Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Bestemmelse galdegang tæthed i muse leveren

Published: April 30, 2019 doi: 10.3791/59587

Summary

Vi præsenterer en temmelig enkel og følsom metode til nøjagtig kvantificering af galdegang tæthed i muse leveren. Denne metode kan hjælpe med at bestemme virkningerne af genetiske og miljømæssige modifikatorer og effektiviteten af potentielle terapier i musemodeller af Biliære sygdomme.

Abstract

Mus er bredt anvendt som en model organisme til at studere galde sygdomme. For at evaluere udviklingen og funktionen af galdesystemet anvendes der forskellige teknikker, herunder serum kemi, histologisk analyse og immun farvning for specifikke markører. Selv om disse teknikker kan give vigtige oplysninger om galde system, de ofte ikke præsenterer et fuldt billede af galdegang (BD) udviklingsmæssige defekter på tværs af hele leveren. Dette er til dels på grund af den robuste evne af musen leveren til at dræne galde selv hos dyr med signifikant svækkelse i galde udvikling. Her præsenterer vi en simpel metode til at beregne det gennemsnitlige antal BD'er, der er forbundet med hver Portal vene (PV) i sektioner, der dækker alle lapper af mutant/Transgene mus. I denne metode monteres lever og sektioneres på en stereotypisk måde for at lette sammenligningen mellem forskellige genotyper og eksperimentelle forhold. BDs identificeres via let mikroskopi af cytokeratin-farvede cholangiocytter, og derefter tælles og divideret med det samlede antal PVs til stede i leveren afsnit. Som et eksempel viser vi, hvordan denne metode klart kan skelne mellem vild-type mus og en musemodel af Alagille syndrom. Den metode, der præsenteres her, kan ikke erstatte teknikker, som visualiserer den tredimensionale struktur i biliær træet. Men, det giver en nem og direkte måde at kvantitativt vurdere BD udvikling og graden af ductular reaktion dannelse i mus.

Introduction

Galde træet er en kritisk del af pattedyr leveren, tillader passage af galde fra hepatocytter i tarmen. Intrahepatiske galdekanaler (BDS) dannes af cholangiocytter, som adskiller fra bipotential hepatoblaster gennem hak og tgfβ signalering1,2. Korrekt specifikation og engagement af cholangiocytes og deres samling i modne BDs er afgørende for udviklingen af det intrahepatiske Biliære træ. Som leveren vokser under udvikling eller ved organ regenerering, galdesystemet skal udvikle sig langs leveren for at sikre korrekt galde dræning. Desuden, en række syndromer og ikke-syndromiske sygdomme resultere i Brandt af intrahepatiske BDS3. Desuden giver en række akutte og kroniske leversygdomme anledning til såkaldte ductular reaktioner i leveren, som defineres som tilstedeværelsen af et betydeligt antal celler, der udtrykker Biliære markører, men ikke nødvendigvis skyldes galde celler eller form patent BDs4. I multi-system Disorder Alagille syndrom (ALGS), haploinsufficiens af notch ligand jagged1 (JAG1) resulterer i dårlig BD dannelse og kolestase5,6. Vores laboratorium har for nylig påvist, at en tidligere genereret Jag1 heterozygot muse linje7 er en dyremodel af BD Brandt i ALGS8. I denne mus model af ALGS, cholangiocytter er stadig til stede. Men de undlader at forpligte sig til inkorporering i moden, patent BDs8. Derfor, analyse af leveren i en model af BD Brandt kræver mere end den tilsyneladende tilstedeværelse eller fravær af cholangiocytter. Det er vigtigt præcist at vurdere, i hvilken grad modne BD'er er til stede i leveren.

