Summary
Questo protocollo viene utilizzato per isolare i cardiomiociti atriale singoli dal cuore adulto del topo utilizzando un approccio di digestione a blocchi. Questo approccio viene utilizzato per isolare i miociti atriale destro o sinistro che possono essere utilizzati per caratterizzare l'elettrofisiologia dei miociti atriale negli studi patch-clamp.
Abstract
Le proprietà elettrofisiologiche dei miociti atriale influenzano in modo importante la funzione cardiaca generale. Le alterazioni delle correnti ioniche sottostanti responsabili del potenziale di azione possono causare substrati pro-aritmici che sono alla base di aritmie, come la fibrillazione atriale, che sono altamente prevalenti in molte condizioni e stati di malattia. Isolare i cardiomiociti atriale per gli adulti per l'uso negli esperimenti di patch-clamp ha notevolmente avanzato la nostra conoscenza e comprensione dell'elettrofisiologia cellulare nel miocardio atriale sano e nell'impostazione della fiofilologia atriale. Inoltre, gli studi condotti su modelli murini genetici hanno chiarito il ruolo di una vasta gamma di proteine nella regolazione dell'elettrofisiologia atriale. Qui forniamo un protocollo dettagliato per l'isolamento dei cardiomiociti dalle appendici atriale dei topi adulti utilizzando una combinazione di digestione enzimatica e dissociazione meccanica di questi tessuti. Questo approccio produce in modo coerente e affidabile cardiomiociti atriale isolati che possono essere utilizzati per caratterizzare l'elettrofisiologia cellulare misurando i potenziali d'azione e le correnti ioniche negli esperimenti patch-clamp sotto una serie di esperimenti sperimentali Condizioni.
Introduction
Gli atri, che sono le sottili camere murali e a bassa pressione del cuore che ricevono sangue dalla vena cava superiore e inferiore e dalle vene polmonari, sono parte integrante della normale fisiologia cardiaca. Come altre regioni del cuore, gli atri contengono una serie di tipi di cellule, tra cui cardiomiociti, fibroblasti, cellule endoteliali, cellule muscolari lisce vascolari, e altri. I miociti atriale sono cellule elettricamente eccitabili che svolgono un ruolo essenziale nella conduzione dei segnali elettrici attraverso il cuore, garantendo così una corretta contrazione atriale durante ogni battito cardiaco1. La disfunzione elettrica negli atri può portare a una serie di aritmie specifiche atriale come flutter atriale e fibrillazione atriale2,3. Queste sono aritmie atriale molto diffuse, ma poco conosciute, che portano a morbilità e mortalità significative. La fibrillazione atriale può verificarsi in associazione con mutazioni genetiche, in associazione con l'invecchiamento o nell'impostazione di forme acquisite di malattie cardiache, tra cui ipertensione, insufficienza cardiaca e diabete2,4,5 ,6. Queste condizioni possono alterare le proprietà elettriche dei miociti atriale che possono creare un substrato che aumenta la prevalenza di aritmogenesi1,2.
La normale funzione elettrica negli atri, così come l'aritmogenesi atriale, sono influenzati in modo importante dalla morfologia del potenziale di azione (AP) prodotta nei miociti atriale. L'AP atriale è generato dall'attività di una serie di correnti ioniche, tra cui la corrente di sodio (INa, trasportata dai canali NaV1.5), la corrente di calcio di tipo L (ICa,L, trasportata dai canali Cav1.2 e CaV1.3 ), e diverse correnti di potassio tra cui la corrente di potassio di rettificatore ritardato ultrarapido (IKur, trasportato da KV1.5 canali), la corrente transitoria di potassio verso l'esterno (Ia, trasportato da KV4.2 e KV4.3 canali), una corrente di potassio a stato costante (IKss, trasportata da canali KV2.1) e la corrente di potassio rettificatore verso l'interno (IK1, trasportata da Kir2.1 canali)1,7, 8. Anche se non svolgono un ruolo importante negli atri del topo, i componenti rapidi e lenti del rettificatore ritardato K- corrente (IKr e IKs) contribuiscono anche alla ripolarizzazione AP in alcune specie7. Le alterazioni in una o più di queste correnti ioniche possono alterare significativamente le proprietà elettriche dei miociti atriale, che possono portare ad aritmie atriale. Ad esempio, una riduzione di INa può rallentare la velocità di conduzione attraverso gli atri riducendo la velocità di upstroke AP. D'altra parte, una riduzione delle correnti di potassio ripolarizzanti o un aumento di ICa,L o la fine INa può provocare lo sviluppo di afterdepolarizations che possono innescare l'attività spontanea negli atri1, 2,9.
