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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

确定小鼠肝脏中的胆汁密度

Published: April 30, 2019 doi: 10.3791/59587
Automatic Translation
1,2,3, 1,3
1Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 2Medical Scientist Training Program (MSTP), Baylor College of Medicine, 3Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine

Summary

我们提出了一种相当简单和敏感的方法,用于准确定量小鼠肝脏中的胆管密度。该方法有助于确定遗传和环境修饰剂的影响,以及潜在疗法在胆汁疾病小鼠模型中的有效性。

Abstract

老鼠被广泛用作研究胆汁疾病的模型。为了评估胆汁系统的发展和功能,使用了各种技术,包括血清化学、组织学分析和特定标记物的免疫染色。虽然这些技术可以提供有关胆汁系统的重要信息,但它们通常不能显示整个肝脏胆管 (BD) 发育缺陷的完整情况。部分原因在于小鼠肝脏能够强大的能力排出胆汁,即使在胆汁发育有显著损害的动物中也是如此。在这里,我们提出了一个简单的方法,以计算与每个门户静脉 (PV) 相关的 D 的平均数量,这些部分涵盖突变/转基因小鼠的所有叶。在这种方法中,肝脏以立体的方式安装和分割,以方便各种基因型和实验条件之间的比较。BD通过细胞角素染色胆汁的光学显微镜进行识别,然后除以肝脏部分的PV总数。例如,我们展示了这种方法如何能够清楚地区分野生型小鼠和Alagille综合征的小鼠模型。这里介绍的方法不能替代可视化胆汁树三维结构的技术。然而,它提供了一种简单而直接的方法,定量评估BD的发展和小鼠的导管反应形成程度。

Introduction

胆汁树是哺乳动物肝脏的关键部分,允许胆汁从肝细胞进入肠道。内肝胆管(BDs)是由胆囊形成,通过Notch和TGF+信号1,2与双电位肝细胞区分。正确规范和承诺胆汁及其组装成成熟的BD对肝胆内树的发展至关重要。随着肝脏在发育过程中或器官再生时生长,胆汁系统需要沿着肝脏发展,以确保适当的胆汁排水。此外,一些综合和非合成性疾病导致肝内3的缺乏。此外,一些急性和慢性肝病引起所谓的肝脏导管反应,这些反应被定义为存在大量细胞,这些细胞表示胆道标记,但不一定来自胆道细胞或形式专利BD4.在多系统紊乱阿拉吉勒综合征(ALGS),单体不全的诺奇配体锯齿1(JAG1)导致不良的BD形成和胆汁症5,6。我们的实验室最近证明,以前生成的Jag1杂物小鼠线7是ALGS 8中BD贫乏的动物模型。在这个ALGS的小鼠模型中,胆小板仍然存在。然而,他们未能承诺纳入成熟的专利BD8。因此,在BD缺乏模型中分析肝脏需要的不仅仅是胆汁的明显存在或缺乏。准确评估成熟性BD在肝脏中存在的程度非常重要。

在解剖病理学中,有公认的定量方法来评估BD是否存在9。例如,对人类患者ALGS的研究通常通过分析每个肝脏活检至少10个门户血管9,10来量化BD到门户静脉(PV)比率。分析形状和整体存在或缺乏专利的BD,结合血清化学,可以提供关于小鼠11,12,13的BD发展的宝贵信息。然而,小鼠可能失去大量的BD,只有血清胆红素水平8略有增加。因此,一种定量方法,评估每个PV存在的BD数量,可以提供更直接的测量在小鼠的BD不足程度。在最近的一份报告中,我们量化了所有肝瓣中每PV的BD数,并报告Jag1+/+动物8的BD与PV比显著下降。在分析过程中,我们注意到,尽管炎症反应和管道反应的程度有显著差异,但BD与PV比并没有表现出太大的变异性8。此外,对BD与PV比的量化使我们能够证明,在Jag1+/+动物中去除一个糖基转移酶基因Poglut1副本可以显著改善其BD不足8。在Jag1+/+背景下,血管平滑肌细胞中Poglut1的有条件损失会导致 BD 数量逐渐增加,这是适度的 (20-30%)在P7,但在成人8变得突出。再次,这项技术允许我们证明,即使在P7,这些动物的BD密度的增加是统计显著。值得注意的是,通过树脂铸造分析,也验证了4个月大时这种基因型的BD密度增加。8这些观察和其他报告测量了不同ALGS小鼠模型14、15的BD密度,这促使我们把这种方法纳入我们的整体策略,以分析各种突变体中的胆汁缺陷和转基因小鼠。

