Summary
Мы представляем довольно простой и чувствительный метод для точной количественной оценки плотности желчных протоков в печени мыши. Этот метод может помочь в определении воздействия генетических и экологических модификаторов и эффективности потенциальных методов лечения в мышиных моделях желчных заболеваний.
Abstract
Мышь широко используется в качестве образцового организма для изучения желчных заболеваний. Для оценки развития и функционирования желчной системы используются различные методы, в том числе химия сыворотки, гистологический анализ и иммуностохинирование для конкретных маркеров. Хотя эти методы могут предоставить важную информацию о желчной системе, они часто не представляют полную картину желчных протоков (BD) дефектов развития всей печени. Отчасти это связано с надежной способностью печени мыши слива желчи даже у животных со значительными нарушениями в желчных развития. Здесь мы представляем простой метод для расчета среднего числа BD, связанных с каждой вены портала (PV) в разделах, охватывающих все доли мутантов / трансгенных мышей. В этом методе, печи установлены и разделены в стереотипном порядке, чтобы облегчить сравнение между различными генотипами и экспериментальных условиях. BDs определены с помощью световой микроскопии цитокератин окрашенных холангиоцитов, а затем подсчитывается и делится на общее количество. присутствует в печени разделе. В качестве примера мы покажем, как этот метод может четко различать мышей дикого типа и мышиную модель синдрома Алагиля. Представленный здесь метод не может заменить методы, которые визуализируют трехмерную структуру желчного дерева. Тем не менее, он предлагает простой и прямой способ количественно оценить развитие BD и степень образования протоковых реакций у мышей.
Introduction
Дерево желчных колдеев является важнейшей частью печени млекопитающих, что позволяет проход желчи из гепатоцитов в кишечник. Интрахепатические желчные протоки (БД) образуются холангиоцитами, которые отличаются от бипотенциальных гепатобластов через Нотч и TGF, сигнализирующих1,2. Правильная спецификация и приверженность холангиоцитов и их сборки в зрелые БД имеют решающее значение для развития внутрипеченочного желчного дерева. По мере того как печенка растет во время развития или на регенерации органа, желчьная система должна превратиться вдоль печенки для того чтобы обеспечить правильный дренаж желчи. Кроме того, ряд синдромных и несиндромных заболеваний приводят к нехватке внутрипечеачных БД3. Кроме того, ряд острых и хронических заболеваний печени приводят к так называемым протокическим реакциям в печени, которые определяются как наличие значительного количества клеток, которые выражают желчных маркеров, но не обязательно возникают из желчных клеток или формы патент BDs4. При многосистемном расстройстве синдром Алагиля (ALGS), гаплоинстоцификция нот лиганда jagged1 (JAG1) приводит к плохой формации BD и холестаз5,6. Наша лаборатория недавно показала, что ранее сгенерированный Jag1 heterozygous мыши линии7 является животной моделью BD скудости в ALGS8. В этой мышиной модели ALGS, холангиоциты все еще присутствуют. Тем не менее, они не в состоянии взять на себя обязательство по включению в зрелые, патентНые БД8. Поэтому анализ печени в модели скудности БД требует большего, чем кажущееся наличие или отсутствие холангиоцитов. Важно точно оценить степень присутствия зрелых БД в печени.
