Summary
Vi presenterar en ganska enkel och känslig metod för noggrann kvantifiering av gallgången densitet i mus levern. Denna metod kan hjälpa till att fastställa effekterna av genetiska och miljömässiga modifierare och effektiviteten av potentiella terapier i musmodeller av gallvägar sjukdomar.
Abstract
Mus används i stor utsträckning som en modellorganism för att studera biliära sjukdomar. För att utvärdera gallsystemets utveckling och funktion används olika tekniker, inklusive serum kemi, histologisk analys och immunofärgning för specifika markörer. Även om dessa tekniker kan ge viktig information om gallvägarna, de ofta inte uppvisar en fullständig bild av gallgången (BD) utvecklingsdefekter över hela levern. Detta är delvis på grund av den robusta förmågan hos musen levern att dränera galla även hos djur med betydande försämring i biliär utveckling. Här presenterar vi en enkel metod för att beräkna det genomsnittliga antalet BDs som är associerat med varje Portal ven (PV) i sektioner som täcker alla lober av muterade/transgena möss. I denna metod är lever, monterade och sektionerade i ett stereotypiskt sätt för att underlätta jämförelser mellan olika genotyper och experimentella förhållanden. BDs identifieras via ljusmikroskopi av cytokeratin-färgade cholangiocyter, och sedan räknas och divideras med det totala antalet PVs närvarande i levern avsnitt. Som ett exempel visar vi hur denna metod tydligt kan skilja mellan vilda möss och en musmodell av Alagille syndrom. Den metod som presenteras här kan inte ersätta tekniker som visualiserar den tredimensionella strukturen i gallträdet. Emellertid, det erbjuder ett enkelt och direkt sätt att kvantitativt bedöma BD utveckling och graden av ductular reaktions bildning hos möss.
Introduction
Gallan trädet är en kritisk del av däggdjurs levern, vilket gör passage av galla från hepatocyter i tarmen. Intrahepatiska gallgångarna (BDS) bildas av cholangiocyter, som skiljer från bipotential hepatoblaster genom notch och tgfβ signalering1,2. Korrekt specifikation och engagemang av cholangiocyter och deras sammansättning i mogna BDs är avgörande för utvecklingen av den intrahepatiska biliär trädet. Eftersom levern växer under utveckling eller vid organ förnyelse, gallvägarna måste utvecklas längs levern för att säkerställa korrekt galla dränering. Dessutom, ett antal syndrom och icke-syndromic sjukdomar resultera i brist på intrahepatisk BDs3. Dessutom, ett antal akuta och kroniska leversjukdomar ger upphov till så kallade ductular reaktioner i levern, som definieras som förekomsten av ett stort antal celler som uttrycker gallvägar, men inte nödvändigtvis uppstår från gallvägar eller form patent BDs4. I multisystem Disorder alagille syndrom (ALGs), haploinsufficiens av notch ligand jagged1 (JAG1) resulterar i dålig BD formation och kolestas5,6. Vårt labb visade nyligen att en tidigare genererad Jag1 heterozygot mus linje7 är ett djurmodell av BD brist på i ALGs8. I denna musmodell av ALGS, cholangiocyter är fortfarande närvarande. Men de underlåter att åta sig att införlivas i mogna, patent BDs8. Därför, analys av levern i en modell av BD brist på kräver mer än den uppenbara närvaron eller frånvaron av cholangiocyter. Det är viktigt att noggrant bedöma i vilken utsträckning mogna BDs är närvarande i levern.