I anatomiske patologi er der accepterede kvantitative metoder til at vurdere, om BD Brandt findes9. For eksempel, undersøgelser på ALGS hos mennesker patienter ofte kvantificere BD til Portal vene (PV) ratio ved at analysere mindst 10 Portal fartøjer pr leveren biopsi9,10. Analyse af form og generel tilstedeværelse eller fravær af patent BDS, kombineret med serum kemi, kan give værdifulde oplysninger om BD udvikling i mus11,12,13. Men, mus kan miste et betydeligt antal BDs med kun en beskeden stigning i serum bilirubinniveau8. Derfor kan en kvantitativ metode, der evaluerer antallet af BDS til stede pr. PV, give en mere direkte måling af graden af BD Brandt i mus. I en nylig rapport kvantificerede vi antallet af BDs pr. PV på tværs af alle leverlobes og rapporterede et signifikant fald i BD til PV-forholdet i Jag1 +/– dyr8. I løbet af vores analyse, bemærkede vi, at på trods af den betydelige variation i graden af inflammatorisk respons og ductular reaktioner, BD til PV ratio viser ikke meget variation8. Desuden, kvantificering af BD til PV ratio tillod os at påvise, at fjerne en kopi af glykosyltransferase genet Poglut1 i Jag1 +/– dyr kan væsentligt forbedre deres BD Brandt8. I en Jag1 +/+ baggrund resulterer betinget tab af Poglut1 i vaskulære glatte muskelceller i en progressiv stigning i BD-numre, hvilket er beskedent (20-30%) på P7, men bliver fremtrædende i voksne8. Igen, denne teknik tillod os at vise, at selv på P7, stigningen i BD tæthed i disse dyr er statistisk signifikant. Bemærk, at den øgede BD-tæthed i denne genotype ved fire måneders alderen også blev valideret ved hjælp af harpiks støbe analyse. 8 disse observationer og andre rapporter, som målte BD-tæthed i forskellige ALGS-musemodeller14,15 fik os til at indarbejde denne metode i vores overordnede strategi om at analysere Biliære defekter i forskellige mutante og Transgene mus.

Her, vi detaljer en ligetil teknik, som kan bruges til at undersøge graden af BD Brandt i musemodeller af leversygdom (figur 1). I denne metode, samtidig farvning med cholangiocyte markører cytokeratin (CK) 8 og CK19 (herefter bredspektret CK, wsCK) bruges til at visualisere BDs og uindarbejdet cholangiocytes i muse leveren. Et antistof mod Alpha-glat muskel actin (αSMA) tilsættes til farvning til etiketten fartøjer. Systematisk analyse af BD-til-PV-forholdet i et afsnit, der dækker alle leverlobes, sikrer, at et stort antal PVs analyseres for hver genotype. Da vores metode er afhængig af kvantificering af BDs og PVs i 2D-billeder, er det ikke egnet til at studere virkningerne af en given mutation på 3D-strukturen i galde træet eller integriteten af de små Biliære ledninger. Ikke desto mindre, det giver en enkel og objektiv strategi for efterforskere til at vurdere biliær udvikling i musen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr blev anbragt i en barriere Animal facilitet på Baylor College of Medicine per institutionel dyrepasning og anvendelse udvalg retningslinjer og under godkendte dyre protokoller.

1. indsamling af mus lever væv

  1. Forberedelse af mus til leveren høst
    1. Euthanize musen ved hjælp af isoflurane.
    2. Udfør livmoderhals afplacering af musen for at sikre døden.
    3. Lav en tværgående indsnit ca. en tomme under ribburet.
    4. Udsætte hele den ventrale overflade af leveren.
  2. Samling af musen leveren
    1. Forsigtigt, med lille saks, skåret gennem ledbånd forbinder leveren til andre organer i maven.
    2. Skær gennem den fælles BD at frigøre leveren fra tarmen.
    3. Fjern omhyggeligt leveren ved at holde på galdeblæren og straks placere i et 50 mL rør fyldt til tre fjerdedele med 4% PARAFORMALDEHYD (PFA).