È importante riconoscere che ci sono differenze nella morfologia AP in diverse parti del miocardio atriale che sono probabilmente dovute a differenze nell'espressione o nella regolazione di questi canali ionici sottostanti. Ad esempio, le differenze nella durata AP tra gli atri destro e sinistro in associazione con le differenze tra Ie densità corrente sono state ben descritte10,11,12,13. Inoltre, abbiamo recentemente dimostrato che ci sono modelli distinti di rimodellamento elettrico nell'atria destra e sinistra di topi con ipertensione cronica6,14. La parete posteriore atriale destra contiene anche il nodo sinoatriale, che ha i suoi modelli distinti di morfologia AP e modelli di cottura15. Le proprietà distinte dei miociti in ciascuna di queste diverse parti degli atri possono essere studiate in dettaglio utilizzando miociti isolati da ciascuna di queste regioni.
Ci sono diversi approcci che possono essere utilizzati per isolare i miociti atriale per studi di elettrofisiologia patch-clamp16. Una possibilità è quella di utilizzare un approccio retrogrado perfusione in cui il cuore è cannulato attraverso l'aorta per la consegna di enzimi. Mentre questo è un approccio praticabile, può produrre variabilità nella qualità dei miociti atriale a causa di incongruenze nella perfusione degli atri. Abbiamo adottato un approccio di digestione "chunk" per l'isolamento dei miociti atriale che elimina la necessità di perfusione retrograda del cuore. Il nostro approccio utilizza una combinazione di digestione enzimatica e dissociazione meccanica del tessuto atriale che produce in modo coerente e affidabile un gran numero di miociti atriale isolati che sono adatti per gli studi patch-clamp. Mentre descriviamo il nostro approccio qui utilizzando il tessuto di appendice atriale, l'approccio può essere utilizzato su qualsiasi regione del miocardio atriale (cioè, appendici atriale destra o sinistra, pareti libere, pareti posteriori) che l'investigatore sceglie. Questo approccio è ideale per studi di elettrofisiologia atriale miocite in topi geneticamente modificati, in modelli murini di malattie cardiovascolari, o per studiare gli effetti dei composti farmacologici5,6,17 , 18 mi lato , 19.
Protocol
Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dall'University of Calgary Animal Care and Use Committee e sono state condotte in conformità con le linee guida del Canadian Council on Animal Care. L'isolamento dei miociti atriale, le immagini e i risultati rappresentativi descritti di seguito sono stati ottenuti da un topo di tipo selvatico C57Bl/6 di 15 settimane. Usiamo abitualmente questo protocollo per isolare i miociti atriale dai topi selvatici17,18, topi portatori di mutazioni genetiche19,20 e modelli murini di malattia come l'ipertensione cronica6, 14. Il protocollo può essere utilizzato in modo simile per topi maschi o femmine. Abbiamo anche utilizzato una versione simile di questa procedura di isolamento per isolare i miociti del nodo sinoatriale dal cuore del mouse17,21,22,23. Un diagramma di flusso di questo protocollo sperimentale si trova nella Figura 1.
1. Preparazione di soluzioni e attrezzature di riserva
- Preparare 1 piatto dissecciato aggiungendo elastomer in silicone secondo le istruzioni del produttore. Aggiungere abbastanza composto di elastomer in silicone per coprire il fondo di un piatto Petri di 10 cm ad una profondità di 1 cm. Lasciare curare e quindi inserire 6 perni di insetto nel piatto.
NOT: Questo piatto di dissezione in silicone può essere riutilizzato per mesi e conservato a temperatura ambiente. - Preparare 3 pipette Pasteur lucidate dal fuoco con un'apertura di 1 mm (piccolo foro), 3 mm (foro medio) o 5 mm (foro grande) di diametro come mostrato nella Figura 2A. Per fare queste pipette, segnare una pipetta Pasteur e poi scattare lungo il segno di punteggio per produrre un'apertura che è leggermente più grande della dimensione del foro desiderato. Utilizzare un file di metallo per levigare la superficie e poi fuoco-lucidare questa apertura con una fiamma aperta.
NOT: Questo produrrà un bordo liscio e lucidato con un'apertura del diametro desiderato. È importante che l'apertura sia priva di crepe e superfici ruvide. Queste pipette levigate al fuoco possono essere conservate a temperatura ambiente e riutilizzate per mesi. - Preparare soluzioni stock per la soluzione pH 6.9 di Tyrode e la soluzione pH 7.4 di Tyrode, come indicato nella tabella 1. Preparate inoltre 10 mL ciascuno di 1 M MgCl2, 1 M CaCl2e 100 mM CaCl2. Utilizzare acqua ultrapura per tutte le soluzioni e conservare a 4 gradi centigradi per un massimo di 2 mesi.
- Preparare 1 L della soluzione kraft-Bbehe (KB) modificata, come indicato nella tabella 2. Utilizzare acqua ultrapura. Dividere la soluzione in 20 mL s e conservarla a -20 gradi centigradi per un massimo di 2 mesi.
