Summary
Этот протокол используется для изоляции одного предсердного кардиомиоцитов от сердца взрослой мыши, используя подход к пищеварению. Этот подход используется для изоляции правых или левых миоцитов предсердий, которые могут быть использованы для характеристики тричной миоцитной электрофизиологии в исследованиях патч-зажима.
Abstract
Электрофизиологические свойства предсердий миоцитов важно влияют на общую сердечную функцию. Изменения в основных ионных токов, ответственных за действие потенциал может вызвать про-аритмических субстратов, которые лежат в основе аритмии, таких как мерцательная аритмия, которые широко распространены во многих условиях и состояниях болезни. Изолировать взрослых мышей предсердий кардиомиоцитов для использования в патч-зажим экспериментов значительно продвинули наши знания и понимание клеточной электрофизиологии в здоровом предсердии миокарда и в условиях патофизиологии предсердий. Кроме того, исследования с использованием генетических моделей мыши прояснили роль широкого спектра белков в регулировании электрофизиологии предсердий. Здесь мы предоставляем подробный протокол для изоляции кардиомиоцитов от предсердных придатков взрослых мышей с использованием комбинации ферментативного пищеварения и механической диссоциации этих тканей. Этот подход последовательно и надежно дает изолированные предсердий кардиомиоцитов, которые затем могут быть использованы для характеристики клеточной электрофизиологии путем измерения потенциалов действия и ионных токов в патч-зажим экспериментов в рамках ряда экспериментальных Условия.
Introduction
Предсердий, которые являются тонкими стенками, камеры низкого давления сердца, которые получают кровь из вышестоящей и нижней полы вены, а также легочных вен, являются неотъемлемой частью нормальной сердечной физиологии. Как и другие области сердца, атрия содержит ряд типов клеток, втомленые кардиомиоциты, фибробласты, эндотелиальные клетки, сосудистые гладкие мышечные клетки и другие. Предсердий миоциты электрически возбудимых клеток, которые играют важную роль в проведении электрических сигналов через сердце, тем самым обеспечивая надлежащее сокращение предсердий во время каждого удара сердца1. Электрическая дисфункция в предсердии может привести к ряду предсердий конкретных аритмий, таких как трепетание предсердий и мерцательной аритмии2,3. Это весьма распространенные, но плохо понимаемые, аритмии предсердий, которые приводят к значительной заболеваемости и смертности. Фибрилляция предсердий может происходить в связи с генетическими мутациями, в связи со старением или в условиях приобретенных форм сердечных заболеваний, включая гипертонию, сердечную недостаточность и диабет2,4,5 ,6. Эти условия могут изменить электрические свойства предсердий миоцитов, которые могут создать субстрат, который увеличивает распространенность аритмогенеза1,2.
Нормальная электрическая функция в предсердии, а также аритмогенез предсердий, важно зависит от морфологии действия потенциал (AP), вырабатываемых в предсердий миоцитов. Предсердий AP генерируется из деятельности ряда ионных токов, в том числе тока натрия (INa, осуществляется NaV1.5 каналов), L-типа кальция тока (ICa, L, осуществляется Cav1.2 и CaV1.3 каналов ), и несколько калийных токов, включая ультра-быстрый задержкой выправляющий калийный ток (IKur, осуществляется KV1.5 каналов), переходный внешний калийный ток (Iк, осуществляется KV4.2 и KV4.3 каналы), устойчивое состояние калия тока (IKss, осуществляется KV2.1 каналов), и внутренний выправлятель калия тока (IK1, осуществляется Kir2.1 каналов)1,7, 8. Хотя они не играют важную роль в мышке atria, быстрые и медленные компоненты задержки выправляющего Ки тока (IKr и IKs) также способствуют AP repolarization в некоторых видах7. Изменения в одном или нескольких из этих ионных токов могут значительно изменить электрические свойства предсердий миоцитов, что может привести к аритмии предсердий. Например, снижение INa может замедлить скорость проводимости через предию за счет снижения скорости АП вверх по мазку. С другой стороны, сокращение повторного поляризации калийных токов или увеличение либо ICa,L или поздно INa может привести к развитию afterdepolarizations, которые могут вызвать спонтанную активность в тририи1, 2,9.
Важно признать, что существуют различия в морфологии АП в различных частях предсердной миокарда, которые, вероятно, из-за различий в выражении или регулировании этих основных ионных каналов. Например, различия в продолжительности AP между правым и левым предстоятельным в связи с различиями в Iк текущей плотности были хорошо описаны10,11,12,13. Кроме того, мы недавно показали, что Существуют различные модели электрической реконструкции в правом и левом предшествующего мышей с хронической гипертензией6,14. Правая задняя стена предсердий также содержит синоатриальный узло, который имеет свои собственные различные модели морфологии AP и моделей стрельбы15. Различные свойства миоцитов в каждой из этих различных частей атрии могут быть подробно исследованы с помощью изолированных миоцитов из каждого из этих регионов.