2. fiksering og indlejring af leveren i paraffin

  1. Fiksering
    1. Fix leveren væv for 48 h i 4% PFA ved 4 °C.
    2. Vask vævet med 70% EtOH i 1 time ved 4 °C.
    3. Vask vævet to gange med 95% EtOH i 1 h hver ved 4 °C.
    4. Vask vævet to gange med 100% EtOH i 1 h hver ved 4 °C.
  2. Clearing
    1. Vask levervævet med clearing agent (tabel over materialer) tre gange i 30 min hver ved stuetemperatur.
      Bemærk: Leveren skal føle stiv efter den tredje vask.
  3. Integrering i paraffin
    1. Placer vævs kassetten i en vævs skimmel i paraffinvoks til 3 vaske, 30 min hver. Voks skal forvarmes til 60 °C.
    2. Fyld vævet støbeform med paraffinvoks til tre fjerdedele højde og holde på en varmeblok ved 60 °C.
    3. Placer leveren i formen med den ventrale side opad.
    4. Fjern forsigtigt formen fra varme blokken.
    5. Placer toppen af kassetten på formen og top off med varm flydende paraffin.
    6. Lad formen og blokken afkøles til stuetemperatur natten over.
      Bemærk: Vævs blokke kan nu opbevares ved stuetemperatur.

3. skæring af levervæv

  1. Klargøring af blokken til skæring
    1. Placer formen på is i 5 minutter, før du fjerner blokken fra formen.
    2. Placer blokken på is med et laboratorie tissue-papir til stede mellem blok og is.
    3. Hold blokken på is, når de ikke skærer for bedste væv udskæring resultater.
  2. Skæring af leveren blokke
    1. Ved hjælp af en mikrotom, begynde ved skæring gennem den overfladiske, Rygside af leveren. Sektioner skal være 5 μm.
    2. Kontroller de overfladiske sektioner under et dissektions mikroskop for at sikre, at sektioner ikke er klipset eller foldet.
    3. Tag en del af leveren, der omfatter hale lap.
      Bemærk: For nogle blokke, vil du have den venstre, mediale, højre og caudatus lapper på samme væv skive.
    4. For de blokke, hvor alle fire lapper ikke er til stede på samme slide, Fortsæt med at skive, indtil venstre, mediale og højre lapper er til stede på samme slide.

4. Immunhistokemi for wsCK og αSMA

  1. Behandling af lysbilleder til immun histokemi
    1. Vælg et dias pr. genotype, der skal analyseres.
    2. Vask diaset i 15 minutter i xylen, 100% EtOH, 95% EtOH og endelig 70% EtOH (3 x 5 min i hver opløsning).
    3. Vask sliden i 5 min i deioniseret H2O.
    4. Skub diaset ind i antigen søgnings opløsningen (Tris-baseret, høj pH).
    5. Varme under tryk i en trykkoger i 3 min ved 10 PSI.
    6. Lad diaset køle af til stuetemperatur (ca. 35 min.).
  2. Blokering af vævs sektioner
    1. Brug en pap-pen til at skitsere sektionerne på diaset.
    2. Anvend fosfat-bufferet saltvand (PBS) + 0,1% Tween til at dække afsnittet to gange, 5 min hver.
    3. Gør blokerende buffer ved at blande normale gede serum (NGS) ved 1:50 i PBS + 0,3% Triton. For at have nok buffer til både blokering og primær antistof applikation er 100 μL pr. sektion tilstrækkelig.
    4. Påfør 100 μL blokerende opløsning pr. sektion.
    5. De slides, som er dækket med blokerings opløsningen, inkubates ved 4 °C i 1 time.
  3. Farvning for wsCK og αSMA
    1. Fortynde anti-CK8 og anti-CK19 antistoffer16 (udviklingsmæssige undersøgelser Hybridoma bank, troma-I og TROMA-III, henholdsvis) 1:20 i blokerende buffer til pletter for wsCK. Anti-αSMA-antistof17 (tabel over materialer) fortyndes til 1:200 i samme buffer.
    2. Påfør 100 μL af den fortyndede antistof opløsning, der indeholder alle tre antistoffer til hver sektion.
    3. De slides, som er dækket med antistof opløsningen, inkubates ved 4 °C natten over.
    4. Vask slides med PBS + 0,1% Triton tre gange, 5 min hver.
    5. Fortyndede sekundære antistoffer (anti-rat-Alexa488 og anti-Mouse-Cy5) 1:200 i PBS + 0,3% Triton.
    6. Påfør 100 μL af den sekundære antistof opløsning, der indeholder både sekundære antistoffer mod gliderne.
    7. Inkuber ved stuetemperatur i 1 time.
  4. DAPI nuklear farvning og montering
    1. Vask slides tre gange, 5 min hver.
    2. Påfør 100 μL DAPI (1:3000) til hver sektion i 10 minutter.
    3. Anvend anti fade monterings medium (tabel over materialer) til slides og Placer en glas dækseddel på toppen af vævs sektioner. Lad slides ved 4 °C natten over. Forsegl diasene den næste dag.
    4. Opbevar slides ved 4 °C og billede inden for 1 uge af montering.