2. Preparazione delle soluzioni e configurazione dell'isolamento per l'isolamento dei miociti atriale
- Preparare 50 mL della soluzione pH 7.4 di una Tyrode modificata, come descritto nella tabella 3 in una fiaschetta Erlenmeyer da 125 mL, utilizzando soluzioni stock 1 M CaCl2 e 1 M MgCl2. Posizionare il pallone Erlenmeyer in un bagno d'acqua a 35 gradi fino all'uso, come illustrato nella Figura 2B.
- Preparare la soluzione pH 6.9 di Tyrode modificata come descritto nella tabella 4 in un tubo da 50 mL, utilizzando la soluzione di riserva CaCl2 da 100 mMM. Aliquota 2,5 mL di questa soluzione in ciascuno dei tre tubi rotondi da 5 mL. Collocare questi tubi in un rack di filo posto in un bagno d'acqua a 35 gradi centigradi fino all'uso, come illustrato nella Figura 2B.
- Preparare la soluzione enzimatica come descritto nella tabella 5 in un tubo rotondo inferiore da 14 mL. Per fare la soluzione proteasi, aggiungere 1 mg di proteasi per 100 l di acqua ultrapura. Posizionare il tubo contenente questa soluzione enzimatica nel rack del filo e incubare in un bagno d'acqua a 35 gradi fino all'uso.
- Scongelare una delle soluzioni KB modificate in un bagno d'acqua a 35 gradi centigradi. Aliquota 2,5 mL di soluzione KB in ciascuno dei tre tubi nidi del fondo da 5 mL e 2,5 mL in un tubo rotondo inferiore da 14 mL. Collocare questi tubi nel rack del filo e incubare in un bagno d'acqua a 35 gradi fino all'uso, come mostrato nella Figura 2B.
- Disporre la piastra di dissezione, gli strumenti di dissezione, una pipetta Pasteur e le pipette levigate dal fuoco, come illustrato nella Figura 2B.
3. Dissezione delle appendici atriale del topo
- Iniettare al topo 0,2 mL di eparina (10 000 USP U/10 mL) tramite iniezione intraperitoneale e attendere 5 min per l'assorbimento.
- Posizionare il topo in una camera di induzione e anesizzare per inalazione isoflurano (3-4%). L'isoflurane e l'ossigeno vengono consegnati utilizzando una macchina anestetica e il gas anestetico di scarto viene scavato. Una volta che il topo è anestesizzato, e non presenta un riflesso pizzico punta, eutanasia il topo da una rapida lussazione cervicale. Posizionare il mouse su un tovagliolo di carta o una scheda di sughero e nastro adesivo le zampe verso il basso per tenere il mouse in posizione.
- Sorare il torace del topo con il 70% di etanolo. Rimuovere la pelliccia e la pelle che coprono il torace con forbici curve. Successivamente, utilizzare pinze dente ratto per sollevare lo sterno e quindi tagliare il diaframma lungo il bordo delle costole. Rimuovere l'intera gabbia toracica utilizzando forbici curve per esporre il cuore.
- Per rimuovere l'appendice atriale (destra o sinistra), sollevare delicatamente l'appendice con pinze di dissezione fine e ritagliarla con le forbici a molla. Trasferire immediatamente l'appendice atriale in un piatto di dissezione rivestito in silicone contenente 20 mL della soluzione di pH 7.4 di Tyrode modificata riscaldata descritta al punto 2.1.
- Posizionare un perno di sblocco nella parte superiore e uno nella parte inferiore dell'apertura dell'appendice atriale. Utilizzando una pipetta da pascolo, lavare gli atri con la soluzione pH 7.4 di Tyrode modificata riscaldata per rimuovere il sangue. Aprire l'appendice atriale tagliando lungo il bordo superiore e inferiore dell'appendice atriale. Successivamente, pin gli angoli dell'appendice atriale verso il basso per creare un piatto, pezzo rettangolare di tessuto, come mostrato Figura 3A.
4. Isolamento dei miociti atriale
NOT: I passi in questa sezione sono tutti eseguiti a 35 gradi centigradi, con tubi sommersi in un bagno d'acqua a 35 gradi centigradi. Fare attenzione durante il trasferimento di strisce di tessuto tra tubi inferiori rotondi per garantire che solo il tessuto (e non la soluzione) venga trasferito tra i tubi.
- Tagliare l'appendice atriale in circa 8-10 strisce di dimensioni uguali (circa 0,7 mm di larghezza) utilizzando forbici a molla e pinze sottili. Un esempio delle strisce di tessuto atriale è mostrato nella Figura 3B. Si noti che le strisce si contraggono una volta che sono tagliate libere dal pezzo principale di tessuto. Utilizzando la piccola pipetta levigata dal fuoco, trasferire le strisce di tessuto nel primo tubo contenente la soluzione pH 6.9 di Tyrode modificata riscaldata descritta al punto 2.2. Attendere 5 min.