При анатомической патологии существуют принятые количественные методы оценкитого, существует ли нехватка БД 9. Например, исследования по ALGS у пациентов часто количественно BD портал вены (PV) соотношение путем анализа по крайней мере 10 портал судов на биопсию печени9,10. Анализ формы и общего наличия или отсутствия патентных БД, в сочетании с химией сыворотки, может предоставить ценную информацию о развитии БД у мышей11,12,13. Тем не менее, мыши могут потерять значительное количество BDs только скромное увеличение уровня билирубина сыворотки8. Соответственно, количественный метод, который оценивает количество БД, присутствующих на П.В. может обеспечить более прямой показатель степени скудности БД у мышей. В недавнем докладе, мы количественно количество БД на П.В. во всех долях печени и сообщили о значительном снижении соотношения БД к. в Jag1 /- животных8. В ходе нашего анализа, мы заметили, что, несмотря на значительные различия в степени воспалительных реакций и протоковых реакций, Соотношение БД к П.В. не показывает большой изменчивости8. Кроме того, количественная оценка соотношения БД к П.В. позволило нам продемонстрировать, что удаление одной копии гена гликозилтрансферазы Poglut1 в Jag1 '/-животные могут значительно улучшить их скудость BD8. На фоне Jag1/', условная потеря Poglut1 в сосудистых гладких мышечных клетках приводит к постепенному увеличению числа БД, что является скромным (20-30%) на P7, но становится видным у взрослых8. Опять же, этот метод позволил нам показать, что даже при P7, увеличение плотности BD у этих животных является статистически значимым. Следует отметить, что увеличение плотности BD в этом генотипе в возрасте четырех месяцев было подтверждено с помощью анализа бросок по миске, а также. 8 Эти наблюдения и другие отчеты, которые измеряли плотность BD в различных моделях мыши ALGS14,15 побудило нас включить этот метод в нашу общую стратегию для анализа желчных дефектов в различных мутантов и трансгенных мышей.
Здесь мы подробно простой метод, который может быть использован для изучения степени Скудобы BD в мышиных моделях заболевания печени(рисунок 1). В этом методе, совместное окрашивание с холангиоцитов маркеров цитокератин (CK) 8 и CK19 (в дальнейшем широкий спектр CK, wsCK) используется для визуализации BDs и неинкорпорированных холангиоцитов в печени мыши. Антитела против альфа-гладкой мышечной актина (ЗСМА) добавляется к окрашиванию для обозначения сосудов. Систематический анализ соотношения БД и П.В. в разделе, охватывающем все доли печени, гарантирует, что для каждого генотипа анализируется большое количество П.В. Так как наш метод опирается на количественную оценку BD s и PVs в 2D изображениях, он не подходит для изучения влияния данной мутации на 3D-структуру желчного дерева или целостность небольших желчных каналов. Тем не менее, он обеспечивает простую и объективную стратегию для исследователей для оценки желчного развития в мыши.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные были размещены в барьер животных объекта в Бейлор колледж медицины в институциональных животных уход и использование Комитета руководящих принципов и в соответствии с утвержденными протоколами животных.
1. Коллекция мышечной печени Ткань
-
Приготовление мыши для сбора печени
- Эвтанизировать мышь с помощью изофлуран.
- Выполните вывих шейки матки мыши, чтобы обеспечить смерть.
- Сделайте поперечный разрез примерно на дюйм ниже грудной клетки.
- Вынаняем всю вентральную поверхность печени.
-
Сбор печени мыши
- Осторожно, с помощью небольших ножниц, прорезать связки, соединяющие печень с другими органами в животе.
- Вырезать через общий BD, чтобы отделить печень от кишечника.
- Тщательно удалите печень, держась за желчный пузырь и сразу же поместите в трубку 50 мл, заполненную до трех четвертей на 4% параформальдегида (ПФА).
2. Фиксация и встраивание печени в Парафин
-
Фиксации
- Исправить ткани печени в течение 48 ч в 4% ПФА при 4 КС.
- Вымойте ткань с 70% EtOH для 1 ч при 4 градусах Цельсия.
- Вымойте ткань дважды с 95% EtOH для 1 ч каждый при 4 c.
- Вымойте ткань дважды с 100% EtOH для 1 ч каждый при 4 градусах Цельсия.
-
Очистка
- Вымойте ткань печени с клиринговым агентом(Таблица материалов) три раза в течение 30 минут каждый при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Печень должна чувствовать себя жесткой после третьей стирки.
- Вымойте ткань печени с клиринговым агентом(Таблица материалов) три раза в течение 30 минут каждый при комнатной температуре.
