Summary
Dit protocol wordt gebruikt om enkelvoudige atriale cardiomyocyten van het volwassen muis hart te isoleren met behulp van een Brok digestie benadering. Deze aanpak wordt gebruikt om te isoleren van rechts of links atriale myocyten die kunnen worden gebruikt voor het karakteriseren van Atrium myocyten elektrofysiologie in Patch-clamp studies.
Abstract
De elektrofysiologische eigenschappen van atriale myocyten zijn belangrijk voor de algehele hartfunctie. Veranderingen in de onderliggende Ionische stromingen die verantwoordelijk zijn voor het actie potentieel kunnen pro-aritmische substraten veroorzaken die het gevolg zijn van aritmie, zoals Boezemfibrillatie, die in vele aandoeningen en ziektetoestanden zeer gangbaar zijn. Het isoleren van volwassen muis atriale hartspier voor gebruik in Patch-clamp experimenten heeft onze kennis en het begrip van de cellulaire elektrofysiologie in het gezonde atriale myocardium en in de setting van atriale pathofysiologie sterk gevorderd. Bovendien hebben studies met behulp van genetische Muismodellen de rol van een groot aantal eiwitten bij het reguleren van atriale elektrofysiologie opgehelderd. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de isolatie van cardiomyocyten van de atriale aanhangsels van volwassen muizen met behulp van een combinatie van enzymatische spijsvertering en mechanische dissociatie van deze weefsels. Deze aanpak levert consequent en betrouwbaar geïsoleerde atriale cardiomyocyten op die vervolgens kunnen worden gebruikt om cellulaire elektrofysiologie te karakteriseren door het meten van actie potentialen en Ionische stromingen in Patch-clamp experimenten onder een aantal experimentele Voorwaarden.
Introduction
De atria, die de dunne ommuurde, lage drukkamers van het hart die bloed ontvangen van de superieure en inferieure Vena ader evenals de pulmonale aderen, zijn integraal in de normale cardiale fysiologie. Net als andere delen van het hart, de atria bevatten een aantal celtypen, met inbegrip van cardiomyocyten, fibroblasten, endotheel cellen, vasculaire gladde spiercellen, en anderen. Atriale myocyten zijn elektrisch prikkelbaar cellen die een essentiële rol spelen in de geleiding van elektrische signalen door het hart, waardoor een goede atriale contractie wordt verzekerd tijdens elke hartslag1. Elektrische disfunctie in de Atria kan leiden tot een aantal atriale specifieke aritmie zoals atriale flutter en boezemfibrilleren2,3. Deze zijn zeer gangbaar, maar slecht begrepen, atriale aritmie die tot ernstige morbiditeit en sterfte leiden. Atriumfibrillatie kan optreden in samenwerking met genetische mutaties, in associatie met veroudering of in de setting van verworven vormen van hartziekte, waaronder hypertensie, hartfalen en diabetes2,4,5 ,6. Deze voorwaarden kunnen de elektrische eigenschappen van atriale myocyten wijzigen die een substraat kunnen creëren dat de prevalentie van aritmogenese1,2verhoogt.
Normale elektrische functie in de atria, evenals atriale aritmogenese, zijn belangrijk beïnvloed door de morfologie van de actiepotentiaal (AP) geproduceerd in atriale myocyten. De atriale AP wordt gegenereerd uit de activiteit van een aantal Ionische stromingen, met inbegrip van de natrium stroom (Ina, uitgevoerd door NaV1,5 kanalen), de l-type calcium stroom (iCA, L, uitgevoerd door cav1,2 en CAv1,3 kanalen ), en verschillende kaliumstromingen, waaronder de ultrasnelle vertraagde gelijkrichter kalium stroom (IKur, uitgevoerd door kv1,5 kanalen), de voorbijgaande uiterlijke kalium stroom (ito, uitgevoerd door kv4,2 en kv4,3 ), een steady state kalium stroom (iKSS, gedragen door kV2,1 kanalen), en de actieve gelijkrichter kalium stroom (iK1, gedragen door kIR2,1 kanalen)1,7, 8. Hoewel ze niet spelen een belangrijke rol in de muis atria, de snelle en langzame onderdelen van de vertraagde gelijkrichter K+ stroom (iKR en ikKS) ook bijdragen aan AP repolarisatie in sommige soorten7. Veranderingen in een of meer van deze Ionische stromingen kunnen de elektrische eigenschappen van atriale myocyten significant veranderen, wat kan leiden tot atriale aritmie. Bijvoorbeeld, een verlaging van Ina kan vertragen geleiding snelheid over de atria door het verminderen van de snelheid van de AP-neerwaartse. Aan de andere kant kan een afname van de repolariserende kaliumstromen of een toename van ICA, L of de late ina leiden tot de ontwikkeling van afterdepolarisaties die spontane activiteit in de atria1kunnen triggeren, 2,9.
Het is belangrijk om te erkennen dat er verschillen in AP-morfologie zijn in verschillende delen van het atriale myocardium die waarschijnlijk te wijten zijn aan verschillen in de uitdrukking of regulering van deze onderliggende ionenkanalen. Verschillen in AP-duur tussen de rechter-en linker atria in verband met verschillen in Itot de huidige dichtheid zijn bijvoorbeeld goed beschreven10,11,12,13. Ook hebben we onlangs aangetoond dat er verschillende patronen van elektrische remodellering in de rechter en linker atria van muizen met chronische hypertensie6,14. De rechter atriale posterieure muur bevat ook het sinoatriale knooppunt, dat zijn eigen kenmerkende patronen van AP-morfologie en vuur patronen heeft15. De afzonderlijke eigenschappen van myocyten in elk van deze verschillende delen van de atria kunnen in detail worden onderzocht met behulp van geïsoleerde myocyten uit elk van deze regio's.
