Summary
Nós apresentamos um método rather simples e sensível para a quantificação exata da densidade do colagogo no fígado do rato. Este método pode ajudar a determinar os efeitos dos modificadores genéticos e ambientais e a eficácia de terapias potenciais em modelos de camundongo de doenças biliares.
Abstract
O rato é amplamente utilizado como um organismo modelo para estudar as doenças biliares. Para avaliar o desenvolvimento e a função do sistema biliar, diversas técnicas são usadas, incluindo a química do soro, a análise histológica, e a imunomarcação para marcadores específicos. Embora essas técnicas possam fornecer informações importantes sobre o sistema biliar, muitas vezes não apresentam um quadro completo de defeitos de desenvolvimento do ducto biliar (BD) em todo o fígado. Isto é em parte devido à habilidade robusta do fígado do rato para drenar a bilis mesmo nos animais com prejuízo significativo no desenvolvimento biliar. Aqui nós apresentamos um método simples para calcular o número médio de BDs associados com cada veia portal (picovolt) nas seções que cobrem todos os lóbulos de ratos mutantes/transgenic. Neste método, os fígados são montados e seccionados de forma estereotipado para facilitar a comparação entre vários genótipos e condições experimentais. Os BDs são identificados por meio de microscopia de luz de colangiócitos corados por citoqueratina e, em seguida, contados e divididos pelo número total de PVs presentes na seção hepática. Como exemplo, mostramos como esse método pode distinguir claramente entre camundongos de tipo selvagem e um modelo de rato da síndrome de Alagille. O método aqui apresentado não pode substituir técnicas que visualizem a estrutura tridimensional da árvore biliar. No entanto, oferece uma maneira fácil e direta de avaliar quantitativamente o desenvolvimento de BD e o grau de formação de reação ductular em camundongos.
Introduction
A árvore biliar é uma parte crítica do fígado de mamíferos, permitindo a passagem da bile de hepatócitos para o intestino. Os ductos biliares intrahepáticos (BDS) são formados por colangiócitos, que se diferenciam dos hepatoblastos bipotenciais através da sinalização de entalhe e TGFβ1,2. A especificação e o compromisso apropriados dos colangiócitos e de seu conjunto em BDS maduros são críticos para o desenvolvimento da árvore biliar intrahepatic. Como o fígado cresce durante o desenvolvimento ou após a regeneração de órgãos, o sistema biliar precisa se desenvolver ao longo do fígado para garantir a drenagem biliar adequada. Além disso, um número de doenças sindrômica e não-sindrômica resultam no escassez de BDS intrahepatic3. Além disso, uma série de doenças hepáticas agudas e crônicas dão origem às chamadas reações ductulares no fígado, que são definidas como a presença de um número significativo de células que expressam marcadores biliares, mas não necessariamente surgem de células biliares ou forma patente BDs4. Na síndrome de Alagille do transtorno multisistema (algs), a haploinsuficiência do entalhe ligante jagged1 (JAG1) resulta em má formação de BD e colestase5,6. Nosso laboratório demonstrou recentemente que uma linha Jag1 heterozygous previamente gerada7 do rato é um modelo animal de BD escassez em algs8. Neste modelo do rato de algs, os colangiócitos estão ainda atuais. No entanto, eles não conseguem se comprometer com a incorporação em maduro, patentes BDs8. Conseqüentemente, a análise do fígado em um modelo de BD escassez exige mais do que a presença ou a ausência aparente de cholangiocytes. É importante avaliar com precisão o grau em que os BDs maduros estão presentes no fígado.
