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Medicine

वयस्क चूहे से एट्रियल मायोसाइट्स का अलगाव

Published: July 25, 2019 doi: 10.3791/59588
Automatic Translation
1, 1
1Libin Cardiovascular Institute of Alberta, Department of Cardiac Sciences, Department of Physiology and Pharmacology, Cumming School of Medicine, University of Calgary

Summary

इस प्रोटोकॉल एक खंड पाचन दृष्टिकोण का उपयोग वयस्क माउस दिल से एकल atrial cardiomycytes को अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इस दृष्टिकोण सही को अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है या छोड़ दिया atrial मायोसाइट्स कि पैच-क्लंप अध्ययन में एट्रियल मायोसाइट इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Abstract

एट्रियल मायोसाइट्स के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुण महत्वपूर्ण रूप से समग्र हृदय समारोह को प्रभावित करते हैं। कार्रवाई की क्षमता के लिए जिम्मेदार अंतर्निहित आयनिक धाराओं में परिवर्तन समर्थक-एरिथिक substrates कि underlie arrhythmias, इस तरह के एट्रियल फाइब्रिलेशन के रूप में पैदा कर सकता है, जो कई स्थितियों और रोग राज्यों में अत्यधिक प्रचलित हैं. पैच-क्लैम्प प्रयोगों में उपयोग के लिए वयस्क माउस एट्रियल कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करने से स्वस्थ एट्रियल मायोकार्डियम में और एट्रियल पैथोफिजियोलॉजी की सेटिंग में हमारे ज्ञान और सेलुलर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी की समझ को बहुत उन्नत किया गया है। इसके अलावा, आनुवंशिक माउस मॉडल का उपयोग कर अध्ययन atrial electrophysiology को विनियमित करने में प्रोटीन की एक विशाल सरणी की भूमिका स्पष्ट है. यहाँ हम एंजाइमी पाचन और इन ऊतकों के यांत्रिक वियोजन का उपयोग कर वयस्क चूहों के atrial उपांगों से cardiomycytes के अलगाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. यह दृष्टिकोण लगातार और मज़बूती से अलग atrial cardiomycytes है कि तो कार्रवाई क्षमता और प्रयोगात्मक की एक संख्या के तहत पैच-क्लैम्प प्रयोगों में आय धाराओं को मापने के द्वारा सेलुलर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता पैदावार शर्तों.

Introduction

एट्रिया, जो दिल की पतली दीवारों, कम दबाव कक्षों कि बेहतर और अवर वेना cavae के रूप में के रूप में अच्छी तरह से फुफ्फुसीय नसों से रक्त प्राप्त कर रहे हैं, सामान्य हृदय शरीर क्रिया विज्ञान में अभिन्न हैं. दिल के अन्य क्षेत्रों की तरह, atria cell प्रकार के एक नंबर होते हैं, cardiomycytes सहित, फाइब्रोब्लास्ट्स, endothelial कोशिकाओं, संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, और दूसरों. एट्रियल मायोसाइट्स विद्युत ीय कोशिकाओं है कि दिल के माध्यम से बिजली के संकेतों के चालन में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं, जिससे प्रत्येक दिल की धड़कन1के दौरान उचित एट्रियल संकुचन सुनिश्चित कर रहे हैं। एट्रिया में विद्युत रोग के कारण अनेक एट्रियल विशिष्ट अतालता हो सकते हैं , जैसे कि एट्रियल स्पंदन और एट्रियल फाइब्रिलेशन2,3. ये अत्यधिक प्रचलित हैं, अभी तक खराब समझ, atrial arrhythmias कि महत्वपूर्ण रुग्णता और मृत्यु के लिए नेतृत्व. एट्रियल फाइब्रिलेशन आनुवंशिक उत्परिवर्तनों के साथ सहयोग में, उम्र बढ़ने के साथ या उच्च रक्तचाप,हृदय विफलता और मधुमेह 2,4,5 सहित हृदय रोग के अधिग्रहीत रूपों की स्थापना में हो सकता है ,6. ये स्थितियां एट्रियल मायोसाइट्स के विद्युत गुणों को बदल सकती हैं जो एक सब्सट्रेट बना सकती हैं जो अतालताजनन1,2के प्रसार को बढ़ाती हैं .