- Lavare le strisce di tessuto trasferendole al secondo e poi al terzo tubo inferiore rotondo contenente la soluzione di pH 6.9 di Tyrode modificata preparata al passaggio 2.2 utilizzando la pipetta media foro lucidato.
- Per lavare le strisce di tessuto, tappo il tubo inferiore rotondo 5 mL e invertire delicatamente il tubo 3 volte. Lasciare che le strisce di tessuto si depositino sul fondo del tubo prima di trasferire le strisce di tessuto al tubo successivo utilizzando la pipetta lucidato dal fuoco a media foro.
- Trasferire le strisce di tessuto nella soluzione enzimatica descritta al punto 2.3 utilizzando una pipetta lucidato a fuoco medio e incubare per 30 minuti.
NOT: All'inizio della digestione enzimatica, le strisce di tessuto si depositano rapidamente dopo il vortice. A circa 20 min di digestione, le strisce di tessuto iniziano a galleggiare nella soluzione enzimatica dopo vorticoso. Durante questo periodo, le strisce di tessuto atriale cambiano anche aspetto dal rosa pallido al bianco mentre vengono digerite. - Dopo la digestione enzimatica, eseguire tre lavatori utilizzando 2,5 mL di soluzione KB nei tubi rotondi del fondo da 5 mL preparati nel passaggio 2.4. Per ogni lavaggio, invertire delicatamente il tubo 3 volte prima di spostare il tessuto al tubo successivo utilizzando la pipetta lucidato dal fuoco medio. Dopo il lavaggio finale, trasferire le strisce nel tubo rotondo inferiore da 14 mL contenente 2,5 mL di soluzione KB. Attendere 5 min.
- Triturare delicatamente il tessuto per 7,5 min utilizzando la pipetta a foro largo lucidato. Questo dissocia meccanicamente le strisce di tessuto e produrrà una soluzione torbida piena di singoli miociti atriale.
NOT: Durante la triturazione, il tessuto diventa bianco e la soluzione diventa torbida. La forza della triturazione, ottenuta alterando sia la frequenza che la velocità di espulsione delle strisce di tessuto dall'ampia pipetta levigata dal fuoco, deve essere adattata all'isolamento individuale. Se la triturazione è troppo delicata, la resa cellulare sarà bassa, mentre la bonifica troppo dura produrrà molte cellule morte. Evitare le bolle durante la trituratura. - Riempire il tubo inferiore rotondo da 14 mL contenente le strisce di tessuto triturato con soluzione KB per un volume finale di 7-10 mL a seconda della densità desiderata delle cellule per l'uso sperimentale. Posizionare questo tubo a temperatura ambiente per 1 h. Dopo questo periodo di incubazione, le cellule possono essere utilizzate per una varietà di esperimenti per un massimo di 7 h. Le cellule possono anche essere conservate a 4 gradi centigradi per un massimo di 7 h.
Representative Results
I miociti atriale isolati utilizzando questo protocollo possono essere utilizzati per caratterizzare le proprietà elettrofisiologiche di queste cellule utilizzando la tecnica patch-clamp. Le aliquote dei miociti atriale nella soluzione KB possono essere aggiunte alla camera di registrazione di un apparato patch-clamp standard e superfuse con soluzioni appropriate per il tipo di registrazione che lo sperimentatolista desidera eseguire. I miociti atriale isolati utilizzando questo protocollo sono meglio utilizzati per studi elettrofisiologici entro 6-7 h di isolamento. I dati relativi ai patch-clamp rappresentativi del nostro laboratorio sono presentati di seguito.
La figura 4 illustra esempi di miociti atriale isolati da topi normali preparati utilizzando il protocollo precedente. I miociti atriale isolati sono in genere dell'ordine di 100 m di lunghezza e di 10 m di larghezza con striature chiare. La capacità dei miociti atriale isolati è tipicamente 40-70 pF.
Figura 5A illustra un esempio di un AP atriale miocito registrato utilizzando la tecnica di morsetto patch-clamp perforato in modalità morsetto corrente, come abbiamo descritto in precedenza6,19,20. I dati di riepilogo che illustrano i tipici parametri AP atriale sono riportati nella tabella 6. In particolare, presentiamo dati riassuntivi per le misurazioni del potenzialedella membrana a riposo (RMP), della velocità massima di upstroke (V max), del superamento (OS) e della durata AP al 50% (APD50),70% (APD70) e 90% (APD90) di ripolarizzazione tempo (Tabella 6). Gli aP possono anche essere registrati nell'intera configurazione della cella14. Le soluzioni di sostituzione e pipetta per la registrazione degli AP sono disponibili nella tabella 7 e nella tabella 8.