Существуют различные подходы, которые могут быть использованы для изоляции предсердий миоцитов для патч-зажим электрофизиологии исследований16. Одна из возможностей заключается в использовании ретроградного перфузионного подхода, где сердце канисируется через аорту для доставки ферментов. Хотя это жизнеспособный подход, он может производить изменчивость в качестве миоцитов предсердий из-за несоответствий в перфузии предсердий. Мы приняли "кусок" пищеварения подход для изоляции предсердий миоцитов, что устраняет необходимость ретроградной перфузии сердца. Наш подход использует сочетание ферментативного пищеварения и механической диссоциации предсердной ткани, которая последовательно и надежно дает большое количество изолированных предсердных миоцитов, которые подходят для исследования патч-зажима. Хотя мы описываем наш подход здесь с помощью ткани предсердного придатка, подход может быть использован в любой области предсердий миокарда (т.е., правые или левые предсердий придатки, свободные стены, задние стены), что следователь выбирает. Этот подход идеально подходит для изучения тричных миоцитов электрофизиологии у генетически модифицированных мышей, в мышиных моделях сердечно-сосудистых заболеваний, или для изучения влияния фармакологических соединений5,6,17 , 18 лет , 19.
Protocol
Все процедуры для животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и использованию животных Университета Калгари и проводились в соответствии с руководящими принципами Канадского совета по уходу за животными. Предсердная изоляция миоцитов, изображения и репрезентативные результаты, описанные ниже, были получены от 15-недельного самца дикого типа C57Bl/6 мыши. Мы регулярно используем этот протокол, чтобы изолировать предсердий миоцитов от диких мышей17,18, мышей проведения генетических мутаций19,20 и мыши модели болезни, такие как хроническая гипертензия6, 14. Протокол может быть использован аналогичным образом для мужчин или женщин мышей. Мы также использовали аналогичную версию этой процедуры изоляции, чтобы изолировать синоатрийный узло миоцитов от сердца мыши17,21,22,23. Диаграмма потока этого экспериментального протокола находится на рисунке 1.
1. Подготовка фондовых решений и оборудования
- Приготовьте 1 рассекающее блюдо, добавив силиконовый эластомер в соответствии с инструкциями производителя. Добавьте достаточносиликоновое эластомерное соединение, чтобы покрыть дно 10 см чашкой Петри на глубину 1 см. Разрешить вылечить, а затем вставить 6 булавок насекомых в блюдо.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это силиконовое рассекающее блюдо можно повторно использовать в течение нескольких месяцев и хранить при комнатной температуре. - Подготовьте 3 огневые пипетки Pasteur с отверстием 1 мм (маленькая скважина), 3 мм (средняя скважина) или 5 мм (большая скважина) в диаметре, как показано на рисунке 2A. Чтобы сделать эти пипетки, оценка Пастер пипетка, а затем оснастки вдоль оценки знак производить отверстие, которое немного больше, чем желаемый размер скважины. Используйте металлический файл, чтобы сгладить поверхность, а затем огонь-полировать это отверстие с помощью открытого пламени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволит создать гладкий, огненосный край с отверстием нужного диаметра. Важно, чтобы отверстие было свободным от трещин и шероховатостей поверхностей. Эти огнепроводные пипетки могут храниться при комнатной температуре и повторно использоваться в течение нескольких месяцев. - Подготовьте фондовые решения для решения Tyrode pH 6.9 и решения Tyrode pH 7.4, перечисленные в таблице1. Также подготовьте 10 мл каждый из 1 M MgCl2, 1 M CaCl2,и 100 мМ CaCl2. Используйте ультрачистую воду для всех растворов и храните при 4 градусах Цельсия до 2 месяцев.
- Подготовьте 1 l модифицированного решения Kraft-Br'he (KB), как указано в таблице 2. Используйте ультрачистую воду. Разделите раствор на 20 мл aliquots и храните при -20 градусов по Цельсию до 2 месяцев.
2. Подготовка решений и изоляции настройки для предсердного миоцитов изоляции
- Приготовьте 50 мл модифицированного решения Tyrode pH 7.4, описанного в таблице 3 в колбе Erlenmeyer объемом 125 мл, используя 1 M CaCl2 и 1 M MgCl2 фондовых решений. Поместите колбу Erlenmeyer в водяной бане 35 градусов до использования, как показано на рисунке 2B.
- Подготовьте модифицированное решение tyrode pH 6.9, описанное в таблице 4 в трубке 50 мл, используя табеленое решение 100 мм CaCl2. Aliquot 2.5 ml этого раствора в каждую из трех 5 мл круглых нижних труб. Поместите эти трубки в проволоку стойку помещается в воду 35 градусов до использования, как показано на рисунке 2B.
- Подготовьте ферментный раствор, как описано в таблице 5, в 14 мл круглой нижней трубки. Чтобы сделать раствор протеазы, добавьте 1 мг протеазы на 100 л ультрачистой воды. Поместите трубку, содержащую этот ферментный раствор, в стойку для проволоки и инкубируйся на водяной бане 35 градусов до использования.