-
Встраивание в парафин
- Поместите тканевую кассету в тканевую форму в парафиновый воск на 3 явки, 30 мин каждый. Воск следует разогреть до 60 градусов по Цельсию.
- Заполните ткань плесени с парафиновой воск до трех четвертей высоты и держать на нагревательный блок при 60 градусов по Цельсию.
- Поместите печень в форму с брюшной стороной вверх.
- Аккуратно снимите форму с нагревательного блока.
- Поместите верхнюю часть кассеты на форму и сверху с горячей жидкой парафина.
- Разрешить плесень и блок для охлаждения до комнатной температуры на ночь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань блоки теперь могут храниться при комнатной температуре.
3. Разделив ткани печени
-
Подготовка блока для секционирования
- Поместите форму на лед в течение 5 минут, прежде чем удалить блок из формы.
- Поместите блок на лед с лабораторной бумагой ткани присутствует между блоком и льдом.
- Держите блок на льду, когда не секции для лучших результатов нарезки тканей.
-
Секция блоков печени
- Использование микротома, начать с раздела через поверхностные, псовой стороне печени. Разделы должны быть 5 мкм.
- Проверьте поверхностные разделы под микроскопом вскрытия, чтобы убедиться, что разделы не стрижки или сложены.
- Возьмите раздел печени, который включает в себя доли caudate.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для некоторых блоков, вы будете иметь левую, медиальную, правую и caudate доли на том же ломтике ткани. - Для тех блоков, где все четыре доли не присутствуют на одном слайде, продолжайте нарезать до тех пор, пока левая, медиальная и правая доли присутствуют на одном слайде.
4. Иммуногистохимия для WSCK и ЗСМА
-
Обработка слайдов для иммуногистохимии
- Выберите один слайд для анализа генотипа.
- Вымойте слайд в течение 15 минут в Xylene, 100% EtOH, 95% EtOH и, наконец, 70% EtOH (3 х 5 мин в каждом растворе).
- Вымойте слайд в течение 5 минут в деионизированных H2O.
- Погрузите слайд в раствор извлечения антигена (Tris-based, высокий рН).
- Тепло под давлением в скороварке в течение 3 мин при 10 пси.
- Дайте слайду остыть до комнатной температуры (примерно 35 мин).
-
Блокирование секций тканей
- Используя Перо Pap, напишите разделы на слайде.
- Нанесите фосфат-буферированный солен (PBS) - 0,1% Tween, чтобы покрыть секцию дважды, по 5 мин каждый.
- Сделать блокирующий буфер, смешивая нормальную сыворотку козы (NGS) в 1:50 в PBS 0,3% Тритон. Чтобы иметь достаточно буфера как для блокирования, так и для первичного применения антител, достаточно 100 кЛ на секцию.
- Нанесите 100 зл блокирующего раствора на секцию.
- Инкубировать слайды, покрытые блокирующим раствором при 4 градусах по Цельсию на 1 ч.
-
Окрашивание для wsCK и ЗСМА
- Разбавлять анти-CK8 и анти-CK19 антитела16 (Исследования развития Hybridoma Bank, TROMA-I и TROMA-III, соответственно) 1:20 в блокирующем буфере для окрашива для wsCK. Разбавить анти-ЗСМА антитела17 (Таблица материалов) до 1:200 в том же буфере.
- Нанесите 100 л разбавленного раствора антитела, содержащего все три антитела к каждому разделу.
- Инкубировать слайды, покрытые раствором антител при цене 4 градусов по Цельсию на ночь.
- Вымойте слайды с PBS 0,1% Тритон три раза, 5 мин каждый.
- Разбавлять вторичные антитела (анти-крыса-Alexa488 и анти-мышь-Cy5) 1:200 в PBS 0,3% Тритон.
- Нанесите на слайды 100 л вторичного раствора антител, содержащего как вторичные антитела, так и вторичные антитела.
- Инкубировать при комнатной температуре 1 ч.