5. billeddannelse og kvantificering af BDs

  1. Billeddannelse lever sektioner
    1. Før billeddannelse skal du blinde dig selv til prøvens genotype med hjælp fra et laboratorie medlem. Sørg for, at alle billedfiler er blottet for genotype eller andre specifikke identifikationsoplysninger ud over et animalsk/prøve nummer.
    2. Ved hjælp af et fluorescerende mikroskop, tage 20x billeder ved 1x zoom af hver sektion og sikre, at hver PV på tværs af leveren er afbildet. Medtag venstre, mediale, højre og caudatus lobes.
      Bemærk: Vi plejer at finde 60-90 Portal skrifter pr. dyr afhængigt af størrelsen af leveren.
    3. For at identitet PVs, kigge efter αSMA plus wsCK farvning. Strukturer, der er αSMA positive, men mangler wsCK farvning er ikke Portal strukturer.
  2. Identifikation og optælling af BDs
    1. Opret et regneark med følgende kolonner: dyr/prøve nummer, billed nummer, antal pv'er og antal BDs.
    2. Gå gennem hvert billede, identificere og registrere antallet af PVs pr billede.
    3. Identificer patent BDs i hvert billede ved tilstedeværelsen af cholangiocytter (wsCK +) omkring en definerbar lumen. Strukturer skal være særskilte og adskilt af mesenchyme fra andre wsCK + celler.
    4. Tæl hvert patent BD og Placer i samme kolonne som billednummeret.
    5. Gør dette for hvert billede taget af en PV.
    6. Beregn summen af alle PVs og alle BD'er i lever prøven.
    7. Beregningen af BD-til-PV-forholdet for lever prøven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi har tidligere dokumenteret Biliære defekter i Jag1 +/– dyr, en musemodel på ALGS8. For at bestemme BD til PV ratio, vi sektionerede P30 mus lever og co-plettet dem for CK8 og CK19 (wsCK) sammen med den vaskulære markør αSMA. Vi derefter afbildet alle PVS i hver af leveren lobes. Som vist i figur 2adefinerede vi PVS som αsma-farvede fartøjer, der har tilstødende wsCK-farvning (arrowheads). De αSMA-farvede strukturer uden wsCK var centrale vener og bør ikke indgå i analysen (Arrow).

Når PVs blev identificeret, identificerede vi patent BDs ved deres karakteristiske form. Som vist i figur 3, har patent kanalerne en klart definerbar lumen, der er omgivet af wsCK + cholangiocytes. Kanalerne er normalt adskilt fra nærliggende kanaler eller cholangiocytes af mesenchyme (Arrowhead). wsCK +-celler, der ikke har et definerbar lumen, er knyttet til tilstødende celler eller vises isoleret, tælles ikke med i det samlede antal BDs (pile). Figur 3a viser en vild-type lever sektion med en PV, som er forbundet med en fuld patent kanal sammen med flere ikke-inkorporerede celler. Figur 3b er en repræsentativ lever sektion fra en P30 Jag1 +/– dyr. Ingen patent BDs er til stede omkring de tre PVs i dette afsnit. Alle wsCK +-celler er ikke indarbejdet og bør derfor ikke tælles. Dette billede fremhæver vigtigheden af omhyggelig BD optælling, som tilstedeværelse eller fravær af wsCK + celler ikke differentiere Jag1 +/- og vild-type lever.

Som påvist i figur 1domfatter analysen af BD-PV-forholdet optælling af alle PV i lever sektionen sammen med det samlede antal patent BD'er, som er til stede omkring hver PV. Under analyse af Jag1 +/- lever, bemærkede vi, at forskellige lapper ikke nødvendigvis påvirkes i samme omfang i disse dyr (ikke-offentliggjorte data). Derfor tæller vi normalt PVS på tværs af venstre, mediale, højre og caudatus lapper for at sikre komplet lever dækning. Efter tabulering af total PVs og BDs beregnes forholdet for hele sektionen.