La figura 5B illustra una famiglia rappresentativa di correnti (INa) registrate nell'intera configurazione cellulare della tecnica patch-clamp. Queste correnti sono state registrate utilizzando passi di morsetto di 50 ms tra -100 e 10 mV da un potenziale di tenuta di -120 mV. Abbiamo descritto approcci e protocolli per la registrazione di INa in precedenza6,14,20. Un riepilogo INa IV relazione è anche presentato in Figura 5B. Le soluzioni utilizzate per registrare INa sono presentate nella tabella 7 e nella tabella8.
La figura 5C illustra una famiglia rappresentativa di correnti Ca2 (ICa,L)registrate nell'intera configurazione cellulare della tecnica patch-clamp. Queste correnti sono state registrate utilizzando passi di morsetto di tensione 250 ms tra -60 e 80 mV da un potenziale di detenzione di -70 mV. Le condizioni sperimentali che possono essere utilizzate per misurare ICa,L sono state descritte in precedenza17,18,20. Un riepilogo ICa,L IV relazione è anche presentato in Figura 5C. Le soluzioni utilizzate per registrare ICa,L sono disponibili nella tabella 7 e nella tabella 8.
Figura 5D illustra una famiglia rappresentativa di correnti K (IK) registrato nell'intera configurazione cellulare della tecnica patch-clamp. Queste correnti sono state registrate da un potenziale di detenzione di -80 mV utilizzando 500 ms gradini di morsetto tensione tra -120 mV e 80 mV, come abbiamo descritto in precedenza6,14. La relazione di sintesi IV per il totale IK è anche presentato in Figura 5D. Le soluzioni utilizzate per registrare IK sono disponibili nella tabella 7 e nella tabella8.
L'utilizzo di questi approcci per registrare ap e le principali famiglie di correnti ioniche, tra cui le correnti Na,Ca2 e K (come illustrato in precedenza), permette allo sperimentatore di interrogare rigorosamente l'elettrofisiologia del miocite atriale in un pletora di condizioni sperimentali. Il nostro laboratorio ha regolarmente impiegato queste tecniche per studiare l'elettrofisiologia atriale del miocito nei topi normali, nei modelli murini delle malattie cardiache e nei topi geneticamente modificati6,14,17,18 ,19,20.
Figura 1: Diagramma di flusso per il protocollo di isolamento dei miociti atriale. Riepilogo dei passaggi utilizzati per isolare i miociti atriale utilizzando questo protocollo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Strumenti sperimentali di configurazione e dissezione per l'isolamento dei mivociti atriale. (A). una piccola pipetta levigata dal fuoco con un'apertura di 1 mm di diametro (a sinistra) viene utilizzata per il trasferimento dei tessuti dopo la dissezione, una pipetta lucidata al fuoco a media foro con un'apertura di 3 mm di diametro (al centro) viene utilizzata per trasferire strisce di tessuto durante la isolamento, e un grande foro tubo lucidato fuoco con un'apertura di 5 mm di diametro (a destra) viene utilizzato per la triturazione del tessuto atriale digerito. (B). Configurazione sperimentale per l'isolamento degli atrialiciti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Immagine della dissezione dell'appendice atriale. (A). Rappresentativa immagine di campo luminoso di un'appendice atriale eccitata tagliata aperta e appuntata. (B). Rappresentazione dell'immagine luminosa dell'appendice atriale tagliata in strisce di tessuto di circa 0,7 mm di larghezza. Barra di scala : 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Immagini di miociti atriale isolati. (Un) immagine di Campo luminoso di miociti atriale isolati subito dopo l'isolamento. Barra della scala: 50 m. (B). Immagine di un singolo miocito atriale isolato. Barra della scala: 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Dati rappresentativi dei cerni di patch ottenuti da miociti atriale isolati. (A). Il rappresentante ha stimolato la registrazione degli AP da un miocito atriale isolato. Il riepilogo dei parametri AP è presentato nella tabella 6. Amphotericin B (200 g/mL) è stato aggiunto alla soluzione pipetta per permeabilizzare la membrana cellulare. (B). Rappresentativo INa registrazioni (sinistra) e riassunto INa IV curva (a destra) da un atriale isolato miocito. Nifedipine (10 M) è stato aggiunto alla soluzione di Tyrode modificato per bloccare ICa,L durante la registrazione INa. C. Rappresentante ICa,Registrazioni L (sinistra) e riassuntivo ICa,L IV curva (a destra) da un miocita atriale isolato. (D). Rappresentativo IK registrazioni (a sinistra) e riassunto IK IV curva (a destra) da un atriale isolato miocito. Le soluzioni utilizzate per registrare ciascuna di queste correnti sono elencate nella tabella 7 e nella tabella 8. Le curve di riepilogo IV sono misurazioni medie da 10 miociti atriale isolati da un topo di tipo selvatico C57Bl/6 maschile di 15 settimane. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| PH di Stock Tyrode 6.9 | PH di Stock Tyrode 7.4 | |
| chimico | in mM | in mM |
| Nacl | 140 del sistema | 140 del sistema |
| Kcl | 5.4 Del sistema | 5.4 Del sistema |
| KH2PO4 | 1.2 (in questo modo) | 1.2 (in questo modo) |
| HEPES | 5 Del numero 3( | 5 Del numero 3( |
| Volume finale | 500 mL | 1 L |
| PH finale con NaOH | 6.9 | 7.4 Della pes . |
Tabella 1: Stock Tyrode's pH 7.4 e stock Tyrode pH 6.9 soluzioni. Composizione delle soluzioni di stock Tyrode (pH 7.4 e pH 6.9) che possono essere realizzate in anticipo e conservate a 4 gradi centigradi per un massimo di 2 mesi.