atria में सामान्य विद्युत समारोह, साथ ही एट्रियल arrhythmogenesis, महत्वपूर्ण रूप से कार्रवाई की क्षमता की आकृति विज्ञान से प्रभावित कर रहे हैं (एपी) atrial मायोसाइट्स में उत्पादित. एट्रियल एपी सोडियम वर्तमान (मैंना,ना द्वारा किए गए Na, 1.5 चैनलों द्वारा किए गए), एल-प्रकार कैल्शियम वर्तमान (मैंCa,L, Cav1.2 और CaV1.3 चैनलों द्वारा किए गए सहित आयनिक धाराओं की एक संख्या की गतिविधि से उत्पन्न होता है ), और अल्ट्रा तीव्र विलंबित दिष्टकारी पोटेशियम वर्तमान सहित कई पोटेशियम धाराओं (IKur, KV1.5 चैनलों द्वारा किया जाता है), क्षणिक जावक पोटेशियम वर्तमान (मैंकरने के लिए, KV4.2 और KV4.3 द्वारा किया जाता है चैनल), एक स्थिर राज्य पोटेशियम वर्तमान (मैंKss, KV2.1 चैनलों द्वारा किया जाता है), और आवक दिष्टकारी पोटेशियम वर्तमान (मैंK1, Kir2.1 चैनलों द्वारा किया जाता है)1,7, 8. हालांकि वे माउस atria में एक प्रमुख भूमिका नहीं निभाते हैं, देरी दिष्टकारी K+ वर्तमान के तेजी से और धीमी गति से घटकों (मैंKr और मैंKs) भी कुछ प्रजातियों में एपी repolarization के लिए योगदान7. इन आयनिक धाराओं में से एक या अधिक में परिवर्तन काफी एट्रियल मायोसाइट्स के विद्युत गुणों को बदल सकते हैं, जो एट्रियल एरिथमिया के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, मैंना में कमी एपी अपस्ट्रोक वेग को कम करने से atria भर में चालन वेग धीमा कर सकते हैं. दूसरी ओर, पोटेशियम धाराओं repolarizing में कमी या या तो मैंCa,L या देर से मैंना में वृद्धि afterdepolarizations के विकास में परिणाम कर सकते हैं कि atria1में सहज गतिविधि को गति प्रदान कर सकते हैं, 2,9.

यह समझना महत्वपूर्ण है कि एट्रियल मायोकार्डियम के विभिन्न भागों में एपी आकृति विज्ञान में अंतर है जो इन अंतर्निहित आयन चैनलों की अभिव्यक्ति या विनियमन में अंतर के कारण होने की संभावना है। उदाहरण के लिए, सही और बाएँ atria के बीच एपी अवधि में मतभेद मैं में वर्तमान घनत्व में अंतरके साथ सहयोग में अच्छी तरह से वर्णित किया गया है10,11,12,13. इसके अलावा, हम हाल ही में दिखा दिया है कि वहाँ बिजली remodeling के अलग पैटर्न हैं सही और पुराने उच्च रक्तचाप के साथ चूहों के बाईं atria6,14. दाईं ओर पीछे की दीवार में साइनोट्रियल नोड भी होता है, जिसका एपी आकृति विज्ञान और फायरिंग पैटर्न15का अपना अलग पैटर्न होता है। एट्रिया के इन विभिन्न भागों में से प्रत्येक में मायोसाइट्स के अलग-अलग गुणों की इन क्षेत्रों में से प्रत्येक से अलग मायोसाइट्स का उपयोग करके विस्तार से जांच की जा सकती है।

वहाँ अलग अलग दृष्टिकोण है कि पैच-क्लैम्प इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी अध्ययन16के लिए एट्रियल मायोसाइट्स को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक संभावना एक प्रतिगामी भ्रम दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए जहां दिल एंजाइमों की डिलीवरी के लिए महारा के माध्यम से cannulated है. हालांकि यह एक व्यवहार्य दृष्टिकोण है, यह atria के perfusion में विसंगतियों के कारण atrial मायोसाइट गुणवत्ता में परिवर्तनशीलता का उत्पादन कर सकते हैं. हमने एट्रियल मायोसाइट्स के अलगाव के लिए एक 'चंक' पाचन दृष्टिकोण अपनाया है जो हृदय के प्रतिगामी भ्रम की आवश्यकता को समाप्त करता है। हमारे दृष्टिकोण एंजाइमी पाचन और एट्रियल ऊतक है कि लगातार और मज़बूती से पैच-क्लैम्प अध्ययन के लिए उपयुक्त हैं कि अलग एट्रियल मायोसाइट्स की बड़ी संख्या पैदावार के यांत्रिक वियोजन का एक संयोजन का उपयोग करता है। जब तक हम अपने दृष्टिकोण का वर्णन यहाँ atrial उपांग ऊतक का उपयोग कर, दृष्टिकोण atrial मायोकार्डियम के किसी भी क्षेत्र पर इस्तेमाल किया जा सकता है (यानी, सही है या छोड़ दिया atrial उपांग, मुक्त दीवारों, पीछे की दीवारों) कि अन्वेषक चुनता है. यह दृष्टिकोण आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों में एट्रियल मायोसाइट इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के अध्ययन के लिए आदर्श है, हृदय रोग के माउस मॉडल में, या औषधीय यौगिकों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए5,6,17 , 18 , 19.

Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं कैलगरी पशु देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया और पशु देखभाल पर कनाडा परिषद के दिशा निर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया. एट्रियल मायोसाइट अलगाव, छवियों, और प्रतिनिधि परिणाम नीचे वर्णित एक 15 सप्ताह पुराने पुरुष wildtype C57Bl / हम नियमित रूप से इस प्रोटोकॉल का उपयोग जंगली प्रकार के चूहों से एट्रियल मायोसाइट्स को अलग करने के लिए करते हैं17,18, चूहों आनुवंशिक उत्परिवर्तन ले जाने19,20 और इस तरह के पुराने उच्च रक्तचाप के रूप में रोग के माउस मॉडल6, 14. प्रोटोकॉल पुरुष या महिला चूहों के लिए इसी तरह इस्तेमाल किया जा सकता है. हमने इस अलगाव प्रक्रिया के इसी प्रकार के संस्करण का उपयोग माउस हार्ट17,21,22,23से सिनोएट्रियल नोड मायोसाइट्स को अलग करने के लिए भी किया . इस प्रायोगिक प्रोटोकॉल का प्रवाह चार्ट चित्र 1में स्थित है।

1. स्टॉक समाधान और उपकरण की तैयारी

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार सिलिकॉन इलोस्टोमर जोड़कर 1 विच्छेदन व्यंजन तैयार करें। 1 सेमी पेट्री डिश के नीचे 1 सेमी की गहराई को कवर करने के लिए पर्याप्त सिलिकॉन इलेस्टोमर यौगिक जोड़ें। इलाज करने की अनुमति दें और फिर पकवान में 6 कीट पिन डालें।
    नोट: इस सिलिकॉन विच्छेदन पकवान महीनों के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता है और कमरे के तापमान पर संग्रहीत.
  2. चित्र 2कमें दर्शाए अनुसार व्यास में 1 मिमी (छोटे बोर), 3 मिमी (मध्यम बोर), या 5 मिमी (बड़े बोर) के उद्घाटन के साथ 3 फायर-पॉलिश पेस्टर पिपेट तैयार करें। इन pipettes बनाने के लिए, एक पाश्चर pipette स्कोर और फिर स्कोर चिह्न के साथ तस्वीर एक खोलने कि वांछित बोर आकार से थोड़ा बड़ा है उत्पादन करने के लिए। सतह को चिकना करने के लिए धातु की फ़ाइल का उपयोग करें और फिर खुली लौ का उपयोग करके इस उद्घाटन को आग-पॉलिश करें।
    नोट: यह वांछित व्यास के उद्घाटन के साथ एक चिकनी, आग पॉलिश बढ़त का उत्पादन होगा। यह महत्वपूर्ण है कि खोलने दरारें और किसी न किसी सतहों से मुक्त है. इन आग पॉलिश pipettes कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है और महीनों के लिए पुन: उपयोग.
  3. तालिका 1में सूचीबद्ध के रूप में Tyrode के पीएच 6.9 समाधान और Tyrod के पीएच 7.4 समाधान के लिए शेयर समाधान तैयार करें। इसके अलावा 1 एम एमजीसीएल2, 1 एम केसीएल2, और 100 एम एम सी सीएल2में से प्रत्येक 10 एमएल तैयार करें . सभी समाधानों के लिए अल्ट्रापरे पानी का उपयोग करें और 2 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. तालिका 2में दर्शाए अनुसार संशोधित क्राफ्ट-ब्राहे (KB) समाधान का 1 L तैयार करें। अल्ट्राप्योर पानी का प्रयोग करें। समाधान को 20 एमएल एलिकोट्स में विभाजित करें और 2 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. Atrial Myocyte अलगाव के लिए समाधान और अलगाव सेटअप की तैयारी