- Оттепель один аликот из модифицированного раствора КБ в водяной бане 35 градусов по Цельсию. Aliquot 2.5 ml решения КБ в каждой из трех 5 мл круглых нижних труб и 2,5 мл в 14 мл круглой нижней трубки. Поместите эти трубки в проволоки стойку и инкубировать в 35 градусов по Цельсию водяной бане до использования, как показано на рисунке 2B.
- Выложить рассекающую пластину, рассекающие инструменты, пипетку Pasteur и огненно-полированные пипетки, как показано на рисунке 2B.
3. Рассечение мыши предсердий Придаток (ы)
- Введите мышь с 0,2 мл гепарина (10 000 USP U/10 мл) с помощью интраперитонеальной инъекции и ждать 5 минут для поглощения.
- Поместите мышь в индукционную камеру и обезболясите при вдыхании изофлюран (3-4%). Изофлуран и кислород поставляются с помощью анестезируетической машины и отходы обезвреженного газа вычищаются. После того, как мышь под анестетом, и не проявляет щепотку ног рефлекс, эвтаназии мыши быстрой вывихшей шейки матки. Поместите мышь на бумажное полотенце или пробковую доску и скотнитесь, чтобы держать мышь на месте.
- Влажная грудь мыши с 70% этанола. Удалите мех и кожу, покрывающие грудь с помощью изогнутых ножниц. Далее, используйте щипцы зуба крысы, чтобы поднять грудину, а затем сократить диафрагму вдоль края ребер. Удалите всю грудную клетку с помощью изогнутых ножниц, чтобы разоблачить сердце.
- Чтобы удалить предсердий придаток (справа или слева), осторожно поднимите придаток с помощью тонкого вскрытия щипцы и вырезать его с пружинными ножницами. Немедленно перенесите предсердий на силиконовое рассекающее блюдо с покрытием, содержащее 20 мл разогретого модифицированного раствора pH 7.4, описанного в шаге 2.1.
- Поместите один рассекающий штифт в верхней части и один штырь в нижней части отверстия предсердного придатка. Используя пипетку пастбища, промойте атрию с разогретым модифицированным раствором pH 7.4 Tyrode для удаления крови. Откройте предсердий придаток, разрезая вдоль верхней и нижней кромки предсердного придатка. Далее, прикрепите углы предсердного придатка вниз, чтобы создать плоский, прямоугольный кусок ткани, как показано на рисунке 3A.
4. Изоляция предсердий миоцитов
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги в этом разделе все выполняются при 35 градусах Цельсия, с трубками, погруженными в водяную ванну 35 градусов по Цельсию. Будьте осторожны при передаче тканевых полос между круглыми нижними трубками, чтобы гарантировать, что только ткань (а не раствор) передается между трубами.
- Разрежьте предсердий придаток примерно на 8-10 полос равных размеров (примерно 0,7 мм в ширину) с помощью пружинных ножниц и тонких щипц. Пример полосок предсердной ткани показан на рисунке 3B. Обратите внимание, что полосы контракт, как только они вырезаны из основной части ткани. Используя небольшой бурно полированный огнем пипетку, перенесите тканевые полоски в первую трубку, содержащую разогретую модифицированную раствор pH 6.9, описанную в шаге 2.2. Подождите 5 минут.
- Вымойте полоски ткани, переведя их на второй, а затем третий круглый нижней трубки, содержащей модифицированный pH 6.9 раствор Tyrode, подготовленный в шаге 2.2 с помощью средней бурной огневой пипетки.
- Для мытья тканей полоски, крышка 5 мл круглой нижней трубки и осторожно инвертировать трубку 3 раза. Пусть ткани полосы оседают на дно трубки перед передачей ткани полоски в следующую трубку с помощью среднего родила огнем полированной пипетки.
- Передача полоски ткани в ферментный раствор, описанный в шаге 2.3 с помощью средней бурной огневой полированной пипетки и инкубировать в течение 30 мин. Закрутите трубку каждые 3-5 минут, чтобы предотвратить ткани полосы от прилипания вместе.
ПРИМЕЧАНИЕ: В начале ферментативного пищеварения полоски тканей быстро оседают после закрученного. Примерно на 20 минуте пищеварения, тканевые полоски начинают плавать в ферментативном растворе после закрученного. В течение этого времени, полоски предсердий ткани также изменения во внешнем виде от бледно-розового до белого, как они перевариваются. - После ферментативного пищеварения выполните три стирки с использованием 2,5 мл раствора КБ в 5 мл круглых нижних труб, подготовленных в шаге 2.4. Для каждой стирки, осторожно инвертировать трубку 3 раза, прежде чем перейти ткани к следующей трубке с помощью среднего родила огнем полированной пипетки. После окончательной стирки перенесите полосы в круглую нижнюю трубку 14 мл, содержащую 2,5 мл раствора КБ. Подождите 5 минут.