Na patologia anatômica, existem métodos quantitativos aceitos para avaliar se a BD escassez existe9. Por exemplo, estudos sobre algs em pacientes humanos frequentemente quantificam a razão BD para veia porta (PV) analisando pelo menos 10 vasos portais por biópsia hepática9,10. A análise da forma e a presença ou ausência geral de BDS de patentes, combinadas com a química sérica, podem fornecer informações valiosas sobre o desenvolvimento de BD em camundongos11,12,13. No entanto, os camundongos podem perder um número significativo de BDs com apenas um aumento modesto no nível de bilirrubina sérica8. Assim, um método quantitativo que avalia o número de BDS presentes por PV pode fornecer uma medida mais direta do grau de BD escassez em camundongos. Em um relatório recente, nós quantificamos o número de BDs por o picovolt através de todos os lóbulos do fígado e relatamos uma diminuição significativa na relação do BD ao picovolt em Jag1 +/- animais8. No decorrer de nossa análise, observamos que, apesar da significativa variação do grau de resposta inflamatória e das reações ductulares, a relação BD com PV não mostra muita variabilidade8. Além disso, a quantificação da relação BD para PV permitiu demonstrar que a remoção de uma cópia do gene glicosiltransferase Poglut1 em Jag1 +/– animais pode melhorar significativamente a sua BD escassez8. Em um fundo Jag1 +/+ , a perda condicional de Poglut1 em células musculares lisas vasculares resulta em um aumento progressivo nos números de BD, o que é modesto (20-30%) no P7, mas torna-se proeminente em adultos8. Mais uma vez, esta técnica permitiu-nos mostrar que, mesmo em P7, o aumento da densidade de BD nesses animais é estatisticamente significante. Da nota, a densidade aumentada do BD neste genótipo em quatro meses da idade foi validada com a análise do molde da resina também. 8 estas observações e outros relatórios que mediram a densidade do BD em modelos diferentes do rato de algs14,15 alertaram-nos incorporar este método em nossa estratégia total para analisar defeitos biliares em vários mutantes e camundongos transgênicos.
Aqui, detalhamos uma técnica direta que pode ser usada para examinar o grau de BD escassez em modelos de camundongo de doença hepática (Figura 1). Neste método, a cocoloração com marcadores de colangiócitos citoqueratina (CK) 8 e CK19 (a seguir CK de largo espectro, wsCK) é usada para visualizar BDs e colangiócitos não incorporados no fígado do mouse. Um anticorpo de encontro ao actínio alfa-liso do músculo (αSMA) é adicionado à mancha para etiquetar embarcações. A análise sistemática da relação BD para PV em uma seção que abrange todos os lóbulos hepáticos assegura que um grande número de PVs seja analisado para cada genótipo. Como nosso método depende da quantificação de BDs e PVs em imagens 2D, não é adequado para estudar os efeitos de uma determinada mutação na estrutura 3D da árvore biliar ou a integridade das pequenas condutas biliares. Não obstante, fornece uma estratégia simples e objetiva para que os investigadores avaliem o desenvolvimento biliar no rato.
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Protocol
Todos os animais foram alojados em uma instalação de barreira animal no Baylor College of Medicine por diretrizes institucionais de cuidado animal e uso do Comitê e protocolos de animais aprovados.
1. coleção do tecido do fígado do rato
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Preparação do rato para a colheita do fígado
- Eutanizar o rato usando isoflurano.
- Realize luxação cervical do mouse para garantir a morte.
- Faça uma incisão transversal aproximadamente uma polegada abaixo da caixa torácica.
- Expor toda a superfície ventral do fígado.
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Coleção do fígado do rato
- Com cuidado, com tesouras pequenas, corte através dos ligamentos que conectam o fígado a outros órgãos no abdômen.
- Corte através do BD comum para separar o fígado do intestino.
- Remova com cuidado o fígado segurando na vesícula biliar e coloc imediatamente em um tubo de 50 ml enchido a três quartos por paraformaldeído de 4% (PFA).
2. fixação e incorporação do fígado em parafina
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Fixação
- Fixar o tecido hepático para 48 h em 4% PFA a 4 ° c.
- Lave o tecido com 70% de EtOH por 1 h a 4 ° c.
- Lave o tecido duas vezes com 95% EtOH para 1 h cada a 4 ° c.
- Lave o tecido duas vezes com 100% EtOH para 1 h cada a 4 ° c.
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Limpar
- Lave o tecido hepático com agente de compensação (tabela de materiais) três vezes por 30 min cada em temperatura ambiente.