I anatomiska patologi, det finns accepterade kvantitativa metoder för att bedöma om BD brist på existerar9. Till exempel, studier på ALGs i mänskliga patienter ofta kvantifiera BD till Portal Vein (PV) förhållandet genom att analysera minst 10 Portal fartyg per leverbiopsi9,10. Analys av formen och den totala närvaron eller frånvaron av patent BDS, kombinerat med serum kemi, kan ge värdefull information om BD utveckling hos möss11,12,13. Men möss kan förlora ett betydande antal BDs med endast en blygsam ökning av serumbilirubin nivå8. En kvantitativ metod som utvärderar antalet BDs-celler per PV kan därför ge ett mer direkt mått på graden av BD-paucitet hos möss. I en nyligen rapport, vi kvantifierat antalet BDs per PV över alla leverlober och rapporterade en signifikant minskning i BD till PV förhållandet i Jag1 +/– djur8. Under loppet av vår analys, vi märkte att trots den betydande variationen i graden av inflammatorisk respons och ductular reaktioner, BD till PV förhållandet visar inte mycket variation8. Dessutom, kvantifiering av BD till PV-kvoten tillät oss att visa att ta bort en kopia av glykosyltransferas genen Poglut1 i Jag1 +/– djur kan avsevärt förbättra sin BD brist på8. I en Jag1 +/+ bakgrund, villkorlig förlust av Poglut1 i vaskulära glatta muskelceller resulterar i en progressiv ökning av BD-nummer, vilket är blygsam (20-30%) på P7 men blir framträdande hos vuxna8. Återigen, denna teknik tillät oss att visa att även vid P7, ökningen av BD densitet hos dessa djur är statistiskt signifikant. Notera, den ökade BD densitet i denna genotyp vid fyra månaders ålder validerades genom harts gjutna analys samt. 8 dessa observationer och andra rapporter som mätt BD densitet i olika ALGs musmodeller14,15 föranledde oss att införliva denna metod i vår övergripande strategi för att analysera biliär defekter i olika Mutant och transgena möss.
Här, vi detalj en enkel teknik som kan användas för att undersöka graden av BD brist på i musmodeller av leversjukdom (figur 1). I denna metod, Co-färgning med cholangiocyte markörer cytokeratin (CK) 8 och CK19 (nedan brett spektrum CK, wsCK) används för att visualisera BDs och oinkorporerade cholangiocyter i musen levern. En antikropp mot alfa-glatta muskler aktin (αsma) läggs till färgning till etikett fartyg. Systematisk analys av förhållandet BD-PV i ett avsnitt som täcker alla leverlober säkerställer att ett stort antal PVs analyseras för varje genotyp. Eftersom vår metod förlitar sig på kvantifiera BDs och PVs i 2D-bilder, är det inte lämpligt för att studera effekterna av en given mutation på 3D-strukturen i gallträdet eller integriteten hos den lilla biliär ledningar. Det ger dock en enkel och objektiv strategi för undersökare att bedöma biliär utveckling i musen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur var inhysta i en barriär djur anläggning vid Baylor College of Medicine per institutionell djuromsorg och användning kommitténs riktlinjer och enligt godkända djur protokoll.
1. insamling av mus levervävnad
-
Beredning av mus för lever skörd
- Euthanize musen med isofluran.
- Utför cervikal dislokation av musen för att säkerställa döden.
- Gör ett tvärgående snitt ungefär en tum under bröstkorgen.
- Exponera hela ventrala ytan av levern.
-
Samling av musen levern
- Försiktigt, med liten sax, skär genom ligament ansluta levern till andra organ i buken.
- Skär genom den gemensamma BD att lossa levern från tarmen.
- Ta försiktigt bort levern genom att hålla på gallblåsan och omedelbart placera i en 50 mL tub fylld till tre fjärdedelar av 4% PARAFORMALDEHYD (PFA).
2. fixering och inbäddning av levern i paraffin
-
Fixering
- Fixera levervävnad för 48 h i 4% PFA vid 4 ° c.
- Tvätta vävnaden med 70% EtOH för 1 h vid 4 ° c.
- Tvätta vävnaden två gånger med 95% EtOH för 1 h vardera vid 4 ° c.
- Tvätta vävnaden två gånger med 100% EtOH för 1 h vardera vid 4 ° c.
-
Röjning
- Tvätta levern vävnad med clearing agent (tabell över material) tre gånger för 30 min vardera vid rumstemperatur.
Anmärkning: Levern ska kännas stel efter den tredje tvätten.