- Аккуратно тритурировать ткани в течение 7,5 мин с помощью широкого родила огнем полированной пипетки. Это механически разъединит полоски ткани и даст облавлирастворяя раствор, наполненный отдельными предсердными миоцитами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время тритурации ткань становится белой и раствор становится облачным. Сила тритурации, достигнутая путем изменения частоты и скорости изгнания тканевых полос из широкой полированной огненной пипетки, должна быть адаптирована к индивидуальной изоляции. Если тритурация слишком мягкая, выход клеток будет низким, в то время как тритурация, которая является слишком суровой даст много мертвых клеток. Избегайте пузырьков во время тритурации. - Заполните 14 мл круглой нижней трубки, содержащей полоски тритуропроваемых тканей с раствором КБ до конечного объема 7-10 мл в зависимости от желаемой плотности клеток для экспериментального использования. Поместите эту трубку при комнатной температуре в течение 1 ч. После этого инкубационного периода, клетки могут быть использованы для различных экспериментов до 7 ч. Клетки также могут храниться при 4 C для до 7 ч.
Representative Results
Предсердный миоциты, изолированные с помощью этого протокола, могут быть использованы для характеристики электрофизиологических свойств этих клеток с помощью метода патч-зажима. Аликвоты предсердий миоцитов в растворе КБ могут быть добавлены в камеру записи стандартного патч-зажима аппарата и заменены решениями, подходящими для такого рода записи, которые пожелает выполнить экспериментатор. Предсердий миоцитов, изолированных с помощью этого протокола лучше всего использовать для электрофизиологических исследований в течение 6-7 ч изоляции. Представленные данные патч-зажима из нашей лаборатории представлены ниже.
На рисунке 4 иллюстрируются примеры изолированных предсердных миоцитов от нормальных мышей, подготовленных с использованием вышеуказанного протокола. Изолированные предсердий миоциты, как правило, на порядок 100 мкм в длину и 10 мкм в ширину с четкими полосами. Конденсация изолированных предсердий миоцитов, как правило, 40-70 pF.
Рисунок 5A иллюстрирует пример предсердного миоцита AP, записанного с использованием перфорированной патч-зажим техники в текущем режиме зажима, как мы описали ранее6,19,20. Краткие данные, иллюстрирующие типичные параметры миоцита предсердного миоцита AP, приведены в таблице 6. В частности, мы представляем сводные данные для измерений потенциала мембраны отдыха (RMP), максимальной скорости подъема (Vmax),превышения (ОС) и продолжительности AP на уровне 50% (APD50),70% (APD70) и 90% (APD90) repolarization время(Таблица 6). APs также могут быть записаны во всей конфигурации ячейки14. Решения для суперфузии и пипетки для записи APs доступны в таблице 7 и таблице 8.
Рисунок 5B иллюстрирует репрезентативную семейство токов Na (INa),записанных во всей конфигурации ячейки метода зажима. Эти токи были записаны с использованием 50 мс зажим шаги между -100 и 10 мВ от удерживая потенциал -120 мВ. Мы описали подходы и протоколы для записи INa ранее6,14,20. Резюме INa IV отношения также представлены в Рисунке 5B. Решения, используемые для записи I Na, представлены в таблицах 7 и таблице 8.
Рисунок 5C иллюстрирует репрезентативную семейство токов Ca2 (ICa,L),записанных во всей конфигурации ячейки метода зажима. Эти токи были записаны с использованием 250 мс зажим напряжения шаги между -60 и 80 мВ от удерживая потенциал -70 мВ. Экспериментальные условия, которые могут быть использованы для измерения ICa,L были ранее описаны17,18,20. Резюме ICa, L IV отношения также представлены в Рисунке 5C. Решения, используемые для записи ICa, L доступны в таблице 7 и таблице 8.
Рисунок 5D иллюстрирует репрезентативную семейство токов K (IK),записанных во всей конфигурации ячейки метода зажима. Эти токи были записаны с удержания потенциал -80 мВ с использованием 500 мс напряжение зажим шаги между -120 мВ и 80 мВ, как мы описали ранее6,14. Резюме IV отношения для всего IK также представлены в Рисунке 5D. Решения, используемые для записи IK доступны в таблице 7 и таблице 8.
Используя эти подходы для записи APs и крупных семей ионных токов, в том числе Naq, Ca2 "и K" токи (как показано выше), позволяет следователю тщательно допрашивать предсердного миоцита электрофизиологии в множество экспериментальных условий. Наша лаборатория регулярно использует эти методы для изучения предсердного миоцита электрофизиологии у нормальных мышей, в мышиных моделях сердечных заболеваний, и у генетически модифицированных мышей6,14,17,18 ,19,20.