| chimico | in mM |
| K-glutammato | 100 del sistema |
| K-aspartate | 10 del sistema |
| Kcl | 25 mi lato |
| KH2PO4 | 10 del sistema |
| MgSO4 | 2 Il nome del sistema |
| Taurina | 20 anni |
| Creatina | 5 Del numero 3( |
| EGTA | 0,5 0,5 |
| glucosio | 20 anni |
| HEPES | 5 Del numero 3( |
| Bsa | 0,10% |
| Volume finale | 1 L |
| PH finale con KOH | 7.2 (in questo stato del documento in questo |
Tabella 2: soluzione KB modificata. Ricetta per la soluzione KB modificata che può essere fatta in anticipo, aliquota, e conservato a -20 s per un massimo di 2 mesi.
| chimico | quantità |
| glucosio | 5,55 mM |
| MgCl2 | 1 mM |
| CaCl2 | 1,8 mM |
| PH di Stock Tyrode 7.4 | 50 mL |
| Eparina | 250 ll |
Tabella 3: Modificato la soluzione pH 7.4 di Tyrode con glucosio, magnesio, calcio ed eparina. Composizione della soluzione pH 7.4 di Tyrode modificata utilizzata per la dissezione del tessuto atriale. Questa soluzione deve essere fatta fresca e conservata in un bagno d'acqua a 35 gradi fino all'uso.
| chimico | quantità |
| glucosio | 18,5 mM |
| Taurina | 49,96 mM |
| Bsa | 15 mg |
| CaCl2 | 0,066 mM |
| PH di Stock Tyrode 6.9 | 15 mL |
Tabella 4: Modificata la soluzione pH 6.9 di Tyrode contenente glucosio, taurina, BSA e calcio basso. Composizione della soluzione pH 6.9 di Tyrode modificata utilizzata per l'isolamento dei miociti atriale. Questa soluzione deve essere fatta fresca e conservata in un bagno d'acqua a 35 gradi fino all'uso.
| chimico | quantità |
| Collagenae | 1.064 U |
| Elastasi | 9 U |
| Soluzione Protease | 65,2 ll |
| PH di Tyrode modificato 6.9 | 5 mL |
Tabella 5: Soluzione ezimatica. Composizione della soluzione enzimatica utilizzata per digerire enzimaticamente le strisce di tessuto atriale. Questa soluzione deve essere fatta fresca e conservata in un bagno d'acqua a 35 gradi fino all'uso.
| parametro | Nella media |
| RMP (mV) | -74,2 - 0,7 |
| Vmax (V/s) | 144,6 x 5,8 |
| Sistema operativo (mV) | 71,9 x 3,0 |
| APD50 (ms) | 11.1 - 1,7 |
| APD70 (ms) | 23,0 - 4,6 |
| APD90 (ms) | 54,7 x 7,8 |
Tabella 6: Riepilogo dei parametri AP da miociti atriale isolati. I dati sono presentati come media : SEM, n - 10 miociti atriale isolati da un topo wildtype maschile di 15 settimane C57Bl/6.
| Correnti di potassio e AP | Correnti di sodio | Correnti di calcio | |
| chimico | in mM | in mM | in mM |
| Nacl | 140 del sistema | 5 Del numero 3( | |
| Kcl | 5.4 Del sistema | ||
| MgCl2 | 1 : il nome del | 1 : il nome del | 1 : il nome del |
| CaCl2 | 1 : il nome del | 1 : il nome del | 2 Il nome del sistema |
| HEPES | 10 del sistema | 10 del sistema | 10 del sistema |
| glucosio | 5.5 5 5 | 5.5 5 5 | 5.5 5 5 |
| Cscl | 130 del sistema | ||
| TEA-Cl | 5.4 Del sistema | 145,5 anni 145,5 | |
| Ph | 7.4 Con NaOH | 7.4 Con CsOH | 7.4 Con CsOH |
Tabella 7: Composizione delle soluzioni di Tyrode utilizzate durante gli esperimenti di patch-clamp. Composizione delle soluzioni del Tyrode utilizzate per registrare gli AP, INa, ICa,L,e IK da miociti atriale isolati.
| Correnti di potassio e AP | Correnti di sodio | Correnti di calcio | |
| chimico | in mM | in mM | in mM |
| Nacl | 5 Del numero 3( | 5 Del numero 3( | 5 Del numero 3( |
| Kcl | 140 del sistema | ||
| MgCl2 | 1 : il nome del | 1 : il nome del | 1 : il nome del |
| CaCl2 | 0,2 0,2 | 0,2 0,2 | 0,2 0,2 |
| HEPES | 10 del sistema | 10 del sistema | 10 del sistema |
| EGTA | 5 Del numero 3( | 5 Del numero 3( | |
| Mg-ATP | 4 DEL psu' | 5 Del numero 3( | 4 DEL psu' |
| Na-GTP | 0.3 0.3 | 0.3 0.3 | 0.3 0.3 |
| Na-phosphocreatine | 6.6 | 6.6 | |
| Cscl | 130 del sistema | 135 del sistema | |
| BAPTA | 5 Del numero 3( | ||
| Ph | 7.2 Con KOH | 7.2 Con CsOH | 7.2 Con CsOH |
Tabella 8: Composizione della soluzione di pipette interne utilizzata durante gli esperimenti di patch-clamp. Composizione delle soluzioni di riempimento pipetta utilizzate per registrare gli AP, INa, ICa,L,e IK da miociti atriale isolati.
Discussion
Il nostro laboratorio utilizza abitualmente questo protocollo per isolare i miociti atriale dei topi da utilizzare in esperimenti patch-clamp al fine di studiare gli effetti di diverse forme di malattie cardiovascolari, mutazioni genetiche o composti farmacologici su miociti atriale Elettrofisiologia. Anche se altamente riproducibile, la qualità dei dati ottenuti dai miociti atriale isolati dipende dalla qualità dell'isolamento. Inoltre, la reintroduzione del calcio dopo l'isolamento atriale dei mivociti comporterà la morte cellulare per una popolazione di miociti isolati a causa del paradosso del calcio16. Di conseguenza, isolare i miociti atriale vitali e di alta qualità utilizzando questo approccio richiede pratica e ottimizzazione in più punti durante l'isolamento. Una volta ottimizzato, si stima che tra il 70-90% dei miociti atriale totali isolati utilizzando questo approccio sarà sia tollerante al calcio che a forma di asta. I passaggi che richiedono la massima pratica e ottimizzazione sono descritti di seguito.
La velocità e l'efficienza della dissezione avranno effetti a valle sulla qualità delle cellule isolate. È importante prendere tempo per garantire che tutto il sangue viene rimosso dal tessuto atriale e che le strisce di tessuto siano tagliate a dimensioni simili. Dovrebbe richiedere circa 5 min per rimuovere l'appendice atriale, tagliare il tessuto a strisce e trasferire le strisce di tessuto nel primo tubo della soluzione pH 6.9 di Tyrode modificata. Tuttavia, se questo passaggio richiede troppo tempo, la qualità del tessuto può essere compromessa.
È anche importante che le strisce di tessuto siano tagliate a una dimensione uniforme all'interno di un isolamento e tra i cuori. Se le strisce di tessuto sono troppo grandi o troppo piccole, o se non sono uniformi all'interno di un isolamento, questo può causare problemi durante sia la digestione enzimatica che la curiosazione. Questo perché le piccole strisce saranno più accuratamente digerite e grandi strisce saranno sotto digerite. È altrettanto importante considerare che il genotipo e l'impostazione della malattia vengono studiati in quanto le dimensioni dell'appendice atriale possono variare tra gli animali. Ad esempio, i cuori ipertrofici hanno appendici atriale più grandi rispetto ai cuori sani, e quindi lo sperimentatore può tagliare più strisce nei cuori ipertrofici rispetto ai cuori di dimensioni normali. Di conseguenza, l'ottimizzazione delle dimensioni delle strisce di tessuto tagliato e l'applicazione di queste dimensioni a ogni singola appendice atriale migliorerà notevolmente la riproducibilità degli isolamenti dei miociti tra condizioni sperimentali.
Il delicato equilibrio tra la digestione enzimatica e la dissociazione meccanica è fondamentale per un riuscito isolamento da miocito atriale utilizzando questo protocollo. Se il tessuto non è adeguatamente vorticoso durante la digestione enzimatica le singole strisce di tessuto tenderanno ad aggregarsi e attaccarsi insieme, il che limiterà l'efficacia della digestione enzimatica. Se agitato troppo frequentemente o vigorosamente, questo può danneggiare il tessuto atriale, che si tradurrà nell'isolamento di cellule non vitali. La dissociazione meccanica dei miociti atriale isolati dalle strisce di tessuto durante la triturazione è il passo più critico per praticare e ottimizzare utilizzando questo approccio per isolare i miociti atriale. Se la triturazione è troppo delicata, la resa cellulare sarà bassa. D'altra parte, se la triturazione è troppo dura, allora un'abbondanza di miociti non vitali sarà isolata e la qualità dei dati ottenuti durante gli esperimenti di patch-clamp sarà compromessa. Inoltre, la composizione degli atri può influenzare l'isolamento. Ad esempio, se il tessuto è fibrotico, la digestione enzimatica e le fasi di triturazione potrebbero dover essere modificate. È quindi importante prendere il tempo per sviluppare le competenze necessarie per ottenere cellule di alta qualità durante la triturazione che possono essere utilizzate per esperimenti patch-clamp.