I figur 4viste vi analysen af BD til PV nøgletal for 3 Wild-type og 3 Jag1 +/– dyr. Denne graf viser, hvordan de to genotyper let kan skelnes baseret på BD-optællinger. Desuden giver denne metode en kvantitativ foranstaltning til analyse af graden af redning af Jag1 +/- fænotype ved genetiske manipulationer, som rapporteret tidligere8.

Figure 1
Figur 1: skematisk af forsøgs processen. A) leveren høstes hele fra musen. B) der er fastsat leverprøver for 48 h, dehydreret og renset. C) levervævet er indlejret i paraffin. Sektioner er lavet og placeret på ladede slides og plettet til wsCK og αSMA. (D) dias er inddelt, og antallet af pv'er og BD'er registreres. BD-PV-forholdet (BD: PV) beregnes for hele lever sektionen. HA = hepatisk arterie; CV = central vene. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: skelne mellem vener fra PVs. A) en PV identificeres ved tilstedeværelsen af αsma-farvning og omgivende wsCK + cholangiocytes (arrowheads). B) centrale vener identificeres ved tilstedeværelsen af αsma-farvning uden wsCK + cholangiocytter, der findes omkring strukturen (Arrow). (A ' og B ') Gråtonebilleder, der viser αSMA-kanalerne fra henholdsvis A og B. Scale bar = 100 μm og gælder for alle paneler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: identifikation af patent BDs. (a-a ')  I P30 Wild-type lever, vi tæller runde til ellipsoide strukturer med en mærkbar lumen omgivet af wsCK + cholangiocytes som en patent BD (Arrowhead). Cholangiocytter, som ikke omgiver en lumen betragtes som uindarbejdet og tælles ikke (pile). (b-b ') I Jag1 +/- lever, cholangiocytter er stadig til stede (pile). Men de fleste er ikke indarbejdet i patent BDs. Scale bar = 100 μm og gælder for alle paneler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: BD til PV graf fra P30 Mouse lever. BDs og PVs kvantificeres, og BD til PV-forholdet genereres. Som rapporteret tidligere8, Jag1 +/– dyr har en karakteristisk og signifikant fald i BD til PV ratio sammenlignet med vilde-type dyr. Til statistisk analyse blev der udført to-vejs t-test. Vandrette linjer viser midler. P< 0,001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Analyse af BD udvikling og reparation i mus er et vigtigt redskab til at studere patogenesen og mekanismen af kolestatiske lidelser. Desuden er udviklingen af nye terapier delvis afhængig af, at der etableres en reproducerbar og fortrinsvis kvantificerbare fænotype. Nuværende fænotypebestemmelse i musemodeller involverer normalt serum kemi, lever histologi og immun farvning for celle-typespecifikke markører. Selv om disse teknikker genererer værdifulde oplysninger om strukturen og funktionen af biliær systemet, de ikke giver en direkte måling af virkningerne af en given genetisk manipulation på antallet af BDs. I en anatomisk patologi bestemmes BD Brandt hos humane patienter gennem analysen af BD til PV ratio i en biopsi afsnit9. Mens klinikere beskæftiger serum kemi analyse for at bestemme sværhedsgraden af kolestase og leversygdom i ALGS og andre kolestatiske sygdomme18,19, histologisk vurdering i musemodeller er afgørende for både forståelse virkningerne af sygdoms modifikatorer på BD-udvikling og effektiviteten af terapier om genopretning af normal kanal udvikling. Dette er til dels fordi mus kan have en alvorlig nedgang i antallet af patent BDs, men stadig viser kun en beskeden stigning i serum bilirubinniveau8, sandsynligvis på grund af den meget effektive galde dræning i muse leveren. Vores tidligere arbejde har vist, at Jag1 heterozygosity resulterer i forringet BD modning, men ikke fraværet af cholangcioytes8. Således, at analysere BD udvikling og vurdere sygdommens sværhedsgrad i musemodeller, det er ikke tilstrækkeligt blot at undersøge fravær eller tilstedeværelse af cholangiocytes. For at løse dette problem, her har vi præsenteret en simpel metode til objektiv måling af patent BD numre i muse leveren.