Er zijn verschillende benaderingen die kunnen worden gebruikt om Atrium myocytes voor patch-klem elektrofysiologie studies16isoleren. Een mogelijkheid is het gebruik van een retrograde perfusie benadering waarbij het hart via de aorta wordt gekandeerd voor de levering van enzymen. Hoewel dit een levensvatbare aanpak is, kan het variabiliteit in atriale myocyten kwaliteit produceren als gevolg van inconsistenties in de perfusie van de atria. We hebben een ' Brok ' digestie benadering aangenomen voor de isolatie van atriale myocyten die de noodzaak van retrograde perfusie van het hart elimineert. Onze aanpak maakt gebruik van een combinatie van enzymatische spijsvertering en mechanische dissociatie van atriale weefsel dat consistent en betrouwbaar grote aantallen geïsoleerde atriale myocyten oplevert die geschikt zijn voor Patch-clamp studies. Hoewel we hier onze aanpak beschrijven met behulp van atriaal aanhangsel weefsel, kan de aanpak worden gebruikt in elke regio van het atriale myocardium (d.w.z. rechts of links atriale aanhangsels, vrije wanden, posterieure wanden) die de onderzoeker kiest. Deze aanpak is ideaal voor studies van atriale myocyten elektrofysiologie bij genetisch gemodificeerde muizen, in muizen modellen van hart-en vaatziekten, of voor het bestuderen van de effecten van farmacologische verbindingen5,6,17 , 18 , 19.
Protocol
Alle dier procedures werden goedgekeurd door de Universiteit van Calgary Animal Care and use Committee en werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Canadese Raad voor dierverzorging. De Atrium myocyten-isolatie, afbeeldingen en representatieve resultaten die hieronder worden beschreven, zijn verkregen van een 15-weekse mannelijk wild type C57Bl/6-muis. We gebruiken dit protocol routinematig om atriale myocyten te isoleren van wild type muizen17,18, muizen met genetische mutaties19,20 en Muismodellen van ziekten zoals chronische hypertensie6, 14. Het protocol kan op dezelfde manier worden gebruikt voor mannelijke of vrouwelijke muizen. We gebruikten ook een soortgelijke versie van deze isolatie procedure te isoleren sinoatriale knooppunt myocyten van de muis hart17,21,22,23. Een stroomschema van dit experimentele protocol bevindt zich in Figuur 1.
1. bereiding van voorraadoplossingen en-apparatuur
- Bereid 1 ontsnij schotel voor door een siliconen elastomeer toe te voegen volgens de instructies van de fabrikant. Voeg voldoende siliconen elastomeer compound toe om de bodem van een 10 cm Petri schaal te bedekken tot een diepte van 1 cm. laten genezen en vervolgens 6 insecten pennen in het schaaltje plaatsen.
Opmerking: Deze siliconen ontsnij schotel kan maanden lang worden hergebruikt en bij kamertemperatuur worden bewaard. - Bereid 3 vuurgepolijste Pasteur-pipetten met een opening van 1 mm (kleine boring), 3 mm (medium boring) of 5 mm (grote boring) in diameter zoals afgebeeld in Figuur 2a. Om deze pipetten te maken, scoor je een Pasteur-pipet en klik je vervolgens langs het Score teken om een opening te produceren die iets groter is dan de gewenste grootte van de boring. Gebruik een metalen bestand om het oppervlak glad te strijken en vuur-polijsten deze opening met behulp van een open vlam.
Opmerking: Dit zal een gladde, vuurgepolijste rand produceren met een opening van de gewenste diameter. Het is belangrijk dat de opening vrij is van scheuren en ruwe oppervlakken. Deze vuurgepolijste pipetten kunnen op kamertemperatuur worden bewaard en maanden lang worden hergebruikt. - Bereid stockoplossingen voor op de pH 6,9-oplossing van Tyrode en de pH 7,4-oplossing van Tyrode zoals vermeld in tabel 1. Bereid ook 10 mL elk van 1 M MgCl2, 1 m CACL2en 100 mm CACL2. Gebruik ultrapuur water voor alle oplossingen en bewaar bij 4 °C gedurende maximaal 2 maanden.
- Bereid 1 L gemodificeerde Kraft-Brühe (KB) oplossing zoals aangegeven in tabel 2. Gebruik ultrapuur water. Verdeel de oplossing in 20 mL aliquots en bewaar bij-20 °C gedurende maximaal 2 maanden.
2. voorbereiding van oplossingen en isolatie-instellingen voor atriale Myocyte-isolatie
- Bereid 50 mL van de pH 7,4-oplossing van Tyrode, zoals beschreven in tabel 3 in een erlenmeyer van 125 ml, met 1 m CACL2 en 1 m MgCl2 voorraadoplossingen. Plaats de erlenmeyer in een waterbad van 35 °C tot het gebruik, zoals afgebeeld in Figuur 2b.
- Bereid de aangepaste pH 6,9-oplossing van Tyrode voor zoals beschreven in tabel 4 in een buis van 50 ml, met de 100 mm CACL2 stockoplossing. Aliquot 2,5 mL van deze oplossing in elk van de drie ronde bodem buizen van 5 mL. Plaats deze buisjes in een draadrek geplaatst in een waterbad van 35 °C, zoals afgebeeld in Figuur 2b.