Рисунок 1: Flowchart для протокола изоляции предсердий миоцитов. Резюме шагов, используемых для изоляции миоцитов предсердий с помощью этого протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Экспериментальные средства установки и вскрытия для изоляции предсердного миоцита. (A). Небольшой родила огнем полированной пипетки с отверстием 1 мм в диаметре (слева) используется для передачи тканей после вскрытия, средняя родила огнем полированной пипетки с отверстием 3 мм в диаметре (средний) используется для передачи тканевых полос во время изоляции, и большой родила огнем полированной пипетки с отверстием 5 мм в диаметре (справа) используется для трихатурации переваренной ткани предсердий. (B). Экспериментальная установка для изоляции предсердного миоцита. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Изображение вскрытия предсердного придатка. (A). Представитель яркое поле изображение вырезанного предсердного придатка вырезать и приколоть. (B). Представитель яркое поле изображение предсердного придатка нарезать тканевыми полосками примерно 0,7 мм в ширину. Шкала бар 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Изображения изолированных предсердий миоцитов. (A). Brightfield изображение изолированных предсердий миоцитов сразу после изоляции. Шкала бар 50 мкм. (B). Брайтфилд изображение одного изолированного предсердного миоцита. Шкала бар 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Представитель патч-зажим данных, полученных из изолированных предсердий миоцитов. (A). Представитель стимулировал AP запись из изолированных предсердий миоцитов. Резюме параметров АП представлено в таблице 6. Амфотерицин B (200 мкг/мл) был добавлен в раствор пипетки для проницательного клеточной мембраны. (B). Представитель INa записи (слева) и резюме INa IV кривой (справа) от изолированных предсердий миоцитов. Нифедипин (10 мкм) был добавлен в модифицированное решение Tyrode, чтобы заблокировать ICa,L при записи INa. C. Представитель ICa,L записи (слева) и резюме ICa, L IV кривой (справа) от изолированных предсердий миоцитов. (D) Представитель IK записи (слева) и резюме IK IV кривой (справа) от изолированных предсердий миоцитов. Решения, используемые для записи каждого из этих токов, перечислены в таблице 7 и таблице8. Резюме IV кривые усреднены измерений из 10 предсердий миоцитов изолированы от 15 недельного мужчины wildtype C57Bl/6 мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Фондовый Tyrode в рН 6,9 | Фондовый Tyrode в рН 7,4 | |
| Химических | в мМ | в мМ |
| Nacl | 140 г. | 140 г. |
| Kcl | 5.4 | 5.4 |
| KH2PO4 | 1,2 | 1,2 |
| ГЕПЕС | 5 | 5 |
| Окончательный том | 500 мл | 1 л |
| Заключительный рН с NaOH | 6,9 | 7.4 |
Таблица 1: фондовый Tyrode в рН 7,4 и запас Tyrode в рН 6,9 решений. Состав стоковых растворов Tyrode (pH 7.4 и pH 6.9), которые можно сделать заранее и хранить при 4 градусах Цельсия в течение 2 месяцев.
| Химических | в мМ |
| К-глютамат | 100 |
| K-аспартат | 10 Лет |
| Kcl | 25 |
| KH2PO4 | 10 Лет |
| MgSO4 | 2 |
| Таурин | 20 |
| Креатин | 5 |
| EGTA | 0,5 |
| Глюкозы | 20 |
| ГЕПЕС | 5 |
| Bsa | 0,10% |
| Окончательный том | 1 л |
| Окончательный рН с KOH | 7.2 |
Таблица 2: Измененное решение КБ. Рецепт для модифицированного решения КБ, который можно сделать заранее, алицитировать и хранить при -20 градусов по Цельсию в течение 2 месяцев.
| Химических | Сумма |
| Глюкозы | 5,55 мМ |
| MgCl2 | 1 мМ |
| CaCl2 | 1,8 мм |
| Фондовый Tyrode в рН 7,4 | 50 мл |
| Гепарин | 250 л |
Таблица 3: Модифицированный раствор pH 7.4 Tyrode с глюкозой, магнием, кальцием и гепарином. Состав модифицированного раствора pH 7.4 Tyrode, используемого для вскрытия предсердий. Это решение должно быть свежим и храниться в водяной бане 35 градусов до использования.
| Химических | Сумма |
| Глюкозы | 18,5 мМ |
| Таурин | 49,96 мМ |
| Bsa | 15 мг |
| CaCl2 | 0,066 мМ |
| Фондовый Tyrode в рН 6,9 | 15 мл |
Таблица 4: Модифицированный раствор pH 6.9 от Tyrode, содержащий глюкозу, таурин, BSA и низкий уровень кальция. Состав модифицированного раствора pH 6.9 Tyrode, используемого для изоляции предсердий миоцитов. Это решение должно быть свежим и храниться в водяной бане 35 градусов до использования.
| Химических | Сумма |
| Коллагенеза | 1 064 U |
| Эластаза | 9 U |
| Решение protease | 65,2 л л |
| Модифицированный рН Tyrode 6.9 | 5 мл |
Таблица 5: Ферментативное решение. Состав ферментативного раствора, используемого для ферментативного переваривания полосок предсердий. Это решение должно быть свежим и храниться в водяной бане 35 градусов до использования.
