير BD وتقييم شدة المرض في نماذج الماوس، فإنه لا يكفي لمجرد دراسة غياب أو وجود الخلايا الأقنية. لمعالجة هذه المسألة، هنا قدمنا طريقة بسيطة للقياس الموضوعي لأرقام BD براءات الاختراع في كبد الماوس.
تحليلنا يعتمد على التثبيت السليم وتضمين كبد الماوس. يتم تضمين الكبد الجانب البطني حتى لضمان تقسيم مماثلة من عينة واحدة إلى أخرى. هذا هو الموقف الأكثر استقرارا. يجب أن تكون الأقسام المستخدمة للتلطيخ عميقة بما فيه الكفاية في فصوص الكبد، حيث أن هناك اختلافات في عدد الـ BDs وحجم أجهزة PVs في المحيط مقابل الهالة في الكبد. نرى أحيانا ً أجهزة الدفع التي يتم قطعها طولياً. في تلك الحالات، عادة ما يكون هناك BD المجاورة التي يتم قطع أيضا طوليا ويظهر مثل أنبوب مفتوح طويل. ولضمان إمكانية إعادة الإنتاج، نحسب هذه الأنابيب الطويلة على أنها BD واحد. ومع ذلك، تظهر بعض الهياكل الصفراوية lumenized ولكن لا تظهر الجولة إلى مورفولوجيا القطع الناقص ينظر عادة في BDs العادية14. في أيدينا، وهذا يمكن أن يؤدي في بعض الأحيان إلى هيكل واحد يسمى BD من قبل محقق ولكن ليس من قبل زميل آخر. ولذلك، ولضمان الاتساق والتكرار في تحليل البيانات وعرضها، نوصي بتحليل جميع العينات المتعلقة بمشروع محدد من قبل اثنين من المحققين بشكل مستقل.
وقد ثبت المضادة للCK8 بمناسبة الخلايا الصفراوية غير ناضجة وناضجة, في حين أن مكافحة CK19 علامات فقط الخلايا الصفراوية الناضجة12,20. لذلك، حتى لو لم يرتبط PV مع BD ناضجة، فإنه يمكن تمييزها بسهولة من الأوردة المركزية بسبب وجود خلايا CK8 +. استخدام هذين الأجسام المضادة في تركيبة مع مكافحة αSMA يضمن تغطية كاملة من المسالك المدخل في القياس الكمي لدينا. وعلاوة على ذلك، في أيدينا، وCK19 الفردية أو CK8 تلطيخ الخلايا الصفراوية يولد إشارة ضعيفة نسبيا ويرتبط مع بعض تلطيخ الخلفية. خلط الأجسام المضادة CK اثنين يؤدي إلى إشارة قوية باستمرار في الخلايا الصفراوية، وبالتالي يسهل التحديد الكمي.
يحدث نضج الشجرة الصفراوية داخل الكبد في اتجاه الهالة إلى المحيطية ويستمر بعد الولادة21. في الواقع، هناك العديد من الخلايا الأقنية الصفراوية غير الناضجة في كبد ما بعد الولادة في وقت مبكر، وخاصة في المناطق الطرفية، والتي هي في الجبهة الرائدة من توسع الكبد بعد الولادة. وعلاوة على ذلك، لاحظنا تغيرا في أعداد BD كما الحيوانات في سن8، مع المزيد من القنوات في الحيوانات الأكبر سنا. وبالإضافة إلى ذلك، تحتوي بعض هياكل البوابة على عدة أجهزة BDs في حين أن البعض الآخر يحتوي على قناة واحدة أو معدومة، لا سيما على طول محيط الكبد. نحن نستخدم شريحة مجهرية تغطي جميع فصوص الكبد لكل الحيوان وكمية منتظمة نسبة BD إلى PV عبر الشريحة بأكملها. في حين أن هذا ليس ضروريا، فإنه يضمن أن يتم تحليل مساحات بوابة وافرة لكل الحيوان بغض النظر عن العمر وحجم الكبد (60-90 PVs لكل كبد اعتمادا على النمط الجيني والعمر). وعلاوة على ذلك، من خلال تحليل جميع PVs على الشريحة، ونحن نضمن أن يتم حساب كل من الهلار أكثر نضجا والمناطق الطرفية أقل نضجا في جميع مراحل تطور الكبد. تغطية جميع فصوص الكبد لكل الحيوان يمكن أيضا أن تقلل من التباين في القياسات إذا طفرة معينة لا يؤثر على تطوير BD بشكل موحد عبر الكبد.