- Bereid de enzym oplossing zoals beschreven in tabel 5 in een ronde bodem buis van 14 ml. Voeg 1 mg protease per 100 μL ultrazuiver water toe om de protease oplossing te maken. Plaats de buis met deze enzym oplossing in het draadrek en inincuberen in een waterbad van 35 °C tot het gebruik.
- Een aliquot van een gemodificeerde KB-oplossing in een waterbad van 35 °C ontdooien. Aliquot 2,5 mL KB oplossing in elk van drie 5 mL ronde bodem buizen en 2,5 mL in een ronde bodem buis van 14 mL. Plaats deze buisjes in het draadrek en incuberen in een waterbad van 35 °C tot het gebruik, zoals afgebeeld in Figuur 2b.
- Leg de ontsnij plaat, de ontsnij gereedschappen, een Pasteur-pipet en de vuurgepolijste pipetten vast zoals afgebeeld in Figuur 2b.
3. dissectie van muis atriale appendage (s)
- Injecteer de muis met 0,2 mL heparine (10 000 USP U/10 mL) via intraperitoneale injectie en wacht 5 min voor absorptie.
- Plaats de muis in een inductie kamer en anesthetiseren door Isofluraan inademing (3-4%). Isofluraan en zuurstof worden geleverd met behulp van een verdovingsmiddel en afval verdovings gas wordt opgeruimd. Zodra de muis is verdoitiseerd, en vertoont geen teen pinch reflex, euthanaseren de muis door snelle cervicale dislocatie. Plaats de muis op een papieren handdoek of een kurk bord en plak de poten omlaag om de muis op zijn plaats te houden.
- Bevochtig de borst van de muis met 70% ethanol. Verwijder de vacht en de huid die de borst bedekken met behulp van een gebogen schaar. Gebruik vervolgens de rat tooth tang om het borstbeen op te tillen en snijd vervolgens het diafragma langs de rand van de ribben. Verwijder de volledige ribbenkast met gebogen schaar om het hart bloot te leggen.
- Om het onderrand van de atriale (rechts of links) te verwijderen, til het aanhangsel voorzichtig op met een fijne ontsnij Tang en snijd het uit met een veer schaar. Breng het bovendeel van het Atrium onmiddellijk over in een siliconen gecoate dissectie schotel met 20 mL van de opgewarmde gemodificeerde Tyrode pH 7,4-oplossing, zoals beschreven in stap 2,1.
- Plaats een ontleden pin aan de bovenkant en een pin aan de onderkant van de opening van de atriale appendage. Spoel de atria met behulp van een weide pipet af met de opgewarmde gemodificeerde Tyrode pH 7,4 oplossing om bloed te verwijderen. Open het atriale aanhangsel door langs de boven-en onderrand van het bovendeel van de boezem te snijden. Speld daarna de hoeken van het atriale aanhangsel omlaag om een plat, rechthoekig stukje weefsel te maken, zoals afgebeeld in Figuur 3a.
4. isolatie van atriale Myocyten
Opmerking: De stappen in deze sectie worden allemaal uitgevoerd op 35 °C, met buizen ondergedompeld in een water bad van 35 °C. Wees voorzichtig bij het overbrengen van weefsel stroken tussen ronde bodem buizen om ervoor te zorgen dat alleen het weefsel (en niet de oplossing) wordt overgebracht tussen buizen.
- Snijd de atriale aanhangsel in ongeveer 8-10 gelijke grootte strips (ongeveer 0,7 mm breed) met behulp van veer schaar en fijne Tang. Een voorbeeld van de stroken atriale weefsel wordt getoond in Figuur 3b. Merk op dat de strips contract zodra ze zijn gesneden vrij van het belangrijkste stukje weefsel. Gebruik de kleine boring met brandwerende pipet en breng de weefsel stroken over in de eerste buis met opgewarmde gemodificeerde Tyrode pH 6,9-oplossing zoals beschreven in stap 2,2. Wacht 5 min.
- Was de weefsel stroken door ze over te brengen naar de tweede en vervolgens de derde ronde onderbuis met gemodificeerde Tyrode pH 6,9 oplossing, bereid in stap 2,2 met behulp van de medium boring met vuur gepolijst pipet.
- Om de weefsel stroken te wassen, dop de 5 mL ronde bodem buis en Inverteer de buis 3 keer zachtjes. Laat de weefsel stroken zich op de bodem van de buis vestigen voordat de weefsel stroken naar de volgende buis worden overgebracht met behulp van de medium boring met een vuurgepolijste pipet.
- Breng de weefsel stroken over in de in stap 2,3 beschreven enzym oplossing met behulp van een brandgepolijste pipet met een medium boring en inincuberen gedurende 30 min. Draai de buis om de 3-5 min om te voorkomen dat de weefsel stroken elkaar vasthouden.
Opmerking: Aan het begin van de enzymatische spijsvertering vestigen weefsel stroken snel na wervelende. Op ongeveer 20 minuten van de spijsvertering, de weefsel stroken beginnen te zweven in de enzymatische oplossing na wervelende. Gedurende deze tijd veranderen de boezem weefsel stroken ook in het uiterlijk van lichtroze tot wit als ze worden verteerd. - Na enzymatische spijsvertering, voeren drie wast met behulp van 2,5 mL KB oplossing in de 5 mL ronde bodem buizen bereid in stap 2,4. Keer voor elke wasbeurt de buis 3 keer zachtjes om voordat u het weefsel naar de volgende buis verplaatst met behulp van de medium boring met brandgepolijst pipet. Na de laatste wasbeurt, breng de strips over in de 14 mL ronde bodem buis met 2,5 mL KB oplossing. Wacht 5 min.