| Параметр | Средняя |
| RMP (mV) | -74.2 и 0.7 |
| Vmax (V/s) | 144,6 и 5,8 |
| ОС (mV) | 71,9 х 3,0 |
| APD50 (ms) | 11.1 и 1,7 |
| APD70 (ms) | 23.0 и 4,6 |
| APD90 (ms) | 54,7 и 7,8 |
Таблица 6: Резюме параметров AP из изолированных предсердий миоцитов. Данные представлены в виде среднего значения - SEM, n - 10 предсердных миоцитов, изолированных от 15-недельного мужского дикого типа C57Bl/6 мыши.
| Калийные токи и ВП | Токи натрия | Кальций токи | |
| Химических | в мМ | в мМ | в мМ |
| Nacl | 140 г. | 5 | |
| Kcl | 5.4 | ||
| MgCl2 | 1 | 1 | 1 |
| CaCl2 | 1 | 1 | 2 |
| ГЕПЕС | 10 Лет | 10 Лет | 10 Лет |
| Глюкозы | 5,5 | 5,5 | 5,5 |
| CsCl | 130 г. | ||
| TEA-Cl | 5.4 | 145,5 | |
| Ph | 7.4 с NaOH | 7.4 с CsOH | 7.4 с CsOH |
Таблица 7: Композиция решений Tyrode, используемых во время экспериментов с патч-зажимом. Состав решений Tyrode, используемых для записи APs, INa, ICa, L, и IK от изолированных предсердий миоцитов.
| Калийные токи и ВП | Токи натрия | Кальций токи | |
| Химических | в мМ | в мМ | в мМ |
| Nacl | 5 | 5 | 5 |
| Kcl | 140 г. | ||
| MgCl2 | 1 | 1 | 1 |
| CaCl2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 |
| ГЕПЕС | 10 Лет | 10 Лет | 10 Лет |
| EGTA | 5 | 5 | |
| Mg-ATP | 4 | 5 | 4 |
| Na-GTP | 0,3 | 0,3 | 0,3 |
| На-фосфокреатин | 6.6 | 6.6 | |
| CsCl | 130 г. | 135 г. | |
| БАПТА | 5 | ||
| Ph | 7.2 с KOH | 7.2 с CsOH | 7.2 с CsOH |
Таблица 8: Состав внутреннего раствора пипетки, используемого во время экспериментов с патч-зажимом. Состав пипетки заполнения решений, используемых для записи APs, INa, ЯCa, L, и яK от изолированных предсердий миоцитов.
Discussion
Наша лаборатория регулярно использует этот протокол для изоляции миоцитов предсердий мыши для использования в экспериментах с патч-зажимом для того, чтобы исследовать последствия различных форм сердечно-сосудистых заболеваний, генетических мутаций или фармакологических соединений на миоцитоте предсердий Электрофизиологии. Несмотря на высокую степень воспроизводства, качество данных, полученных из изолированных предсердных миоцитов, зависит от качества изоляции. Кроме того, реинтродукция кальция после изоляции предсердий миоцитов приведет к гибели клеток для популяции изолированных миоцитов из-за парадокса кальция16. Соответственно, изоляция жизнеспособных, высококачественных предсердных миоцитов с использованием этого подхода требует практики и оптимизации в нескольких точках на протяжении всей изоляции. После оптимизации, по оценкам, между 70-90% от общего числа предсердий миоцитов, изолированных с помощью этого подхода будет как кальций терпимым и стержня формы. Ниже рассматриваются шаги, требующие максимальной практики и оптимизации.
Скорость и эффективность вскрытия будет иметь вниз по течению влияние на качество изолированных клеток. Важно, чтобы занять время, чтобы обеспечить все кровь удаляется из ткани предсердий и что ткани полосы разрезаны до аналогичного размера. Это должно занять около 5 минут, чтобы удалить предсердий придаток, разрезать ткань на полоски, и передать ткани полосы в первую трубку модифицированных Tyrode рН 6.9 раствора. Однако, если этот шаг занимает слишком много времени, качество ткани может быть скомпрометировано.
Важно также, чтобы тканевые полосы были вырезаны до равномерного размера в изоляции и между сердцами. Если полоски ткани слишком большие или слишком малы, или если они не являются однородными в изоляции, это может вызвать проблемы как во время ферментативного пищеварения и трикуляции. Это потому, что небольшие полоски будут более тщательно переваривается и большие полосы будут под переваривается. Не менее важно учитывать генотип и болезни настройки изучается, как размер предсердного придатка может варьироваться между животными. Например, гипертрофические сердца имеют большие предсердий придатки по сравнению со здоровыми сердцами, и поэтому экспериментатор может сократить больше полос в гипертрофированные сердца по сравнению с нормальным размера сердца. Соответственно, оптимизация размера полосок вырезанной ткани и применение этих измерений к каждому отдельному придатку предсердий значительно улучшит воспроизводимость изоляции миоцитов между экспериментальными условиями.