Nota: O fígado deve sentir-se rígido após a terceira lavagem.
- Lave o tecido hepático com agente de compensação (tabela de materiais) três vezes por 30 min cada em temperatura ambiente.
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Incorporação em parafina
- Coloque a fita de tecido em um molde de tecido em cera de parafina para 3 laves, 30 min cada. A cera deve ser pré-aquecida a 60 ° c.
- Encha o molde do tecido com a cera de parafina à altura de três quartos e mantenha-o em um bloco de aquecimento em 60 ° c.
- Coloque o fígado no molde com o lado ventral virado para cima.
- Retire cuidadosamente o molde do bloco de aquecimento.
- Coloc a parte superior da gaveta no molde e parte superior fora com a parafina líquida quente.
- Permita que o molde e o bloco esfriem à temperatura ambiente durante a noite.
Nota: Os blocos do tecido podem agora ser armazenados na temperatura ambiente.
3. seccionamento do tecido hepático
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Preparação do bloco de corte
- Coloc o molde no gelo por 5 minutos antes de remover o bloco do molde.
- Coloc o bloco no gelo com um papel de tecido do laboratório atual entre o bloco e o gelo.
- Mantenha o bloco no gelo quando não seccionamento para melhores resultados de fatiamento do tecido.
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Seccionamento dos blocos de fígado
- Usando um micrótomo, comece por seccionamento através do lado superficial, dorsal do fígado. As secções devem ser 5 μm.
- Verifique as seções superficiais um microscópio de dissecção para garantir que as seções não sejam cortadas ou dobradas.
- Tome uma seção do fígado que inclui o lobo caudado.
Nota: Para alguns blocos, você terá os lóbulos esquerdos, medial, direito e caudado na mesma fatia do tecido. - Para aqueles blocos onde todos os quatro lóbulos não estão presentes no mesmo slide, continue a fatiar até que os lóbulos esquerdos, medial e direito estejam presentes no mesmo slide.
4. immunohistochemistry para wsCK e αSMA
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Processamento de lâminas para imunohistoquímica
- Selecione um slide por genótipo a ser analisado.
- Lave o slide por 15 min em xileno, 100% EtOH, 95% EtOH e, finalmente, 70% EtOH (3 x 5 min em cada solução).
- Lave a lâmina durante 5 min em H2O deionizado.
- Mergulhe a corrediça na solução da recuperação do antígeno (pH Tris-baseado, elevado).
- Aqueça pressão em uma panela de pressão por 3 min a 10 psi.
- Deixe a corrediça arrefecer até à temperatura ambiente (aproximadamente 35 min).
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Bloqueando as secções de tecido
- Usando um PAP Pen, delinear as seções no slide.
- Aplique solução salina tampão fosfato (PBS) + 0,1% Tween para cobrir a seção duas vezes, 5 min cada.
- Faça o tampão de obstrução misturando o soro normal da cabra (NGS) em 1:50 em PBS + 0,3% Triton. Para ter o suficiente tampão para o bloqueio e a aplicação preliminar do anticorpo, 100 μL por a seção são suficientes.
- Aplique 100 μL de solução de bloqueio por secção.
- Incubar as lâminas cobertas com a solução de bloqueio a 4 ° c durante 1 h.
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Coloração para wsCK e αSMA
- Diluir anticorpos CK8 e anti-CK1916 (estudos de desenvolvimento hybridoma Bank, Troma-I e TROMA-III, respectivamente) 1:20 no bloqueio de buffer para manchar para wsck. Diluir o anticorpo anti-αSMA17 (tabela de materiais) para 1:200 no mesmo buffer.
- Aplicar 100 μL da solução de anticorpos diluídos contendo todos os três anticorpos para cada secção.
- Incubar as lâminas cobertas com a solução de anticorpos a 4 ° c durante a noite.
- Lave as lâminas com PBS + 0,1% Triton três vezes, 5 min cada.
- Diluir anticorpos secundários (anti-Rat-Alexa488 e anti-mouse-Cy5) 1:200 em PBS + 0,3% Triton.