在这里,我们详细介绍了一个简单的技术,可用于检查小鼠肝脏疾病模型中的BD缺乏程度(图1)。在此方法中,与胆小球菌标记物 (CK) 8 和 CK19 (下到广谱 CK, wsCK) 共同染色用于可视化小鼠肝脏中的 BD 和未合并的胆汁。对α平滑肌活动蛋白(αSMA)的抗体被添加到染色中,以标记血管。系统分析涵盖所有肝叶的一节中的BD与PV比,确保对每种基因型分析大量的PV。由于我们的方法依赖于在二维图像中量化 BD 和 PV,因此它不适合研究给定突变对胆汁树的 3D 结构的影响或小胆管的完整性。然而,它为调查人员提供了一个简单而客观的策略,以评估小鼠的胆汁发育情况。

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Protocol

所有动物被安置在贝勒医学院的屏障动物设施,根据机构动物护理和使用委员会的指导方针和批准的动物协议。

1. 小鼠肝脏组织收集

  1. 为肝脏收获准备小鼠
    1. 使用胶然化小鼠安乐死。
    2. 执行小鼠的宫颈脱位,以确保死亡。
    3. 在肋骨笼下方约一英寸处进行横向切口。
    4. 露出肝脏的整个腹腔表面。
  2. 小鼠肝脏的收集
    1. 小心,用小剪刀,切开连接肝脏和腹部其他器官的韧带。
    2. 切穿普通BD,将肝脏从肠道中分离出来。
    3. 通过抓住胆囊小心地取出肝脏,并立即放入50 mL管中,填充至四分之三甲醛(PFA)。

2. 在石蜡中固定和嵌入肝脏

  1. 固定
    1. 将肝脏组织固定在 4%PFA 中 48 小时,温度为 4°C。
    2. 在4°C下用70%EtOH清洗组织1小时。
    3. 用95%EtOH洗涤组织两次,每次在4°C下洗涤1小时。
    4. 用100%EtOH洗涤组织两次,每次在4°C下洗涤1小时。
  2. 结算
    1. 在室温下,用清除剂(材料表)清洗肝组织三次,每次30分钟。
      注:第三次洗涤后,肝脏应感到僵硬。
  3. 嵌入石蜡
    1. 将组织盒放入石蜡中的组织模具中,进行3次涂片,每次30分钟。蜡应预热至 60°C。
    2. 将石蜡填充组织模具至四分之三高度,并保持在 60°C 的加热块上。
    3. 将肝脏放在模具中,腹腔面朝上。
    4. 小心地将模具从加热块中取出。
    5. 将盒顶放在模具上,用热液体石蜡顶放。
    6. 让模具和块冷却至室温过夜。
      注:组织块现在可以储存在室温下。

3. 分块肝组织

  1. 为切片准备块
    1. 将模具放在冰上 5 分钟,然后从模具中取出块。
    2. 用实验室纸巾在冰块和冰块之间放置冰块。
    3. 不切片时,将块保持在冰上,以获得最佳的组织切片效果。
  2. 分割肝块
    1. 使用微质元,首先从肝脏表面的背端分割开始。截面应为 5 μm。
    2. 检查解剖显微镜下的表层部分,以确保各部分没有被截层或折叠。
    3. 取一部分肝脏,包括牛叶。
      注:对于某些块,您将在同一组织切片上有左、中、右和牛叶。
    4. 对于同一幻灯片上不存在所有四个叶的块,继续切片,直到同一张幻灯片上出现左、中叶和右叶。