Тонкий баланс между ферментативным пищеварением и механической диссоциацией является ключом к успешной изоляции миоцитов предсердий с помощью этого протокола. Если ткань не достаточно закрученных во время ферментативного пищеварения отдельные полоски ткани, как правило, слипаются и слипаются, что ограничит эффективность ферментативного пищеварения. Если взволнован слишком часто или энергично, это может привести к повреждению ткани предсердий, что приведет к изоляции нежизнеспособных клеток. Механическая диссоциация изолированных предсердных миоцитов от тканевых полос оклица во время тритурации является наиболее важным шагом на практике и оптимизации с помощью этого подхода для изоляции предсердных миоцитов. Если тритурация слишком мягкая, выход клеток будет низким. С другой стороны, если тритурация будет слишком жесткой, то обилие нежизнеспособных миоцитов будет изолировано, и качество данных, полученных в ходе экспериментов с патч-зажимом, будет поставлено под угрозу. Кроме того, состав притязания может повлиять на изоляцию. Например, если ткань фиброзна, ферментативное пищеварение и тритурации шаги, возможно, потребуется изменить. Поэтому важно взять время, чтобы развивать навыки, необходимые для получения высококачественных клеток во время тритурации, которые могут быть использованы для патч-зажим экспериментов.
Как и во всех экспериментальных методах есть ограничения. Этот метод требует практики для того, чтобы воспроизвкаки жизнеспособной, высококачественные миоциты высокого качества, которые, в свою очередь, повлияет на осуществимость любых экспериментов, которые будут проводиться с использованием этих миоцитов. Этот подход также является терминальным и предсердий миоцитов изолированы с помощью этого подхода могут быть использованы в день изоляции только. Наша лаборатория использует клетки в пределах 6-7 ч изоляции.
Такой подход к изоляции кардиомиоцитов предсердий имеет несколько применений. Например, этот подход может быть изменен, чтобы изолировать миоциты предсердий (а также сердечные фибробласты) от других видов, включая биопсию тканей человека. Кроме того, преимущество множась к использованию этого метода кусок для изоляции предсердий миоцитов (в отличие от ретроградной перфузии сердца) является то, что он может быть изменен, чтобы изолировать кардиомиоциты из других регионов сердца, таких как синоатриальный узло или других конкретных регионах предсердий миокарда, или охватывают всю суправентрикулярную область сердца. Наша лаборатория использует предсердий кардиомиоцитов для патч-зажим экспериментов для измерения потенциалов действия и ионных токов, хотя этот подход не должен ограничиваться этой техникой. Например, изолированные миоциты могут быть использованы для исследования изменений в переходных кальция и контрактности в различных экспериментальных условиях. Предсердий кардиомиоцитов также может быть использован в иммунофлуоресценции исследований для изучения расположения белков или структур, представляющих интерес. Соответственно, этот подход является весьма универсальным с большим количеством возможных приложений.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа поддерживается оперативными грантами От Канадских институтов исследований в области здравоохранения (MOP 93718, 142486) и Фонда сердца и инсульта Канады Р.А. Роузу. Х.Джей Янсен является получателем стипендий Киллама.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1, 2-Bis(2-Aminophenoxy)ethane-N, N, N', N'-tetraacetic acid 98% | Sigma | A4926-1G | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra, > 99%, from microbial | Sigma | A7699-1G | |
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt > 95%, bacterial | Sigma | A9187-1G | |
| Amphocetericin B from Streptomyces sp. ~80% (HPLC), powder | Sigma | A4888-500 MG | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A3059-50G | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506-500G | |
| Cesium chloride ReagentPlus, 99.9% | Sigma | 289329-100G | |
| Cesium hydroxide monohydrate > 99.5% trace metals basis | Sigma | 562505-1KG | |
| Collagenase Type 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | |
| Creatine anhydrous | Sigma | C0780 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| DL-Aspartic acid potassium salt | Sigma | A2025-100G | |
| Elastase suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS002279 | |
| Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid >97.0% | Sigma | E4378-25G | |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate > 95% (HPLC), powder | Sigma | G8877-250MG | |
| Heparin 10 000 USP U/10 mL | SANDOZ | 10750 | |
| HEPES > 99.5% (titration) | Sigma | H3375-500G | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate > 99% (HPLC), powder | Sigma | G1501-500G | |
| Magnesium sulfate | Sigma | M2643-500G | |
| Nifedipine > 98% (HPLC), powder | Sigma | N7634-1G | |
| Phosphocreatine disodium salt hydrate enzymatic, approx 98% | Sigma | P7936-5G | |
| Potassium chloride ACS reagent, 99.0-100.5% | Sigma | P3911-500G | |
| Potassium hydroxide | EM Science | PX1480-1 | |
| Potassium phosphate monobasic | EMD | PX1565-1 | |
| Protease from Streptomyces griseus, type XIV, >3.5 units/mg solid, powder | Sigma | P5147-1G | |
| Sodium chloride ACS reagent, > 99.0% | Sigma | S9888-2.5KG | |
| Sodium hydroxide, pellets, 97+%, A.C.S. reagent | Sigma | 221465-500G | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | World Precision Instruments Inc | SYLG184 | |
| Taurine | Sigma | T0625-100G | |
| Tetraethylammonium chloride > 98% (titration) | Sigma | T2265-100G |
References
- Bartos, D. C., Grandi, E., Ripplinger, C. M. Ion Channels in the Heart. Comprehensive Physiology. 5 (3), 1423-1464 (2015).
