Summary
Denne protokol bruges til at isolere enkelt atrieflimren kardiomyocytter fra den voksne mus hjerte ved hjælp af en bid fordøjelse tilgang. Denne fremgangsmåde bruges til at isolere højre eller venstre atrieflimren myocytter, der kan bruges til at karakterisere atrieflimren nekrotiske Elektrofysiologi i patch-clamp undersøgelser.
Abstract
De elektrofysiologiske egenskaber af atrieflimren myocytter vigtigt påvirker den samlede hjertefunktion. Ændringer i de underliggende ionstrømninger med ansvar for aktionspotentialet kan forårsage Pro-arytmiske substrater, der ligger til grund for arytmika, såsom atrieflimren, som er meget udbredt i mange tilstande og sygdomstilstande. Isolering af voksne mus atrieflimren kardiomyocytter til brug i patch-clamp eksperimenter har i høj grad fremmet vores viden og forståelse af cellulær Elektrofysiologi i det raske atriale myokardiet og i fastsættelsen af atrieflimren. Desuden har undersøgelser ved hjælp af genetiske musemodeller belyst rollen som en bred vifte af proteiner i reguleringen af atrieflimfysiologi. Her giver vi en detaljeret protokol til isolering af kardiomyocytter fra atrieflimren vedhæng af voksne mus ved hjælp af en kombination af enzymatisk fordøjelse og mekanisk dissociation af disse væv. Denne fremgangsmåde sikrer konsekvent og pålideligt isolerede atriale kardiomyocytter, som derefter kan bruges til at karakterisere cellulær Elektrofysiologi ved at måle aktionspotentialer og ionstrømninger i forsøg med plaster klemmer under en række eksperimentelle Betingelser.
Introduction
Atria, som er de tynde murede, lavtryks kamre i hjertet, der modtager blod fra den overlegne og ringere Vena cavae samt de pulmonale vener, er integreret i normal hjerte fysiologi. Ligesom andre regioner i hjertet, Atria indeholder en række celletyper, herunder kardiomyocytter, fibroblaster, endotelceller, vaskulære glatte muskelceller, og andre. Atrieflimren myocytter er elektrisk overgearet celler, der spiller en væsentlig rolle i ledning af elektriske signaler gennem hjertet, og dermed sikre ordentlig atrieflimning under hver hjerterytme1. Elektrisk dysfunktion i Atria kan føre til en række atriefarytmider såsom atrieflagren og atrieflimren2,3. Disse er meget udbredt, men dårligt forstået, atriefarytmier, der fører til signifikant sygelighed og dødelighed. Atrieflimren kan forekomme i forbindelse med genetiske mutationer, i tilknytning til aldring eller i fastsættelsen af erhvervede former for hjertesygdomme, herunder hypertension, hjertesvigt og diabetes2,4,5 ,6. Disse betingelser kan ændre de elektriske egenskaber af atrieflimren myocytter, som kan skabe et substrat, der øger forekomsten af arytmogenesis1,2.
Normal elektrisk funktion i Atria, samt atriefarytmogenesis, er vigtigere påvirket af morfologien af aktionspotentialet (AP) produceret i atrieflimren myocytter. Atrieflimren AP genereres fra aktiviteten af en række Ioniske strømme, herunder natrium strømmen (ina, båret af naV1,5 kanaler), L-typen calcium strøm (ica, l, båret af cav1,2 og cav1,3 kanaler ), og flere kalium strømme, herunder den ultrahurtige forsinkede ensretter kalium strøm (Ikur, båret af kv1,5 kanaler), den forbigående passiv kalium strøm (itil, båret af kv4,2 og kv4,3 (iKss, båret af kV2,1-kanaler) og den indadrettede ensretter kalium strøm (iK1, båret af kIR2,1 kanaler)1,7, 8. Selv om de ikke spiller en stor rolle i mus Atria, de hurtige og langsomme komponenter i den forsinkede ensretter K+ strøm (ikr og iKS) også bidrage til AP repolarisering i nogle arter7. Ændringer i en eller flere af disse ionstrømninger kan i væsentlig grad ændre de elektriske egenskaber af atrieflimren myocytter, hvilket kan føre til atriefarytmier. For eksempel kan en reduktion i ina bremse lednings hastigheden på tværs af Atria ved at reducere AP-opstød-hastigheden. På den anden side, en reduktion i repolariserende kalium strømme eller en stigning i enten jegca, L eller den sene ina kan resultere i udviklingen af afterdepolariseringer, der kan udløse spontan aktivitet i Atria1, 2,9.
Det er vigtigt at erkende, at der er forskelle i AP morfologi i forskellige dele af atrialmyokardiet, som sandsynligvis skyldes forskelle i ekspression eller regulering af disse underliggende ion-kanaler. For eksempel, forskelle i AP varighed mellem højre og venstre Atria i forening med forskelle i itil nuværende tæthed er blevet godt beskrevet10,11,12,13. Også, vi har for nylig demonstreret, at der er særskilte mønstre af elektrisk remodeling i højre og venstre Atria af mus med kronisk hypertension6,14. Den højre atriale posterior Wall indeholder også den sinoatriale node, som har sine egne forskellige mønstre af AP morfologi og fyring mønstre15. De distinkte egenskaber af myocytter i hver af disse forskellige dele af Atria kan undersøges i detaljer ved hjælp af isolerede myocytter fra hver af disse regioner.
Der er forskellige tilgange, der kan bruges til at isolere atrieflimren myocytter for patch-clamp Elektrofysiologi undersøgelser16. En mulighed er at bruge en retrograd perfusion tilgang, hvor hjertet er bannuleret via aorta til levering af enzymer. Selv om dette er en holdbar tilgang, det kan producere variation i atrieflimren nekrotiske kvalitet på grund af uoverensstemmelser i perfusion af Atria. Vi har vedtaget en "chunk" fordøjelse tilgang til isolering af atrieflimren myocytter, der eliminerer behovet for retrograd perfusion af hjertet. Vores tilgang bruger en kombination af enzymatisk fordøjelse og mekanisk dissociation af atrieflimren, der konsekvent og pålideligt giver et stort antal isolerede atrieflimmyocytter, der egner sig til patch-clamp undersøgelser. Mens vi beskriver vores tilgang her ved hjælp af atrieflimren vedhæng væv, kan tilgangen anvendes på enhver region af atrialmyokardiet (dvs., højre eller venstre atrieflimmer, frie vægge, posterior vægge), som investigator vælger. Denne fremgangsmåde er ideel til studier af atrieflimren myocyt Elektrofysiologi i genetisk modificerede mus, i musemodeller af hjerte-kar-sygdomme, eller til at studere virkningerne af farmakologiske forbindelser5,6,17 , 18 , 19.
Protocol
Alle dyr procedurer blev godkendt af University of Calgary Animal Care og use udvalget og blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne for det canadiske råd om dyrepleje. Atrieflimren nekrotiske isolation, billeder og repræsentative resultater beskrevet nedenfor blev opnået fra en 15 ugers gammel mandlig dværg C57Bl/6 mus. Vi bruger rutinemæssigt denne protokol til at isolere atrieflimren myocytter fra dværg mus17,18, mus, der transporterer genetiske mutationer19,20 og musemodeller af sygdom såsom kronisk hypertension6, 14. Protokollen kan anvendes på samme måde for mandlige eller hunmus. Vi udnyttede også en lignende version af denne isolations procedure for at isolere Sinoatrialt node myocytter fra muse hjertet17,21,22,23. Et rutediagram over denne forsøgsprotokol findes i figur 1.
1. udarbejdelse af Stam løsninger og udstyr
- Forbered 1 dissekere parabol ved at tilføje silikoneelastomer i henhold til producentens anvisninger. Tilsæt nok silikoneelastomer sammensatte til at dække bunden af en 10 cm Petri skål til en dybde på 1 cm. lad det hærde og indsæt derefter 6 insekt stifter i skålen.
Bemærk: Denne silikone dissekere parabol kan genbruges i månedsvis og opbevares ved stuetemperatur. - Forbered 3 ildpoleret Pasteur-pipetter med en åbning på 1 mm (lille boring), 3 mm (medium boring) eller 5 mm (stor boring) i diameter som vist i figur 2a. For at gøre disse pipetter, score en Pasteur pipette og derefter snap langs score mærket for at producere en åbning, der er lidt større end den ønskede bore størrelse. Brug en metal-fil til at glatte overfladen og derefter brand-polish denne åbning ved hjælp af en åben flamme.
Bemærk: Dette vil producere en glat, ildpoleret kant med en åbning af den ønskede diameter. Det er vigtigt, at åbningen er fri for revner og ru overflader. Disse ildpoleret pipetter kan opbevares ved stuetemperatur og genbruges i månedsvis. - Forbered Stam løsninger til Tyrode pH 6,9-opløsning og Tyrode pH 7,4-opløsning som anført i tabel 1. Også forberede 10 mL hver af 1 M MgCl2, 1 m CaCl2, og 100 mm CaCl2. Brug ultrarent vand til alle opløsninger og opbevar ved 4 °c i op til 2 måneder.
- Forbered 1 L modificeret kraft-Brühe (KB) opløsning som angivet i tabel 2. Brug ultrarent vand. Opløsningen opdeles i 20 mL aliquoter og opbevares ved-20 °C i op til 2 måneder.
2. klargøring af opløsninger og isolations opsætning til isolation af atrial myocyte
- 50 mL af en modificeret Tyrode pH 7,4-opløsning forberedes som beskrevet i tabel 3 i en 125 ml Erlenmeyer-kolbe med 1 m CaCl2 -og 1 m mgcl2 -stamopløsninger. Erlenmeyer-kolben anbringes i et 35 °C-vandbad, indtil det anvendes, som vist i figur 2b.
- Den modificerede Tyrode pH 6,9-opløsning forberedes som beskrevet i tabel 4 i et 50 ml rør ved hjælp af 100 mm CaCl2 stamopløsning. Aliquot 2,5 mL af denne opløsning i hver af tre 5 mL runde bundrør. Disse rør anbringes i en rist, der er anbragt i et 35 °C-vandbad, indtil det anvendes, som vist i figur 2b.
- Enzymopløsningen forberedes som beskrevet i tabel 5 i et 14 ml rundt bund rør. For at fremstille proteaseopløsningen tilsættes 1 mg proteasehæmmere pr. 100 μl ultrarent vand. Anbring røret med denne enzym opløsning i risten og Inkuber i et 35 °C vandbad indtil brug.
- Tø en alikvot af modificeret KB-opløsning i et 35 °C vandbad. Aliquot 2,5 mL KB opløsning i hver af tre 5 mL runde bund rør og 2,5 mL i en 14 mL rund bund slange. Disse rør placeres i risten og inkuberes i et 35 °C-vandbad indtil brug, som vist i figur 2b.
- Læg skære pladen, dissekere-værktøjerne, en Pasteur-pipette og de ildpolerede pipetter ud som vist i figur 2b.
3. dissektion af mus atrial Appendage (s)
- Injicer musen med 0,2 mL heparin (10 000 USP U/10 mL) via intraperitoneal injektion og vent 5 min for absorption.
- Placer musen i et induktions kammer og bedøve ved indånding af isofluran (3-4%). Isofluran og ilt leveres ved hjælp af en bedøvelses maskine og affald bedøvelses gas er scavenged. Når musen er bedøvet, og ikke udviser en tå knivspids refleks, aflive musen ved hurtig livmoderhals dislokation. Placer musen på et papir håndklæde eller en kork bord og tape poterne ned for at holde musen på plads.
- Våd brystet af musen med 70% ethanol. Fjern pels og hud, der dækker brystet ved hjælp af buet saks. Derefter skal du bruge rotte tand tang til at løfte brystbenet og derefter skære membranen langs kanten af ribbenene. Fjern hele ribburet ved hjælp af buet saks for at afsløre hjertet.
- For at fjerne atrieflimren vedhæng (højre eller venstre), løft forsigtigt vedhæng ved hjælp af fine dissekere pincet og skær det ud med fjeder saks. Overfør straks atrieflimren til en silikonebelagt dissekere-skål indeholdende 20 ml af den varmede modificerede tyrode-pH 7,4-opløsning, der er beskrevet i trin 2,1.
- Placer en dissekting stift foroven og en nål i bunden af åbningen af atrieflimren. Ved hjælp af en græsnings pipette skylles Atria med den varmede modificerede Tyrode pH 7,4-opløsning for at fjerne blod. Åbn atrieflimren-vedhæng ved at skære langs den øverste og nederste kant af atrieflimren-vedhæng. Dernæst Fastgør hjørnerne af atrieflimen ned for at oprette et fladt, rektangulært stykke væv, som vist i figur 3a.
4. isolering af atrial Myocytter
Bemærk: Trinene i dette afsnit er alle udført ved 35 °C, med rør nedsænket i en 35 °C vandbad. Vær forsigtig ved overførsel af vævs strimler mellem runde bund rør for at sikre, at kun vævet (og ikke opløsningen) overføres mellem rørene.
- Skær atrieflimren vedhæng i ca 8-10 lige store strimler (ca. 0,7 mm i bredden) ved hjælp af fjeder saks og fine pincet. Et eksempel på strimler af atrieflimren væv er vist i figur 3b. Bemærk, at strips kontrakt, når de er skåret fri fra de vigtigste stykke væv. Ved hjælp af den lille bar ildpoleret pipette overføres vævs strimlerne til det første rør, der indeholder varmet modificeret Tyrode-pH 6,9-opløsning, som beskrevet i trin 2,2. Vent 5 min.
- Vævs strimlerne vaskes ved at overføre dem til den anden og derefter den tredje runde bund slange, der indeholder modificeret Tyrode pH 6,9-opløsning, tilberedt i trin 2,2 ved hjælp af den medium bore-poleret pipette.
- For at vaske vævs strimlerne skal du hætte 5 mL rund bund røret og forsigtigt invertere røret 3 gange. Lad vævs strimlerne bosætte sig i bunden af røret, før du overfører vævs strimlerne til det næste rør ved hjælp af medium bore brand-poleret pipette.
- Vævs strimlerne overføres til den enzym opløsning, der er beskrevet i trin 2,3, ved hjælp af en medium bar ildpoleret pipette og Inkuber i 30 min. Drej røret hver 3-5 min for at forhindre, at vævs båndene klæber sammen.
Bemærk: I begyndelsen af den enzymatiske fordøjelse, væv strimler bosætte sig hurtigt efter hvirvlende. Ved ca. 20 minutters fordøjelse begynder vævs strimlerne at flyde i den enzymatiske opløsning efter hvirvlende. I løbet af denne tid, det atrieflimvæv strimler også ændre udseende fra lyserød til hvid, da de er fordøjet. - Efter Enzymatisk nedbrydning udføres tre vaske med 2,5 mL KB-opløsning i de 5 mL runde bund rør, der er fremstillet i trin 2,4. For hver vask, vend forsigtigt røret 3 gange, før du flytter vævet til næste rør ved hjælp af medium bore ildpoleret pipette. Efter den sidste vask overføres strimlerne til 14 mL rund bund slange indeholdende 2,5 mL KB opløsning. Vent 5 min.
- Forsigtigt udriv vævet til 7,5 min ved hjælp af den brede bar brand-poleret pipette. Dette vil mekanisk dissociere vævs strimlerne og give en uklar opløsning fyldt med individuelle atriale myocytter.
Bemærk: Under trituration bliver vævet hvidt, og opløsningen bliver uklar. Den kraft af trituration, der opnås ved at ændre både hyppigheden og hastigheden af udvisning af vævs strimler fra den brede bore brand-poleret pipette, bør skræddersys til den individuelle isolation. Hvis formalings er for blid, vil celle udbyttet være lavt, mens formalings, der er for hård, vil give mange døde celler. Undgå bobler mens triturating. - Fyld det 14 mL runde bundrør, der indeholder de triturerede vævs strimler med KB-opløsning, til en endelig volumen på 7-10 mL afhængigt af den ønskede celletæthed til eksperimentel brug. Placer dette rør ved stuetemperatur i 1 time. Efter denne inkubationsperiode kan cellerne bruges til en række forskellige eksperimenter i op til 7 h. celler kan også opbevares ved 4 °C i op til 7 timer.
Representative Results
De atriale myocytter isoleret ved hjælp af denne protokol kan bruges til at karakterisere de elektrofysiologiske egenskaber af disse celler ved hjælp af patch-clamp teknik. Aliquoter af atrieflimren myocytter i KB opløsning kan føjes til optagelsen kammer af en standard patch-clamp apparat og superfbrugt med løsninger, der passer til den form for optagelse, som eksperimentator ønsker at udføre. Atrial myocytter isoleret ved hjælp af denne protokol er bedst anvendes til elektrofysiologiske undersøgelser inden for 6-7 h af isolation. Repræsentative patch-clamp data fra vores laboratorium er præsenteret nedenfor.
Figur 4 illustrerer eksempler på isolerede atriale myocytter fra normale mus, som er fremstillet ved hjælp af ovenstående protokol. Isolerede atriale myocytter er typisk på rækkefølgen 100 μm i længden og 10 μm i bredden med klare striber. Kapacitansen af isolerede atrieflimmyocytter er typisk 40-70 pF.
Figur 5a illustrerer et eksempel på en atrieflimren nekrotiske AP indspillet ved hjælp af perforeret patch-clamp teknik i den aktuelle klemme tilstand, som vi har beskrevet tidligere6,19,20. Oversigtsdata, der illustrerer typiske atriale nekrotiske AP-parametre, er angivet i tabel 6. Specifikt præsenterer vi opsummerende data for målinger af hvile membran potentiale (RMP), maksimal optakt hastighed (VMax), overskridelse (os) og AP varighed på 50% (apd50), 70% (apd70) og 90% (APD90) repolarisering tid (tabel 6). APs kan også optages i hele celle konfigurationen14. Superfusions-og pipette løsningerne til optagelse af APs findes i tabel 7 og tabel 8.
Figur 5b illustrerer en repræsentativ familie af na+ strømme (ina) registreret i hele celle konfigurationen af patch-clamp teknik. Disse strømninger blev indspillet med 50 MS spændings klemme trin mellem-100 og + 10 mV fra et Holding potentiale på-120 mV. Vi har beskrevet tilgange og protokoller til optagelse Ina tidligere6,14,20. Et resumé ina IV-forhold er også præsenteret i figur 5b. De løsninger, der anvendes til registrering af Ina , er præsenteret i tabel 7 og tabel 8.
Figur 5c illustrerer en repræsentativ familie på ca2 + strømme (ica, L), der er registreret i hele celle konfigurationen af patch-clamp teknikken. Disse strømninger blev indspillet med 250 MS spændings klemme trin mellem-60 og + 80 mV fra et Holding potentiale på-70 mV. De eksperimentelle betingelser, der kan anvendes til at måle ica, L er tidligere beskrevet17,18,20. Et resumé ica, L IV forhold er også præsenteret i figur 5c. De løsninger, der bruges til at optage ica, L er tilgængelige i tabel 7 og tabel 8.
Figur 5D illustrerer en repræsentativ familie af k+ strømme (ik), der er optaget i hele celle konfigurationen af patch-klemme teknikken. Disse strømme blev registreret fra et Holding potentiale på-80 mv ved hjælp af 500 MS spændings klemme trin mellem-120 mv og + 80 mv, som vi har beskrevet tidligere6,14. Sammendrag IV forholdet for total iK er også præsenteret i figur 5D. De løsninger, der bruges til at optage iK , findes i tabel 7 og tabel 8.
Ved at bruge disse tilgange til at registrere ApS og større familier af Ioniske strømme, herunder na+, ca2 + og K+ strømme (som illustreret ovenfor), tillader investigator at nøje afhøre atrieflimren nekrotiske Elektrofysiologi i en overflod af forsøgsbetingelser. Vores laboratorium har rutinemæssigt anvendt disse teknikker til at studere atrieflimren nekrotiske Elektrofysiologi i normale mus, i musemodeller af hjertesygdomme, og i genetisk modificerede mus6,14,17,18 ,19,20.
Figur 1: rutediagram for isolations protokollen atrieflimren nekrotiske. Resumé af de trin, der anvendes til at isolere atrieflimren myocytter ved hjælp af denne protokol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: eksperimentel opsætning og dissektions værktøjer for atrieflimren nekrotiske isolation. (A). en lille bar brand-poleret pipette med en åbning 1 mm i diameter (venstre) anvendes til vævs overførsel efter dissektion, en medium bar brand-poleret pipette med en åbning 3 mm i diameter (midterste) bruges til at overføre vævs strimler under isolering, og en stor bar brand-poleret pipette med en åbning 5 mm i diameter (højre) anvendes til formalings af fordøjet atriefarvæv. (B). eksperimentel opsætning for isolation af atrieflimren nekrotiske. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: billede af den atriale vedhæng Dissection. (A). repræsentativt lyse felt billede af en exciseret atrieflimren vedhæng skåret åben og fastgjort. (B). repræsentativt lyse felt billede af atrieflimren vedhæng skåret i vævs strimler på ca. 0,7 mm i bredden. Scale bar = 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: billeder af isolerede atriale myocytter. (A). brightfield billede af isolerede atriale myocytter umiddelbart efter isolation. Scale bar = 50 μm. (B). brightfield billede af en enkelt isoleret atrieflimren myocyte. Scale bar = 100 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: repræsentativ patch-klemme data opnået fra isolerede atriale myocytter. (A). repræsentativ stimuleret AP optagelse fra en isoleret atrieflimren myocyte. Resumé af AP parametre er præsenteret i tabel 6. Amphotericin B (200 μg/mL) blev føjet til pipette opløsningen for at trænge ind i den cellulære membran. (B). repræsentative ina -optagelser (venstre) og Resumé Ina IV-kurve (højre) fra en isoleret atrieflimren myocyte. Nifedipin (10 μM) blev føjet til den modificerede Tyrode opløsning til at blokere Ica, L ved optagelse ina. C. repræsentative ica, l optagelser (venstre) og Resumé Ica, l IV kurve (højre) fra en isoleret atrieflimren myocyte. (D). repræsentative ik -optagelser (venstre) og Resumé Ik IV-kurve (højre) fra en isoleret atrieflimren myocyte. De løsninger, der bruges til at registrere hver af disse strømninger, er anført i tabel 7 og tabel 8. Resumé IV kurver er gennemsnitlige målinger fra 10 atrialmyocytter isoleret fra en 15 ugers gammel mandlig dværg C57Bl/6 mus. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Stock Tyrode pH 6,9 | Stock Tyrode pH 7,4 | |
| Kemiske | i mM | i mM |
| Nacl | 140 | 140 |
| KCl | 5,4 | 5,4 |
| KH2po4 | 1,2 | 1,2 |
| HEPES | 5 | 5 |
| Endelige volumen | 500 mL | 1 L |
| Endelig pH med NaOH | 6,9 | 7,4 |
Tabel 1: Stock Tyrode ph 7,4 og Stock Tyrode ph 6,9-opløsninger. Sammensætningen af Stock Tyrode opløsninger (pH 7,4 og pH 6,9), der kan laves på forhånd og opbevares ved 4 °C i op til 2 måneder.
| Kemiske | i mM |
| K-glutamat | 100 |
| K-aspartat | 10 |
| KCl | 25 |
| KH2PO4 | 10 |
| MgSO4 | 2 |
| Taurin | 20 |
| Kreatin | 5 |
| EGTA | 0,5 |
| Glukose | 20 |
| HEPES | 5 |
| Bsa | 0,10% |
| Endelige volumen | 1 L |
| Endelig pH med KOH | 7,2 |
Tabel 2: modificeret KB-løsning. Opskrift på modificeret KB-løsning, der kan laves på forhånd, aliciteres og opbevares ved-20 °C i op til 2 måneder.
| Kemiske | Beløb |
| Glukose | 5,55 mM |
| MgCl2 | 1 mM |
| CaCl2 | 1,8 mM |
| Stock Tyrode pH 7,4 | 50 mL |
| Heparin | 250 μL |
Tabel 3: modificeret Tyrode pH 7,4-opløsning med glucose, magnesium, calcium og heparin. Sammensætningen af modificeret Tyrode pH 7,4-opløsning, der anvendes til atrieflimens dissektion. Denne opløsning skal gøres frisk og opbevares i et 35 °C vandbad indtil brug.
| Kemiske | Beløb |
| Glukose | 18,5 mM |
| Taurin | 49,96 mM |
| Bsa | 15 mg |
| CaCl2 | 0,066 mM |
| Stock Tyrode pH 6,9 | 15 mL |
Tabel 4: modificeret Tyrode pH 6,9-opløsning, der indeholder glucose, taurin, BSA og lavt calciumindhold. Sammensætningen af den modificerede tyrode pH 6,9-opløsning, der anvendes til isolation af atrieflimren nekrotiske. Denne opløsning skal gøres frisk og opbevares i et 35 °C vandbad indtil brug.
| Kemiske | Beløb |
| Kollagenase | 1.064 U |
| Elastase | 9 U |
| Proteaseopløsning | 65,2 μL |
| Modificeret Tyrode pH 6,9 | 5 mL |
Tabel 5: enzymatisk opløsning. Sammensætningen af den enzymatiske opløsning, der anvendes til enzymatisk fordøjelse af atrieflimvæv. Denne opløsning skal gøres frisk og opbevares i et 35 °C vandbad indtil brug.
| Parameter | Gennemsnitlige |
| RMP (mV) | -74,2 ± 0,7 |
| Vmax (V/s) | 144,6 ± 5,8 |
| OS (mV) | 71,9 ± 3,0 |
| APD50 (MS) | 11,1 ± 1,7 |
| APD70 (MS) | 23,0 ± 4,6 |
| APD90 (MS) | 54,7 ± 7,8 |
Tabel 6: oversigt over AP-parametre fra isolerede atriale myocytter. Data præsenteres som Mean ± SEM, n = 10 atrieflimren myocytter isoleret fra en 15 ugers mandlig dværg C57Bl/6 mus.
| Kalium strømme og APs | Natrium strømme | Calcium strømme | |
| Kemiske | i mM | i mM | i mM |
| Nacl | 140 | 5 | |
| KCl | 5,4 | ||
| MgCl2 | 1 | 1 | 1 |
| CaCl2 | 1 | 1 | 2 |
| HEPES | 10 | 10 | 10 |
| Glukose | 5,5 | 5,5 | 5,5 |
| CsCl | 130 | ||
| TEA-CL | 5,4 | 145,5 | |
| Ph | 7,4 med NaOH | 7,4 med CsOH | 7,4 med CsOH |
Tabel 7: sammensætningen af Tyrode-opløsninger, der anvendes under eksperimenter med patch-klemme. Sammensætningen af Tyrode løsninger, der bruges til at registrere APs, Ina, ica, L, og jegK fra isolerede atriale myocytter.
| Kalium strømme og APs | Natrium strømme | Calcium strømme | |
| Kemiske | i mM | i mM | i mM |
| Nacl | 5 | 5 | 5 |
| KCl | 140 | ||
| MgCl2 | 1 | 1 | 1 |
| CaCl2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 |
| HEPES | 10 | 10 | 10 |
| EGTA | 5 | 5 | |
| Mg-ATP | 4 | 5 | 4 |
| Na-GTP | 0,3 | 0,3 | 0,3 |
| Na-fosfokreatin | 6,6 | 6,6 | |
| CsCl | 130 | 135 | |
| BAPTA | 5 | ||
| Ph | 7,2 med KOH | 7,2 med CsOH | 7,2 med CsOH |
Tabel 8: sammensætning af intern pipette opløsning, der anvendes under eksperimenter med patch-klemme. Sammensætningen af de pipette påfyldnings opløsninger, der bruges til at registrere APs, Ina, ica, L, og jegK fra isolerede atriale myocytter.
Discussion
Vores laboratorium bruger rutinemæssigt denne protokol til at isolere mus atrieflimren myocytter til brug i patch-clamp eksperimenter for at undersøge virkningerne af forskellige former for hjerte-kar-sygdom, genetiske mutationer, eller farmakologiske forbindelser på atrieflimren nekrotiske Elektrofysiologi. Selv om det er meget reproducerbart, afhænger kvaliteten af de data, som opnås fra de isolerede atriale myocytter, af isoleringen. Desuden vil genindførelsen af calcium efter atrieflimren nekrotiske isolation resultere i celledød for en population af isolerede myocytter på grund af calcium Paradox16. Derfor kræver isolering af levedygtige atrialmyocytter af høj kvalitet ved hjælp af denne fremgangsmåde praksis og optimering på flere punkter i hele isolationen. Når optimeret, anslås det, at mellem 70-90% af de samlede atrieflimren myocytter isoleret ved hjælp af denne fremgangsmåde vil være både calcium tolerant og stang formet. De trin, der kræver mest praksis og optimering diskuteres nedenfor.
Den hastighed og effektivitet af dissektion vil have downstream virkninger på kvaliteten af de isolerede celler. Det er vigtigt at tage sig tid til at sikre, at alt blod fjernes fra atrieflimvævet, og at vævs strimler skæres i samme størrelse. Det bør tage ca. 5 minutter at fjerne atrieflimren, klippe vævet ind i strimler og overføre vævs strimlerne til det første rør af modificeret Tyrode pH 6,9-opløsning. Men hvis dette trin tager for lang tid, kan kvaliteten af vævet blive kompromitteret.
Det er også vigtigt, at vævs strimler skæres til en ensartet størrelse inden for en isolation og mellem hjerter. Hvis vævs strimler er for store eller for små, eller hvis de ikke er ensartede i en isolation, kan dette give problemer under både enzymatisk fordøjelse og trituration. Dette skyldes, at små strimler vil være mere grundigt fordøjet og store strimler vil være under fordøjet. Det er lige så vigtigt at betragte den genotype og sygdoms indstilling, der er undersøgt, som størrelsen af atrieflimren kan variere mellem dyrene. For eksempel har hypertrofisk hjerter større atrieflimren vedhæng sammenlignet med sunde hjerter, og derfor eksperimententer kan skære flere strimler i hypertrofisk hjerter i forhold til normal størrelse hjerter. Derfor vil optimering af størrelsen af de afskårne vævs strimler og anvendelse af disse dimensioner til hver enkelt atrieflimning i høj grad forbedre reproducerbarhed af nekrotiske isoleringer mellem eksperimentelle betingelser.
Den delikate balance mellem enzymatisk fordøjelse og mekanisk dissociation er nøglen til en vellykket atrieflimren nekrotiske isolation ved hjælp af denne protokol. Hvis vævet ikke er tilstrækkeligt hvirvlet under den enzymatiske fordøjelse de enkelte vævs strimler vil tendens til at klump og holde sammen, hvilket vil begrænse effektiviteten af den enzymatiske fordøjelse. Hvis ophidset for ofte eller energisk, dette kan beskadige atrieflimvævet, hvilket vil resultere i isolering af ikke-levedygtige celler. Mekanisk dissociation af isolerede atriale myocytter fra vævs strimler under formalings er det mest kritiske skridt til at øve og optimere ved hjælp af denne tilgang til at isolere atrieflimren myocytter. Hvis formalings er for blid, vil celle udbyttet være lavt. På den anden side, hvis formalings er for hård, så en overflod af ikke-levedygtige myocytter vil blive isoleret, og kvaliteten af data opnået under patch-klemme eksperimenter vil blive bragt i fare. Desuden kan sammensætningen af Atria påvirke isolationen. For eksempel, hvis væv er fibrotisk, den enzymatiske fordøjelse og formalings trin kan være nødvendigt at blive ændret. Det er derfor vigtigt at tage sig tid til at udvikle de færdigheder, der kræves for at opnå høj kvalitet celler under formalings, der kan anvendes til patch-clamp eksperimenter.
Som med alle eksperimentelle teknikker er der begrænsninger. Denne teknik kræver praksis for at reproducerbart isolere levedygtige, høj kvalitet myocytter, som igen vil påvirke gennemførligheden af eventuelle eksperimenter, der skal udføres ved hjælp af disse myocytter. Denne fremgangsmåde er også Terminal og atrieflimren myocytter isoleret ved hjælp af denne fremgangsmåde kan anvendes på dagen for isolation kun. Vores laboratorium bruger cellerne inden for 6-7 h isolation.
Denne tilgang til isolering atrieflimren kardiomyocytter har flere anvendelser. For eksempel kan denne fremgangsmåde modificeres for at isolere atrieflimren myocytter (såvel som kardiale fibroblaster) fra andre arter, herunder humane atrieflimbider. Desuden er en fordel ved at bruge denne chunk metode til atrieflimren nekrotiske isolation (i modsætning til retrograd perfusion af hjertet), at det kan ændres til at isolere kardiomyocytter fra andre områder af hjertet, såsom sinoatrialt knude eller andre specifikke regioner af atrialmyokardiet, eller omfatter hele den supraventrikulære region i hjertet. Vores laboratorium bruger atrieflimren kardiomyocytter til patch-clamp eksperimenter til at måle aktionspotentialer og ionstrømninger, selv om denne fremgangsmåde ikke behøver at være begrænset til denne teknik. For eksempel kan isolerede myocytter bruges til at undersøge ændringer i calcium transienter og kontraktilitet i en række eksperimentelle indstillinger. Atrial kardiomyocytter kan også anvendes i immunofluorescens undersøgelser for at studere placeringen af proteiner eller strukturer af interesse. Derfor er denne fremgangsmåde meget alsidig med mange mulige applikationer.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde understøttes af driftstilskud fra de canadiske institutter for sundhedsforskning (MOP 93718, 142486) og Heart and Stroke Foundation of Canada til R.A. Rose. H.J. Jansen er modtager af et postdoc-stipendium fra Killam.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1, 2-Bis(2-Aminophenoxy)ethane-N, N, N', N'-tetraacetic acid 98% | Sigma | A4926-1G | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra, > 99%, from microbial | Sigma | A7699-1G | |
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt > 95%, bacterial | Sigma | A9187-1G | |
| Amphocetericin B from Streptomyces sp. ~80% (HPLC), powder | Sigma | A4888-500 MG | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A3059-50G | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506-500G | |
| Cesium chloride ReagentPlus, 99.9% | Sigma | 289329-100G | |
| Cesium hydroxide monohydrate > 99.5% trace metals basis | Sigma | 562505-1KG | |
| Collagenase Type 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | |
| Creatine anhydrous | Sigma | C0780 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| DL-Aspartic acid potassium salt | Sigma | A2025-100G | |
| Elastase suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS002279 | |
| Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid >97.0% | Sigma | E4378-25G | |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate > 95% (HPLC), powder | Sigma | G8877-250MG | |
| Heparin 10 000 USP U/10 mL | SANDOZ | 10750 | |
| HEPES > 99.5% (titration) | Sigma | H3375-500G | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate > 99% (HPLC), powder | Sigma | G1501-500G | |
| Magnesium sulfate | Sigma | M2643-500G | |
| Nifedipine > 98% (HPLC), powder | Sigma | N7634-1G | |
| Phosphocreatine disodium salt hydrate enzymatic, approx 98% | Sigma | P7936-5G | |
| Potassium chloride ACS reagent, 99.0-100.5% | Sigma | P3911-500G | |
| Potassium hydroxide | EM Science | PX1480-1 | |
| Potassium phosphate monobasic | EMD | PX1565-1 | |
| Protease from Streptomyces griseus, type XIV, >3.5 units/mg solid, powder | Sigma | P5147-1G | |
| Sodium chloride ACS reagent, > 99.0% | Sigma | S9888-2.5KG | |
| Sodium hydroxide, pellets, 97+%, A.C.S. reagent | Sigma | 221465-500G | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | World Precision Instruments Inc | SYLG184 | |
| Taurine | Sigma | T0625-100G | |
| Tetraethylammonium chloride > 98% (titration) | Sigma | T2265-100G |
References
- Bartos, D. C., Grandi, E., Ripplinger, C. M. Ion Channels in the Heart. Comprehensive Physiology. 5 (3), 1423-1464 (2015).
- Heijman, J., Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. Cellular and molecular electrophysiology of atrial fibrillation initiation, maintenance, and progression. Circulation Research. 114 (9), 1483-1499 (2014).
- Jalife, J. Mechanisms of persistent atrial fibrillation. Current Opinion in Cardiology. 29 (1), 20-27 (2014).
- Nattel, S., Maguy, A., Le Bouter, S., Yeh, Y. H. Arrhythmogenic ion-channel remodeling in the heart: heart failure, myocardial infarction, and atrial fibrillation. Physiological Reviews. 87 (2), 425-456 (2007).
- Jansen, H. J., et al. Atrial structure, function and arrhythmogenesis in aged and frail mice. Scientific Reports. 7, 44336 (2017).
- Jansen, H. J., et al. Distinct patterns of atrial electrical and structural remodeling in angiotensin II mediated atrial fibrillation. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 124, 12-25 (2018).
- Nerbonne, J. M., Kass, R. S. Molecular physiology of cardiac repolarization. Physiological Reviews. 85 (4), 1205-1253 (2005).
- Grant, A. O. Cardiac ion channels. Circulalation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).
- Schmitt, N., Grunnet, M., Olesen, S. P. Cardiac potassium channel subtypes: new roles in repolarization and arrhythmia. Physiological Reviews. 94 (2), 609-653 (2014).
- Lomax, A. E., Kondo, C. S., Giles, W. R. Comparison of time- and voltage-dependent K+ currents in myocytes from left and right atria of adult mice. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 285 (5), H1837-H1848 (2003).
- Li, D., Zhang, L., Kneller, J., Nattel, S. Potential ionic mechanism for repolarization differences between canine right and left atrium. Circ Res. 88 (11), 1168-1175 (2001).
- Wirth, K. J., Knobloch, K. Differential effects of dofetilide, amiodarone, and class lc drugs on left and right atrial refractoriness and left atrial vulnerability in pigs. Naunyn Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 363 (2), 166-174 (2001).
- Qi, A., Yeung-Lai-Wah, J. A., Xiao, J., Kerr, C. R. Regional differences in rabbit atrial repolarization: importance of transient outward current. American Journal of Physiology. 266 (2 Pt 2), H643-H649 (1994).
- Jansen, H. J., et al. NPR-C (Natriuretic Peptide Receptor-C) Modulates the Progression of Angiotensin II-Mediated Atrial Fibrillation and Atrial Remodeling in Mice. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 12 (1), e006863 (2019).
- Mangoni, M. E., Nargeot, J. Genesis and regulation of the heart automaticity. Physiological Reviews. 88 (3), 919-982 (2008).
- Voigt, N., Pearman, C. M., Dobrev, D., Dibb, K. M. Methods for isolating atrial cells from large mammals and humans. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 86, 187-198 (2015).
- Springer, J., et al. The natriuretic peptides BNP and CNP increase heart rate and electrical conduction by stimulating ionic currents in the sinoatrial node and atrial myocardium following activation of guanylyl cyclase-linked natriuretic peptide receptors. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 52 (5), 1122-1134 (2012).
- Hua, R., Adamczyk, A., Robbins, C., Ray, G., Rose, R. A. Distinct patterns of constitutive phosphodiesterase activity in mouse sinoatrial node and atrial myocardium. PLoS One. 7 (10), e47652 (2012).
- Egom, E. E., et al. Impaired sinoatrial node function and increased susceptibility to atrial fibrillation in mice lacking natriuretic peptide receptor C. Journal of Physiology. 593 (5), 1127-1146 (2015).
- Hua, R., et al. Effects of Wild-Type and Mutant Forms of Atrial Natriuretic Peptide on Atrial Electrophysiology and Arrhythmogenesis. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 8 (5), 1240-1254 (2015).
- Krishnaswamy, P. S., et al. Altered parasympathetic nervous system regulation of the sinoatrial node in Akita diabetic mice. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 82, 125-135 (2015).
- Mackasey, M., et al. Natriuretic peptide receptor C (NPR-C) protects against angiotensin II mediated sinoatrial disease in mice. JACC Basic to Translational Science. , (2018).
- Azer, J., Hua, R., Vella, K., Rose, R. A. Natriuretic peptides regulate heart rate and sinoatrial node function by activating multiple natriuretic peptide receptors. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 53 (5), 715-724 (2012).