4. 用于 wsCK 和 _SMA 的免疫性基化学

  1. 免疫性化学的幻灯片处理
    1. 选择每个基因型的一张幻灯片进行分析。
    2. 在二甲苯中洗涤幻灯片 15 分钟,100% EtOH,95% EtOH,最后 70% EtOH(每个溶液 3 x 5 分钟)。
    3. 在去离子 H2O 中清洗幻灯片 5 分钟。
    4. 将幻灯片浸入抗原检索溶液中(基于Tris的高pH值)。
    5. 在压力锅中,在压力锅中加热 3 分钟,10 psi。
    6. 让幻灯片冷却至室温(约 35 分钟)。
  2. 阻塞组织部分
    1. 使用巴氏笔,勾勒幻灯片上的部分。
    2. 应用磷酸盐缓冲盐水(PBS)= 0.1%补间覆盖部分两次,每次5分钟。
    3. 通过在 PBS 中 1:50 混合正常山羊血清 (NGS) 进行阻塞缓冲液 = 0.3% Triton。为了有足够的缓冲液用于阻断和初级抗体的应用,每节100μL就足够了。
    4. 每节应用100μL的阻滞溶液。
    5. 在 4°C 下孵育堵塞溶液覆盖的幻灯片 1 小时。
  3. wsCK 和 _SMA 的染色
    1. 稀释抗CK8和抗CK19抗体16(发育研究杂交瘤库,TROMA-I和TROMA-III,分别)1:20在阻断缓冲液中染色的wsCK。在同一缓冲液中稀释抗βSMA抗体17(材料表)至1:200。
    2. 将含有所有三种抗体的稀释抗体溶液的100 μL涂抹到每个部分。
    3. 在4°C处孵育抗体溶液覆盖的幻灯片过夜。
    4. 用 PBS = 0.1% Triton 清洗幻灯片三次,每次 5 分钟。
    5. 稀释二级抗体(抗鼠-Alexa488和抗小鼠Cy5)1:200在PBS = 0.3%Triton。
    6. 将含有两种次级抗体的次级抗体的100μL涂在幻灯片上。
    7. 在室温下孵育1小时。
  4. DAPI 核染色和安装
    1. 洗幻灯片三次,每张5分钟。
    2. 在每个部分应用 100 μL DAPI (1:3000) 10 分钟。
    3. 将防褪色安装介质(材料表)涂抹到幻灯片上,并在组织部分顶部放置玻璃盖玻片。将幻灯片放在 4°C 过夜。第二天密封幻灯片。
    4. 将幻灯片存储在 4°C,并在安装后的 1 周内存储图像。

5. D的成像和定量

  1. 成像肝部分
    1. 在成像之前,在实验室成员的帮助下,自己看不到样本的基因型。确保所有成像文件没有基因型或其他特定的识别信息,除了动物/样本编号。
    2. 使用荧光显微镜,以每截面的 1 倍变焦拍摄 20 倍图像,并确保对肝脏的每个 PV 进行成像。包括左叶、中叶、右叶和牛叶。
      注:我们通常发现每个动物60-90个入口,这取决于肝脏的大小。
    3. 要识别 PV,请查看 _SMA 加 wsCK 染色。*SMA 阳性但缺少 wsCK 染色的结构不是门户结构。
  2. 身份证的识别和计数
    1. 创建包含以下列的电子表格:动物/样本编号、图像编号、PV 数和 BD 数。
    2. 遍历每个图像,识别并记录每个图像的 PV 数。
    3. 通过围绕可定义的流明存在的胆小子 (wsCK+) 来识别每个图像中的专利 BD。结构应该是不同的,并与其他wsCK®细胞的间质分离。
    4. 计算每个专利 BD 并放置在与图像编号相同的列中。
    5. 对 PV 拍摄的每个图像执行此操作。
    6. 计算肝脏样本中所有 PV 和所有 BD 的总和。
    7. 计算肝脏样本的 BD 与 PV 比率。