- Tvätta levern vävnad med clearing agent (tabell över material) tre gånger för 30 min vardera vid rumstemperatur.
-
Inbäddning i paraffin
- Placera vävnaden kassetten i en vävnad mögel i paraffinvax för 3 tvättar, 30 min vardera. Vaxet ska förvärmas till 60 ° c.
- Fyll vävnaden mögel med paraffinvax till tre fjärdedelar höjd och hålla på en värmeblock vid 60 ° c.
- Placera levern i formen med den ventrala sidan vänd uppåt.
- Ta försiktigt bort mögel från värmeblocket.
- Placera toppen av kassetten på formen och toppen av med varm flytande paraffin.
- Låt mögel och block svalna till rumstemperatur över natten.
Anmärkning: Vävnads block kan nu förvaras i rumstemperatur.
3. snittning av levervävnad
-
Beredning av blocket för snittning
- Placera mögel på is för 5 min innan du tar bort blocket från mögel.
- Placera blocket på isen med ett labb silkespapper som finns mellan block och is.
- Håll blocket på is när inte snittning för bästa vävnad segmening resultat.
-
Snittning av lever block
- Med hjälp av en mikrotom, börja med snittning genom den ytliga, ryggsidan av levern. Avsnitten ska vara 5 μm.
- Kontrollera de ytliga avsnitten under en dissektion Mikroskop för att säkerställa att avsnitten inte klippt eller vikta.
- Ta en del av levern som innehåller caudatus LOB.
Anmärkning: För vissa block, du kommer att ha vänster, medial, höger och caudatus loberna på samma vävnad slice. - För de block där alla fyra loberna inte finns på samma bild, fortsätter att skära tills vänster, mediala och högra loberna finns på samma bild.
4. immunohistokemi för wsCK och αSMA
-
Bearbetning av diabilder för immunohistokemi
- Välj en bild per genotyp som ska analyseras.
- Tvätta glaset i 15 min i xylen, 100% EtOH, 95% EtOH och slutligen 70% EtOH (3 x 5 min i varje lösning).
- Tvätta bilden i 5 min i avjoniserat H2O.
- Sänk ned bilden i antigen hämtnings lösningen (Tris-baserat, högt pH).
- Värm under tryck i en tryckkokare i 3 min vid 10 psi.
- Låt bilden svalna till rumstemperatur (ca 35 min).
-
Blockering av vävnads sektionerna
- Använd en PAP-penna för att beskriva avsnitten i bilden.
- Applicera fosfatbuffrad saltlösning (PBS) + 0,1% Tween för att täcka sektionen två gånger, 5 min vardera.
- Gör blockerande buffert genom att blanda normala get serum (NGS) vid 1:50 i PBS + 0,3% Triton. För att få tillräckligt med buffert för både blockerande och primär antikropps applikation räcker 100 μL per sektion.
- Applicera 100 μL blockerande lösning per sektion.
- Inkubera de diabilder som täcks med den blockerande lösningen vid 4 ° c i 1 h.
-
Färgning för wsCK och αSMA
- Späd anti-CK8 och anti-CK19 antikroppar16 (utvecklingsstudier hybridoma bank, Troma-I och TROMA-III, respektive) 1:20 i blockerande buffert för att färga för wsCK. Späd anti-αSMA-antikroppen17 (tabell över material) till 1:200 i samma buffert.
- Applicera 100 μL av den utspädda antikroppslösningen som innehåller alla tre antikroppar mot varje sektion.
- Inkubera de diabilder som täcks med antikroppslösningen vid 4 ° c över natten.
- Tvätta bilderna med PBS + 0,1% Triton tre gånger, 5 min vardera.
- Späd sekundära antikroppar (anti-råtta-Alexa488 och anti-mus-Cy5) 1:200 i PBS + 0,3% Triton.
- Applicera 100 μL av den sekundära antikroppslösningen som innehåller både sekundära antikroppar mot diabilderna.
- Inkubera vid rumstemperatur i 1 h.