وتقتصر هذه الطريقة في التمييز بين قنوات الصفراء الصغيرة ومجموعات الخلايا الصفراوية غير المدمجة. القنوات الصفراوية4 عادة ما تكون صغيرة جدا بحيث لا يمكن التعرف عليها كبنية لومنة في التكبير الذي نستخدمه لتحليل هذه البقع. ولذلك، فمن المرجح أن يتم استبعادها من التدرجات الكمية لدينا، وبالتالي فإن الطريقة تميل نحو تحديد القنوات المتوسطة إلى الكبيرة. على الرغم من هذا القيد, الطريقة الموصوفة هنا يميز بسهولة بين Jag1 +/– وJag1 +/+ الكبد. وعلاوة على ذلك، فإنه حساس بما فيه الكفاية للكشف عن الإنقاذ الجزئي من Jag1 +/- BD الندرة عند فقدان نسخة واحدة في وقت واحد من Polgut1 +/- والزيادة المتواضعة في كثافة BD في الحيوانات Jag1 +/+ مع فقدان مشروط من Poglut1 في خلايا العضلات الملساء الوعائية8. وتشير هذه الملاحظات إلى فائدة هذه الطريقة في تحديد التغيرات في كثافة BD في مختلف الخلفيات الوراثية، حتى عندما تكون التغيرات في عدد BD متواضعة.
في السنوات الأخيرة، تم استخدام التصور للهيكل 3D من شجرة الصفراوية من قبل عدة مجموعات لتحليل التنمية BD22،23،24،25. تعتمد هذه الطرق الأنيقة على ملء الشجرة الصفراوية من BD المشتركة عن طريق الحبر أو الراتنج، وبالتالي دراسة اللياقة من النظام الصفراوية. وعلاوة على ذلك، فإنها توفر معلومات عن بنية 3D من شجرة الصفراوية وتشكيلها في محيط الكبد كما ينمو الكبد، والتي لا يمكن تقييمها من خلال تقييم 2D المستخدمة في بروتوكولات مثل تلك المعروضة هنا. ومع ذلك، فإن الأداء الناجح لتقنيات التصور ثلاثية الأبعاد هذه يتطلب خبرة كبيرة26. وعلى النقيض من ذلك، فإن التقنية المعروضة هنا واضحة إلى حد ما ويمكن تنفيذها من قبل أي مجموعة مع إمكانية الوصول إلى المعدات الروتينية لتحليل النسيج والتصوير. وعلاوة على ذلك، فإن تحليل أقسام مزدوجة ملطخة لwsCK وαSMA تظهر أيضا ما إذا كانت ردود الفعل القنواتية أو تشوهات خلايا العضلات الملساء الوعائية موجودة في الكبد8،27،28. نقترح أن قياس نسبة BD إلى PV في أقسام الكبد بأكملها يمكن أن يوفر مقياسا حساسا واستنساخا للتنمية الصفراوية في الفئران ويمكن أن تكون بمثابة تقنية سهلة نسبيا لمساعدة المحققين على تقرير ما إذا كان ينبغي النظر في المزيد من تقنيات متطورة مثل التصور 3D من شجرة الصفراوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
يقر المؤلفون بالدعم المقدم من المعاهد الوطنية للصحة (R01 GM084135 وR01 DK109982)، وجائزة تجريبية/جدوى من مركز تكساس الطبي لأمراض الجهاز الهضمي تحت معهد الصحة الوطنية P30 DK56338، وجائزة مسرّع متلازمة ألاجيل من المؤسسة الطبية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isothesia (Isoflurane) | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Desiccator | Bel-Art | 16-800-552 | |
| 10% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15712 | |
| 50 mL tube | ThermoScientific | 339653 | |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2401 | |
| 95% Ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| HistoChoice | VWR Life Sciences | H103-4L | clearing agent |
| Omnisette Tissue Cassette | Fisher HealthCare | 15-197-710E | |
| Macrosette | Simport | M512 | |
| Paraplast X-TRA | McCormick Scientific | 39503002 | Parrafin |
| Tissue Mold | Fisher Scientific | 62528-32 | |
| Microtome | Microm | HM 325 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Xylene | Fisher Scientific | C8H10 | |
| Tris-Based Antigen Retrieval | Vector Laboratories | H-3301 | |
| Pressure Cooker | Instant Pot | Lux Mini | |
| Mini Pap Pen | Life Technologies | 8877 | |
| Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | J.T. Baker | X251-07 | |
| Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100) | J.T. Baker | X198-07 | |
| Normal Goat Serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I | Antibody Registry ID AB531826 |
| anti-CK19 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-III | Antibody Registry ID AB2133570 |
| anti-αSMA | Sigma Aldrich | A2547, Clone 1A4 | |
| anti-rat-Alexa488 | ThermoFisher | A21208 | |
| anti-mouse-Cy5 | Jackson Immunoresearch | 715-175-151 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 22 x 50 mm2 micro cover glass | VWR Life Sciences | 48393 059 | |
| Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000 B | |
| Kimwipes | Kimtech Science | 05511 | |
| VECTASHIELD | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade Mounting Medium |
References
- Zong, Y., et al. Notch signaling controls liver development by regulating biliary differentiation. Development. 136 (10), 1727-1739 (2009).