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Representative Results

我们之前记录了Jag1+/+动物的胆汁缺陷,这是ALGS8的小鼠模型。为了确定BD与PV比,我们对P30小鼠肝脏进行切片,并将其与血管标记αSMA一起用于CK8和CK19(wsCK)。共染色。然后,我们拍摄了每个肝叶中的所有 PV。如图2A所示,我们将 PV 定义为具有相邻 wsCK 染色(箭头)的 _SMA 染色容器。没有 wsCK 的 _SMA 染色结构是中央静脉,不应包含在分析中(箭头)。

一旦确定PV,我们就通过它们的特征形状来识别专利的BD。如图3所示,专利管道具有一个清晰可定义的流明,被wsCK®胆汁包围。管道通常通过间质(箭头)与附近的管道或胆管分离。没有可定义的流明、附着在相邻细胞上的或单独出现的 wsCK+ 细胞不计入 BD 的总数(箭头)。图 3A显示了一个带 PV 的野生型肝部分,该部分与完全专利管道以及多个未合并的细胞相关联。图 3B是来自 P30 Jag1+/+动物的代表性肝脏部分。本节中的三台 PV 周围没有专利 BD。所有 wsCK+ 单元格都是未合并的,因此不应计算。此图像强调了仔细进行 BD 计数的重要性,因为 wsCK® 细胞的存在或不存在不会区分Jag1+/*和野生型肝脏。

如图1D所示,对BD与PV比的分析涉及计算肝脏部分的每个PV以及每个PV周围的专利BD总数。在分析Jag1+ / +肝脏时,我们注意到,在这些动物中,不同的叶不一定受到相同程度的影响(未公布的数据)。因此,我们通常计算左、中、右和牛叶的PV,以确保完全的肝脏覆盖。在计算总 PV 和 BD 后,将计算整个部分的比率。

在图4中,我们展示了3种野生型和3种Jag1+/+动物的BD与PV比的分析。此图显示了如何根据 BD 计数轻松区分两个基因型。此外,该方法提供了一个定量的度量,用于分析通过基因操作拯救Jag1+/*表型的程度,如前8例所述。

Figure 1
图1:实验过程原理图。(A) 肝脏是从老鼠中全部收获的.(B) 肝脏样本固定为48小时,脱水并清除。(C) 肝脏组织嵌入石蜡中.截面制作并放置在带电的幻灯片上,并用于 wsCK 和 _SMA 进行染色。(D) 幻灯片是图像,并记录 PV 和 BD 的数量。BD 到 PV 比 (BD:PV) 计算整个肝脏部分。HA = 肝动脉;CV = 中央静脉。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图 2:区分中央静脉光伏(A) PV 通过存在 _SMA 染色和周围的 sCK® 胆囊(箭头)来识别。(B) 中央静脉通过存在βSMA染色来识别,结构周围没有wsCK®胆汁(箭头)。(A'和B')灰度图像分别显示来自 A 和 B 的 μSMA 通道。刻度条 = 100 μm,适用于所有面板。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3:专利身份证的识别。(A-A') 在P30野生型肝脏中,我们计算圆为椭圆形结构与可辨别的流明包围的wsCK® 胆汁作为专利BD(箭头)。不围绕流明的胆囊被视为未合并且不计数(箭头)。(B-B')在Jag1+/*肝脏中,胆小球体仍然存在(箭头)。然而,大多数没有纳入专利BD。刻度条 = 100 μm,适用于所有面板。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4:从P30小鼠肝脏的BD到PV图。对 BD 和 PV 进行了量化,并生成了 BD 与 PV 的比率。如前8例所述,与野生类动物相比,Jag1+/*动物的BD与PV比有显著下降。 对于统计分析,进行了双向t-测试。 水平线显示表示方式。P<0.001.请点击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