-
DAPI ядерного окрашивания и монтажа
- Вымойте слайды три раза, 5 мин каждый.
- Нанесите 100 кЛ DAPI (1:3000) на каждый раздел в течение 10 минут.
- Применить Antifade Монтаж Medium (Таблица материалов) на слайды и место стеклянной крышкой на верхней части ткани разделов. Оставьте слайды на 4 градуса Цельсия на ночь. Печать слайдов на следующий день.
- Храните слайды при 4 градусах Цельсия и изображение в течение 1 недели после монтажа.
5. Визуализация и количественная оценка БД
-
Изображение секций печени
- Перед визуализацией ослепите генотип образца с помощью одного из членов лаборатории. Убедитесь, что все файлы изображений лишены генотипа или другой конкретной идентифицирующей информации, кроме номера животного/образца.
- Используя флуоресцентный микроскоп, возьмите 20x изображения в 1x зум каждого раздела и убедитесь, что каждый фотовежжей через печень изображен. Включите левую, медиальную, правую и каудатские доли.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно мы находим 60-90 порталных трактов на одно животное в зависимости от размера печени. - Чтобы оповестить pVs, ищите sMA plus wsCK окрашивания. Структуры, которые являются положительными, но отсутствие wsCK окрашивания не являются портальные структуры.
-
Идентификация и подсчет БД
- Создайте электронную таблицу со следующими столбцов: номер животных/образец, номер изображения, количество фотоаппаратов и количество BD.
- Проходя через каждое изображение, определить и записать количество фотоаппаратов на изображение.
- Определите патентные БД на каждом изображении по наличию холангиоцитов (wsCK), окружающих определяемый просвет. Структуры должны быть различны и отделены мезенхимом от других ячеек wsCK.
- Подсчитайте каждый патент BD и поместите в ту же колонку, что и номер изображения.
- Сделайте это для каждого изображения, сделанного PV.
- Рассчитайте сумму всех П.И. и всех БД в образце печени.
- Рассчитайте соотношение BD к П.В. для образца печени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ранее мы задокументировали желчные дефекты в Jag1 '/-животных, мыши модели ALGS8. Чтобы определить соотношение BD к П.В., мы разделили печень мыши P30 и совместно запятнали их для CK8 и CK19 (wsCK) вместе с сосудистым маркером ЗСМА. Затем мы смогли сделать все п.п. в каждой из долей печени. Как показано на рисунке 2A, мы определили. как ЗМА-окрашенные сосуды, которые имеют смежные wsCK окрашивания (стрелы). Окрашенные в зСМА структуры без wsCK были центральными венами и не должны быть включены в анализ (стрелка).
После того, как. были определены, мы определили патент BDs по их характерной форме. Как показано на рисунке 3, патентные протоки имеют четко определяемый просвет, который окружен холангиоцитами wsCK. Протоки обычно отделены от близлежащих воздуховодов или холангиоцитов мезенхимом (наконечником стрел). клетки wsCK, которые не имеют определяемого просвета, прикрепляются к соседним ячейкам или появляются в изоляции, не учитываются в общем количестве БД (стрел). На рисунке 3A показана секция печени дикого типа с.., которая связана с полностью патентным протоком вместе с несколькими неинкорпорированными клетками. Рисунок 3B является репрезентативным разделом печени от P30 Jag1 /-- животное. Нет патента BDs присутствуют вокруг трех ПК в этом разделе. Все ячейки wsCK' неинкорпорированы и поэтому не должны учитываться. Это изображение подчеркивает важность тщательного подсчета BD, так как наличие или отсутствие клеток wsCK' не дифференцирует Jag1 /-- и дикую печень типа.
