Summary
Wir präsentieren eine recht einfache und empfindliche Methode zur genauen Quantifizierung der Gallengangsdichte in der Mausleber. Diese Methode kann bei der Bestimmung der Auswirkungen von genetischen und ökologischen Modifikatoren und der Wirksamkeit potenzieller Therapien in Mausmodellen von Gallenerkrankungen helfen.
Abstract
Maus wird allgemein als Modellorganismus verwendet, um Gallenkrankheiten zu untersuchen. Um die Entwicklung und Funktion des Gallensystems zu bewerten, werden verschiedene Techniken verwendet, einschließlich Serumchemie, histologische Analyse und Immunostainierung für bestimmte Marker. Obwohl diese Techniken wichtige Informationen über das Gallensystem liefern können, stellen sie oft kein vollständiges Bild der Gallengang (BD) Entwicklungsfehler in der gesamten Leber dar. Dies ist zum Teil auf die robuste Fähigkeit der Mausleber zurückzuführen, die Galle auch bei Tieren mit erheblichen Beeinträchtigungen in der Gallenentwicklung zu entwässern. Hier stellen wir eine einfache Methode zur Berechnung der durchschnittlichen Anzahl von BDs vor, die jeder Portalvene (PV) zugeordnet sind, in Abschnitten, die alle Lappen mutierter/transgener Mäuse abdecken. Bei dieser Methode werden Lebern in einer stereotypen Weise montiert und geschnitten, um den Vergleich zwischen verschiedenen Genotypen und experimentellen Bedingungen zu erleichtern. BDs werden mittels Lichtmikroskopie von Cytokeratin-gefärbten Cholangiocyten identifiziert und dann gezählt und durch die Gesamtzahl der im Leberbereich vorhandenen PVs dividiert. Als Beispiel zeigen wir, wie diese Methode klar zwischen Wildtypmäusen und einem Mausmodell des Alagille-Syndroms unterscheiden kann. Die hier vorgestellte Methode kann keine Techniken ersetzen, die die dreidimensionale Struktur des Gallenbaums visualisieren. Es bietet jedoch eine einfache und direkte Möglichkeit, die BD-Entwicklung und den Grad der kanalulären Reaktionsbildung bei Mäusen quantitativ zu bewerten.
Introduction
Der Gallenbaum ist ein kritischer Teil der Säugetierleber, so dass der Durchgang der Galle von Hepatozyten in den Darm ermöglicht. Intrahepatische Gallengänge (BDs) werden durch Cholangiozyten gebildet, die sich von bipotenten Hepatoblasten durch Notch und TGF-Signalisierung1,2unterscheiden. Die richtige Spezifikation und Das Richtige Engagement von Cholangiocyten und deren Montage in ausgereifte BDs sind entscheidend für die Entwicklung des intrahepatischen Gallenbaums. Da die Leber während der Entwicklung oder bei der Organregeneration wächst, muss sich das Gallensystem entlang der Leber entwickeln, um eine ordnungsgemäße Gallendrainage zu gewährleisten. Darüber hinaus führen eine Reihe von syndromischen und nicht-syndromischen Erkrankungen zu einem Mangel an intrahepatischen BDs3. Darüber hinaus führen eine Reihe akuter und chronischer Lebererkrankungen zu sogenannten kanalulären Reaktionen in der Leber, die definiert sind als das Vorhandensein einer signifikanten Anzahl von Zellen, die Gallenmarker exprimieren, aber nicht notwendigerweise aus Gallenzellen oder Patent BDs4. Bei der Multisystem-Störung Alagille-Syndrom (ALGS), Haploinsuffizienz der Kerb Liganden gezackt1 (JAG1) führt zu schlechter BD-Bildung und Cholestase5,6. Unser Labor hat kürzlich gezeigt, dass eine zuvor generierte Jag1 heterozygote Mauslinie7 ein Tiermodell von BD-Mangel in ALGS8ist. In diesem Mausmodell von ALGS sind Cholangiozyten noch vorhanden. Sie verpflichten sich jedoch nicht zur Aufnahme in ausgereifte, patente BDs8. Daher erfordert die Analyse der Leber in einem Modell der BD-Knappheit mehr als das scheinbare Vorhandensein oder Fehlen von Cholangiocyten. Es ist wichtig, genau zu beurteilen, inwieweit reife BDs in der Leber vorhanden sind.
In der anatomischen Pathologie gibt es anerkannte quantitative Methoden zur Beurteilung, ob BD-Mangel existiert9. Zum Beispiel, Studien an ALGS bei menschlichen Patienten oft quantifizieren die BD zu Portal Vene (PV) Verhältnis durch die Analyse von mindestens 10 Portalgefäße pro Leberbiopsie9,10. Die Analyse der Form und des Gesamtvorhandenseins oder Fehlens von Patent-BDs, kombiniert mit Serumchemie, kann wertvolle Informationen über die BD-Entwicklung bei Mäusen11,12,13liefern. Jedoch, Mäuse können eine erhebliche Anzahl von BDs mit nur einem bescheidenen Anstieg des Serum Bilirubin-Spiegel8verlieren. Dementsprechend kann eine quantitative Methode, die die Anzahl der pro PV vorhandenen BDs bewertet, ein direkteres Maß für den Grad des BD-Mangels bei Mäusen liefern. In einem kürzlich veröffentlichten Bericht quantifizierten wir die Anzahl der BDs pro PV über alle Leberlappen hinweg und berichteten von einem signifikanten Rückgang des BD-PV-Verhältnisses bei Jag1+/– Tieren8. Im Laufe unserer Analyse stellten wir fest, dass trotz der signifikanten Variation des Grades der Entzündungsreaktion und der Kanalreaktionen das BD-PV-Verhältnis nicht viel Variabilitätaufweist 8. Darüber hinaus konnte die Quantifizierung des BD-PV-Verhältnisses nachweisen, dass das Entfernen einer Kopie des Glykosyltransferase-Gens Poglut1 in Jag1+/– Tiere ihren BD-Mangel deutlich verbessern kann8. In einem Jag1+/+ Hintergrund führt der bedingte Verlust von Poglut1 in vaskulären glatten Muskelzellen zu einem progressiven Anstieg der BD-Zahlen, der bescheiden ist (20-30%) bei P7, wird aber bei Erwachsenendeutlich 8. Auch diese Technik erlaubte es uns zu zeigen, dass selbst bei P7 die Zunahme der BD-Dichte bei diesen Tieren statistisch signifikant ist. Bemerkenswert ist, dass die erhöhte BD-Dichte in diesem Genotyp im Alter von vier Monaten auch durch Harzgussanalyse validiert wurde. 8 Diese Beobachtungen und andere Berichte, die die BD-Dichte in verschiedenen ALGS-Mausmodellen14,15 maßen, veranlassten uns, diese Methode in unsere Gesamtstrategie zur Analyse von Gallendefekten in verschiedenen Mutanten zu integrieren. und transgene Mäuse.
Hier beschreiben wir eine einfache Technik, die verwendet werden kann, um den Grad des BD-Mangels in Mausmodellen von Lebererkrankungen zu untersuchen (Abbildung 1). Bei dieser Methode wird die Co-Färbung mit den Cholangiozytenmarkern Cytokeratin (CK) 8 und CK19 (im Folgenden Wide-Spektrum CK, wsCK) verwendet, um BDs und ungekauzte Cholangiozyten in der Mausleber zu visualisieren. Ein Antikörper gegen alpha-glattes Muskelaktin wird der Färbung zur Kennzeichnung von Gefäßen hinzugefügt. Die systematische Analyse des BD-PV-Verhältnisses in einem Abschnitt, der alle Leberlappen abdeckt, stellt sicher, dass für jeden Genotyp eine große Anzahl von Pv-VVs analysiert wird. Da unsere Methode auf der Quantifizierung von BDs und PVs in 2D-Bildern beruht, ist sie nicht geeignet, die Auswirkungen einer gegebenen Mutation auf die 3D-Struktur des Gallenbaums oder die Integrität der kleinen Gallenschläuche zu untersuchen. Dennoch bietet es eine einfache und objektive Strategie für die Ermittler, die Gallenentwicklung in der Maus zu bewerten.
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Protocol
Alle Tiere wurden in einer Barrieretieranlage am Baylor College of Medicine gemäß den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee und gemäß den genehmigten Tierprotokollen untergebracht.
1. Sammlung von Maus Lebergewebe
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Vorbereitung der Maus für die Leberernte
- Euthanisieren Sie die Maus mit Isofluran.
- Führen Sie zervikale Dislokation der Maus, um den Tod zu gewährleisten.
- Machen Sie einen Querschnitt etwa einen Zoll unter dem Rippenkäfig.
- Setzen Sie die gesamte ventrale Oberfläche der Leber aus.
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Sammlung der Mausleber
- Vorsichtig, mit einer kleinen Schere, durch schneiden die Bänder, die die Leber mit anderen Organen im Bauch verbinden.
- Schneiden Sie durch die gemeinsame BD, um die Leber aus dem Darm zu lösen.
- Entfernen Sie die Leber vorsichtig, indem Sie an der Gallenblase festhalten und sofort in ein 50 ml-Rohr, das zu drei Vierteln mit 4% Paraformaldehyd (PFA) gefüllt ist, aufstellen.
2. Fixierung und Einbettung der Leber in Paraffin
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fixierung
- Fixieren Sie das Lebergewebe für 48 h in 4% PFA bei 4 °C.
- Waschen Sie das Gewebe mit 70% EtOH für 1 h bei 4 °C.
- Waschen Sie das Gewebe zweimal mit 95% EtOH für je 1 h bei 4 °C.
- Waschen Sie das Gewebe zweimal mit 100% EtOH für je 1 h bei 4 °C.
-
lichtung
- Waschen Sie das Lebergewebe mit Clearingmittel (Tabelle der Materialien) dreimal für jeweils 30 min bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Die Leber sollte sich nach der dritten Wäsche starr anfühlen.
- Waschen Sie das Lebergewebe mit Clearingmittel (Tabelle der Materialien) dreimal für jeweils 30 min bei Raumtemperatur.
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Einbettung in Paraffin
- Legen Sie die Gewebekassette in einer Gewebeform in Paraffinwachs für 3 Waschungen, jeweils 30 min. Wachs sollte auf 60 °C vorgewärmt werden.
- Füllen Sie die Gewebeform mit Paraffinwachs auf drei Viertel Höhe und halten Sie auf einem Heizblock bei 60 °C.
- Legen Sie die Leber in die Form mit der ventralen Seite nach oben.
- Entfernen Sie die Form vorsichtig aus dem Heizblock.
- Legen Sie die Oberseite der Kassette auf die Form und krumnet mit heißem flüssigen Paraffin.
- Lassen Sie die Form und block über Nacht auf Raumtemperatur abkühlen.
HINWEIS: Gewebeblöcke können nun bei Raumtemperatur gelagert werden.
3. Schnitt von Lebergewebe
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Vorbereitung des Blocks für die Schnitte
- Legen Sie die Form für 5 min auf Eis, bevor Sie den Block aus der Form entfernen.
- Legen Sie den Block auf Eis mit einem Labor-Gewebepapier zwischen Block und Eis vorhanden.
- Halten Sie den Block auf Eis, wenn Sie nicht schneiden für die besten Gewebe-Slicing-Ergebnisse.
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Schnitt der Leberblöcke
- Mit einem Mikrotom, beginnen Sie durch die oberflächliche, dorsale Seite der Leber zu abschnitt. Die Abschnitte sollten 5 m betragen.
- Überprüfen Sie die oberflächlichen Abschnitte unter einem Seziermikroskop, um sicherzustellen, dass die Abschnitte nicht geschoren oder gefaltet werden.
- Nehmen Sie einen Abschnitt der Leber, der den Caudate-Lappen enthält.
HINWEIS: Für einige Blöcke haben Sie die linken, medialen, rechten und caudate Lappen auf der gleichen Gewebescheibe. - Für Blöcke, in denen nicht alle vier Lappen auf derselben Folie vorhanden sind, fahren Sie fort, bis der linke, mittlere und rechte Lappen auf derselben Folie vorhanden sind.
4. Immunhistochemie für wsCK und SMA
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Verarbeitung von Dias für die Immunhistochemie
- Wählen Sie eine Folie pro zu analysierendem Genotyp aus.
- Waschen Sie die Rutsche für 15 min in Xylol, 100% EtOH, 95% EtOH und schließlich 70% EtOH (3 x 5 min in jeder Lösung).
- Waschen Sie die Rutsche für 5 min in deionisierte M2O.
- Tauchen Sie die Rutsche in die Antigen-Retrieval-Lösung (Tris-basiert, hoher pH-Wert).
- Unter Druck in einem Schnellkochtopf 3 min bei 10 psi erhitzen.
- Lassen Sie die Rutsche auf Raumtemperatur abkühlen (ca. 35 min).
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Blockieren der Gewebeabschnitte
- Beschreiben Sie mithilfe eines Pap-Stifts die Abschnitte auf der Folie.
- Setzen Sie Phosphat-gepufferte Saline (PBS) + 0,1% Tween auf, um den Abschnitt zweimal, jeweils 5 min abzudecken.
- Machen Sie blockieren Puffer durch Mischen Normal Goat Serum (NGS) bei 1:50 in PBS + 0.3% Triton. Um genügend Puffer sowohl für die Blockierung als auch für die primäre Antikörperanwendung zu haben, sind 100 l pro Abschnitt ausreichend.
- Tragen Sie pro Abschnitt 100 L Blockierlösung auf.
- Inkubieren Sie die mit der Sperrlösung bedeckten Dias bei 4 °C für 1 h.
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Färbung für wsCK und SMA
- Verdünnung von Anti-CK8- und Anti-CK19-Antikörpern16 (Developmental Studies Hybridoma Bank, TROMA-I bzw. TROMA-III) 1:20 im Sperrpuffer, um für wsCK zu färben. Verdünnen Sie den Anti-SMA-Antikörper17 (Materialtabelle) im selben Puffer auf 1:200.
- Tragen Sie 100 l der verdünnten Antikörperlösung auf, die alle drei Antikörper enthält, auf jeden Abschnitt auftragen.
- Inkubieren Sie die mit der Antikörperlösung bedeckten Dias über Nacht bei 4 °C.
- Waschen Sie die Dias mit PBS + 0,1% Triton dreimal, jeweils 5 min.
- Verdünnung von Sekundärantikörpern (Anti-Ratte-Alexa488 und Anti-Maus-Cy5) 1:200 in PBS + 0,3% Triton.
- Tragen Sie 100 l der sekundären Antikörperlösung auf, die beide sekundären Antikörper enthält, auf die Dias auf.
- Bei Raumtemperatur 1 h inkubieren.
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DAPI Kernfärbung und -montage
- Waschen Sie die Dias dreimal, jeweils 5 min.
- Tragen Sie 100 L DAPI (1:3000) auf jeden Abschnitt für 10 min auf.
- Antifade Mounting Medium (Materialtabelle) auf die Dias auftragen und einen Glasdeckel auf die Gewebeabschnitte legen. Lassen Sie die Dias bei 4 °C über Nacht. Versiegeln Sie die Dias am nächsten Tag.
- Bewahren Sie die Dias bei 4 °C auf und zeigen Sie das Bild innerhalb von 1 Woche nach der Montage.
5. Bildgebung und Quantifizierung von BDs
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Bildgebende Leberabschnitte
- Blinden Sie sich vor der Bildgebung mit Hilfe eines Labormitglieds für den Genotyp der Probe. Stellen Sie sicher, dass alle Bildgebungsdateien neben einer Tier-/Probennummer keinen Genotyp oder andere spezifische Identifizierungsinformationen enthalten.
- Nehmen Sie mit einem Fluoreszenzmikroskop 20x Bilder mit 1x Zoom pro Abschnitt auf und stellen Sie sicher, dass jede PV in der Leber abgebildet wird. Schließen Sie die linken, medialen, rechten und caudate Lappen ein.
HINWEIS: Wir finden in der Regel 60-90 Portal-Trakte pro Tier, abhängig von der Größe der Leber. - Um die PVs zu identifizieren, suchen Sie nach der Färbung von SMA plus wsCK. Strukturen, die "SMA positiv sind, aber keine wsCK-Färbung haben, sind keine Portalstrukturen.
-
Identifikation und Zählung von BDs
- Erstellen Sie eine Kalkulationstabelle mit den folgenden Spalten: Tier-/Beispielnummer, Bildnummer, Anzahl der PVs und Anzahl der BDs.
- Wenn Sie jedes Bild durchgehen, identifizieren und erfassen Sie die Anzahl der PVs pro Bild.
- Identifizieren Sie Patent-BDs in jedem Bild durch das Vorhandensein von Cholangiocyten (wsCK+), die ein definierbares Lumen umgeben. Strukturen sollten durch Mesenchym von anderen wsCK+-Zellen getrennt sein.
- Zählen Sie jedes Patent BD und platzieren Sie in der gleichen Spalte wie die Bildnummer.
- Tun Sie dies für jedes Bild, das von einer PV aufgenommen wurde.
- Berechnen Sie die Summe aller PVs und aller BDs in der Leberprobe.
- Berechnen Sie das BD-PV-Verhältnis für die Leberprobe.
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Representative Results
Wir haben bereits Gallendefekte bei Jag1+/– Tieren dokumentiert, einem Mausmodell von ALGS8. Um das BD-PV-Verhältnis zu bestimmen, haben wir P30-Mausleber geschnitten und für CK8 und CK19 (wsCK) zusammen mit dem Gefäßmarker SMA mitgefärbt. Wir haben dann alle PVs in jedem der Leberlappen abgebildet. Wie in Abbildung 2Adargestellt, haben wir PVs als "SMA-befleckte Gefäße" definiert, die benachbarte wsCK-Färbung (Pfeilspitzen) haben. Die "SMA-gefärbten Strukturen ohne wsCK" waren zentrale Venen und sollten nicht in die Analyse einbezogen werden (Pfeil).
Nachdem PVs identifiziert wurden, identifizierten wir Patent-BDs anhand ihrer charakteristischen Form. Wie in Abbildung 3dargestellt, haben Patentkanäle ein deutlich definierbares Lumen, das von wsCK+ Cholangiocyten umgeben ist. Die Kanäle sind in der Regel von nahegelegenen Kanälen oder Cholangiozyten durch Mesenchym (Pfeilspitze) getrennt. wsCK+-Zellen, die kein definierbares Lumen haben, an benachbarte Zellen angefügt sind oder isoliert erscheinen, werden nicht auf die Gesamtzahl der BDs (Pfeile) angerechnet. Abbildung 3A zeigt einen Wildtyp-Leberabschnitt mit einer PV, die mit einem vollständig patentierten Kanal zusammen mit mehreren nicht inkorporierten Zellen verbunden ist. Abbildung 3B ist ein repräsentativer Leberabschnitt eines P30 Jag1+/– Tieres. Um die drei PVs in diesem Abschnitt sind keine Patent-BDs vorhanden. Alle wsCK+-Zellen sind nicht inkorporiert und sollten daher nicht gezählt werden. Dieses Bild unterstreicht die Bedeutung einer sorgfältigen BD-Zählung, da das Vorhandensein oder Fehlen von wsCK+-Zellen die Jag1+/-und Wild-Leber nicht unterscheidet.
Wie in Abbildung 1Ddargestellt, beinhaltet die Analyse des BD-PV-Verhältnisses die Zählung jeder PV im Leberbereich zusammen mit der Gesamtzahl der Patent-BDs, die um jede PV herum vorhanden sind. Bei der Analyse der Jag1+/– Lebern stellten wir fest, dass bei diesen Tieren nicht unbedingt verschiedene Lappen im gleichen Ausmaß betroffen sind (unveröffentlichte Daten). Daher zählen wir in der Regel PVs über die linke, mediale, rechte und kaudate Lappen, um eine vollständige Leberabdeckung zu gewährleisten. Nach der Tabelleneinreichung der gesamten PVs und BDs wird das Verhältnis für den gesamten Abschnitt berechnet.
In Abbildung 4zeigten wir die Analyse der BD-PV-Verhältnisse für 3 Wild-Typ- und 3 Jag1+/--Tiere. Diese Grafik zeigt, wie die beiden Genotypen anhand der BD-Zahlen leicht unterschieden werden können. Darüber hinaus bietet diese Methode eine quantitative Messung für die Analyse des Grades der Rettung des Jag1+/- Phänotyps durch genetische Manipulationen, wie zuvor berichtet8.
Abbildung 1: Schematic des experimentellen Prozesses. (A) Die Leber wird ganz von der Maus geerntet. (B) Leberproben werden für 48 h fixiert, dehydriert und gelöscht. (C) Das Lebergewebe ist in Paraffin eingebettet. Die Abschnitte werden auf geladenen Dias gefertigt und platziert und für wsCK und SMA gebeizt. (D) Folien werden abgebildet, und die Anzahl der PVs und BDs wird aufgezeichnet. Das BD-PV-Verhältnis (BD:PV) wird für den gesamten Leberabschnitt berechnet. HA = Leberarterie; CV = zentrale Vene. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Unterscheidung zentraler Venen von PVs. (A) Eine PV wird durch das Vorhandensein von SMA-Färbung und umgebenden wsCK+ Cholangiocyten (Pfeilspitzen) identifiziert. (B) Zentrale Venen werden durch das Vorhandensein von SMA-Färbung ohne wsCK+ Cholangiocyten um die Struktur (Pfeil) identifiziert. (A' und B') Graustufenbilder, die die Kanäle von A bzw. B zeigen. Scale bar = 100 m und gilt für alle Panels. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Identifizierung von Patent-BDs. (A-A') In P30 Wildlebern zählen wir runde zu ellipsoiden Strukturen mit einem erkennbaren Lumen, umgeben von wsCK+ Cholangiocyten als Patent BD (Pfeilspitze). Cholangiocytes, die sich nicht um ein Lumen befinden, gelten als nicht inkorporiert und werden nicht gezählt (Pfeile). (B-B') In Jag1+/– Lebern sind Cholangiozyten noch vorhanden (Pfeile). Die meisten sind jedoch nicht in Patent-BDs integriert. Scale bar = 100 m und gilt für alle Panels. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Der BD-zu-PV-Graph aus P30-Mauslebern. BDs und PVs werden quantifiziert und das BD-PV-Verhältnis erzeugt. Wie bereits8 berichtet, haben Jag1+/– Tiere eine charakteristische und signifikante Abnahme des BD-PV-Verhältnisses im Vergleich zu Wildtieren. Für die statistische Analyse wurde ein zweiseitiget-t-Test durchgeführt. Horizontale Linien zeigen Mittelwerte an. P<0.001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Analyse der BD-Entwicklung und -Reparatur bei Mäusen ist ein wichtiges Instrument zur Untersuchung der Pathogenese und des Mechanismus cholestatischer Erkrankungen. Darüber hinaus hängt die Entwicklung neuer Therapien zum Teil von der Etablierung eines reproduzierbaren und vorzugsweise quantifizierbaren Phänotyps ab. Aktuelle Phänotypisierung in Mausmodellen beinhaltet in der Regel Serumchemie, Leberhistologie und Immunostainierung für zelltypspezifische Marker. Obwohl diese Techniken wertvolle Informationen über die Struktur und Funktion des Gallensystems generieren, liefern sie kein direktes Maß für die Auswirkungen einer bestimmten genetischen Manipulation auf die Anzahl der BDs. In der anatomischen Pathologie wird BD-Mangel bei menschlichen Patienten durch die Analyse des BD-PV-Verhältnisses in einem Biopsieabschnitt9bestimmt. Während Ärzte Serum-Chemie-Analyse verwenden, um die Schwere von Cholestase und Lebererkrankungen bei ALGS und anderen cholestatischen Erkrankungen18,19zu bestimmen, ist die histologische Bewertung in Mausmodellen entscheidend für das Verständnis die Auswirkungen von Krankheitsmodifikatoren auf die BD-Entwicklung und die Wirksamkeit von Therapien auf die Wiederherstellung der normalen Kanalentwicklung. Dies liegt zum Teil daran, dass Mäuse eine starke Abnahme der Anzahl der Patent-BDs haben können, aber immer noch nur eine bescheidene Zunahme des Serum-Bilirubin-Spiegels8aufweisen, wahrscheinlich aufgrund der hocheffizienten Gallendrainage in der Mausleber. Unsere bisherige Arbeit hat gezeigt, dass Jag1 Heterozygosität führt zu beeinträchtigten BD Reifung, aber nicht das Fehlen von Cholangcioyten8. Um die BD-Entwicklung zu analysieren und den Schweregrad der Erkrankung in Mausmodellen zu bewerten, reicht es daher nicht aus, nur das Fehlen oder Vorhandensein von Cholangiozyten zu untersuchen. Um dieses Problem anzugehen, haben wir hier eine einfache Methode zur objektiven Messung von Patentierten BD-Nummern in der Mausleber vorgestellt.
Unsere Analyse ist abhängig von der richtigen Fixierung und Einbettung der Mausleber. Lebern sind eine ventrale Seite nach oben eingebettet, um eine ähnliche Schnitte von einer Probe zur anderen zu gewährleisten. Dies ist die stabilste Position. Die Abschnitte, die für die Färbung verwendet werden, müssen tief genug in den Leberlappen sein, da es Unterschiede in der Anzahl der BDs und der Größe von PVs in der Peripherie im Vergleich zum Hilum der Leber gibt. Gelegentlich sehen wir PVs, die längs geschnitten werden. In diesen Fällen gibt es in der Regel eine benachbarte BD, die auch längs geschnitten wird und wie ein langes offenes Rohr erscheint. Um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, zählen wir diese langen Rohre als einen einzigen BD. Die Identifizierung von Patent-BDs ist größtenteils eindeutig. Einige Gallenstrukturen erscheinen jedoch lumenisiert, zeigen aber nicht die runde bis ellipsoide Morphologie, die typischerweise in normalen BDs14zu sehen ist. In unseren Händen kann dies manchmal dazu führen, dass eine Struktur von einem Ermittler als BD bezeichnet wird, aber nicht von einem anderen Kollegen. Um Konsistenz und Reproduzierbarkeit bei der Datenanalyse und -präsentation zu gewährleisten, empfehlen wir daher, dass alle Proben im Zusammenhang mit einem bestimmten Projekt von zwei Prüfern unabhängig analysiert werden.
Anti-CK8 hat gezeigt, dass unreife und reife Gallenzellen markieren, während Anti-CK19 nur reife Gallenzellenmarkiert 12,20. Daher kann eine PV, selbst wenn sie nicht mit einem ausgereiften BD verbunden ist, aufgrund des Vorhandenseins von CK8+-Zellen leicht von zentralen Venen unterschieden werden. Die Verwendung dieser beiden Antikörper in Kombination mit Anti-SMA gewährleistet eine vollständige Abdeckung der Portaltrakte in unserer Quantifizierung. Darüber hinaus erzeugt in unseren Händen die individuelle CK19- oder CK8-Färbung der Gallenzellen ein relativ schwaches Signal und ist mit einer hintergrundfärbenden Färbung verbunden. Das Mischen der beiden CK-Antikörper führt zu einem konstant starken Signal in Gallenzellen und erleichtert somit die Quantifizierung.
Die Reifung des intrahepatischen Gallenbaums erfolgt in hilar-zu-peripherer Richtung und setzt sich postnatalfort 21. Tatsächlich gibt es viel mehr unreife Cholangiozyten in frühen postnatalen Lebern, vor allem in peripheren Gebieten, die an der Spitze der postnatalen Leberexpansion stehen. Darüber hinaus beobachteten wir eine Veränderung der BD-Zahlen im Alter von8Jahren mit mehr Kanälen bei älteren Tieren. Darüber hinaus enthalten einige Portalstrukturen mehrere BDs, während andere einen oder keine Kanäle haben, insbesondere entlang der Leberperipherie. Wir verwenden einen Mikroskop-Dia, der alle Leberlappen für jedes Tier abdeckt und das BD-PV-Verhältnis über die gesamte Folie systematisch quantifiziert. Obwohl dies nicht unbedingt notwendig ist, stellt es sicher, dass für jedes Tier unabhängig von Alter und Lebergröße (60-90 PVs pro Leber je nach Genotyp und Alter) ausreichend Portaltrakte analysiert werden. Darüber hinaus stellen wir durch die Analyse aller PVs auf der Rutsche sicher, dass sowohl reifere hilar als auch weniger reife Randbereiche in allen Stadien der Leberentwicklung gezählt werden. Die Abdeckung aller Leberlappen für jedes Tier kann auch die Variabilität in Messungen verringern, wenn eine bestimmte Mutation die BD-Entwicklung nicht gleichmäßig in der Leber beeinflusst.
Die Methode ist beschränkt, um kleinere Gallenschläuche von Gruppen von nicht inkorporierten Gallenzellen zu unterscheiden. Die Gallendukulile4 sind in der Regel zu klein, um als lumenisierte Struktur in der Vergrößerung erkannt zu werden, die wir verwenden, um diese Färbungen zu analysieren. Daher sind sie wahrscheinlich von unseren Quantifizierungen ausgeschlossen, und daher ist die Methode auf die Identifizierung von mittleren bis großen Kanälen ausgerichtet. Trotz dieser Einschränkung unterscheidet die hier beschriebene Methode leicht zwischen der Jag1+/-und der Jag1+/+ Leber. Darüber hinaus ist es sensibel genug, um die teilweise Rettung des Jag1+/– BD-Mangels bei gleichzeitigem Verlust einer Kopie von Polgut1+/ und die bescheidene Zunahme der BD-Dichte bei Jag1+/+ Tieren mit bedingtem Verlust von Poglut1 zu erkennen. in vaskulären glatten Muskelzellen8. Diese Beobachtungen deuten auf den Nutzen dieser Methode bei der Bestimmung von Veränderungen der BD-Dichte in verschiedenen genetischen Hintergründen hin, selbst wenn die Veränderungen der BD-Zahl bescheiden sind.
In den letzten Jahren wurde die Visualisierung der 3D-Struktur des Gallenbaums von mehreren Gruppen verwendet, um bd Entwicklung22,23,24,25zu analysieren. Diese eleganten Methoden basieren auf der Füllung des Gallenbaums aus dem gemeinsamen BD durch Tinte oder Harz, und daher die Durchgängigkeit des Gallensystems zu untersuchen. Darüber hinaus liefern sie Informationen über die 3D-Struktur des Gallenbaums und seine Bildung in der Leberperipherie, während die Leber wächst, die nicht durch 2D-Bewertung beurteilt werden kann, die in Protokollen wie dem hier vorgestellten verwendet wird. Die erfolgreiche Ausführung dieser 3D-Visualisierungstechniken erfordert jedoch erhebliches Fachwissen26. Im Gegensatz dazu ist die hier vorgestellte Technik recht einfach und kann von jeder Gruppe mit Zugang zu Routinegeräten für histologische und bildgebende Analysen ausgeführt werden. Darüber hinaus wird die Analyse der Abschnitte doppelgefleckt für wsCK und SMA auch zeigen, ob kanaluläre Reaktionen oder vaskuläre glatte Muskelzellanomalien in der Leber existieren8,27,28. Wir schlagen vor, dass die Quantifizierung des BD-PV-Verhältnisses in den gesamten Leberabschnitten ein empfindliches und reproduzierbares Maß für die Gallenentwicklung bei Mäusen liefern kann und als relativ einfache Technik dienen kann, um den Forschern bei der Entscheidung zu helfen, ob sie mehr ausgeklügelte Techniken wie die 3D-Visualisierung des Gallenbaums.
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Disclosures
Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Die Autoren würdigen die Unterstützung der National Institutes of Health (NIH) (R01 GM084135 und R01 DK109982), einen Pilot/Feasibility Award des Texas Medical Center Digestive Disease Center unter NIH P30 DK56338 und einen Alagille Syndrome Accelerator Award von Die Medical Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isothesia (Isoflurane) | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Desiccator | Bel-Art | 16-800-552 | |
| 10% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15712 | |
| 50 mL tube | ThermoScientific | 339653 | |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2401 | |
| 95% Ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| HistoChoice | VWR Life Sciences | H103-4L | clearing agent |
| Omnisette Tissue Cassette | Fisher HealthCare | 15-197-710E | |
| Macrosette | Simport | M512 | |
| Paraplast X-TRA | McCormick Scientific | 39503002 | Parrafin |
| Tissue Mold | Fisher Scientific | 62528-32 | |
| Microtome | Microm | HM 325 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Xylene | Fisher Scientific | C8H10 | |
| Tris-Based Antigen Retrieval | Vector Laboratories | H-3301 | |
| Pressure Cooker | Instant Pot | Lux Mini | |
| Mini Pap Pen | Life Technologies | 8877 | |
| Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | J.T. Baker | X251-07 | |
| Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100) | J.T. Baker | X198-07 | |
| Normal Goat Serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I | Antibody Registry ID AB531826 |
| anti-CK19 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-III | Antibody Registry ID AB2133570 |
| anti-αSMA | Sigma Aldrich | A2547, Clone 1A4 | |
| anti-rat-Alexa488 | ThermoFisher | A21208 | |
| anti-mouse-Cy5 | Jackson Immunoresearch | 715-175-151 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 22 x 50 mm2 micro cover glass | VWR Life Sciences | 48393 059 | |
| Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000 B | |
| Kimwipes | Kimtech Science | 05511 | |
| VECTASHIELD | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade Mounting Medium |
References
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