小鼠BD发育与修复分析是研究胆囊性疾病发病机制和机理的重要工具。此外,新疗法的发展部分取决于建立可重复的,最好是可量化的表型。小鼠模型中的电流表示通常涉及血清化学、肝脏信息学和细胞类型特定标记物的免疫染色。虽然这些技术产生了关于胆管系统的结构和功能的宝贵信息,但它们不能直接测量给定基因操作对发育系统数量的影响。在解剖病理学中,通过分析活检第9节的BD与PV比,确定人类患者的BD不足。虽然临床医生使用血清化学分析来确定ALGS和其他胆囊静症中胆汁症和肝病的严重程度18,19,但小鼠模型中组织学评估对两者的理解都至关重要疾病修饰剂对BD发展的影响和治疗对恢复正常导管发育的有效性。部分原因在于小鼠的专利BD数量可能严重减少,但仍只显示血清胆红素8级略有增加,这可能是由于小鼠肝脏的高效胆汁引流。我们以前的工作已经表明,Jag1异质性导致BD成熟受损,但不是缺乏胆汁8。因此,要分析BD发展并评估小鼠模型中的疾病严重程度,仅仅检查胆小病的缺失或存在是不够的。为了解决这个问题,我们提出了一个简单的方法,客观测量专利BD数在小鼠肝脏。

我们的分析依赖于小鼠肝脏的正确固定和嵌入。肝脏是嵌入腹侧向上,以确保从一个样品到另一个类似的切片。这是最稳定的位置。用于染色的节段必须在肝叶中足够深,因为在边缘的 BD 和 PV 的大小与肝脏的冬至有差异。我们偶尔会看到纵向切割的 PV。在这些情况下,通常有一个相邻的 BD,也纵向切割,看起来像一个长开管。为了确保可重复性,我们将这些长管算作单个BD。专利的识别在大部分方面都是明确的。然而,一些胆汁结构似乎流明,但不显示圆形到椭圆形形态,通常见于正常的BDs14。在我们手中,这有时会导致一个结构被调查员称为BD,而不是由另一位同事调用。因此,为了确保数据分析和演示的一致性和可重复性,我们建议由两名调查员独立分析与特定项目相关的所有样本。

抗CK8已被证明标记不成熟和成熟的胆细胞,而抗CK19只标记成熟的胆细胞12,20。因此,即使PV与成熟的BD不相关,由于CK8+细胞的存在,它可以很容易地从中央静脉中区分。将这两种抗体与抗βSMA结合使用,可确保在我们的定量中完全覆盖门户区域。此外,在我们的手中,胆汁细胞的单个CK19或CK8染色产生一个相对较弱的信号,并与一些背景染色相关。混合两种CK抗体在胆汁细胞中产生持续强烈的信号,从而促进定量。

肝胆内树的成熟发生在从高音到外围方向,并在产后21继续。事实上,在产后早期肝脏中,特别是在处于产后肝扩张前沿的周边地区,还有更多不成熟的胆囊。此外,我们观察到BD数随着动物年龄8岁而变化,较老的动物体内的导管较多。此外,一些门户结构包含多个 BD,而其他则有一个或没有管道,特别是沿肝脏外围。我们使用显微镜幻灯片覆盖每个动物的所有肝瓣,并系统地量化整个幻灯片的 BD 与 PV 比。虽然这不是必要的,但它确保分析足够的门户区域为每个动物,无论年龄和肝脏大小(60-90 PV每个肝脏取决于基因型和年龄)。此外,通过分析幻灯片上的所有 PV,我们确保在肝脏发育的所有阶段都计算更成熟的周围区域和不太成熟的外围区域。如果给定突变不影响整个肝脏的BD发育,覆盖每只动物的所有肝瓣也可以减少测量的变异性。