Как показано на рисунке 1D, анализ BD к. соотношение включает в себя подсчет каждого. в печени разделе наряду с общим числом патентных BDs настоящее время вокруг каждого. При анализе Jag1 '/- печени, мы заметили, что различные доли не обязательно страдают в той же степени в этих животных (неопубликованные данные). Таким образом, мы обычно подсчитываем PVs через левую, медиальную, правую и caudate доли для того чтобы обеспечить полное охват печенки. После подсчета общего количества. и БД соотношение рассчитывается для всего раздела.
На рисунке 4, мы показали анализ BD к. отношения для 3 диких типа и 3 Jag1 /-животных. На этом графике показано, как два генотипа можно легко отличить на основе количества BD. Кроме того, этот метод обеспечивает количественную меру для анализа степени спасения Jag1 /-фенотипа генетическими манипуляциями, как сообщалось ранее8.
Рисунок 1: Схема экспериментального процесса. (A) Печень собрана целиком из мыши. (B) Образцы печени фиксируются на 48 ч, обезвоживаются и очищаются. (C) Ткань печени встроена в парафин. Разделы сделаны и помещены на заряженных слайдах и окрашены для wsCK и SMA. (D) Слайды изображены, и количество PVs и BDs записаны. Соотношение BD к PV (BD:PV) рассчитывается для всего раздела печени. HA - печеноксельная артерия; CV и центральная вена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Отличая центральные вены от П.с. (A). идентифицируется наличием sMA окрашивания и окружающих wsCK е холангиоцитов (стрелы). (B) Центральные вены идентифицируются по присутствию окрашивания SMA без wsCK' холангиоцитов, присутствующих вокруг структуры (стрелка). (А' и B') Серые изображения, показывающие каналы ЗСМА из A и B, соответственно. Шкала бар 100 мкм и применяется ко всем панелям. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Идентификация патентных БД. (A-A') В P30 дикого типа печени, мы считаем круглые эллипсоидных структур с заметным просветом в окружении wsCK е холангиоцитов в качестве патента BD (стрелка). Холангиоциты, которые не окружают просвет, считаются неинкорпорированными и не учитываются (стрелки). (B-B') В Jag1 '/- печени, холангиоциты все еще присутствуют (стрелки). Тем не менее, большинство из них не включены в патент BDs. Шкала бар 100 мкм и применяется ко всем панелям. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: BD к PV График из печени мыши P30. BDs и PVs количественно и BD к. соотношение генерируется. Как сообщалось ранее8, Jag1 /- животные имеют характерные и значительное снижение в BD к. соотношение по сравнению с дикими животными типа. Для статистического анализа был проведен двусторонний т-тест. Горизонтальные линии отображали средства. PЗлт;0.001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Анализ развития и ремонта БД у мышей является важным инструментом в изучении патогенеза и механизма холестатических расстройств. Кроме того, разработка новых методов лечения частично зависит от создания воспроизводимого и предпочтительно поддающегося количественной оценке фенотипа. Текущий фенотипирование в моделях мышей обычно включает в себя химию сыворотки, гистологии печени и иммуностоинга для клеточного типа конкретных маркеров. Хотя эти методы генерируют ценную информацию о структуре и функции желчной системы, они не дают прямого измерения воздействия данной генетической манипуляции на количество БД. При анатомической патологии, BD скудость у пациентов определяется путем анализа BD к. соотношение в разделе биопсии9. В то время как врачи используют анализ химии сыворотки для определения тяжести холестаз и заболевания печени в ALGS и других холестатических заболеваний18,19, гистологическая оценка в моделях мыши имеет решающее значение для понимания влияние модификаторов заболеваний на развитие БД и эффективность терапии на восстановление нормального развития протоков. Это отчасти потому, что мыши могут иметь серьезное снижение числа патентных УВ, но по-прежнему показывают лишь скромное увеличение уровня билирубина сыворотки8, вероятно, из-за высокоэффективного дренажа желчи в печени мыши. Наша предыдущая работа показала, что Гетерозигоity Jag1 приводит к нарушению созревания BD, но не отсутствие cholangcioytes8. Таким образом, для анализа развития BD и оценки тяжести заболевания в моделях мыши, недостаточно просто изучить отсутствие или наличие холангиоцитов. Для решения этой проблемы, здесь мы представили простой метод для объективного измерения патентных номеров BD в печени мыши.