-
DAPI nukleär färgning och montering
- Tvätta bilderna tre gånger, 5 min vardera.
- Applicera 100 μL DAPI (1:3000) på varje sektion i 10 minuter.
- Applicera AntiFade-Monteringsmediet (tabell över material) på glidbanorna och placera ett täckglas ovanpå vävnads sektionerna. Låt diabilderna vara 4 ° c över natten. Försegla bilderna nästa dag.
- Förvara bilderna vid 4 ° c och bild inom 1 vecka efter monteringen.
5. avbildning och kvantifiering av BDs
-
Imaging lever sektioner
- Före avbildning, blind dig till genotypen av provet med hjälp av en Lab medlem. Se till att alla Imaging-filer saknar genotyp eller annan specifik identifierande information förutom ett djur/provnummer.
- Med hjälp av ett fluorescerande Mikroskop, ta 20x bilder vid 1x zoom av varje sektion och se till att varje PV i levern är avbildad. Inkludera vänster, medial, höger och caudatus lobes.
Anmärkning: Vi brukar hitta 60-90 Portal skrifter per djur beroende på storleken av levern. - För att identifiera PVs, leta efter αSMA plus wsCK färgning. Strukturer som är αSMA positiva men saknar wsCK färgning är inte Portal strukturer.
-
Identifiering och räkning av BDs
- Skapa ett kalkylblad med följande kolumner: djur/provnummer, bildnummer, antal PVs och antal BDs.
- Att gå igenom varje bild, identifiera och registrera antalet PVs per bild.
- Identifiera patent BDs i varje bild genom förekomst av cholangiocyter (wsCK +) som omger en definierbar lumen. Strukturerna bör vara distinkta och åtskilda av Mesenchyme från andra wsCK +-celler.
- Räkna varje patent BD och placera i samma kolumn som bildnumret.
- Gör detta för varje bild tagen av en PV.
- Beräkna summan av alla PVs och alla BDs i levern provet.
- Beräkna BD till PV förhållandet för levern provet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har tidigare dokumenterat biliär defekter i Jag1 +/– djur, en musmodell av ALGs8. För att bestämma BD till PV ratio, sektioned vi P30 mus lever och co-färgade dem för CK8 och CK19 (wsCK) tillsammans med den vaskulära markören αSMA. Vi avbildade sedan alla PVs i varje lever lober. Som framgår i figur 2A, definierade vi PVS som αsma-färgade fartyg som har angränsande wsCK färgning (pilspetsar). De αSMA-färgade strukturer utan wsCK var centrala vener och bör inte ingå i analysen (Arrow).
När PVs identifierades identifierade vi patent BDs genom sin karakteristiska form. Som framgår av figur 3, har patent kanaler en klart definierbara lumen som är omgiven av wsck + cholangiocyter. Kanalerna är vanligtvis separeras från närliggande kanaler eller cholangiocyter av Mesenchyme (Arrowhead). wsCK +-celler som inte har en definierbar lumen, är kopplade till intilliggande celler, eller visas isolerat, räknas inte mot det totala antalet BDs (pilar). Figur 3a visar en vildtyp lever sektion med en PV som är förknippad med en helt patenterad kanal tillsammans med flera icke-inkorporerade celler. Figur 3b är en representativ lever sektion från P30 Jag1 +/– djur. Inga patent BDs är närvarande runt om de tre PVs i detta avsnitt. Alla wsCK +-celler är ej införlivade och bör därför inte räknas. Denna bild belyser vikten av noggrann BD räkna, som närvaro eller frånvaro av wsCK + celler inte differentiera Jag1 +/- och Wild-typ lever.
Som framgår i figur 1d, analys av BD till PV förhållandet innebär att räkna varje PV i levern avsnitt tillsammans med det totala antalet patent BDS närvarande runt varje PV. Samtidigt analysera Jag1 +/- lever, märkte vi att olika lober inte nödvändigtvis påverkas i samma utsträckning i dessa djur (opublicerade data). Därför, vi brukar räkna PVS över vänster, medial, höger och caudatus lober att säkerställa fullständig lever täckning. Efter tabulering av totala PVs och BDs beräknas kvoten för hela sektionen.