Vores analyse er afhængig af korrekt fiksering og integrering af muse leveren. Lever er indlejret ventrale side op for at sikre lignende skæring fra en prøve til en anden. Dette er den mest stabile position. De sektioner, der anvendes til farvning skal være dybt nok i leveren lobes, da der er forskelle i antallet af BDs og størrelsen af PVs i periferien versus hilum af leveren. Vi lejlighedsvis Se PVs, der er skåret i længderetningen. I disse tilfælde er der normalt en tilstødende BD, der også skæres længderetningen og fremstår som et langt åbent rør. For at sikre reproducerbarhed, tæller vi disse lange rør som en enkelt BD. identifikation af patent BDs er entydig for det meste. Men nogle galde strukturer synes lumenized, men viser ikke runden til ellipsoide morfologi typisk set i normale BDs14. I vores hænder, dette kan undertiden resultere i en struktur, der kaldes en BD af en investigator, men ikke af en anden kollega. Derfor, for at sikre konsistens og reproducerbarhed i dataanalyse og præsentation, anbefaler vi, at alle prøver relateret til et bestemt projekt analyseres af to efterforskere selvstændigt.

Anti-CK8 har vist sig at markere umodne og modne Biliære celler, mens anti-CK19 kun markerer modne Biliære celler12,20. Derfor, selv om en PV ikke er forbundet med en moden BD, det kan let skelnes fra centrale vener på grund af tilstedeværelsen af CK8 + celler. Brug af disse to antistoffer i kombination med anti-αSMA sikrer fuldstændig dækning af Portal skrifter i vores kvantificering. Desuden, i vores hænder, den enkelte CK19 eller CK8 farvning af galde cellerne genererer et relativt svagt signal og er forbundet med nogle baggrunds farvning. Blanding af de to CK-antistoffer resulterer i et konstant stærkt signal i Biliære celler og letter derfor kvantificeringen.

Modning af det intrahepatiske Biliære træ sker i en hilar-til-perifer retning og fortsætter efter natally21. Faktisk er der mange flere umodne cholangiocytter i tidlige postnatale lever, især i perifere områder, som er på den førende front af postnatale leveren ekspansion. Desuden observerede vi en ændring i BD-numre som dyrene alder8, med flere kanaler i ældre dyr. Derudover indeholder nogle Portal strukturer flere BD'er, mens andre har en eller ingen kanaler, især langs lever periferien. Vi bruger en mikroskopi slide, der dækker alle lever lapper for hvert dyr og systematisk kvantificere BD til PV ratio på tværs af hele diaset. Selv om dette ikke er afgørende, det sikrer, at rigelig Portal skrifter analyseres for hvert dyr, uanset alder og leverstørrelse (60-90 PVs per lever afhængigt af genotype og alder). Desuden, ved at analysere alle PVs på diaset, sikrer vi, at både mere modne hilar og mindre modne perifere områder tælles i alle stadier af lever udviklingen. Dækker alle lever lapper for hvert dyr kan også mindske variabilitet i målinger, hvis en given mutation ikke påvirker BD udvikling ensartet på tværs af leveren.

Metoden er begrænset til at skelne mindre galde ledninger fra grupper af uindarbejdet Biliære celler. Galde ductules4 er normalt for små til at blive anerkendt som en lumenized struktur i forstørrelsen, som vi bruger til at analysere disse faringer. Derfor vil de sandsynligvis blive udelukket fra vores kvantifikationer, og dermed er metoden skæv i retning af at identificere medium til store kanaler. På trods af denne begrænsning skelner den beskrevne metode let mellem Jag1 +/– og Jag1 +/+ lever. Desuden er den følsom nok til at detektere den delvise redning af Jag1 +/– BD Brandt ved samtidig tab af en kopi af Polgut1 +/– og den beskedne stigning i BD-tætheden i Jag1 +/+- dyr med betinget tab af Poglut1 i vaskulære glatte muskelceller8. Disse observationer indikerer denne metodes anvendelighed til at bestemme ændringer i BD-tæthed i forskellige genetiske baggrunde, selv når ændringerne i BD-nummer er beskedne.