Наш анализ зависит от правильной фиксации и встраивания печени мыши. Livers встроены брюшной стороны вверх для обеспечения аналогичного сечения от одного образца к другому. Это наиболее стабильная позиция. Разделы, используемые для окрашивания должны быть достаточно глубокими в доли печени, как Есть различия в количестве BDs и размер. на периферии по сравнению с hilum печени. Мы иногда видим pVs которые отрезаны longitudinally. В этих случаях, как правило, соседние BD, который также вырезать продольно и появляется как длинная открытая трубка. Для обеспечения воспроизводимости, мы считаем эти длинные трубы как единый BD. Идентификация патентных БД является недвусмысленным по большей части. Тем не менее, некоторые желчные структуры появляются lumenized, но не показывают круглые эллипсоидной морфологии обычно видели в нормальных BDs14. В наших руках, это может иногда привести к одной структуры называют BD следователем, но не другой коллега. Поэтому для обеспечения согласованности и воспроизводимости в анализе и представлении данных мы рекомендуем, чтобы все образцы, связанные с конкретным проектом, были проанализированы двумя следователями независимо.
Анти-CK8 было показано, чтобы отметить незрелые и зрелые желчные клетки, в то время как анти-CK19 только знаки зрелых желчных клеток12,20. Таким образом, даже если П.В. не связан со зрелым BD, он может быть легко дифференцирован ы от центральных вен из-за присутствия ck8 "клеток. Использование этих двух антител в сочетании с анти-ЗСМА обеспечивает полное покрытие порталных трактов в нашей количественной оценке. Кроме того, в наших руках, отдельные CK19 или CK8 окрашивания желчных клеток генерирует относительно слабый сигнал и связано с некоторыми фоновыми окрашивания. Смешивание двух антител CK приводит к последовательно сильный сигнал в желчных клетках и, следовательно, облегчает количественную оценку.
Созревание внутрипеченочного желчного дерева происходит в направлении hilar-to-peripheral и продолжается послеродово21. Действительно, Есть много больше незрелых холангиоцитов в ранних послеродовой печени, особенно в периферических областях, которые находятся на переднем фронте послеродового расширения печени. Кроме того, мы наблюдали изменение числа BD, как животные возраста8, с большим количеством протоков в старых животных. Кроме того, некоторые структуры портала содержат несколько БД, в то время как другие имеют один или нет протоков, особенно вдоль периферии печени. Мы используем слайд микроскопии, охватывающий все доли печени для каждого животного и систематически количественно BD к. соотношение по всему слайду. Хотя это не является существенным, он гарантирует, что достаточно портал арочных трактов анализируются для каждого животного, независимо от возраста и размера печени (60-90 PVs на печень в зависимости от генотипа и возраста). Кроме того, анализируя все П.На слайде, мы гарантируем, что как более зрелые hilar и менее зрелые периферийные области учитываются на всех стадиях развития печени. Покрытие всех долей печени для каждого животного может также уменьшить изменчивость в измерениях, если данная мутация не влияет на развитие BD равномерно по всей печени.
Метод ограничен в различении более мелких желчных каналов от групп неинкорпорированных желчных клеток. Желчные протоки4, как правило, слишком малы, чтобы быть признаны в качестве просветифицированной структуры в увеличении, что мы используем для анализа этих окрашивания. Таким образом, они, вероятно, будут исключены из наших количественных определений, и, таким образом, метод перекос в сторону выявления средних и крупных каналов. Несмотря на это ограничение, описанный здесь метод легко различает ягевские печени Jag1 и Jag1. Кроме того, он достаточно чувствителен, чтобы обнаружить частичное спасение Jag1 '/- BD скудость при одновременной потере одной копии Polgut1 /- и скромное увеличение плотности BD в Jag1 "/" животных с условной потерей Poglut1 в сосудистых гладких мышечных клетках8. Эти наблюдения указывают на полезность этого метода в определении изменений в плотности БД в различных генетических фонах, даже если изменения в количестве БД являются скромными.