- Clotman, F., et al. Control of liver cell fate decision by a gradient of TGFβ signaling modulated by Onecut transcription factors. Genes & Development. 19 (16), 1849-1854 (2005).
- Karpen, S. J. Update on the etiologies and management of neonatal cholestasis. Clin Perinatol. 29 (1), 159-180 (2002).
- Roskams, T. A., et al. Nomenclature of the finer branches of the biliary tree: canals, ductules, and ductular reactions in human livers. Hepatology. 39 (6), 1739-1745 (2004).
- Oda, T., et al. Mutations in the human Jagged1 gene are responsible for Alagille syndrome. Nature Genetics. 16 (3), 235 (1997).
- Li, L., et al. Alagille syndrome is caused by mutations in human Jagged1, which encodes a ligand for Notch1. Nature Genetics. 16 (3), 243 (1997).
- Xue, Y., et al. Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the Notch ligand Jagged1. Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).
- Thakurdas, S. M., et al. Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi). Hepatology. 63 (2), 550-565 (2016).
- Hadchouel, M. Paucity of interlobular bile ducts. Seminars in Diagnostic Pathology. 9 (1), 24-30 (1992).
- Emerick, K. M., et al. Features of Alagille syndrome in 92 patients: frequency and relation to prognosis. Hepatology. 29 (3), 822-829 (1999).
- Poncy, A., et al. Transcription factors SOX4 and SOX9 cooperatively control development of bile ducts. Dev Biol. 404 (2), 136-148 (2015).
- Hofmann, J. J., et al. Jagged1 in the portal vein mesenchyme regulates intrahepatic bile duct development: insights into Alagille syndrome. Development. 137 (23), 4061-4072 (2010).
- McCright, B., Lozier, J., Gridley, T. A mouse model of Alagille syndrome: Notch2 as a genetic modifier of Jag1 haploinsufficiency. Development. 129 (4), 1075-1082 (2002).
- Andersson, E. R., et al. Mouse Model of Alagille Syndrome and Mechanisms of Jagged1 Missense Mutations. Gastroenterology. 154 (4), 1080-1095 (2018).
- Loomes, K. M., et al. Bile duct proliferation in liver-specific Jag1 conditional knockout mice: effects of gene dosage. Hepatology. 45 (2), 323-330 (2007).
- Brulet, P., Babinet, C., Kemler, R., Jacob, F. Monoclonal antibodies against trophectoderm-specific markers during mouse blastocyst formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (7), 4113-4117 (1980).
- Skalli, O., et al. A monoclonal antibody against alpha-smooth muscle actin: a new probe for smooth muscle differentiation. J Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2787-2796 (1986).
- Kamath, B. M., et al. A longitudinal study to identify laboratory predictors of liver disease outcome in Alagille syndrome. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 50 (5), 526 (2010).
- Mouzaki, M., et al. Early life predictive markers of liver disease outcome in an International, Multicentre Cohort of children with Alagille syndrome. Liver International. 36 (5), 755-760 (2016).
- Shiojiri, N. Development and differentiation of bile ducts in the mammalian liver. Microsc Res Tech. 39 (4), 328-335 (1997).
- Crawford, J. M. Development of the intrahepatic biliary tree. Semin Liver Dis. 22 (3), 213-226 (2002).
- Kaneko, K., Kamimoto, K., Miyajima, A., Itoh, T. Adaptive remodeling of the biliary architecture underlies liver homeostasis. Hepatology. 61 (6), 2056-2066 (2015).
- Schaub, J. R., et al. De novo formation of the biliary system by TGFbeta-mediated hepatocyte transdifferentiation. Nature. 557 (7704), 247-251 (2018).
- Sparks, E. E., Huppert, K. A., Brown, M. A., Washington, M. K., Huppert, S. S. Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice. Hepatology. 51 (4), 1391-1400 (2010).
- Tanimizu, N., et al. Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice. Hepatology. 64 (1), 175-188 (2016).
- Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. 3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system. J Vis Exp. (68), e4272 (2012).
- Popper, H., Kent, G., Stein, R. Ductular cell reaction in the liver in hepatic injury. J Mt Sinai Hosp N Y. 24 (5), 551-556 (1957).
- Yimlamai, D., et al. Hippo pathway activity influences liver cell fate. Cell. 157 (6), 1324-1338 (2014).