Come con tutte le tecniche sperimentali ci sono limitazioni. Questa tecnica richiede pratica per isolare riproducibilmente i miociti vitali e di alta qualità, che a loro volta influiranno sulla fattibilità di qualsiasi esperimento da eseguire utilizzando questi miociti. Questo approccio è anche terminale e i miociti atriale isolati utilizzando questo approccio possono essere utilizzati solo il giorno dell'isolamento. Il nostro laboratorio usa le cellule entro 6-7 h di isolamento.
Questo approccio di isolamento dei cardiomiociti atriale ha diverse applicazioni. Ad esempio, questo approccio può essere modificato per isolare i miociti atriale (così come i fibroblasti cardiaci) da altre specie, incluse le biopsie del tessuto atriale umano. Inoltre, un vantaggio dell'utilizzo di questo metodo a blocchi per l'isolamento dei miociti atriale (a differenza della perfusione retrograda del cuore) è che può essere modificato per isolare i cardiomiociti da altre regioni del cuore, come il nodo sinoatrial o altre regioni specifiche del miocardio atriale, o comprendono l'intera regione solficia del cuore. Il nostro laboratorio utilizza cardiomiociti atriale per esperimenti patch-clamp per misurare i potenziali d'azione e le correnti ioniche, anche se questo approccio non deve essere limitato a questa tecnica. Ad esempio, i miociti isolati possono essere utilizzati per studiare le alterazioni dei transitori di calcio e la contrattilità in una varietà di ambienti sperimentali. I cardiomiociti atriale possono essere utilizzati anche negli studi di immunofluorescenza per studiare la posizione di proteine o strutture di interesse. Di conseguenza, questo approccio è altamente versatile con molte possibili applicazioni.
Disclosures
Gli autori non devono nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è supportato dalle sovvenzioni operative dei Canadian Institutes of Health Research (MOP 93718, 142486) e della Heart and Stroke Foundation of Canada a R.A. Rose. H.J. Jansen è il destinatario di una killam Postdoctoral Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1, 2-Bis(2-Aminophenoxy)ethane-N, N, N', N'-tetraacetic acid 98% | Sigma | A4926-1G | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra, > 99%, from microbial | Sigma | A7699-1G | |
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt > 95%, bacterial | Sigma | A9187-1G | |
| Amphocetericin B from Streptomyces sp. ~80% (HPLC), powder | Sigma | A4888-500 MG | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A3059-50G | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506-500G | |
| Cesium chloride ReagentPlus, 99.9% | Sigma | 289329-100G | |
| Cesium hydroxide monohydrate > 99.5% trace metals basis | Sigma | 562505-1KG | |
| Collagenase Type 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | |
| Creatine anhydrous | Sigma | C0780 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| DL-Aspartic acid potassium salt | Sigma | A2025-100G | |
| Elastase suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS002279 | |
| Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid >97.0% | Sigma | E4378-25G | |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate > 95% (HPLC), powder | Sigma | G8877-250MG | |
| Heparin 10 000 USP U/10 mL | SANDOZ | 10750 | |
| HEPES > 99.5% (titration) | Sigma | H3375-500G | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate > 99% (HPLC), powder | Sigma | G1501-500G | |
| Magnesium sulfate | Sigma | M2643-500G | |
| Nifedipine > 98% (HPLC), powder | Sigma | N7634-1G | |
| Phosphocreatine disodium salt hydrate enzymatic, approx 98% | Sigma | P7936-5G | |
| Potassium chloride ACS reagent, 99.0-100.5% | Sigma | P3911-500G | |
| Potassium hydroxide | EM Science | PX1480-1 | |
| Potassium phosphate monobasic | EMD | PX1565-1 | |
| Protease from Streptomyces griseus, type XIV, >3.5 units/mg solid, powder | Sigma | P5147-1G | |
| Sodium chloride ACS reagent, > 99.0% | Sigma | S9888-2.5KG | |
| Sodium hydroxide, pellets, 97+%, A.C.S. reagent | Sigma | 221465-500G | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | World Precision Instruments Inc | SYLG184 | |
| Taurine | Sigma | T0625-100G | |
| Tetraethylammonium chloride > 98% (titration) | Sigma | T2265-100G |
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