- Schud het weefsel voorzichtig gedurende 7,5 minuten met behulp van de brede, met vuur gepolijste pipet. Dit zal de weefsel stroken mechanisch ontkoppelen en een troebele oplossing opleveren, gevuld met individuele atriale myocyten.
Opmerking: Tijdens de trituratie wordt het weefsel wit en wordt de oplossing troebel. De kracht van trituratie, bereikt door het veranderen van zowel de frequentie en snelheid van het verstellen van de weefsel stroken uit de brede boring brandgepolijst Pipet, moet worden afgestemd op de individuele isolatie. Als de trituratie te zacht is, zal de celopbrengst laag zijn, terwijl een te harde trituratie veel dode cellen oplevert. Vermijd bubbels tijdens het tritureren. - Vul de 14 mL ronde bodem buis met de getritureerde weefsel stroken met KB-oplossing tot een eindvolume van 7-10 mL, afhankelijk van de gewenste celdichtheid voor experimenteel gebruik. Plaats deze buis op kamertemperatuur gedurende 1 uur. Na deze incubatieperiode kunnen cellen worden gebruikt voor een verscheidenheid aan experimenten tot 7 uur. cellen kunnen ook worden opgeslagen bij 4 °C voor maximaal 7 uur.
Representative Results
De atriale myocyten die met dit protocol worden geïsoleerd, kunnen worden gebruikt om de elektrofysiologische eigenschappen van deze cellen te karakteriseren met behulp van de patch-clamp-techniek. Aliquots van atriale myocyten in KB-oplossing kunnen worden toegevoegd aan de opname kamer van een standaard patch-klem apparaat en superfused met oplossingen die geschikt zijn voor het soort opname dat de experimentalist wenst uit te voeren. Atriale myocyten geïsoleerd met behulp van dit protocol worden het best gebruikt voor elektrofysiologische studies binnen 6-7 h van isolatie. Representatieve Patch-clamp gegevens uit ons laboratorium worden hieronder weergegeven.
Figuur 4 illustreert voorbeelden van geïsoleerde atriale myocyten van normale muizen die zijn bereid met het bovenstaande protocol. Geïsoleerde atriale myocyten zijn meestal op de orde van 100 μm in lengte en 10 μm in de breedte met duidelijke striations. De capaciteit van geïsoleerde atriale myocyten is meestal 40-70 pF.
Figuur 5a illustreert een voorbeeld van een atriale myocyten AP opgenomen met behulp van de geperforeerde Patch-clamp techniek in stroomtang modus, zoals we eerder hebben beschreven6,19,20. Overzichtsgegevens die typische atriale myocyten AP-parameters illustreren, staan in tabel 6. Concreet presenteren wij samenvattingsgegevens voor metingen van de rust membraanpotentiaal (RMP), maximale neerwaartse Velocity (VMax), overschrijding (OS) en AP duur bij 50% (apd50), 70% (apd70) en 90% (apd90) repolarisatie tijd (tabel 6). APs kan ook worden opgenomen in de hele cel configuratie14. De superfusie-en pipet oplossingen voor het opnemen van APs zijn beschikbaar in tabel 7 en tabel 8.
Figuur 5b illustreert een representatieve familie van na+ stromingen (Ina) opgenomen in de hele celconfiguratie van de patch-clamp techniek. Deze stromen werden opgenomen met behulp van 50 MS spannings klem stappen tussen-100 en + 10 mV van een vasthoud potentiaal van-120 mV. We hebben beschreven benaderingen en protocollen voor het opnemen van Ina eerder6,14,20. Een samenvatting Ina IV-relatie wordt ook weergegeven in Figuur 5b. Oplossingen die worden gebruikt om Ina op te nemen, worden weergegeven in tabel 7 en tabel 8.
Afbeelding 5c illustreert een representatieve familie van CA2 + stromingen (ICA, L) opgenomen in de hele celconfiguratie van de patch-clamp techniek. Deze stromingen werden geregistreerd met behulp van 250 MS spannings klem stappen tussen-60 en + 80 mV van een vasthoud potentiaal van-70 mV. De experimentele omstandigheden die kunnen worden gebruikt voor het meten van ICA, L zijn eerder beschreven17,18,20. Een samenvatting ICA, L IV relatie wordt ook gepresenteerd in figuur 5c. De oplossingen die worden gebruikt voor het opnemen van ICA, L zijn beschikbaar in tabel 7 en tabel 8.
Figuur 5d illustreert een representatieve familie van k+ stromingen (IK) die is opgenomen in de hele celconfiguratie van de patch-clamp techniek. Deze stromingen werden opgenomen van een vasthoud potentiaal van-80 MV met behulp van 500 MS spannings klem stappen tussen-120 MV en + 80 mv, zoals we eerder hadden beschreven6,14. De samenvatting IV-relatie voor totaal IK wordt ook weergegeven in figuur 5d. De oplossingen die worden gebruikt om IK op te nemen zijn beschikbaar in tabel 7 en tabel 8.
Met behulp van deze benaderingen om APs en grote families van Ionische stromingen op te nemen, waaronder de stromen na+, CA2 + en K+ (zoals hierboven afgebeeld), is het de onderzoeker toegestaan om atriale myocyten elektrofysiologie grondig te ondervragen in een overvloed aan experimentele omstandigheden. Ons laboratorium heeft deze technieken routinematig gebruikt om atriale myocyten elektrofysiologie te bestuderen in normale muizen, in muizen modellen van hartziekten, en bij genetisch gemodificeerde muizen6,14,17,18 ,19,20.
Figuur 1: stroomdiagram voor het atriale myocyten Isolation protocol. Samenvatting van de stappen die worden gebruikt om Atrium myocytes met behulp van dit protocol te isoleren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: experimentele Setup en dissectie tools voor atriale myocyten isolatie. A). een kleine boring met een vuurgepolijste pipet met een opening van 1 mm in diameter (links) wordt gebruikt voor weefsel overdracht na een sectie, wordt een medium boring met brandgepolijst pipet met een opening van 3 mm in diameter (midden) gebruikt voor het overbrengen van weefsel stroken tijdens de isolatie, en een grote boring brandgepolijst pipet met een opening 5 mm in diameter (rechts) wordt gebruikt voor de trituratie van verteerd atriale weefsel. (B). experimentele opstelling voor atriale myocyten-isolatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: afbeelding van de dissectie van de atriale aanhangsel. (A). representatief helderveld beeld van een uitgestraagd atriaal aanhangsel gesneden open en vastgemaakt. B). representatief helderveld van de in de breedte van het atriale aanhangsel gesneden weefsel stroken van ongeveer 0,7 mm breed. Schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: afbeeldingen van geïsoleerde atriale myocyten. (A). brightfield-afbeelding van geïsoleerde atriale myocyten onmiddellijk na isolatie. Schaalbalk = 50 μm. B). brightfield-afbeelding van een enkele geïsoleerde atriale Myocyte. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: representatieve patch-klem gegevens verkregen uit geïsoleerde atriale myocyten. (A). representatieve geprikkeld AP-opname van een geïsoleerde atriale Myocyte. Samenvatting van de AP-parameters wordt weergegeven in tabel 6. Amfotericine B (200 μg/mL) is toegevoegd aan de pipet oplossing voor permeabilize het cellulaire membraan. (B). representatieve ina -opnames (links) en samenvatting ina IV curve (rechts) van een geïsoleerde atriale Myocyte. Nifedipine (10 μM) werd toegevoegd aan de gemodificeerde Tyrode oplossing om I CA te blokkeren, L bij opname ina. C. vertegenwoordiger ICA, l opnames (links) en samenvatting iCA, l IV curve (rechts) van een geïsoleerde atriale Myocyte. (D). representatieve ik -opnames (links) en samenvatting ik IV curve (rechts) van een geïsoleerde atriale Myocyte. De oplossingen die worden gebruikt om elk van deze stromingen op te nemen, staan vermeld in tabel 7 en tabel 8. Samenvatting IV Curves zijn gemiddeld metingen van 10 atriale myocyten geïsoleerd van een 15 weken oude mannelijke wild type C57Bl/6 muis. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Voorraad Tyrode 's pH 6,9 | Voorraad Tyrode 's pH 7,4 | |
| Chemische | in mM | in mM |
| Nacl | 140 | 140 |
| Kcl | 5,4 | 5,4 |
| KH2po4 | 1,2 | 1,2 |
| HEPES | 5 | 5 |
| Eindvolume | 500 mL | 1 L |
| Uiteindelijke pH met NaOH | 6,9 | 7,4 |
Tabel 1: voorraad tyrode is ph 7,4 en ph 6,9 oplossingen van tyrode. Samenstelling van de oplossingen van Stock Tyrode (pH 7,4 en pH 6,9) die op voorhand gemaakt kunnen worden en bewaard bij 4 °C gedurende maximaal 2 maanden.
| Chemische | in mM |
| K-glutamaat | 100 |
| K-aspartaat | 10 |
| Kcl | 25 |
| KH2PO4 | 10 |
| MgSO4 | 2 |
| Taurine | 20 |
| Creatine | 5 |
| EGTA | 0,5 |
| Glucose | 20 |
| HEPES | 5 |
| Bsa | 0,10% |
| Eindvolume | 1 L |
| Uiteindelijke pH met KOH | 7,2 |
Tabel 2: gemodificeerde KB-oplossing. Recept voor gemodificeerde KB-oplossing die op voorhand kan worden gemaakt, aliciteerde en bewaard bij-20 °C gedurende maximaal 2 maanden.
| Chemische | Bedrag |
| Glucose | 5,55 mM |
| MgCl2 | 1 mM |
| CaCl2 | 1,8 mM |
| Voorraad Tyrode 's pH 7,4 | 50 mL |
| Heparine | 250 μL |
Tabel 3: gemodificeerde Tyrode pH 7,4 oplossing met glucose, magnesium, calcium en heparin. Samenstelling van gemodificeerde Tyrode pH 7,4 oplossing gebruikt voor de atriale weefsel dissectie. Deze oplossing moet vers worden gemaakt en in een waterbad van 35 °C worden bewaard tot het gebruik.
| Chemische | Bedrag |
| Glucose | 18,5 mM |
| Taurine | 49,96 mM |
| Bsa | 15 mg |
| CaCl2 | 0,066 mM |
| Voorraad Tyrode 's pH 6,9 | 15 mL |
Tabel 4: aangepaste pH 6,9-oplossing van Tyrode met glucose, taurine, BSA en een laag calciumgehalte. Samenstelling van de gemodificeerde Tyrode pH 6,9-oplossing die wordt gebruikt voor de atriale myocyten-isolatie. Deze oplossing moet vers worden gemaakt en in een waterbad van 35 °C worden bewaard tot het gebruik.
| Chemische | Bedrag |
| Collagenase | 1.064 U |
| Elastase | 9 U |
| Protease oplossing | 65,2 μL |
| Gemodificeerde Tyrode 's pH 6,9 | 5 mL |
Tabel 5: enzymatische oplossing. Samenstelling van de enzymatische oplossing die wordt gebruikt voor enzymatisch verteren van atriale weefsel stroken. Deze oplossing moet vers worden gemaakt en in een waterbad van 35 °C worden bewaard tot het gebruik.
| Parameter | Gemiddelde |
| RMP (mV) | -74,2 ± 0,7 |
| Vmax (V/s) | 144,6 ± 5,8 |
| OS (mV) | 71,9 ± 3,0 |
| APD50 (MS) | 11,1 ± 1,7 |
| APD70 (MS) | 23,0 ± 4,6 |
| APD90 (MS) | 54,7 ± 7,8 |
Tabel 6: samenvatting van AP-parameters van geïsoleerde atriale myocyten. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM, n = 10 atriale myocyten geïsoleerd van een 15 weken mannelijk wild type C57Bl/6 muis.
| Kaliumstromen en APs | Natrium stromen | Calcium stromen | |
| Chemische | in mM | in mM | in mM |
| Nacl | 140 | 5 | |
| Kcl | 5,4 | ||
| MgCl2 | 1 | 1 | 1 |
| CaCl2 | 1 | 1 | 2 |
| HEPES | 10 | 10 | 10 |
| Glucose | 5,5 | 5,5 | 5,5 |
| CsCl | 130 | ||
| TEA-cl | 5,4 | 145,5 | |
| Ph | 7,4 met NaOH | 7,4 met CsOH | 7,4 met CsOH |
Tabel 7: samenstelling van de oplossingen van Tyrode tijdens Patch-clamp-experimenten. Samenstelling van de Tyrode oplossingen gebruikt voor het opnemen van APs, ikna, iCA, L, en ikK van geïsoleerde atriale myocyten.
| Kaliumstromen en APs | Natrium stromen | Calcium stromen | |
| Chemische | in mM | in mM | in mM |
| Nacl | 5 | 5 | 5 |
| Kcl | 140 | ||
| MgCl2 | 1 | 1 | 1 |
| CaCl2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 |
| HEPES | 10 | 10 | 10 |
| EGTA | 5 | 5 | |
| Mg-ATP | 4 | 5 | 4 |
| Na-GTP | 0,3 | 0,3 | 0,3 |
| Na-fosfocreatine | 6,6 | 6,6 | |
| CsCl | 130 | 135 | |
| BAPTA | 5 | ||
| Ph | 7,2 met KOH | 7,2 met CsOH | 7,2 met CsOH |
Tabel 8: samenstelling van de interne pipet oplossing die tijdens de patch-klem experimenten wordt gebruikt. Samenstelling van de pipet vuloplossingen die worden gebruikt om APs op te nemen, Ina, iCA, Len IK van geïsoleerde atriale myocyten.
Discussion
Ons lab gebruikt dit protocol routinematig om muis atriale myocyten te isoleren voor gebruik in Patch-clamp experimenten om de effecten van verschillende vormen van hart-en vaatziekten, genetische mutaties of farmacologische verbindingen op atriale myocyten te onderzoeken Elektrofysiologie. Hoewel zeer reproduceerbaar, is de kwaliteit van de gegevens verkregen uit de geïsoleerde atriale myocyten afhankelijk van de kwaliteit van de isolatie. Bovendien zal herintroductie van calcium na de atriale myocyten isolatie resulteren in celdood voor een populatie van geïsoleerde myocyten als gevolg van de calcium paradox16. Dienovereenkomstig, isoleren van levensvatbare, kwalitatief hoogwaardige atriale myocyten met behulp van deze aanpak vereist praktijk en optimalisatie op meerdere punten in de isolatie. Eenmaal geoptimaliseerd, wordt geschat dat tussen 70-90% van de totale atriale myocyten die met deze benadering worden geïsoleerd, zowel calcium tolerant als staafvormig zal zijn. De stappen die de meeste praktijk en optimalisatie vereisen, worden hieronder besproken.
De snelheid en efficiëntie van de dissectie zullen downstream effecten hebben op de kwaliteit van de geïsoleerde cellen. Het is belangrijk om de tijd te nemen om ervoor te zorgen dat al het bloed uit het atriale weefsel wordt verwijderd en dat weefsel stroken worden gesneden in een vergelijkbare grootte. Het moet ongeveer 5 minuten duren om het bovendeel van de atriale te verwijderen, het weefsel in stroken te knippen en de weefsel stroken in de eerste buis van gemodificeerde Tyrode pH 6,9-oplossing over te brengen. Echter, als deze stap duurt te lang, de kwaliteit van het weefsel kan worden aangetast.
Het is ook belangrijk dat weefsel stroken worden gesneden tot een uniforme grootte binnen een isolement en tussen harten. Als weefsel stroken te groot of te klein zijn, of als ze niet uniform zijn binnen een isolatie, kan dit problemen veroorzaken bij zowel enzymatische spijsvertering als trituratie. Dit komt omdat kleine stroken meer grondig worden verteerd en grote strips onder verteerd zullen worden. Het is even belangrijk om rekening te houden met het genotype en de ziekte-instelling die wordt bestudeerd, aangezien de grootte van het aanhangsel van de boezem kan variëren tussen dieren. Hypertrofische harten hebben bijvoorbeeld grotere atriale aanhangsels in vergelijking met gezonde harten, en daarom kan de experimenteerder meer stroken in hypertrofische harten snijden in vergelijking met normale grootte harten. Dienovereenkomstig zal het optimaliseren van de grootte van de gesneden weefsel stroken en het toepassen van deze afmetingen op elk afzonderlijk atriale aanhangsel de reproduceerbaarheid van myocyten isolaties tussen experimentele omstandigheden aanzienlijk verbeteren.
Het delicate evenwicht tussen de enzymatische spijsvertering en mechanische dissociatie is de sleutel tot een succesvolle atriale myocyten isolatie met behulp van dit protocol. Als weefsel niet voldoende wordt gezwenld tijdens de enzymatische vertering, zullen de afzonderlijke weefsel stroken de neiging hebben om samen te klonteren en aan elkaar te kleven, wat de effectiviteit van de enzymatische spijsvertering zal beperken. Als het te vaak of krachtig wordt geagiteerd, kan dit het atriale weefsel beschadigen, wat zal resulteren in het isoleren van niet-levensvatbare cellen. Mechanische dissociatie van geïsoleerde atriale myocyten uit weefsel stroken tijdens de trituratie is de meest kritieke stap om te oefenen en te optimaliseren met behulp van deze aanpak om atriale myocyten te isoleren. Als de trituratie te zacht is, zal de celopbrengst laag zijn. Aan de andere kant, als de trituratie te streng is, zal een overvloed aan niet-levensvatbare myocyten worden geïsoleerd, en de kwaliteit van de gegevens die worden verkregen tijdens patch-klem experimenten zullen in gevaar worden gebracht. Bovendien kan de samenstelling van de atria invloed hebben op de isolatie. Bijvoorbeeld, als weefsel fibrotische, de enzymatische spijsvertering en de trituratie stappen mogelijk moeten worden gewijzigd. Het is daarom belangrijk om de tijd te nemen om de vaardigheden te ontwikkelen die nodig zijn om hoge kwaliteit cellen te verkrijgen tijdens de trituratie die gebruikt kan worden voor Patch-clamp experimenten.
Zoals bij alle experimentele technieken zijn er beperkingen. Deze techniek vereist praktijk om levensvatbare, hoge kwaliteit myocyten te isoleren, wat weer invloed zal hebben op de haalbaarheid van eventuele experimenten die met deze myocyten worden uitgevoerd. Deze aanpak is ook Terminal en Atrium myocyten geïsoleerd met behulp van deze aanpak kan worden gebruikt op de dag van de isolatie alleen. Ons lab gebruikt de cellen binnen 6-7 h van isolatie.
Deze aanpak van het isoleren van atriale hartspier heeft verschillende toepassingen. Deze benadering kan bijvoorbeeld worden aangepast om atriale myocyten (evenals cardiale fibroblasten) te isoleren van andere soorten, waaronder biopsies van menselijk Atrium weefsel. Bovendien, een voordeel voor het gebruik van deze Chunk methode voor atriale myocyten isolatie (in tegenstelling tot retrograde perfusie van het hart) is dat het kan worden gewijzigd om te isoleren van hartspier uit andere gebieden van het hart, zoals de sinoatriale knooppunt of andere specifieke regio's van het atriale myocardium, of omvatten het gehele Supraventriculaire gebied van het hart. Ons laboratorium gebruikt atriale cardiomyocyten voor Patch-clamp experimenten om actie potentialen en Ionische stromingen te meten, hoewel deze aanpak niet beperkt hoeft te blijven tot deze techniek. Geïsoleerde myocyten kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt om veranderingen in calcium Transiënten en contractiliteit in verschillende experimentele instellingen te onderzoeken. Atriale cardiomyocyten kunnen ook worden gebruikt in immunofluorescentie studies om de locatie van eiwitten of structuren van belang te bestuderen. Dienovereenkomstig is deze aanpak zeer veelzijdig met veel mogelijke toepassingen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door de exploitatiesubsidies van de Canadese instituten voor gezondheidsonderzoek (MOP 93718, 142486) en het hart en beroerte Foundation van Canada aan R.A. Rose. H.J. Jansen is de winnaar van een Killam Postdoctoral Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1, 2-Bis(2-Aminophenoxy)ethane-N, N, N', N'-tetraacetic acid 98% | Sigma | A4926-1G | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra, > 99%, from microbial | Sigma | A7699-1G | |
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt > 95%, bacterial | Sigma | A9187-1G | |
| Amphocetericin B from Streptomyces sp. ~80% (HPLC), powder | Sigma | A4888-500 MG | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A3059-50G | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506-500G | |
| Cesium chloride ReagentPlus, 99.9% | Sigma | 289329-100G | |
| Cesium hydroxide monohydrate > 99.5% trace metals basis | Sigma | 562505-1KG | |
| Collagenase Type 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | |
| Creatine anhydrous | Sigma | C0780 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| DL-Aspartic acid potassium salt | Sigma | A2025-100G | |
| Elastase suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS002279 | |
| Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid >97.0% | Sigma | E4378-25G | |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate > 95% (HPLC), powder | Sigma | G8877-250MG | |
| Heparin 10 000 USP U/10 mL | SANDOZ | 10750 | |
| HEPES > 99.5% (titration) | Sigma | H3375-500G | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate > 99% (HPLC), powder | Sigma | G1501-500G | |
| Magnesium sulfate | Sigma | M2643-500G | |
| Nifedipine > 98% (HPLC), powder | Sigma | N7634-1G | |
| Phosphocreatine disodium salt hydrate enzymatic, approx 98% | Sigma | P7936-5G | |
| Potassium chloride ACS reagent, 99.0-100.5% | Sigma | P3911-500G | |
| Potassium hydroxide | EM Science | PX1480-1 | |
| Potassium phosphate monobasic | EMD | PX1565-1 | |
| Protease from Streptomyces griseus, type XIV, >3.5 units/mg solid, powder | Sigma | P5147-1G | |
| Sodium chloride ACS reagent, > 99.0% | Sigma | S9888-2.5KG | |
| Sodium hydroxide, pellets, 97+%, A.C.S. reagent | Sigma | 221465-500G | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | World Precision Instruments Inc | SYLG184 | |
| Taurine | Sigma | T0625-100G | |
| Tetraethylammonium chloride > 98% (titration) | Sigma | T2265-100G |
References
- Bartos, D. C., Grandi, E., Ripplinger, C. M. Ion Channels in the Heart. Comprehensive Physiology. 5 (3), 1423-1464 (2015).
- Heijman, J., Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. Cellular and molecular electrophysiology of atrial fibrillation initiation, maintenance, and progression. Circulation Research. 114 (9), 1483-1499 (2014).
- Jalife, J. Mechanisms of persistent atrial fibrillation. Current Opinion in Cardiology. 29 (1), 20-27 (2014).
- Nattel, S., Maguy, A., Le Bouter, S., Yeh, Y. H. Arrhythmogenic ion-channel remodeling in the heart: heart failure, myocardial infarction, and atrial fibrillation. Physiological Reviews. 87 (2), 425-456 (2007).
- Jansen, H. J., et al. Atrial structure, function and arrhythmogenesis in aged and frail mice. Scientific Reports. 7, 44336 (2017).
- Jansen, H. J., et al. Distinct patterns of atrial electrical and structural remodeling in angiotensin II mediated atrial fibrillation. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 124, 12-25 (2018).
- Nerbonne, J. M., Kass, R. S. Molecular physiology of cardiac repolarization. Physiological Reviews. 85 (4), 1205-1253 (2005).
- Grant, A. O. Cardiac ion channels. Circulalation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).
- Schmitt, N., Grunnet, M., Olesen, S. P. Cardiac potassium channel subtypes: new roles in repolarization and arrhythmia. Physiological Reviews. 94 (2), 609-653 (2014).
- Lomax, A. E., Kondo, C. S., Giles, W. R. Comparison of time- and voltage-dependent K+ currents in myocytes from left and right atria of adult mice. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 285 (5), H1837-H1848 (2003).
- Li, D., Zhang, L., Kneller, J., Nattel, S. Potential ionic mechanism for repolarization differences between canine right and left atrium. Circ Res. 88 (11), 1168-1175 (2001).
- Wirth, K. J., Knobloch, K. Differential effects of dofetilide, amiodarone, and class lc drugs on left and right atrial refractoriness and left atrial vulnerability in pigs. Naunyn Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 363 (2), 166-174 (2001).
- Qi, A., Yeung-Lai-Wah, J. A., Xiao, J., Kerr, C. R. Regional differences in rabbit atrial repolarization: importance of transient outward current. American Journal of Physiology. 266 (2 Pt 2), H643-H649 (1994).
- Jansen, H. J., et al. NPR-C (Natriuretic Peptide Receptor-C) Modulates the Progression of Angiotensin II-Mediated Atrial Fibrillation and Atrial Remodeling in Mice. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 12 (1), e006863 (2019).
- Mangoni, M. E., Nargeot, J. Genesis and regulation of the heart automaticity. Physiological Reviews. 88 (3), 919-982 (2008).
- Voigt, N., Pearman, C. M., Dobrev, D., Dibb, K. M. Methods for isolating atrial cells from large mammals and humans. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 86, 187-198 (2015).
- Springer, J., et al. The natriuretic peptides BNP and CNP increase heart rate and electrical conduction by stimulating ionic currents in the sinoatrial node and atrial myocardium following activation of guanylyl cyclase-linked natriuretic peptide receptors. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 52 (5), 1122-1134 (2012).
- Hua, R., Adamczyk, A., Robbins, C., Ray, G., Rose, R. A. Distinct patterns of constitutive phosphodiesterase activity in mouse sinoatrial node and atrial myocardium. PLoS One. 7 (10), e47652 (2012).
- Egom, E. E., et al. Impaired sinoatrial node function and increased susceptibility to atrial fibrillation in mice lacking natriuretic peptide receptor C. Journal of Physiology. 593 (5), 1127-1146 (2015).
- Hua, R., et al. Effects of Wild-Type and Mutant Forms of Atrial Natriuretic Peptide on Atrial Electrophysiology and Arrhythmogenesis. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 8 (5), 1240-1254 (2015).
- Krishnaswamy, P. S., et al. Altered parasympathetic nervous system regulation of the sinoatrial node in Akita diabetic mice. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 82, 125-135 (2015).
- Mackasey, M., et al. Natriuretic peptide receptor C (NPR-C) protects against angiotensin II mediated sinoatrial disease in mice. JACC Basic to Translational Science. , (2018).
- Azer, J., Hua, R., Vella, K., Rose, R. A. Natriuretic peptides regulate heart rate and sinoatrial node function by activating multiple natriuretic peptide receptors. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 53 (5), 715-724 (2012).