I de seneste år, visualisering af 3D-strukturen i galde træet er blevet brugt af flere grupper til at analysere BD udvikling22,23,24,25. Disse elegante metoder er afhængige af at fylde galde træet fra den fælles BD ved blæk eller harpiks, og derfor undersøge patency af galdesystemet. Desuden giver de oplysninger om 3D-strukturen i galde træet og dets dannelse i leveren periferi som leveren vokser, som ikke kan vurderes ved 2D vurdering anvendes i protokoller som den, der præsenteres her. Men, vellykket ydeevne af disse 3D visualisering teknikker kræver betydelig ekspertise26. I modsætning hertil er den teknik, der præsenteres her, ret ligetil og kan udføres af enhver gruppe med adgang til rutine udstyr til histologisk og billedbehandlings analyse. Desuden vil analysen af de sektioner, der er dobbelt plettet for wsck og αsma, også vise, om der findes ductular-reaktioner eller vaskulære glatte muskel celle anomalier i leveren8,27,28. Vi foreslår, at kvantificering af BD til PV ratio i hele leveren sektioner kan give en følsom og reproducerbar måling af biliær udvikling i mus og kan tjene som en forholdsvis nem teknik til at hjælpe forskerne beslutte, om de bør overveje mere sofistikerede teknikker som 3D visualisering af biliær træet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender støtte fra National Institutes of Health (NIH) (R01 GM084135 og R01 DK109982), en pilot/gennemførligheds pris fra Texas Medical Center fordøjelses sygdoms Center under NIH P30 DK56338, og en Alagille syndrom Accelerator Award fra Det medicinske fundament.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isothesia (Isoflurane) Henry Schein 11695-6776-2
Desiccator Bel-Art 16-800-552
10% PFA Electron Microscopy Sciences 15712
50 mL tube ThermoScientific 339653
70% Ethanol Decon Laboratories 2401
95% Ethanol Decon Laboratories 2801
100% Ethanol Decon Laboratories 2701
HistoChoice VWR Life Sciences H103-4L clearing agent
Omnisette Tissue Cassette Fisher HealthCare 15-197-710E
Macrosette Simport M512
Paraplast X-TRA McCormick Scientific 39503002 Parrafin
Tissue Mold Fisher Scientific 62528-32
Microtome Microm HM 325
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Xylene Fisher Scientific C8H10
Tris-Based Antigen Retrieval Vector Laboratories H-3301
Pressure Cooker Instant Pot Lux Mini
Mini Pap Pen Life Technologies 8877
Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) J.T. Baker X251-07
Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100) J.T. Baker X198-07
Normal Goat Serum Jackson Immunoresearch 005-000-121
anti-CK8 Developmental Studies Hybridoma Bank TROMA-I Antibody Registry ID AB531826
anti-CK19 Developmental Studies Hybridoma Bank TROMA-III Antibody Registry ID AB2133570
anti-αSMA Sigma Aldrich A2547, Clone 1A4
anti-rat-Alexa488 ThermoFisher A21208
anti-mouse-Cy5 Jackson Immunoresearch 715-175-151
DAPI Vector Laboratories H-1000
22 x 50 mm2 micro cover glass VWR Life Sciences 48393 059
Fluorescence Microscope Leica DMI6000 B
Kimwipes Kimtech Science 05511
VECTASHIELD Vector Laboratories H-1000 Antifade Mounting Medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zong, Y., et al. Notch signaling controls liver development by regulating biliary differentiation. Development. 136 (10), 1727-1739 (2009).
  2. Clotman, F., et al. Control of liver cell fate decision by a gradient of TGFβ signaling modulated by Onecut transcription factors. Genes & Development. 19 (16), 1849-1854 (2005).
  3. Karpen, S. J. Update on the etiologies and management of neonatal cholestasis. Clin Perinatol. 29 (1), 159-180 (2002).
  4. Roskams, T. A., et al. Nomenclature of the finer branches of the biliary tree: canals, ductules, and ductular reactions in human livers. Hepatology. 39 (6), 1739-1745 (2004).
  5. Oda, T., et al. Mutations in the human Jagged1 gene are responsible for Alagille syndrome. Nature Genetics. 16 (3), 235 (1997).