В последние годы визуализация 3D-структуры желчного дерева была использована несколькими группами для анализа разработки BD22,23,24,25. Эти элегантные методы полагаются на заполнение желчного дерева из общего BD чернилами или мелиной, и, следовательно, изучить проницаемость желчной системы. Кроме того, они предоставляют информацию о 3D структуре желчного дерева и его формировании на периферии печени по мере роста печени, которая не может быть оценена по 2D-оценке, используемой в протоколах, подобной представленной здесь. Тем не менее, успешная производительность этих методов 3D визуализации требует значительных знаний26. В отличие от этого, метод, представленный здесь довольно прост и может быть выполнен любой группой с доступом к обычному оборудованию для гистологического и анализа изображений. Кроме того, анализ разделов двойной окрашенных для wsCK и ЗСМА также покажет, являются ли протокиальные реакции или сосудистые гладкие аномалии мышечных клеток существуют в печени8,27,28. Мы предлагаем, что количественное соотношение BD к П.В. в целом разделы печени может обеспечить чувствительные и воспроизводимые меры желчного развития у мышей и может служить относительно простой метод, чтобы помочь следователям решить, следует ли им рассмотреть более сложные методы, такие как 3D визуализация желчного дерева.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Авторы признают поддержку со стороны Национальных институтов здравоохранения (NIH) (R01 GM084135 и R01 DK109982), пилот / Доступность премии от Техасского медицинского центра пищеварительной болезни центр под NIH P30 DK56338, и Алагил синдром Ускоритель премии от Медицинский фонд.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isothesia (Isoflurane) | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Desiccator | Bel-Art | 16-800-552 | |
| 10% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15712 | |
| 50 mL tube | ThermoScientific | 339653 | |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2401 | |
| 95% Ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| HistoChoice | VWR Life Sciences | H103-4L | clearing agent |
| Omnisette Tissue Cassette | Fisher HealthCare | 15-197-710E | |
| Macrosette | Simport | M512 | |
| Paraplast X-TRA | McCormick Scientific | 39503002 | Parrafin |
| Tissue Mold | Fisher Scientific | 62528-32 | |
| Microtome | Microm | HM 325 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Xylene | Fisher Scientific | C8H10 | |
| Tris-Based Antigen Retrieval | Vector Laboratories | H-3301 | |
| Pressure Cooker | Instant Pot | Lux Mini | |
| Mini Pap Pen | Life Technologies | 8877 | |
| Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | J.T. Baker | X251-07 | |
| Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100) | J.T. Baker | X198-07 | |
| Normal Goat Serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I | Antibody Registry ID AB531826 |
| anti-CK19 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-III | Antibody Registry ID AB2133570 |
| anti-αSMA | Sigma Aldrich | A2547, Clone 1A4 | |
| anti-rat-Alexa488 | ThermoFisher | A21208 | |
| anti-mouse-Cy5 | Jackson Immunoresearch | 715-175-151 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 22 x 50 mm2 micro cover glass | VWR Life Sciences | 48393 059 | |
| Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000 B | |
| Kimwipes | Kimtech Science | 05511 | |
| VECTASHIELD | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade Mounting Medium |
References
- Zong, Y., et al. Notch signaling controls liver development by regulating biliary differentiation. Development. 136 (10), 1727-1739 (2009).
- Clotman, F., et al. Control of liver cell fate decision by a gradient of TGFβ signaling modulated by Onecut transcription factors. Genes & Development. 19 (16), 1849-1854 (2005).
- Karpen, S. J. Update on the etiologies and management of neonatal cholestasis. Clin Perinatol. 29 (1), 159-180 (2002).