I figur 4, vi visade analysen av BD till PV nyckeltal för 3 vildtyp och 3 Jag1 +/– djur. Detta diagram visar hur de två genotyperna lätt kan särskiljas baserat på BD-räkningar. Dessutom, denna metod ger en kvantitativ åtgärd för analys av graden av räddning av Jag1 +/– fenotyp av genetiska manipulationer, som rapporterats tidigare8.
Figur 1: Schematisk av försöks processen. (A) levern skördas hela från musen. B) leverprover är fasta för 48 h, dehydratiserade och avklarade. C) lever vävnaden är inbäddad i paraffin. Avsnitten görs och placeras på laddade diabilder och färgas för wsCK och αSMA. (D) diabilder är avbildade och antalet PVS och BDS registreras. Förhållandet BD-PV (BD: PV) beräknas för hela lever sektionen. HA = leverartär; CV = Central ven. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: skilja centrala vener från PVs. (A) en PV identifieras genom förekomst av αsma färgning och omgivande wsCK + cholangiocyter (pilspetsar). (B) centrala vener identifieras genom förekomst av αsma färgning utan wsCK + cholangiocyter som finns runt strukturen (pil). (A " och B") Gråskalebilder som visar αSMA-kanalerna från A respektive B. Scale bar = 100 μm och gäller för alla paneler. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: identifiering av patent BDS. (a-a) I P30 vildtyps-livers räknar vi runt till ellipsoidstrukturer med en urskiljbar lumen omgiven av wsCK + cholangiocyter som ett patent BD (Arrowhead). Kolangiocyter som inte omger ett lumen betraktas som icke-inkorporerade och räknas inte (pilar). (b-b ') I Jag1 +/– lever, cholangiocyter är fortfarande närvarande (pilar). De flesta är dock inte införlivas i patent BDs. Scale bar = 100 μm och gäller för alla paneler. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 4: BD till PV Graph från P30 mus lever. BDs och PVs kvantifieras och BD till PV-förhållandet genereras. Som rapporterats tidigare8, Jag1 +/– djur har en karakteristisk och signifikant minskning av BD till PV förhållande jämfört med vildtyp djur. För statistisk analys utfördes tvåvägst -test. Horisontella linjer visar betyder. P< 0,001. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analys av BD utveckling och reparation i möss är ett viktigt verktyg i att studera patogenesen och mekanismen för kolestatiska sjukdomar. Dessutom är utvecklingen av nya terapier delvis beroende av att man upprättar en reproducerbar och företrädesvis kvantifierbar fenotyp. Nuvarande fenotypning i musmodeller innebär vanligtvis serum kemi, leverhistologi och immunofärgning för cell-typ specifika markörer. Även om dessa tekniker genererar värdefull information om gallsystemets struktur och funktion, ger de inte ett direkt mått på effekterna av en given genetisk manipulation på antalet BDs. I anatomisk patologi, BD brist på hos mänskliga patienter bestäms genom analys av BD till PV förhållandet i en biopsi avsnitt9. Medan kliniker använder serum kemi analys för att fastställa svårighetsgraden av kolestas och leversjukdom i ALGs och andra kolestatiska sjukdomar18,19, histologisk bedömning i musmodeller är avgörande för både förståelse effekterna av sjukdomsmodifierare på BD utveckling och effektiviteten av terapier för att återställa normal kanal utveckling. Detta är delvis eftersom möss kan ha en allvarlig minskning av antalet patent BDs men visar fortfarande bara en blygsam ökning av serumbilirubin nivå8, sannolikt på grund av den mycket effektiva galla dränering i mus levern. Vårt tidigare arbete har visat att Jag1 heterozygosity resulterar i försämrad BD mognad men inte avsaknaden av cholangcioytes8. Således, för att analysera BD utveckling och bedöma sjukdomens svårighetsgrad i musmodeller, är det inte tillräckligt att bara undersöka frånvaro eller förekomst av cholangiocyter. För att lösa detta problem, här har vi presenterat en enkel metod för objektiv mätning av patent BD-nummer i mus levern.