- Aplique 100 μL da solução de anticorpos secundários contendo ambos os anticorpos secundários às lâminas.
- Incubar à temperatura ambiente durante 1 h.
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DAPI coloração nuclear e montagem
- Lave as lâminas três vezes, 5 min cada.
- Aplique 100 μL de DAPI (1:3000) a cada seção por 10 min.
- Aplique o meio de montagem Antifade (tabela de materiais) nas lâminas e coloque uma lamínula de vidro em cima das secções de tecido. Deixe as lâminas a 4 ° c durante a noite. Sele os slides no dia seguinte.
- Armazene as lâminas a 4 ° c e a imagem dentro de 1 semana de montagem.
5. imagem e quantificação de BDs
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Seções do fígado da imagem latente
- Antes da imagem latente, cegar-se ao genótipo da amostra com a ajuda de um membro do laboratório. Assegure-se de que todos os arquivos de imagem sejam desprovidos de genótipo ou outras informações específicas de identificação além de um número de animal/amostra.
- Usando um microscópio fluorescente, tomar 20x imagens em 1x zoom de cada seção e garantir que cada PV através do fígado é imaged. Inclua os lóbulos esquerdos, medial, direito e caudado.
Nota: Costumamos encontrar 60-90 tratos portal por animal, dependendo do tamanho do fígado. - Para identificar os PVs, procure por αSMA mais coloração wsCK. Estruturas que são αSMA positivo, mas falta de coloração wsCK não são estruturas portais.
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Identificação e contagem de BDs
- Crie uma planilha com as seguintes colunas: número de animal/amostra, número da imagem, número de PVs e número de BDs.
- Passando por cada imagem, identifique e registre o número de PVs por imagem.
- Identificar BDs de patente em cada imagem pela presença de colangiócitos (wsCK +) em torno de um lúmen definível. As estruturas devem ser distintas e separadas por mesenquime de outras células wsCK +.
- Conte cada patente BD e coloque na mesma coluna que o número da imagem.
- Faça isso para cada imagem tirada de um PV.
- Calcule a soma de todos os PVs e todos os BDs na amostra de fígado.
- Calcule a relação BD para PV para a amostra de fígado.
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Representative Results
Nós documentamos previamente defeitos biliares em Jag1 +/- Animals, um modelo do rato de algs8. Para determinar a relação BD com PV, nós seccionamos os fígados do mouse p30 e os cortinos para CK8 e CK19 (wsCK), juntamente com o marcador vascular αSMA. Nós então imaged todos os PVs em cada um dos lóbulos do fígado. Como mostrado na Figura 2a, definimos PVS como vasos manchados de αsma que têm coloração de wsck adjacente (pontas de seta). As estruturas de αSMA-manchadas sem wsCK eram veias centrais e não devem ser incluídas na análise (seta).
Uma vez identificados os PVs, identificamos os BDs de patente por sua forma característica. Como mostrado na Figura 3, os dutos de patente têm um lúmen claramente definível que é cercado por colangiócitos de wsck +. Os dutos são geralmente separados de dutos próximos ou colangiócitos por mesênquima (Arrowhead). as células wsCK + que não têm um lúmen definível, são anexadas a células adjacentes ou aparecem isoladamente, não são contabilizadas para o número total de BDs (setas). A Figura 3a mostra uma seção do fígado do selvagem-tipo com um picovolt que seja associado com um duto inteiramente da patente junto com diversas pilhas região. A Figura 3B é uma secção representativa do fígado de um animal p30 Jag1 +/– . Nenhum BDs da patente está atual em torno dos três PVs nesta seção. Todas as células wsCK + não são incorporadas e, portanto, não devem ser contabilizadas. Esta imagem destaca a importância da contagem cuidadosa de BD, pois a presença ou ausência de células wsCK + não diferencia os fígados Jag1 +/– e Wild-Type.
Como demonstrado na Figura 1D, a análise da relação BD para PV envolve a contagem de cada PV na seção hepática, juntamente com o número total de BDS de patente presentes em torno de cada PV. Ao analisar o Jag1 +/– fígados, percebemos que diferentes lobos não são necessariamente afetados na mesma medida nesses animais (dados não publicados). Conseqüentemente, nós costumamos contar PVS através dos lóbulos esquerdos, medial, direito e caudado para assegurar a cobertura completa do fígado. Após a Tabulação do total de PVs e BDs, a razão é calculada para toda a seção.
Na Figura 4, mostramos a análise das proporções de BD para PV para 3 animais selvagens e 3 Jag1 +/– . Este gráfico mostra como os dois genótipos podem ser facilmente distinguidos com base nas contagens de BD. Adicionalmente, este método fornece uma medida quantitativa para a análise do grau de salvamento do Jag1 +/– phenotype por manipulações genéticas, como relatado previamente8.
Figura 1: esquema do processo experimental. (A) o fígado é colhido inteiro do rato. (B) as amostras de fígado são fixadas para 48 h, desidratadas e limpas. (C) o tecido hepático está incorporado em parafina. As seções são feitas e colocadas em slides carregados e manchadas para wsCK e αSMA. (D) as lâminas são fotografadas e o número de PVS e BDS são gravados. A relação BD para PV (BD: PV) é calculada para toda a secção hepática. HA = artéria hepática; CV = veia central. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: distinguir as veias centrais da PVs. (A) um PV é identificado pela presença de coloração de αsma e em torno de wsck + colangiócitos (pontas de seta). (B) as veias centrais são identificadas pela presença de coloração de αsma sem colangiócitos de wsck + presentes em torno da estrutura (seta). (A ' e B ') Imagens em escala de cinza mostrando os canais αSMA de A e B, respectivamente. Barra de escala = 100 μm e aplica-se a todos os painéis. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: identificação de BDS de patentes. (a-a ') Nos fígados do tipo selvagem p30, contamos arredondar para estruturas elipsóides com um lúmen perceptível cercado por wsck + colangiócitos como uma patente BD (Arrowhead). Os colangiócitos que não cercam um lúmen são considerados não incorporados e não são contados (setas). (b-b ') Em Jag1 +/– fígados, os colangiócitos ainda estão presentes (setas). No entanto, a maioria não são incorporados em BDs de patentes. barra de escala = 100 μm e aplica-se a todos os painéis. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: o BD para PV Graph de fígados de mouse p30. Os BDs e os PVs são quantificados e a relação BD a PV é gerada. Como relatado anteriormente8, Jag1 +/– os animais têm uma diminuição característica e significativa na relação BD para PV em comparação com animais do tipo selvagem. Para análise estatística, realizou-se teste tde duas vias. As linhas horizontais mostram meios. P< 0,001. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A análise do desenvolvimento e reparo da BD em camundongos é uma importante ferramenta para estudar a patogênese e o mecanismo de distúrbios colestáticos. Além, o desenvolvimento de terapias novas é na parte dependente em cima de estabelecer um phenotype reprodutível e preferivelmente quantificáveis. A fenotipagem atual em modelos de mouse geralmente envolve química sérica, histologia hepática e imunocoloração para marcadores específicos do tipo celular. Embora essas técnicas gerem informações valiosas sobre a estrutura e a função do sistema biliar, elas não fornecem uma medida direta dos efeitos de uma determinada manipulação genética sobre o número de BDs. Na patologia anatômica, a BD escassez em pacientes humanos é determinada através da análise da relação BD para PV em uma seção de biópsia9. Enquanto os médicos empregam análise de química sérica para determinar a severidade da colestase e da doença hepática em algs e outras doenças colestáticas18,19, a avaliação histológica em modelos de mouse é fundamental para a compreensão os efeitos de modificadores da doença no desenvolvimento de BD e a eficácia das terapias em restaurar o desenvolvimento normal do duto. Isto é em parte porque os ratos podem ter uma diminuição severa no número de BDs da patente mas ainda mostram somente um aumento modesto no nível8da bilirrubina do soro, provável devido à drenagem altamente eficiente da bilis no fígado do rato. Nosso trabalho precedente mostrou que Jag1 resultados do heterozygosity na maturação danificada do BD mas não na ausência de cholangcioytes8. Assim, para analisar o desenvolvimento da BD e avaliar a severidade da doença em modelos de camundongo, não é suficiente meramente examinar a ausência ou presença de colangiócitos. Para abordar esta questão, aqui apresentamos um método simples para a medição objetiva de números de patentes de BD no fígado do rato.
Nossa análise é dependente da fixação apropriada e da incorporação do fígado do rato. Fígados são incorporados lado ventral para cima para garantir o corte semelhante de uma amostra para outra. Esta é a posição mais estável. As secções utilizadas para a coloração devem ser suficientemente profundas nos lóbulos hepáticos, pois existem diferenças no número de BDs e no tamanho dos PVs na periferia versus o Hilo do fígado. Ocasionalmente, vemos PVs que são cortados longitudinalmente. Nesses casos, geralmente há um BD vizinho que também é cortado longitudinalmente e aparece como um longo tubo aberto. Para garantir a reprodutibilidade, contamos estes tubos longos como um único BD. a identificação de BDs de patente é inequívoca na maior parte. Entretanto, algumas estruturas biliares aparecem lumenized mas não mostram a rodada à morfologia elipsóide considerada tipicamente em BDS normais14. Em nossas mãos, isso às vezes pode resultar em uma estrutura sendo chamada de BD por um investigador, mas não por outro colega. Portanto, para garantir consistência e reprodutibilidade na análise e apresentação dos dados, recomenda-se que todas as amostras relacionadas a um projeto específico sejam analisadas por dois investigadores de forma independente.
Anti-CK8 foi mostrado para marcar células biliares imaturos e maduros, enquanto CK19 apenas marca células biliares maduras12,20. Conseqüentemente, mesmo se um picovolt não é associado com um BD maduro, pode prontamente ser diferenciado das veias centrais por causa da presença de pilhas de CK8 +. A utilização destes dois anticorpos em combinação com o anti-αSMA assegura uma cobertura completa dos tratos portais na nossa quantificação. Além disso, em nossas mãos, a mancha CK19 ou CK8 individual das pilhas biliares gera um sinal relativamente fraco e é associada com alguma mancha do fundo. Misturar os dois anticorpos CK resulta em um sinal consistentemente forte nas células biliares e, portanto, facilita a quantificação.
A maturação da árvore biliar intrahepatic ocorre em um sentido hilar-à-periférico e continua postnatally21. De fato, há muitos mais colangiócitos imaturos em fígados pós-natais precoces, especialmente em áreas periféricas, que estão na frente principal da expansão pós-natal do fígado. Além disso, observou-se uma mudança nos números de BD como os animais de8anos, com mais dutos em animais mais velhos. Além disso, algumas estruturas do portal contêm vários BDs, enquanto outros têm um ou nenhum ducto, particularmente ao longo da periferia do fígado. Nós usamos uma corrediça da microscopia que cobre todos os lóbulos do fígado para cada animal e quantificamos sistematicamente o BD à relação do picovolt através da corrediça inteira. Embora isso não seja essencial, assegura que os setores portais amplos sejam analisados para cada animal, independentemente da idade e do tamanho do fígado (60-90 PVs por fígado, dependendo do genótipo e da idade). Além disso, analisando todos os PVs na corrediça, nós asseguramos que as áreas periféricas mais maduras hilar e menos maduras estejam contadas em todas as fases do desenvolvimento do fígado. Cobrindo todos os lóbulos do fígado para cada animal também pode diminuir a variabilidade nas medições se uma determinada mutação não afeta o desenvolvimento de BD uniformemente através do fígado.
O método é limitado na distinção de condutas biliares menores de grupos de células biliares não incorporadas. Os ductules da bilis4 são geralmente demasiado pequenos para ser reconhecidos como uma estrutura lumenized na ampliação que nós nos usamos para analisar estes stainings. Portanto, eles são susceptíveis de ser excluído de nossas quantificações, e, portanto, o método é distorcida para a identificação de médio a grandes dutos. Apesar dessa limitação, o método descrito aqui distingue prontamente entre os fígados Jag1 +/– e Jag1 +/+ . Além disso, é sensível o suficiente para detectar o resgate parcial do Jag1 +/– BD escassez após a perda simultânea de uma cópia de Polgut1 +/– e o modesto aumento na densidade de BD em Jag1 +/+ animais com perda condicional de Poglut1 em células musculares lisas vasculares8. Estas observações indicam a utilidade deste método em determinar alterações na densidade do BD em vários fundos genéticos, mesmo quando as mudanças no número do BD são modestas.
Nos últimos anos, a visualização da estrutura 3D da árvore biliar tem sido utilizada por vários grupos para analisar o desenvolvimento do BD22,23,24,25. Estes métodos elegantes confiam em encher a árvore biliar do BD comum pela tinta ou pela resina, e examinam conseqüentemente o patência do sistema biliar. Além disso, fornecem informações sobre a estrutura 3D da árvore biliar e sua formação na periferia hepática à medida que o fígado cresce, o que não pode ser avaliado pela avaliação 2D utilizada em protocolos como o apresentado aqui. No entanto, o desempenho bem-sucedido dessas técnicas de visualização 3D requer uma experiência considerável26. Em contrapartida, a técnica aqui apresentada é bastante simples e pode ser executada por qualquer grupo com acesso a equipamentos de rotina para análise histológica e de imagem. Além disso, a análise das seções coradas de dupla para wsck e αsma também mostrará se as reações ductular ou anormalidades vasculares da célula do músculo liso existem no fígado8,27,28. Nós sugerimos que quantificar o BD à relação do picovolt nas seções inteiras do fígado possa fornecer uma medida sensível e reprodutível do desenvolvimento biliar nos ratos e pode serir como uma técnica relativamente fácil para ajudar os investigadores a decidir se devem considerar mais técnicas sofisticadas como visualização 3D da árvore biliar.
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Disclosures
Os autores não têm conflito de interesses.
Acknowledgments
Os autores reconhecem o apoio dos institutos nacionais de saúde (NIH) (R01 GM084135 e R01 DK109982), um prêmio de piloto/viabilidade do centro médico do centro de doenças digestivas do Texas NIH p30 DK56338, e um prêmio de acelerador de síndrome de Alagille de A Fundação médica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isothesia (Isoflurane) | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Desiccator | Bel-Art | 16-800-552 | |
| 10% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15712 | |
| 50 mL tube | ThermoScientific | 339653 | |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2401 | |
| 95% Ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| HistoChoice | VWR Life Sciences | H103-4L | clearing agent |
| Omnisette Tissue Cassette | Fisher HealthCare | 15-197-710E | |
| Macrosette | Simport | M512 | |
| Paraplast X-TRA | McCormick Scientific | 39503002 | Parrafin |
| Tissue Mold | Fisher Scientific | 62528-32 | |
| Microtome | Microm | HM 325 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Xylene | Fisher Scientific | C8H10 | |
| Tris-Based Antigen Retrieval | Vector Laboratories | H-3301 | |
| Pressure Cooker | Instant Pot | Lux Mini | |
| Mini Pap Pen | Life Technologies | 8877 | |
| Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | J.T. Baker | X251-07 | |
| Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100) | J.T. Baker | X198-07 | |
| Normal Goat Serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I | Antibody Registry ID AB531826 |
| anti-CK19 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-III | Antibody Registry ID AB2133570 |
| anti-αSMA | Sigma Aldrich | A2547, Clone 1A4 | |
| anti-rat-Alexa488 | ThermoFisher | A21208 | |
| anti-mouse-Cy5 | Jackson Immunoresearch | 715-175-151 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 22 x 50 mm2 micro cover glass | VWR Life Sciences | 48393 059 | |
| Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000 B | |
| Kimwipes | Kimtech Science | 05511 | |
| VECTASHIELD | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade Mounting Medium |
References
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