该方法在区分较小的胆道和未合并的胆汁细胞组方面受到限制。胆管4通常太小,无法识别为流明结构放大,我们用于分析这些染色。因此,它们很可能被排除在我们的量化之外,因此该方法偏向于识别大中型管道。尽管有这种限制,这里描述的方法很容易区分Jag1+/+和Jag1+/+肝脏。此外,在同时丢失一个Polgut1+/*副本且有条件损失Poglut1的Jag1+/+动物的 BD 密度略有增加时,它足够灵敏,可以检测到Jag1+/* BD 的局部抢救在血管平滑肌细胞8。这些观察表明,这种方法在确定不同遗传背景的BD密度变化时很有用,即使BD数的变化不大。

近年来,胆汁树的3D结构可视化已被几个组用于分析BD发展22,23,24,25。这些优雅的方法依赖于用墨水或树脂填充普通BD的胆汁树,因此检查胆汁系统的可分度。此外,它们还提供有关胆汁树的3D结构及其在肝脏周围随着肝脏生长而形成的信息,这不能通过像这里介绍的协议中使用的2D评估来评估。然而,这些3D可视化技术的成功表现需要相当的专业知识26。相比之下,这里介绍的技术相当简单,可以由任何能够访问常规设备进行组织学和成像分析的组执行。此外,对wsCK和βSMA双染色部分的分析也将显示肝脏8、27、28是否存在导管反应或血管平滑肌细胞异常。我们建议,量化整个肝脏部分的BD与PV比,可以为小鼠的胆汁发育提供一种敏感且可重复的测量,并可以作为一种相对简单的技术,帮助研究者决定是否应该考虑更多复杂的技术,如胆汁树的3D可视化。

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Disclosures

提交人没有利益冲突。

Acknowledgments

作者感谢美国国家卫生研究院(R01 GM084135和R01 DK109982)的支持,来自德克萨斯州医疗中心消化疾病中心的试点/可行性奖,由NIH P30 DK56338颁发,阿拉吉勒综合征加速器奖来自医学基金会

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isothesia (Isoflurane) Henry Schein 11695-6776-2
Desiccator Bel-Art 16-800-552
10% PFA Electron Microscopy Sciences 15712
50 mL tube ThermoScientific 339653
70% Ethanol Decon Laboratories 2401
95% Ethanol Decon Laboratories 2801
100% Ethanol Decon Laboratories 2701
HistoChoice VWR Life Sciences H103-4L clearing agent
Omnisette Tissue Cassette Fisher HealthCare 15-197-710E
Macrosette Simport M512
Paraplast X-TRA McCormick Scientific 39503002 Parrafin
Tissue Mold Fisher Scientific 62528-32
Microtome Microm HM 325
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Xylene Fisher Scientific C8H10
Tris-Based Antigen Retrieval Vector Laboratories H-3301
Pressure Cooker Instant Pot Lux Mini
Mini Pap Pen Life Technologies 8877
Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) J.T. Baker X251-07
Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100) J.T. Baker X198-07
Normal Goat Serum Jackson Immunoresearch 005-000-121
anti-CK8 Developmental Studies Hybridoma Bank TROMA-I Antibody Registry ID AB531826
anti-CK19 Developmental Studies Hybridoma Bank TROMA-III Antibody Registry ID AB2133570
anti-αSMA Sigma Aldrich A2547, Clone 1A4
anti-rat-Alexa488 ThermoFisher A21208
anti-mouse-Cy5 Jackson Immunoresearch 715-175-151
DAPI Vector Laboratories H-1000
22 x 50 mm2 micro cover glass VWR Life Sciences 48393 059
Fluorescence Microscope Leica DMI6000 B
Kimwipes Kimtech Science 05511
VECTASHIELD Vector Laboratories H-1000 Antifade Mounting Medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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发育生物学 问题 146 肝脏发育 胆管 细胞角蛋白 Notch 信号 阿拉吉勒综合征 Jag1
确定小鼠肝脏中的胆汁密度
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Adams, J. M., Jafar-Nejad, H.… More

Adams, J. M., Jafar-Nejad, H. Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver. J. Vis. Exp. (146), e59587, doi:10.3791/59587 (2019).

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