Vår analys är beroende av korrekt fixering och inbäddning av mus levern. Lever är inbäddade ventrala Sidan upp för att säkerställa liknande snittning från ett prov till ett annat. Detta är den mest stabila positionen. De avsnitt som används för färgning måste vara tillräckligt djupt i levern loberna, eftersom det finns skillnader i antalet BDs och storleken på PVs i periferin kontra hilum i levern. Ibland ser vi PVs som skärs i längsled. I dessa fall finns det vanligtvis en angränsande BD som också skärs longitudinellt och verkar som en lång öppen slang. För att säkerställa reproducerbarhet räknar vi dessa långa rör som en enda BD. identifiering av patent BDs är otvetydigt för det mesta. Emellertid, vissa gallvägar verkar lumenized men inte Visa rundan till ellipsoid morfologi typiskt sett i normala BDs14. I våra händer, detta kan ibland resultera i en struktur som kallas en BD av en utredare, men inte av en annan kollega. Därför, för att säkerställa konsekvens och reproducerbarhet i dataanalys och presentation, rekommenderar vi att alla prover som rör ett visst projekt analyseras av två utredare självständigt.
Anti-CK8 har visat sig Markera omogen och mogna biliär celler, medan anti-CK19 endast märken mogna gallvägar12,20. Därför, även om en PV inte är förknippad med en mogen BD, det kan lätt differentieras från centrala vener på grund av närvaron av CK8 + celler. Genom att använda dessa två antikroppar i kombination med anti-αSMA säkerställs fullständig täckning av portalens skrifter i vår kvantifiering. Dessutom, i våra händer, den enskilde CK19 eller CK8 färgning av gallvägarna genererar en relativt svag signal och är associerad med vissa bakgrunds färgning. Att blanda de två CK-antikropparna resulterar i en genomgående stark signal i gallvägarna och underlättar därför kvantifieringen.
Mogningen av det intrahepatiska gallan träd uppstår i en hilar-till-perifer riktning och fortsätter födseln21. Faktum är att det finns många fler omogna cholangiocyter i tidig postnatal lever, särskilt i perifera områden, som är på den ledande fronten av postnatal levern expansion. Dessutom observerade vi en förändring i BD-nummer som djuren ålder8, med fler kanaler i äldre djur. Dessutom, vissa Portal strukturer innehåller flera BDs medan andra har en eller inga kanaler, särskilt längs leverns periferi. Vi använder en mikroskopi bild som täcker alla leverlober för varje djur och systematiskt kvantifiera BD till PV förhållandet över hela bilden. Även om detta inte är viktigt, det säkerställer att riklig Portal skrifter analyseras för varje djur oavsett ålder och lever storlek (60-90 PVs per lever beroende på genotyp och ålder). Dessutom, genom att analysera alla PVs på bilden, vi ser till att både mer mogna hilar och mindre mogna perifera områden räknas i alla stadier av lever utveckling. Täcker alla leverlober för varje djur kan också minska variationen i mätningar om en given mutation inte påverkar BD utveckling jämnt över levern.
Metoden är begränsad i att skilja mindre galla conduits från grupper av icke-inkorporerade gallvägar celler. Gallan ductules4 är oftast för små för att erkännas som en lumenized struktur i förstoringen som vi använder för att analysera dessa stainings. Därför kommer de sannolikt att uteslutas från våra kvantifieringar, och därmed metoden är skev mot att identifiera medelstora till stora kanaler. Trots denna begränsning, den metod som beskrivs här lätt skiljer mellan Jag1 +/– och Jag1 +/+ livers. Dessutom är det tillräckligt känsligt för att upptäcka partiell räddning av Jag1 +/- BD brist på på Samtidig förlust av en kopia av Polgut1 +/- och den blygsamma ökningen av BD densitet i Jag1 +/+ djur med villkorlig förlust av Poglut1 i vaskulära glatta muskelceller8. Dessa observationer indikerar denna metod användbarhet för att fastställa förändringar i BD densitet i olika genetiska bakgrunder, även när förändringarna i BD-nummer är blygsamma.
Under de senaste åren, visualisering av 3D-strukturen i gallan trädet har använts av flera grupper för att analysera BD utveckling22,23,24,25. Dessa eleganta metoder förlitar sig på att fylla gallan trädet från den gemensamma BD med bläck eller harts, och därför undersöka patency av gallvägarna. Dessutom ger de information om 3D-strukturen i gallträdet och dess bildande i levern periferin som levern växer, som inte kan bedömas genom 2D-bedömning som används i protokoll som den som presenteras här. Men framgångsrik prestanda för dessa 3D visualiseringstekniker kräver stor expertis26. Däremot är den teknik som presenteras här ganska enkel och kan utföras av någon grupp med tillgång till rutinmässig utrustning för histologisk och Imaging analys. Dessutom, analys av avsnitten dubbelfärgade för wsck och αsma kommer också att visa om ductular reaktioner eller vaskulära glatta muskel cell avvikelser finns i levern8,27,28. Vi föreslår att kvantifiera BD till PV förhållandet i hela levern avsnitten kan ge en känslig och reproducerbara mått av biliär utveckling hos möss och kan fungera som en relativt enkel teknik för att hjälpa utredarna avgöra om de bör överväga mer sofistikerade tekniker som 3D-visualisering av gallträdet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Författarna erkänner stöd från National Institutes of Health (NIH) (R01 GM084135 och R01 DK109982), en pilot/genomförbarhets utmärkelse från Texas Medical Center magsjukdom Center under NIH P30 DK56338, och ett Alagille Syndrome Accelerator Award från Den medicinska stiftelsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isothesia (Isoflurane) | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Desiccator | Bel-Art | 16-800-552 | |
| 10% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15712 | |
| 50 mL tube | ThermoScientific | 339653 | |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2401 | |
| 95% Ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| HistoChoice | VWR Life Sciences | H103-4L | clearing agent |
| Omnisette Tissue Cassette | Fisher HealthCare | 15-197-710E | |
| Macrosette | Simport | M512 | |
| Paraplast X-TRA | McCormick Scientific | 39503002 | Parrafin |
| Tissue Mold | Fisher Scientific | 62528-32 | |
| Microtome | Microm | HM 325 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Xylene | Fisher Scientific | C8H10 | |
| Tris-Based Antigen Retrieval | Vector Laboratories | H-3301 | |
| Pressure Cooker | Instant Pot | Lux Mini | |
| Mini Pap Pen | Life Technologies | 8877 | |
| Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | J.T. Baker | X251-07 | |
| Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100) | J.T. Baker | X198-07 | |
| Normal Goat Serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I | Antibody Registry ID AB531826 |
| anti-CK19 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-III | Antibody Registry ID AB2133570 |
| anti-αSMA | Sigma Aldrich | A2547, Clone 1A4 | |
| anti-rat-Alexa488 | ThermoFisher | A21208 | |
| anti-mouse-Cy5 | Jackson Immunoresearch | 715-175-151 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 22 x 50 mm2 micro cover glass | VWR Life Sciences | 48393 059 | |
| Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000 B | |
| Kimwipes | Kimtech Science | 05511 | |
| VECTASHIELD | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade Mounting Medium |
References
- Zong, Y., et al. Notch signaling controls liver development by regulating biliary differentiation. Development. 136 (10), 1727-1739 (2009).
- Clotman, F., et al. Control of liver cell fate decision by a gradient of TGFβ signaling modulated by Onecut transcription factors. Genes & Development. 19 (16), 1849-1854 (2005).
- Karpen, S. J. Update on the etiologies and management of neonatal cholestasis. Clin Perinatol. 29 (1), 159-180 (2002).