- Heijman, J., Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. Cellular and molecular electrophysiology of atrial fibrillation initiation, maintenance, and progression. Circulation Research. 114 (9), 1483-1499 (2014).
- Jalife, J. Mechanisms of persistent atrial fibrillation. Current Opinion in Cardiology. 29 (1), 20-27 (2014).
- Nattel, S., Maguy, A., Le Bouter, S., Yeh, Y. H. Arrhythmogenic ion-channel remodeling in the heart: heart failure, myocardial infarction, and atrial fibrillation. Physiological Reviews. 87 (2), 425-456 (2007).
- Jansen, H. J., et al. Atrial structure, function and arrhythmogenesis in aged and frail mice. Scientific Reports. 7, 44336 (2017).
- Jansen, H. J., et al. Distinct patterns of atrial electrical and structural remodeling in angiotensin II mediated atrial fibrillation. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 124, 12-25 (2018).
- Nerbonne, J. M., Kass, R. S. Molecular physiology of cardiac repolarization. Physiological Reviews. 85 (4), 1205-1253 (2005).
- Grant, A. O. Cardiac ion channels. Circulalation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).
- Schmitt, N., Grunnet, M., Olesen, S. P. Cardiac potassium channel subtypes: new roles in repolarization and arrhythmia. Physiological Reviews. 94 (2), 609-653 (2014).
- Lomax, A. E., Kondo, C. S., Giles, W. R. Comparison of time- and voltage-dependent K+ currents in myocytes from left and right atria of adult mice. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 285 (5), H1837-H1848 (2003).
- Li, D., Zhang, L., Kneller, J., Nattel, S. Potential ionic mechanism for repolarization differences between canine right and left atrium. Circ Res. 88 (11), 1168-1175 (2001).
- Wirth, K. J., Knobloch, K. Differential effects of dofetilide, amiodarone, and class lc drugs on left and right atrial refractoriness and left atrial vulnerability in pigs. Naunyn Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 363 (2), 166-174 (2001).
- Qi, A., Yeung-Lai-Wah, J. A., Xiao, J., Kerr, C. R. Regional differences in rabbit atrial repolarization: importance of transient outward current. American Journal of Physiology. 266 (2 Pt 2), H643-H649 (1994).
- Jansen, H. J., et al. NPR-C (Natriuretic Peptide Receptor-C) Modulates the Progression of Angiotensin II-Mediated Atrial Fibrillation and Atrial Remodeling in Mice. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 12 (1), e006863 (2019).
- Mangoni, M. E., Nargeot, J. Genesis and regulation of the heart automaticity. Physiological Reviews. 88 (3), 919-982 (2008).
- Voigt, N., Pearman, C. M., Dobrev, D., Dibb, K. M. Methods for isolating atrial cells from large mammals and humans. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 86, 187-198 (2015).
- Springer, J., et al. The natriuretic peptides BNP and CNP increase heart rate and electrical conduction by stimulating ionic currents in the sinoatrial node and atrial myocardium following activation of guanylyl cyclase-linked natriuretic peptide receptors. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 52 (5), 1122-1134 (2012).
- Hua, R., Adamczyk, A., Robbins, C., Ray, G., Rose, R. A. Distinct patterns of constitutive phosphodiesterase activity in mouse sinoatrial node and atrial myocardium. PLoS One. 7 (10), e47652 (2012).
- Egom, E. E., et al. Impaired sinoatrial node function and increased susceptibility to atrial fibrillation in mice lacking natriuretic peptide receptor C. Journal of Physiology. 593 (5), 1127-1146 (2015).
- Hua, R., et al. Effects of Wild-Type and Mutant Forms of Atrial Natriuretic Peptide on Atrial Electrophysiology and Arrhythmogenesis. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 8 (5), 1240-1254 (2015).
- Krishnaswamy, P. S., et al. Altered parasympathetic nervous system regulation of the sinoatrial node in Akita diabetic mice. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 82, 125-135 (2015).
- Mackasey, M., et al. Natriuretic peptide receptor C (NPR-C) protects against angiotensin II mediated sinoatrial disease in mice. JACC Basic to Translational Science. , (2018).
- Azer, J., Hua, R., Vella, K., Rose, R. A. Natriuretic peptides regulate heart rate and sinoatrial node function by activating multiple natriuretic peptide receptors. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 53 (5), 715-724 (2012).