  1. 1 M CaCl 2 और 1 M MgCl2 स्टॉक समाधान का उपयोग करते हुए, 125 एमएल Erlenmeyer फ्लास्क में तालिका 3 में वर्णित के रूप में एक संशोधित Tyrod के पीएच 7.4 समाधान के 50 एमएल तैयार करें। Erlenmeyer फ्लास्क को 35 डिग्री सेल्सियस जल स्नान में उपयोग होने तक रखें, जैसा कि चित्र 2खमें दर्शाया गया है।
  2. 100 एमएल सीसीएल2 स्टॉक विलयन का उपयोग करते हुए 50 एमएल ट्यूब में सारणी 4 में वर्णित संशोधित टायरोड का पीएच 6ण्9 विलयन तैयार कीजिए। अलीकोट इस विलयन का 2.5 एमएल प्रत्येक में तीन 5 एमएल गोल तल तली में होता है। इन ट्यूबों को 35 डिग्री सेल्सियस जल स्नान में तब तक रखे जाते हैं जब तक कि वे उपयोग न कर लें, जैसा कि चित्र 2खमें दर्शाया गया है।
  3. सारणी 5 में वर्णित एंजाइम विलयन को 14 एमएल गोल तल नलिका में निरूपित कीजिए। प्रोटीज़ घोल बनाने के लिए, अल्ट्राप्यूर पानी के प्रति 1 मिलीग्राम प्रोटीज़ जोड़ें। तार रैक में इस एंजाइम समाधान युक्त ट्यूब रखें और उपयोग होने तक 35 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में इनक्यूबेट करें।
  4. 35 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में संशोधित KB समाधान के एक aliquot था. अलीकोट 2.5 एमएल केबी विलयन में प्रत्येक तीन 5 एमएल गोल तल नलिकाएं तथा 2.5 एमएल 14 एमएल गोल तल नलिका में। इन ट्यूबों को तार रैक में रखें और 35 डिग्री सेल्सियस जल स्नान में उपयोग होने तक इनक्यूबेट करें, जैसा कि चित्र 2खमें दर्शाया गया है।
  5. चित्र 2खमें दर्शाए अनुसार विच्छेदार प्लेट, विच्छेदन उपकरण, एक पाश्चर पिपेट और अग्नि-पॉलिश पिपेट्स को बाहर रखें।

3. माउस एट्रियल परिशिष्ट (ओं) का विच्छेदन

  1. 0.2 एमएल हेपरिन (10 000 यूएसपी U/10 एमएल) के साथ माउस को इंट्रापेरिटोनल इंजेक्शन के माध्यम से इंजेक्ट करें और अवशोषण के लिए 5 मिनट प्रतीक्षा करें।
  2. माउस को प्रेरण कक्ष में रखें और isoflurane साँस लेना (3-4%) द्वारा एनेस्थेटाइज करें। Isoflurane और ऑक्सीजन एक संवेदनाहारी मशीन का उपयोग कर वितरित कर रहे हैं और अपशिष्ट संवेदनाहारी गैस scaved है. एक बार माउस anesthetized है, और एक अंगुली चुटकी पलटा प्रदर्शन नहीं करता है, तेजी से गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा माउस euthanize. माउस को एक कागज तौलिया या कॉर्क बोर्ड पर रखें और माउस को जगह में रखने के लिए पंजे को नीचे टेप करें।
  3. 70% इथेनॉल के साथ माउस की छाती गीला. घुमावदार कैंची का उपयोग कर छाती को कवर फर और त्वचा निकालें। इसके बाद, स्टर्नम को उठाने के लिए चूहे दांत संदंश का उपयोग करें और फिर पसलियों के किनारे डायाफ्राम को काटें। दिल को बेनकाब करने के लिए घुमावदार कैंची का उपयोग कर पूरे रिब पिंजरे निकालें।
  4. एट्रियल उपांग (दाएं या बाएं) को हटाने के लिए, धीरे से ठीक विच्छेदन बलप्स का उपयोग कर परिशिष्ट उठा और वसंत कैंची के साथ इसे काट दिया। तुरंत एक सिलिकॉन लेपित विच्छेदन के लिए एक सिलिकॉन लेपित विच्छेदन पकवान गर्म संशोधित Tyrode के पीएच 7.4 समाधान चरण 2.1 में वर्णित की 20 एमएल युक्त करने के लिए एट्रियल उपांग हस्तांतरण।
  5. एट्रियल उपांग के उद्घाटन के नीचे एक अलग-अलग पिन को शीर्ष पर रखें और एक पिन रखें। एक चरागाह पिपेट का उपयोग करना, रक्त को हटाने के लिए गर्म संशोधित Tyrode के पीएच 7.4 समाधान के साथ atria फ्लश। एट्रियल उपांग के ऊपरी और नीचे किनारे के साथ काटने से एट्रियल उपांग खोलें। इसके बाद, एट्रियल उपांग के कोनों को नीचे पिन करके एक समतल, आयताकार ऊतक का टुकड़ा बनाया जा सकता है, जैसा कि चित्र 3कमें दिखाया गया है।