- Roskams, T. A., et al. Nomenclature of the finer branches of the biliary tree: canals, ductules, and ductular reactions in human livers. Hepatology. 39 (6), 1739-1745 (2004).
- Oda, T., et al. Mutations in the human Jagged1 gene are responsible for Alagille syndrome. Nature Genetics. 16 (3), 235 (1997).
- Li, L., et al. Alagille syndrome is caused by mutations in human Jagged1, which encodes a ligand for Notch1. Nature Genetics. 16 (3), 243 (1997).
- Xue, Y., et al. Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the Notch ligand Jagged1. Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).
- Thakurdas, S. M., et al. Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi). Hepatology. 63 (2), 550-565 (2016).
- Hadchouel, M. Paucity of interlobular bile ducts. Seminars in Diagnostic Pathology. 9 (1), 24-30 (1992).
- Emerick, K. M., et al. Features of Alagille syndrome in 92 patients: frequency and relation to prognosis. Hepatology. 29 (3), 822-829 (1999).
- Poncy, A., et al. Transcription factors SOX4 and SOX9 cooperatively control development of bile ducts. Dev Biol. 404 (2), 136-148 (2015).
- Hofmann, J. J., et al. Jagged1 in the portal vein mesenchyme regulates intrahepatic bile duct development: insights into Alagille syndrome. Development. 137 (23), 4061-4072 (2010).
- McCright, B., Lozier, J., Gridley, T. A mouse model of Alagille syndrome: Notch2 as a genetic modifier of Jag1 haploinsufficiency. Development. 129 (4), 1075-1082 (2002).
- Andersson, E. R., et al. Mouse Model of Alagille Syndrome and Mechanisms of Jagged1 Missense Mutations. Gastroenterology. 154 (4), 1080-1095 (2018).
- Loomes, K. M., et al. Bile duct proliferation in liver-specific Jag1 conditional knockout mice: effects of gene dosage. Hepatology. 45 (2), 323-330 (2007).
- Brulet, P., Babinet, C., Kemler, R., Jacob, F. Monoclonal antibodies against trophectoderm-specific markers during mouse blastocyst formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (7), 4113-4117 (1980).
- Skalli, O., et al. A monoclonal antibody against alpha-smooth muscle actin: a new probe for smooth muscle differentiation. J Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2787-2796 (1986).
- Kamath, B. M., et al. A longitudinal study to identify laboratory predictors of liver disease outcome in Alagille syndrome. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 50 (5), 526 (2010).
- Mouzaki, M., et al. Early life predictive markers of liver disease outcome in an International, Multicentre Cohort of children with Alagille syndrome. Liver International. 36 (5), 755-760 (2016).
- Shiojiri, N. Development and differentiation of bile ducts in the mammalian liver. Microsc Res Tech. 39 (4), 328-335 (1997).
- Crawford, J. M. Development of the intrahepatic biliary tree. Semin Liver Dis. 22 (3), 213-226 (2002).
- Kaneko, K., Kamimoto, K., Miyajima, A., Itoh, T. Adaptive remodeling of the biliary architecture underlies liver homeostasis. Hepatology. 61 (6), 2056-2066 (2015).
- Schaub, J. R., et al. De novo formation of the biliary system by TGFbeta-mediated hepatocyte transdifferentiation. Nature. 557 (7704), 247-251 (2018).
- Sparks, E. E., Huppert, K. A., Brown, M. A., Washington, M. K., Huppert, S. S. Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice. Hepatology. 51 (4), 1391-1400 (2010).
- Tanimizu, N., et al. Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice. Hepatology. 64 (1), 175-188 (2016).
- Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. 3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system. J Vis Exp. (68), e4272 (2012).
- Popper, H., Kent, G., Stein, R. Ductular cell reaction in the liver in hepatic injury. J Mt Sinai Hosp N Y. 24 (5), 551-556 (1957).
- Yimlamai, D., et al. Hippo pathway activity influences liver cell fate. Cell. 157 (6), 1324-1338 (2014).