  6. Li, L., et al. Alagille syndrome is caused by mutations in human Jagged1, which encodes a ligand for Notch1. Nature Genetics. 16 (3), 243 (1997).
  7. Xue, Y., et al. Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the Notch ligand Jagged1. Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).
  8. Thakurdas, S. M., et al. Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi). Hepatology. 63 (2), 550-565 (2016).
  9. Hadchouel, M. Paucity of interlobular bile ducts. Seminars in Diagnostic Pathology. 9 (1), 24-30 (1992).
  10. Emerick, K. M., et al. Features of Alagille syndrome in 92 patients: frequency and relation to prognosis. Hepatology. 29 (3), 822-829 (1999).
  11. Poncy, A., et al. Transcription factors SOX4 and SOX9 cooperatively control development of bile ducts. Dev Biol. 404 (2), 136-148 (2015).
  12. Hofmann, J. J., et al. Jagged1 in the portal vein mesenchyme regulates intrahepatic bile duct development: insights into Alagille syndrome. Development. 137 (23), 4061-4072 (2010).
  13. McCright, B., Lozier, J., Gridley, T. A mouse model of Alagille syndrome: Notch2 as a genetic modifier of Jag1 haploinsufficiency. Development. 129 (4), 1075-1082 (2002).
  14. Andersson, E. R., et al. Mouse Model of Alagille Syndrome and Mechanisms of Jagged1 Missense Mutations. Gastroenterology. 154 (4), 1080-1095 (2018).
  15. Loomes, K. M., et al. Bile duct proliferation in liver-specific Jag1 conditional knockout mice: effects of gene dosage. Hepatology. 45 (2), 323-330 (2007).
  16. Brulet, P., Babinet, C., Kemler, R., Jacob, F. Monoclonal antibodies against trophectoderm-specific markers during mouse blastocyst formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (7), 4113-4117 (1980).
  17. Skalli, O., et al. A monoclonal antibody against alpha-smooth muscle actin: a new probe for smooth muscle differentiation. J Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2787-2796 (1986).
  18. Kamath, B. M., et al. A longitudinal study to identify laboratory predictors of liver disease outcome in Alagille syndrome. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 50 (5), 526 (2010).
  19. Mouzaki, M., et al. Early life predictive markers of liver disease outcome in an International, Multicentre Cohort of children with Alagille syndrome. Liver International. 36 (5), 755-760 (2016).
  20. Shiojiri, N. Development and differentiation of bile ducts in the mammalian liver. Microsc Res Tech. 39 (4), 328-335 (1997).
  21. Crawford, J. M. Development of the intrahepatic biliary tree. Semin Liver Dis. 22 (3), 213-226 (2002).
  22. Kaneko, K., Kamimoto, K., Miyajima, A., Itoh, T. Adaptive remodeling of the biliary architecture underlies liver homeostasis. Hepatology. 61 (6), 2056-2066 (2015).
  23. Schaub, J. R., et al. De novo formation of the biliary system by TGFbeta-mediated hepatocyte transdifferentiation. Nature. 557 (7704), 247-251 (2018).
  24. Sparks, E. E., Huppert, K. A., Brown, M. A., Washington, M. K., Huppert, S. S. Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice. Hepatology. 51 (4), 1391-1400 (2010).
  25. Tanimizu, N., et al. Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice. Hepatology. 64 (1), 175-188 (2016).
  26. Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. 3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system. J Vis Exp. (68), e4272 (2012).
  27. Popper, H., Kent, G., Stein, R. Ductular cell reaction in the liver in hepatic injury. J Mt Sinai Hosp N Y. 24 (5), 551-556 (1957).
  28. Yimlamai, D., et al. Hippo pathway activity influences liver cell fate. Cell. 157 (6), 1324-1338 (2014).

Tags

Udviklingsmæssige biologi lever udvikling galdegang cytokeratin notch signalering Alagille syndrom Jag1
Bestemmelse galdegang tæthed i muse leveren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Adams, J. M., Jafar-Nejad, H.More

Adams, J. M., Jafar-Nejad, H. Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver. J. Vis. Exp. (146), e59587, doi:10.3791/59587 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter