Summary
Bu protokol, bir öbek sindirim yaklaşımı kullanarak yetişkin fare kalbi tek atriyal kardiyomiyositler izole etmek için kullanılır. Bu yaklaşım, yama kelepçe çalışmalarında atriyal miyosit elektrofizyolojisini karakterize etmek için kullanılabilecek sağ veya sol atriyal miyositleri izole etmek için kullanılır.
Abstract
Atriyal miyositlerin elektrofizyolojik özellikleri en önemlisi, genel kalp fonksiyonunu etkiler. Eylem potansiyelinden sorumlu altta yatan iyonik akımlarda yapılan değişiklikler, birçok koşulda ve hastalık Devletlerinde son derece yaygın olan atriyal fibrilasyon gibi aritmilerin altını çizen Pro-aritmik substratlar neden olabilir. Yama-kelepçe deneylerinde kullanılmak üzere yetişkin fare atriyal kardiyomiyositleri izole etmek, sağlıklı atriyal miyokard ve atriyal Patofizyoloji ortamında hücresel Elektrofizyolojinin bilgimizi ve anlayışını büyük ölçüde geliştirmiştir. Buna ek olarak, genetik fare modelleri kullanan çalışmalar atriyal Elektrofizyoloji düzenleyen protein geniş bir dizi rolünü aydınlatılamamıştır var. Burada, bu dokuların enzimatik sindirim ve mekanik dağılımının bir kombinasyonu ile yetişkin farelerin atriyal uzantılarıyla kardiyomiyositlerin izolasyonuna yönelik ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz. Bu yaklaşım sürekli ve güvenilir bir dizi deneysel altında yama-kelepçe deneylerinde eylem potansiyelleri ve iyonik akımları ölçerek hücresel Elektrofizyoloji karakterize etmek için kullanılabilir izole atriyal kardiyomiyositler verir Koşul -ları.
Introduction
Üstün ve inferior vena cavae 'nin yanı sıra pulmoner damarlardan kan alan kalbin ince duvarlı, düşük basınçlı odaları olan Atria, normal kardiyak fizyolojide ayrılmaz bir parçasıdır. Kalbin diğer bölgeleri gibi, atriyumda kardiyomiyositler, fibroblastlar, endotel hücreler, vasküler pürüzsüz Kas hücreleri ve diğerleri de dahil olmak üzere bir dizi hücre türü bulunur. Atriyal miyositler, kalp yoluyla elektrik sinyallerinin iletilmede önemli bir rol oynayan elektriksel olarak heyecanlı hücrelerdir, böylece her kalp atışı sırasında uygun atriyal kasılma sağlanması1. Atria 'daki elektrik fonksiyon bozukluğu, atriyal flutter ve atriyal fibrilasyon gibi bir dizi atriyal spesifik aritmilerin2,3' e yol açabilir. Bunlar önemli morbidite ve mortaliteye yol açabilecek son derece yaygın, henüz kötü anlaşılmayan atriyal aritmiler. Atriyal fibrilasyon, yaşlanma ile veya hipertansiyon, kalp yetmezliği ve diyabet dahil olmak üzere elde edilen kalp hastalığı formları ayarında, genetik mutasyonlar ile birlikte ortaya çıkabilir2,4,5 ,6. Bu koşullar, aritmojenin prevalansını artıran bir substrat oluşturabilen atriyal miyositlerin elektrik özelliklerini değiştirebilir1,2.
Atriyal aritmojeninin yanı sıra Atria 'daki normal elektrik fonksiyonu da daha da önemlisi, atriyal miyositlerde üretilen eylem potansiyelinin (AP) morfolojisinin etkilenir. Atriyal AP, sodyum akımı (ına, nav1,5 kanallar tarafından taşınan), l-tipi kalsiyum akımı (ıCA, l, cav1,2 ve CAv1,3 kanallar tarafından taşınan dahil olmak üzere bir dizi iyonik akımın aktivitesinden üretilir. ) ve ultra hızlı gecikmeli doğrultucu potasyum akımı (ıKur, kv1,5 kanallar tarafından taşınan), geçici dışa doğru potasyum akımı (Kv4,2 ve kv4,3 tarafından taşınan)dahil olmak üzere çeşitli potasyum akımları kanallar), sabit bir durum potasyum akımı (ıKSS, kV2,1 kanallar tarafından taşınan), ve içe doğrultucu potasyum akımı (ıK1, kir2,1 kanallar tarafından taşınan)1,7, 8' den itibaren. Onlar fare Atria önemli bir rol oynamıyor rağmen, Gecikmeli doğrultucu K+ akım hızlı ve yavaş bileşenleri (ıKR ve benKS) Ayrıca bazı türler AP repolarizasyon katkıda7. Bu iyonik akımlardan bir veya birkaçı içinde yapılan değişiklikler, atriyal aritmilerin elektrik özelliklerini önemli ölçüde değiştirebilir. Örneğin, ına 'da BIR azalma AP darbesi hızını azaltarak Atria genelinde iletim hızını yavaşlatabilir. Öte yandan, potasyum akımlarının repolarize edilmesi veya ıCA, L veya Late ına 'da bir artış, Atria1' de spontan aktivite tetikleyebilen afterdepolarizasyon gelişimine neden olabilir, 2,9.
Atriyal miyokardinin farklı bölgelerinde AP morfolojisinde, bu temel iyon kanallarının ifadesinde veya düzenlenmesinde farklılıklar nedeniyle muhtemel farklılıklar olduğunu tanımak önemlidir. Örneğin, sağ ve sol Atria arasındaki AP süresinde, ı 'nin geçerli yoğunluğa farklılıklarla ilişkilendirdiği farklılıklar iyi10,11,12,13olarak tanımlanmıştır. Ayrıca, son zamanlarda, kronik hipertansiyon ile farelerin sağ ve sol Atria elektrik remodeling farklı desenler olduğunu göstermiştir6,14. Sağ atriyal posterior duvar da AP Morfoloji ve ateş desenleri15kendi farklı desenleri vardır Sinoatriyal düğüm içerir. Atria 'nın bu farklı bölümlerinin her birinde miyositlerin ayrı özellikleri, bu bölgelerin her birinden izole miyositler kullanılarak ayrıntılı olarak incelenebilir.
Atriyal miyositler için yama-kelepçe Elektrofizyoloji çalışmaları16yalıtmak için kullanılabilecek farklı yaklaşımlar vardır. Bir olasılık, kalp enzimlerin teslim için aort aracılığıyla kanüle bir retrograd perfüzyon yaklaşımı kullanmaktır. Bu uygun bir yaklaşım olsa da, atriyal miyosit kalitesinde, Atria perfüzyon tutarsızlıkları nedeniyle değişkenlik üretebilir. Biz kalp retrograd perfüzyon ihtiyacını ortadan kaldıran atriyal miyositlerin yalıtım için bir ' öbek ' sindirim yaklaşımı benimsemiştir. Yaklaşımımız, yama-kelepçe çalışmaları için uygun olan çok sayıda izole atriyal miyositlerin sürekli ve güvenilir bir şekilde verebilmesi için enzimatik sindirim ve atriyal dokuların mekanik dağılımının bir kombinasyonunu kullanır. Burada atriyal uzantı dokusu kullanarak yaklaşımımızı tarif ederken, bu yaklaşım, dedektifin seçtiği atriyal miyokard (yani sağ veya sol atriyal eklentileri, serbest duvarlar, arka duvarlar) herhangi bir bölgede kullanılabilir. Bu yaklaşım, genetiği değiştirilmiş fareler atriyal miyoksit elektrofizyolojisi çalışmaları için idealdir, kardiyovasküler hastalığın fare modellerinde, veya farmakolojik bileşiklerin etkilerini incelemek için5,6,17 , 18 , 19 yaşında.
Protocol
Tüm hayvan prosedürleri Calgary Üniversitesi hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış ve hayvan bakımı Kanada Konseyi kurallarına uygun olarak yapılmıştır. Aşağıda açıklanan atriyal miyosit yalıtımı, görüntüleri ve temsili sonuçlar 15 haftalık erkek wildtype C57Bl/6 fareden elde edildi. Biz rutin olarak bu protokol kullanarak atriyal miyositleri izole etmek için kullanmak wildtip fareler17,18, genetik mutasyonlar taşıyan fareler19,20 ve kronik hipertansiyon gibi hastalığın fare modelleri6, 14oldu. Protokol erkek veya dişi fareler için benzer şekilde kullanılabilir. Biz de bu yalıtım prosedürün benzer bir sürümünü fare kalbi Sinoatriyal düğüm miyoksit izole etmek için kullanılan17,21,22,23. Bu deneysel protokolün akış şeması Şekil 1' de bulunur.
1. stok çözümleri ve ekipmanlarının hazırlanması
- Üreticinin talimatlarına göre silikon elastomer ekleyerek 1 diseksiyon çanak hazırlayın. 1 cm derinliğine 10 cm Petri tabak alt kapsayacak kadar silikon elastomer bileşik ekleyin. tedavi için Izin verin ve sonra çanak içine 6 böcek pin ekleyin.
Not: Bu silikon diseksiyon çanak aylar boyunca yeniden kullanılabilir ve oda sıcaklığında saklanır. - Şekil 2a'da gösterildiği gibi, 1 mm (küçük delik), 3 mm (orta delik) veya 5 mm (büyük delik) açılıyla 3 adet yangın parlatılmış Pasteur pipet hazırlayın. Bu pipetler yapmak için, bir Pasteur pipet puan ve daha sonra istenen delik boyutundan biraz daha büyük bir açılış üretmek için puan işareti boyunca çekin. Yüzeyi yumuşatmak için metal bir dosya kullanın ve açık bir alev kullanarak bu açılışa ateş parlatın.
Not: Bu, istenilen çaplı bir açılım ile pürüzsüz, yangın cilalı bir kenar üretecek. Açılışın çatlaklar ve pürüzlü yüzeylerden serbest olması önemlidir. Bu yangın parlatılmış pipetler oda sıcaklığında saklanabilir ve aylarca yeniden kullanılabilir. - Tyrode pH 6,9 solüsyonu ve Tyrode pH 7,4 çözeltisi için Tablo 1' de listelenen stok çözümlerini hazırlayın. Ayrıca 10 mL her 1 M MgCl2, 1 m CAcl2ve 100 mm CAcl2hazırlayın. 4 °c ' de 2 aya kadar tüm çözümler ve depolar için ultra saf su kullanın.
- 1 L modifiye Kraft-Brühe (KB) çözümünü Tablo 2' de belirtildiği şekilde hazırlayın. Ultra saf su kullanın. Çözümü 20 mL 'ye bölüşe ve 2 aya kadar-20 °C ' de saklayın.
2. atriyal Miyoksit Izolasyonu için çözeltiler ve yalıtım kurulumunun hazırlanması
- 1 M CaCl2 ve 1 m MgCl2 stok çözümleri kullanılarak, bir 125 ml Erlenmeyer Flask içinde Tablo 3 ' te açıklandığı gibi değiştirilmiş bir tyrode pH 7,4 çözeltisi 50 ml hazırlayın. Erlenmeyer Flask 'ı, Şekil 2B'de gösterildiği gibi, kullanım kadar 35 °c su banyosuna yerleştirin.
- Modifiye Tyrode 's pH 6,9 solüsyonu, 100 mM CaCl2 Stock çözümünü kullanarak, 50 ml 'lik bir tüpte Tablo 4 ' te açıklandığı şekilde hazırlayın. Aliquot 2,5 her üç 5 mL yuvarlak alt tüpler içine bu çözümün mL. Bu tüpleri, Şekil 2B'de gösterildiği gibi, kullanım kadar 35 °c su banyosuna yerleştirilen bir tel rafa yerleştirin.
- Enzim çözümünü, 14 mL 'Lik yuvarlak alt tüpte Tablo 5 ' te açıklandığı şekilde hazırlayın. Proteaz çözeltisi yapmak için, 100 μL başına 1 mg proteaz ultra saf su ekleyin. Bu enzim çözeltisi içeren tüpü tel rafa yerleştirin ve 35 °C ' lik su banyosunun kullanımına kadar inküye yapın.
- 35 °c ' lik bir su banyosunda değiştirilmiş KB çözeltisi bir kısım çözüyor. Aliquot 2,5 mL her üç 5 mL yuvarlak alt tüpler ve 2,5 mL içine KB çözüm 14 mL yuvarlak alt tüp içine. Bu tüpleri tel raf içine yerleştirin ve Şekil 2B'de gösterildiği gibi, kullanım kadar bir 35 °c su banyosuna inkübe.
- Şekil 2B'de gösterildiği gibi, diseksiyon plakasını, diseksiyon araçlarını, Pasteur pipetini ve yangın parlatılmış pipetlerini bırakın.
3. fare atriyal uzantının diseksiyonu (ler)
- İntraperitoneal enjeksiyon yoluyla 0,2 mL heparin (10 000 USP U/10 mL) ile fare enjekte ve emilimi için 5 dakika bekleyin.
- Fareyi bir indüksiyon odasına yerleştirin ve isofluran inhalasyonu (% 3-4) ile anestezize yapın. Isoflurane ve oksijen bir anestezik makine kullanılarak teslim edilir ve atık anestezik gaz atılır. Bir kez fare anestezize ve bir ayak tutam refleks sergiler değil, hızlı servikal dislocation tarafından fare ötenize. Bir kağıt havlu ya da bir mantar tahtası üzerine fareyi yerleştirin ve yerine fareyi tutmak için pençeleri bant.
- 70% etanol ile fare göğsüne ıslak. Eğri makas kullanarak göğsü kaplayan kürk ve cildi çıkarın. Sonra, sternum kaldırmak ve sonra kaburgaların kenarı boyunca diyaframı kesmek için sıçan diş forseps kullanın. Kalbi açığa çıkarmak için eğri makas kullanarak tüm kaburga kafesi çıkarın.
- Atriyal uzantının (sağ veya sol) kaldırılması için, ince diseksiyon forseps kullanarak uzantının hafifçe kaldırın ve yay makas ile kesip. Hemen bir silikon kaplı diseksiyon çanak için atriyal eklentinin transfer 20 mL ısıtılmış değiştirilmiş Tyrode pH 7,4 çözeltisi adım 2,1 içinde açıklanan.
- Atriyal uzantının açılışının alt kısmındaki üst ve bir pin bir diseksiyon pin yerleştirin. Bir mera pipet kullanarak, kan kaldırmak için ısıtılmış değiştirilmiş Tyrode pH 7,4 çözeltisi ile Atria Flush. Atriyal uzantının üst ve alt kenarı boyunca keserek atriyal eklentiyi açın. Sonra, Şekil 3A'da gösterildiği gibi, düz, dikdörtgen bir doku parçası oluşturmak için atriyal uzantının köşelerini aşağı doğru sabitleyin.
4. atriyal miyositlerin izolasyonu
Not: Bu bölümdeki adımlar 35 °C ' de, 35 °C ' lik su banyosuna batık tüplerle gerçekleştirilir. Sadece doku (ve çözüm) tüpler arasında transfer edilmesini sağlamak için yuvarlak alt tüpler arasında doku şeritleri aktarırken dikkatli olun.
- Yaklaşık 8-10 eşit büyüklükte şeritleri (yaklaşık 0,7 mm genişliğinde) yay makas ve ince forseps kullanarak atriyal uzantının kes. Şekil 3B'de atriyal doku şeritleri örneği gösterilir. Şeritler sözleşme bir kez onlar doku ana parçasından serbest kesilir unutmayın. Küçük delik Yangın Cilalı pipet kullanarak, ilk tüp içine doku şeritler transfer sıcak değiştirilmiş Tyrode 's pH 6,9 çözüm adım 2,2 açıklanan içerir. 5 dakika bekleyin.
- İkinci ve sonra üçüncü yuvarlak alt tüp değiştirilmiş Tyrode 's pH 6,9 çözüm adım 2,2 orta delik Yangın Cilalı pipet kullanarak hazırlanan içeren onları transfer ederek doku şeritleri yıkayın.
- Doku şeritleri yıkamak için, 5 mL yuvarlak alt tüp kap ve hafifçe tüp tersine çevir 3 kez. Doku şeritler orta delik Yangın Cilalı pipet kullanarak bir sonraki tüp doku şeritleri aktarmadan önce tüpün altına yerleşmek edelim.
- Doku şeritleri, adım 2,3 ' de açıklanan enzim çözeltisi ile orta boylu yangın parlatılmış pipet kullanarak aktarın ve 30 dakika boyunca inküye yapın. tüp her 3-5 dakikada bir birlikte yapışarak doku şeritleri önlemek için.
Not: Enzimatik sindirimi başında, doku şeritler hızlı bir şekilde dönen aşağıdaki yerleşmek. Yaklaşık 20 dakika sindirimi, doku şeritler kaymayı takiben enzimatik çözelti içinde yüzen başlar. Bu süre zarfında, atriyal doku şeritler aynı zamanda sindirilmiş gibi soluk pembe beyazdan görünüşünü değiştirir. - Enzimatik sindirim sonra, adım 2,4 hazırlanmış 5 mL yuvarlak alt tüpler KB çözüm 2,5 mL kullanarak üç yıkıyor gerçekleştirin. Her yıkama için, dokuyu orta çap yangın parlatılmış pipet kullanarak bir sonraki tüpe taşımadan önce tüpü 3 kez hafifçe ters çevirin. Son yıkamayı takiben, şeritler 2,5 mL KB çözeltisi içeren 14 mL yuvarlak alt tüpüne aktarın. 5 dakika bekleyin.
- Geniş delikli yangın parlatılmış pipet kullanarak 7,5 dk için dokusu nazikçe triturate. Bu mekanik doku şeritleri DISSOCIATE ve bireysel atriyal miyositler ile dolu bir bulutlu çözüm verim olacaktır.
Not: Tritürasyon sırasında doku beyaz olur ve çözüm bulutlu olur. Geniş delikli yangın parlatılmış pipetinden doku şeritlerini uzaklaştırarak hem frekans hem de hızını değiştirerek elde edilen tritürasyon kuvveti, bireysel izolasyona uyarlanmış olmalıdır. Eğer toz çok nazik ise, hücre verimi düşük olacak, çok sert toz birçok ölü hücreler verecektir iken. Triturating sırasında kabarcıklar kaçının. - Doldurmak 14 ml Yuvarlak alt tüp içeren tonerinin doku şeritler son hacmine KB çözeltisi ile 7-10 ml deneysel kullanım için hücrelerin istenilen yoğunluğa bağlı olarak. Bu tüpü 1 saat oda sıcaklığında yerleştirin. Bu kuluçk döneminin ardından, hücreler 7 saate kadar çeşitli deneyler için kullanılabilir. hücreler 4 °C ' de 7 saate kadar saklanabilir.
Representative Results
Bu protokol kullanılarak izole edilen atriyal miyositler, yama kelepçe tekniği kullanılarak bu hücrelerin elektrofizyolojik özelliklerini karakterize etmek için kullanılabilir. KB çözeltisi atriyal miyositlerin aliquots standart bir yama-kelepçe aparatının kayıt odasına eklenebilir ve deney yapmak isteyen kayıt türü için uygun çözümler ile süperfused. Bu protokol kullanılarak izole atriyal miyositler en iyi yalıtım 6-7 h içinde elektrofizyolojik çalışmalar için kullanılır. Laboratuvarımızın temsilci yama-kelepçe verileri aşağıda verilmiştir.
Şekil 4 yukarıdaki protokol kullanılarak hazırlanan normal farelerden izole atriyal miyositlerin örneklerini göstermektedir. İzole atriyal miyositler genellikle 100 μm uzunluğundadır ve 10 μm genişlikte net çizmeler vardır. İzole atriyal miyositlerin kapasitans genellikle 40-70 pF 'dir.
Şekil 5A , daha önce6,19,20olarak tarif ettiğimiz gibi, geçerli kelepçe modunda delikli yama kelepçe tekniği kullanılarak kaydedilmiş bir atriyal miyoksit AP örneği gösterir. Tipik atriyal miyosit AP parametrelerini gösteren özet veriler Tablo 6' da sağlanır. Özellikle, biz istirahat membran potansiyeli ölçümleri için Özet veri sunuyoruz (RMP), maksimum upstroke hız (VMax), OVERSHOOT (OS) ve AP süresi 50% (apd50), 70% (APD70) ve 90% (APD90) repolarizasyon Saat (Tablo 6). APs de tüm hücre yapılandırması14kaydedilebilir. AP kayıtları için superfusion ve pipet çözümleri Tablo 7 ve Tablo 8' de mevcuttur.
Şekil 5B , yama kelepçe tekniğinin tüm hücre konfigürasyonuna kaydedilen na+ akımları (ına) temsili bir aile göstermektedir. Bu akımlar,-120 mV 'nin bir tutma potansiyeline kadar-100 ve + 10 mV arasında 50 MS voltaj kelepçe basamakları kullanılarak kaydedildi. Biz daha önce6,14,20Ina kayıt için yaklaşımlar ve protokoller tarif ettik. Bir Özet ına IV Ilişki de Şekil 5Bsunulmuştur. Ina kayıt için kullanılan çözümler Tablo 7 ve Tablo 8sunulmuştur.
Şekil 5c , yama kelepçe tekniğinin tüm hücre konfigürasyonuna kaydedilen CA2 + akımlarının (ıCA, L) temsili bir ailesini gösterir. Bu akımlar 250 MS voltaj kelepçesi arasında-60 ve + 80 mV arasında-70 mV bir tutma potansiyeline sahip olarak kaydedildi. I CA ölçmek için kullanılabilecek deneysel koşullar, ben daha önce17,18,20tarif edilmiştir. Bir Özet ıCA, L IV Ilişki de Şekil 5csunulmaktadır. ICA, L kayıt için kullanılan çözümler Tablo 7 ve Tablo 8' de mevcuttur.
Şekil 5D , yama kelepçe tekniğinin tüm hücre konfigürasyonuna kaydedilmiş k+ akımları (ıK) temsili bir aile göstermektedir. Bu akımlar, daha önce6,14' ü tarif ettiğimiz gibi 500 MS voltaj kelepçe basamakları-120 MV ve + 80 MV kullanarak-80 MV bir tutma potansiyeline kaydedildi. Toplam ıK IÇIN Özet IV Ilişkisi Ayrıca Şekil 5D'de sunulmuştur. IK kaydetmek için kullanılan çözümler Tablo 7 ve Tablo 8' de mevcuttur.
Na+, CA2 + ve K+ akımları (yukarıda gösterildiği gibi) dahil olmak üzere iyon akımlarının kayıt APS ve büyük aileleri bu yaklaşımlar kullanarak, titizlikle atriyal miyoksit Elektrofizyoloji sorgulamaya izin Deneysel koşulların bolluk. Laboratuvarımız normal farelerde atriyal miyoksit elektrofizyolojisini incelemek için bu teknikleri rutin olarak işe aldı, kalp hastalığının fare modellerinde ve genetiği değiştirilmiş farelerde6,14,17,18 ,19,20.
Resim 1: atriyal miyosit yalıtım protokolünün akış çizelgesi. Bu protokolü kullanarak atriyal miyositleri izole etmek için kullanılan adımların Özeti. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: atriyal miyosit yalıtımı Için deneysel kurulum ve diseksiyon araçları. (A). 1 mm çapında (sol) bir açılım olan küçük delikli yangın parlatılmış pipet, diseksiyon sonrası doku transferi için kullanılır, 3 mm çapında (orta) bir açılım olan orta çap yangın parlatılmış pipet, doku şeritleri sırasında transfer izolasyonlu ve büyük çaplı yangın parlatılmış pipet, 5 mm çapında (sağda) bir açıyla sindirilmiş atriyal dokuların triturasyonu için kullanılır. (B). atriyal miyosit yalıtımı için deneysel kurulum. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: atriyal uzantı diseksiyonu görüntüsü. (A). bir eksiz atriyal uzantının temsili parlak alan görüntüsü açık ve sabitlenmiş kesilir. (B). yaklaşık 0,7 mm genişliğinde doku şeritleri kesilmiş atriyal uzantının temsilcisi parlak alan görüntüsü. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Şekil 4: izole atriyal miyositlerin görüntüleri. (A). izolasyondan hemen sonra izole atriyal miyositlerin Brightfield görüntüsü. Ölçek çubuğu = 50 μm. (B). tek bir izole atriyal miyosit Brightfield görüntü. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5: izole atriyal miyositlerden elde edilen temsilci yama-kelepçe verileri. (A). temsilci, yalıtılmış bir atriyal MIYOKSIT AP kaydını stimüle etti. AP parametrelerinin özeti Tablo 6' da sunulmuştur. Amphotericin B (200 μg/mL), hücresel membranı nüfuz etmek için pipet çözümüne eklendi. (B). temsilci ına Recordings (sol) ve Özet ına IV Curve (sağda) izole atriyal miyoksit. Nifedipine (10 μM) bennakaydetmek Için değiştirilmiş tyrode çözüm ıCA, L engellemek için eklendi. C. temsilci ıCA, l kayıtlar (sol) ve Özet ıCA, l IV eğrisi (sağ) izole atriyal miyoksit. (D). temsilci ık kayıtları (sol) ve Özet ık IV eğrisi (sağda) izole atriyal miyoksit. Bu akımların her birini kaydetmek için kullanılan çözümler Tablo 7 ve Tablo 8' de listelenir. Özet IV eğrileri, 15 haftalık erkek wildtype C57Bl/6 fareden izole edilen 10 atriyal miyositlerden ortalama ölçülerdir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
| Stok Tyrode 's pH 6,9 | Stok Tyrode 's pH 7,4 | |
| Kimyasal | mM olarak | mM olarak |
| Nacl | 140 | 140 |
| Kartal | 5,4 | 5,4 |
| KH2Po4 | 1,2 | 1,2 |
| HEPES | 5 | 5 |
| Son hacim | 500 mL | 1 L |
| NaOH ile son pH | 6,9 | 7,4 |
Tablo 1: stok tyrode 's ph 7,4 ve stok Tyrode ph 6,9 çözümleri. Önceden yapılabilir ve 2 aya kadar 4 °C ' de saklanan Tyrode çözeltileri (pH 7,4 ve pH 6,9) bileşimi.
| Kimyasal | mM olarak |
| K-glutamat | 100 |
| K-aspartat | 10 |
| Kartal | 25 |
| KH2PO4 | 10 |
| MgSO4 | 2 |
| Taurin | 20 |
| Kreatin | 5 |
| EGTA 'da | 0,5 |
| Glikoz | 20 |
| HEPES | 5 |
| Bsa | 0,10% |
| Son hacim | 1 L |
| KOH ile final pH | 7,2 |
Tablo 2: DEĞIŞTIRILMIŞ KB çözümü. Önceden yapılacak, değiştirilmiş KB çözeltisi tarifi ve 2 aya kadar-20 °C ' de depolanabilir.
| Kimyasal | Tutar |
| Glikoz | 5,55 mM |
| MgCl2 | 1 mM 'Lik |
| CaCl2 | 1,8 mM |
| Stok Tyrode 's pH 7,4 | 50 mL |
| Heparin | 250 (μL) |
Tablo 3: değiştirilmiş Tyrode 's pH 7,4 glikoz ile çözelti, magnezyum, kalsiyum, ve heparin. Değiştirilmiş Tyrode 's pH 7,4 çözeltisi atriyal doku diseksiyon için kullanılan bileşimi. Bu çözelti taze yapılmalıdır ve 35 °C ' de su banyosunda tutulur.
| Kimyasal | Tutar |
| Glikoz | 18,5 mM |
| Taurin | 49,96 mM |
| Bsa | 15 mg 'lık |
| CaCl2 | 0,066 mM |
| Stok Tyrode 's pH 6,9 | 15 mL 'Lik |
Tablo 4: değiştirilmiş Tyrode pH 6,9 solüsyonu içeren glikoz, taurin, BSA, ve düşük kalsiyum. Atriyal miyoksit yalıtımı için kullanılan değiştirilmiş Tyrode pH 6,9 çözeltisi bileşimi. Bu çözelti taze yapılmalıdır ve 35 °C ' de su banyosunda tutulur.
| Kimyasal | Tutar |
| Kolajenaz | 1.064 |
| Elastaz | 9 U |
| Proteaz çözeltisi | 65,2 (μL) |
| Modifiye Tyrode 's pH 6,9 | 5 mL 'Lik |
Tablo 5: enzimatik çözüm. Enzimatik olarak atriyal doku şeritleri sindirmek için kullanılan enzim çözeltisi bileşimi. Bu çözelti taze yapılmalıdır ve 35 °C ' de su banyosunda tutulur.
| Parametre | Ortalama |
| RMP (mV) | -74,2 ± 0,7 |
| Vmax (V/s) | 144,6 ± 5,8 |
| İşletim sistemi (mV) | 71,9 ± 3,0 |
| APD50 (MS) | 11,1 ± 1,7 |
| APD70 (MS) | 23,0 ± 4,6 |
| APD90 (MS) | 54,7 ± 7,8 |
Tablo 6: yalıtılmış atriyal miyositlerden AP parametrelerinin Özeti. Veri ortalama ± SEM, n = 10 atriyal miyosit 15 hafta erkek Wildtype C57Bl/6 fare izole olarak sunulmaktadır.
| Potasyum akımları ve APs | Sodyum akımları | Kalsiyum akımları | |
| Kimyasal | mM olarak | mM olarak | mM olarak |
| Nacl | 140 | 5 | |
| Kartal | 5,4 | ||
| MgCl2 | 1 | 1 | 1 |
| CaCl2 | 1 | 1 | 2 |
| HEPES | 10 | 10 | 10 |
| Glikoz | 5,5 | 5,5 | 5,5 |
| CsCl | 130 | ||
| ÇAY-CL | 5,4 | 145,5 | |
| Ph | NaOH ile 7,4 | CsOH ile 7,4 | CsOH ile 7,4 |
Tablo 7: yama-kelepçe deneyleri sırasında kullanılan Tyrode çözümlerinin bileşimi. Tyrode çözümlerinin kompozisyon APs, ına, ıCA, L, ve ben izole atriyal miyositlerdenK kaydetmek için kullanılır.
| Potasyum akımları ve APs | Sodyum akımları | Kalsiyum akımları | |
| Kimyasal | mM olarak | mM olarak | mM olarak |
| Nacl | 5 | 5 | 5 |
| Kartal | 140 | ||
| MgCl2 | 1 | 1 | 1 |
| CaCl2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 |
| HEPES | 10 | 10 | 10 |
| EGTA 'da | 5 | 5 | |
| Mg-ATP | 4 | 5 | 4 |
| Na-GTP | 0,3 | 0,3 | 0,3 |
| Na-fosfokreatin | 6,6 | 6,6 | |
| CsCl | 130 | 135 | |
| BERK bey | 5 | ||
| Ph | KOH ile 7,2 | CsOH ile 7,2 | CsOH ile 7,2 |
Tablo 8: yama kelepçe deneylerinde kullanılan iç pipet çözeltisi bileşimi. Pipet doldurma çözeltisinin bileşimi APs, ına, ıCA, Lve izole atriyal miyositlerden ıK kaydı için kullanılır.
Discussion
Laboratuvarımız, farklı kardiyovasküler hastalıklar, genetik mutasyonlar veya farmakolojik bileşiklerin atriyal miyosit üzerindeki etkilerini incelemek amacıyla, fare atriyal miyositlerini yama kelepçe deneylerinde kullanılmak üzere izole etmek için bu protokolü düzenli olarak kullanır Elektrofizyoloji. Son derece tekrarlanabilir olsa da, izole atriyal miyositlerden elde edilen verilerin kalitesi yalıtım kalitesine bağlıdır. Buna ek olarak, atriyal miyosit izolasyonunun ardından kalsiyum yeniden giriş kalsiyum paradoks16nedeniyle izole miyositlerin bir nüfus için hücre ölümü neden olacaktır. Buna göre, bu yaklaşımı kullanarak uygun, yüksek kaliteli atriyal miyositlerin yalıtılması, yalıtım boyunca birden fazla noktaya uygulama ve optimizasyon gerektirir. Bir kez optimize edilmiş, bu yaklaşım kullanılarak izole toplam atriyal miyositlerin% 70-90 arasında hem kalsiyum toleranslı ve çubuk şeklinde olacaktır tahmin edilmektedir. En iyi uygulama ve optimizasyon gerektiren adımlar aşağıda açıklanmıştır.
Diseksiyon hızı ve verimliliği izole hücrelerin kalitesi üzerinde aşağı etkileri olacaktır. Tüm kanın atriyal dokudan çıkarıldığından ve doku şeritlerinin benzer bir boyuta kesildiğinden emin olmak için zaman almak önemlidir. Atriyal uzantının kaldırılması, dokuyu şeritler halinde kesmek ve doku şeritleri değiştirilmiş Tyrode pH 6,9 çözeltisi ilk tüp içine aktarmak için yaklaşık 5 dakika sürer. Ancak, bu adım çok uzun sürerse, doku kalitesi tehlikeye olabilir.
Aynı zamanda doku şeritler bir yalıtım içinde ve kalpler arasında tek boyutlu bir boyutta kesilir önemlidir. Doku şeritler çok büyük veya çok küçük ise, ya da bir izolasyon içinde üniforma değilse, bu enzimatik sindirim ve trituration sırasında sorunlara neden olabilir. Küçük şeritler daha iyice sindirilmiş olacak ve büyük şeritler sindirilmiş altında olacak çünkü bu. Atriyal uzantının büyüklüğü hayvanlar arasında farklılık gösterebileceğinden, genotip ve hastalık ayarının incelenmesini dikkate almak aynı derecede önemlidir. Örneğin, hipertrofik kalpleri sağlıklı kalpleri ile karşılaştırıldığında daha büyük atriyal eklentileri vardır, ve bu nedenle deney normal boyutta kalpleri ile karşılaştırıldığında hipertrofik kalpleri daha şeritler kesebilir. Buna göre, kesme dokusu şeritleri boyutunu optimize etmek ve her bir atriyal uzantının bu boyutlarını uygulamak, deneysel koşullar arasındaki miyoksit izolasyonlarının yeniden üretilebilirliği büyük ölçüde artıracaktır.
Enzimatik sindirim ve mekanik dissociasyon arasındaki hassas denge, bu protokol kullanılarak başarılı bir atriyal miyosit izolasyonunun anahtarıdır. Eğer doku yeterli enzimatik sindirim sırasında swirled değilse bireysel doku şeritler küp eğiliminde ve birlikte sopa, hangi enzimatik sindirim etkinliğini sınırlayacaktır. Çok sık veya şiddetle tedirgin iseniz, bu atriyal dokuya zarar verebilir, bu da uygun olmayan hücrelerin izolasyonuna neden olur. Triturasyon sırasında izole atriyal miyositlerin doku şeritlerinin mekanik olarak dağılması, atriyal miyositleri izole etmek için bu yaklaşımı kullanarak uygulama ve optimize etmek için en önemli adımdır. Eğer toz çok nazik ise, hücre verimi düşük olacaktır. Öte yandan, eğer toz çok sert ise, o zaman uygun olmayan miyositlerin bir bolluk izole edilecektir, ve yama-kelepçe deneyleri sırasında elde edilen veri kalitesi tehlikeye olacak. Ayrıca, Atria bileşimi yalıtımı etkileyebilir. Örneğin, doku fibrotik ise, enzimatik sindirim ve triturasyon adımlarının değiştirilmesi gerekebilir. Bu nedenle, yama-kelepçe deneyleri için kullanılabilecek triturasyon sırasında yüksek kaliteli hücreler elde etmek için gereken becerileri geliştirmek için zaman almak önemlidir.
Tüm deneysel tekniklerde olduğu gibi sınırlamalar vardır. Bu teknik, bu miyositler kullanılarak gerçekleştirilecek herhangi bir deneylerin fizibilitesini etkileyebilecek, uygun, yüksek kaliteli miyositlerin yeniden üretilmesini sağlamak için pratik gerektirir. Bu yaklaşım aynı zamanda Terminal ve bu yaklaşım kullanılarak izole atriyal miyositler sadece yalıtım gününde kullanılabilir. Laboratuvarımız hücreleri 6-7 içinde kullanır.
Atriyal kardiyomiyositlerin izolasyon yaklaşımı çeşitli uygulamalara sahiptir. Örneğin, bu yaklaşım, insan atriyal doku biyopsisi de dahil olmak üzere diğer türlerinden atriyal miyositler (hem de kardiyak fibroblastlar) izole etmek için değiştirilebilir. Buna ek olarak, atriyal miyoksit yalıtımı için bu öbek yöntemini kullanmanın bir yararı (kalbin retrograd perfüzyonunun aksine), kardiyomiyositlerin Sinoatriyal düğüm veya diğer belirli bölgeler gibi kalbin diğer bölgelerinden izole edilmesi için değiştirilebilen bir yöntemdir. ya da kalbin tüm supraventriküler bölgesini kapsar. Laboratuvarımız, eylem potansiyelleri ve iyonik akımları ölçmek için yama kelepçe deneyleri için atriyal kardiyomiyositler kullanır, ancak bu yaklaşım bu teknikle sınırlı olmamalıdır. Örneğin, izole miyositler çeşitli deneysel ayarlarında kalsiyum geçişler ve kontrazlık değişiklikleri araştırmak için kullanılabilir. Atriyal kardiyomiyositler Ayrıca immünofluoresesans çalışmalarda proteinlerin veya ilgi yapılarının yerini incelemek için de kullanılabilir. Buna göre, bu yaklaşım birçok olası uygulamalar ile çok yönlü.
Disclosures
Yazarlar ifşa etmek için hiçbir şey var.
Acknowledgments
Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (MOP 93718, 142486) ve Kanada kalp ve Inme Vakfı 'ndan R.A. gül 'e kadar çalışan hibe tarafından desteklenmektedir. HG Jansen, Killam doktora sonrası bursu sahibidir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1, 2-Bis(2-Aminophenoxy)ethane-N, N, N', N'-tetraacetic acid 98% | Sigma | A4926-1G | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra, > 99%, from microbial | Sigma | A7699-1G | |
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt > 95%, bacterial | Sigma | A9187-1G | |
| Amphocetericin B from Streptomyces sp. ~80% (HPLC), powder | Sigma | A4888-500 MG | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A3059-50G | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506-500G | |
| Cesium chloride ReagentPlus, 99.9% | Sigma | 289329-100G | |
| Cesium hydroxide monohydrate > 99.5% trace metals basis | Sigma | 562505-1KG | |
| Collagenase Type 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | |
| Creatine anhydrous | Sigma | C0780 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| DL-Aspartic acid potassium salt | Sigma | A2025-100G | |
| Elastase suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS002279 | |
| Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid >97.0% | Sigma | E4378-25G | |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate > 95% (HPLC), powder | Sigma | G8877-250MG | |
| Heparin 10 000 USP U/10 mL | SANDOZ | 10750 | |
| HEPES > 99.5% (titration) | Sigma | H3375-500G | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate > 99% (HPLC), powder | Sigma | G1501-500G | |
| Magnesium sulfate | Sigma | M2643-500G | |
| Nifedipine > 98% (HPLC), powder | Sigma | N7634-1G | |
| Phosphocreatine disodium salt hydrate enzymatic, approx 98% | Sigma | P7936-5G | |
| Potassium chloride ACS reagent, 99.0-100.5% | Sigma | P3911-500G | |
| Potassium hydroxide | EM Science | PX1480-1 | |
| Potassium phosphate monobasic | EMD | PX1565-1 | |
| Protease from Streptomyces griseus, type XIV, >3.5 units/mg solid, powder | Sigma | P5147-1G | |
| Sodium chloride ACS reagent, > 99.0% | Sigma | S9888-2.5KG | |
| Sodium hydroxide, pellets, 97+%, A.C.S. reagent | Sigma | 221465-500G | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | World Precision Instruments Inc | SYLG184 | |
| Taurine | Sigma | T0625-100G | |
| Tetraethylammonium chloride > 98% (titration) | Sigma | T2265-100G |
References
- Bartos, D. C., Grandi, E., Ripplinger, C. M. Ion Channels in the Heart. Comprehensive Physiology. 5 (3), 1423-1464 (2015).
- Heijman, J., Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. Cellular and molecular electrophysiology of atrial fibrillation initiation, maintenance, and progression. Circulation Research. 114 (9), 1483-1499 (2014).
- Jalife, J. Mechanisms of persistent atrial fibrillation. Current Opinion in Cardiology. 29 (1), 20-27 (2014).
- Nattel, S., Maguy, A., Le Bouter, S., Yeh, Y. H. Arrhythmogenic ion-channel remodeling in the heart: heart failure, myocardial infarction, and atrial fibrillation. Physiological Reviews. 87 (2), 425-456 (2007).
- Jansen, H. J., et al. Atrial structure, function and arrhythmogenesis in aged and frail mice. Scientific Reports. 7, 44336 (2017).
- Jansen, H. J., et al. Distinct patterns of atrial electrical and structural remodeling in angiotensin II mediated atrial fibrillation. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 124, 12-25 (2018).
- Nerbonne, J. M., Kass, R. S. Molecular physiology of cardiac repolarization. Physiological Reviews. 85 (4), 1205-1253 (2005).
- Grant, A. O. Cardiac ion channels. Circulalation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).
- Schmitt, N., Grunnet, M., Olesen, S. P. Cardiac potassium channel subtypes: new roles in repolarization and arrhythmia. Physiological Reviews. 94 (2), 609-653 (2014).
- Lomax, A. E., Kondo, C. S., Giles, W. R. Comparison of time- and voltage-dependent K+ currents in myocytes from left and right atria of adult mice. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 285 (5), H1837-H1848 (2003).
- Li, D., Zhang, L., Kneller, J., Nattel, S. Potential ionic mechanism for repolarization differences between canine right and left atrium. Circ Res. 88 (11), 1168-1175 (2001).
- Wirth, K. J., Knobloch, K. Differential effects of dofetilide, amiodarone, and class lc drugs on left and right atrial refractoriness and left atrial vulnerability in pigs. Naunyn Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 363 (2), 166-174 (2001).
- Qi, A., Yeung-Lai-Wah, J. A., Xiao, J., Kerr, C. R. Regional differences in rabbit atrial repolarization: importance of transient outward current. American Journal of Physiology. 266 (2 Pt 2), H643-H649 (1994).
- Jansen, H. J., et al. NPR-C (Natriuretic Peptide Receptor-C) Modulates the Progression of Angiotensin II-Mediated Atrial Fibrillation and Atrial Remodeling in Mice. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 12 (1), e006863 (2019).
- Mangoni, M. E., Nargeot, J. Genesis and regulation of the heart automaticity. Physiological Reviews. 88 (3), 919-982 (2008).
- Voigt, N., Pearman, C. M., Dobrev, D., Dibb, K. M. Methods for isolating atrial cells from large mammals and humans. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 86, 187-198 (2015).
- Springer, J., et al. The natriuretic peptides BNP and CNP increase heart rate and electrical conduction by stimulating ionic currents in the sinoatrial node and atrial myocardium following activation of guanylyl cyclase-linked natriuretic peptide receptors. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 52 (5), 1122-1134 (2012).
- Hua, R., Adamczyk, A., Robbins, C., Ray, G., Rose, R. A. Distinct patterns of constitutive phosphodiesterase activity in mouse sinoatrial node and atrial myocardium. PLoS One. 7 (10), e47652 (2012).
- Egom, E. E., et al. Impaired sinoatrial node function and increased susceptibility to atrial fibrillation in mice lacking natriuretic peptide receptor C. Journal of Physiology. 593 (5), 1127-1146 (2015).
- Hua, R., et al. Effects of Wild-Type and Mutant Forms of Atrial Natriuretic Peptide on Atrial Electrophysiology and Arrhythmogenesis. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 8 (5), 1240-1254 (2015).
- Krishnaswamy, P. S., et al. Altered parasympathetic nervous system regulation of the sinoatrial node in Akita diabetic mice. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 82, 125-135 (2015).
- Mackasey, M., et al. Natriuretic peptide receptor C (NPR-C) protects against angiotensin II mediated sinoatrial disease in mice. JACC Basic to Translational Science. , (2018).
- Azer, J., Hua, R., Vella, K., Rose, R. A. Natriuretic peptides regulate heart rate and sinoatrial node function by activating multiple natriuretic peptide receptors. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 53 (5), 715-724 (2012).