- Roskams, T. A., et al. Nomenclature of the finer branches of the biliary tree: canals, ductules, and ductular reactions in human livers. Hepatology. 39 (6), 1739-1745 (2004).
- Oda, T., et al. Mutations in the human Jagged1 gene are responsible for Alagille syndrome. Nature Genetics. 16 (3), 235 (1997).
- Li, L., et al. Alagille syndrome is caused by mutations in human Jagged1, which encodes a ligand for Notch1. Nature Genetics. 16 (3), 243 (1997).
- Xue, Y., et al. Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the Notch ligand Jagged1. Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).
- Thakurdas, S. M., et al. Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi). Hepatology. 63 (2), 550-565 (2016).
- Hadchouel, M. Paucity of interlobular bile ducts. Seminars in Diagnostic Pathology. 9 (1), 24-30 (1992).
- Emerick, K. M., et al. Features of Alagille syndrome in 92 patients: frequency and relation to prognosis. Hepatology. 29 (3), 822-829 (1999).
- Poncy, A., et al. Transcription factors SOX4 and SOX9 cooperatively control development of bile ducts. Dev Biol. 404 (2), 136-148 (2015).
- Hofmann, J. J., et al. Jagged1 in the portal vein mesenchyme regulates intrahepatic bile duct development: insights into Alagille syndrome. Development. 137 (23), 4061-4072 (2010).
- McCright, B., Lozier, J., Gridley, T. A mouse model of Alagille syndrome: Notch2 as a genetic modifier of Jag1 haploinsufficiency. Development. 129 (4), 1075-1082 (2002).
- Andersson, E. R., et al. Mouse Model of Alagille Syndrome and Mechanisms of Jagged1 Missense Mutations. Gastroenterology. 154 (4), 1080-1095 (2018).
- Loomes, K. M., et al. Bile duct proliferation in liver-specific Jag1 conditional knockout mice: effects of gene dosage. Hepatology. 45 (2), 323-330 (2007).
- Brulet, P., Babinet, C., Kemler, R., Jacob, F. Monoclonal antibodies against trophectoderm-specific markers during mouse blastocyst formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (7), 4113-4117 (1980).
- Skalli, O., et al. A monoclonal antibody against alpha-smooth muscle actin: a new probe for smooth muscle differentiation. J Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2787-2796 (1986).
- Kamath, B. M., et al. A longitudinal study to identify laboratory predictors of liver disease outcome in Alagille syndrome. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 50 (5), 526 (2010).
- Mouzaki, M., et al. Early life predictive markers of liver disease outcome in an International, Multicentre Cohort of children with Alagille syndrome. Liver International. 36 (5), 755-760 (2016).
- Shiojiri, N. Development and differentiation of bile ducts in the mammalian liver. Microsc Res Tech. 39 (4), 328-335 (1997).
- Crawford, J. M. Development of the intrahepatic biliary tree. Semin Liver Dis. 22 (3), 213-226 (2002).
- Kaneko, K., Kamimoto, K., Miyajima, A., Itoh, T. Adaptive remodeling of the biliary architecture underlies liver homeostasis. Hepatology. 61 (6), 2056-2066 (2015).
- Schaub, J. R., et al. De novo formation of the biliary system by TGFbeta-mediated hepatocyte transdifferentiation. Nature. 557 (7704), 247-251 (2018).
- Sparks, E. E., Huppert, K. A., Brown, M. A., Washington, M. K., Huppert, S. S. Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice. Hepatology. 51 (4), 1391-1400 (2010).
- Tanimizu, N., et al. Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice. Hepatology. 64 (1), 175-188 (2016).
- Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. 3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system. J Vis Exp. (68), e4272 (2012).
- Popper, H., Kent, G., Stein, R. Ductular cell reaction in the liver in hepatic injury. J Mt Sinai Hosp N Y. 24 (5), 551-556 (1957).
- Yimlamai, D., et al. Hippo pathway activity influences liver cell fate. Cell. 157 (6), 1324-1338 (2014).