4. एट्रियल मायोसाइट्स का अलगाव

नोट: इस खंड में कदम सभी 35 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन कर रहे हैं, ट्यूब एक 35 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जलमग्न के साथ. सावधान रहें जब दौर नीचे ट्यूबों के बीच ऊतक स्ट्रिप्स स्थानांतरित करने के लिए सुनिश्चित करें कि केवल ऊतक (और नहीं समाधान) ट्यूबों के बीच स्थानांतरित किया जाता है.

  1. लगभग 8-10 बराबर आकार स्ट्रिप्स (लगभग 0.7 मिमी चौड़ाई में) वसंत कैंची और ठीक संदंश का उपयोग कर में एट्रियल उपांग कट. एट्रियल ऊतक की पट्टियों का एक उदाहरण चित्र 3ठमें दर्शाया गया है। ध्यान दें कि स्ट्रिप्स अनुबंध एक बार वे ऊतक के मुख्य टुकड़े से मुक्त काट रहे हैं. छोटे बोर आग पॉलिश पिपेट का उपयोग करना, पहले ट्यूब में ऊतक स्ट्रिप्स हस्तांतरण गर्म संशोधित Tyrode पीएच 6.9 कदम 2.2 में वर्णित समाधान युक्त. 5 मिनट रुको.
  2. उन्हें दूसरे और फिर संशोधित Tyrode पीएच 6.9 समाधान चरण 2.2 में तैयार मध्यम बोर आग पॉलिश पिपेट का उपयोग करयुक्त उन्हें दूसरे और फिर तीसरे दौर के नीचे ट्यूब को स्थानांतरित करके ऊतक स्ट्रिप्स धो लें।
    1. ऊतक स्ट्रिप्स धोने के लिए, 5 एमएल दौर नीचे ट्यूब टोपी और धीरे ट्यूब 3 बार उलटा. ऊतक स्ट्रिप्स मध्यम बोर आग पॉलिश पिपेट का उपयोग कर अगले ट्यूब करने के लिए ऊतक स्ट्रिप्स स्थानांतरित करने से पहले ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करते हैं।
  3. एक मध्यम बोर आग-पॉलिश पिपेट और 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट का उपयोग करके चरण 2.3 में वर्णित एंजाइम समाधान में ऊतक स्ट्रिप्स को स्थानांतरित करें। ऊतक स्ट्रिप्स को एक साथ का उपयोग करने से रोकने के लिए हर 3-5 मिनट में ट्यूब को घुमाएं।
    नोट: एंजाइमी पाचन की शुरुआत में, ऊतक स्ट्रिप्स घूमता के बाद जल्दी से व्यवस्थित. पाचन के लगभग 20 मिनट पर, ऊतक स्ट्रिप्स घूमता के बाद एंजाइमी समाधान में तैरने लगते हैं। इस समय के दौरान, एट्रियल ऊतक स्ट्रिप्स भी हल्के गुलाबी से सफेद उपस्थिति में परिवर्तन के रूप में वे पचा रहे हैं.
  4. एंजाइमी पाचन के बाद, चरण 2.4 में तैयार 5 एमएल गोल नीचे ट्यूबों में केबी घोल के 2.5 एमएल का उपयोग करके तीन washes करें। प्रत्येक धोने के लिए, धीरे मध्यम बोर आग पॉलिश पिपेट का उपयोग कर अगले ट्यूब करने के लिए ऊतक ले जाने से पहले ट्यूब 3 बार उलटा। अंतिम धोने के बाद, स्ट्रिप्स को 14 एमएल गोल बॉटम ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 2.5 एमएल KB समाधान होता है। 5 मिनट रुको.
  5. विस्तृत बोर आग-पॉलिश पिपेट का उपयोग करके 7.5 मिनट तक ऊतक को धीरे-धीरे त्रिचना। यह यंत्रवत् ऊतक स्ट्रिप्स को अलग कर देगा और व्यक्तिगत एट्रियल मायोसाइट्स से भरा एक बादल समाधान उपज देगा।
    नोट: अनुरणन के दौरान, ऊतक सफेद हो जाता है और समाधान बादल हो जाता है। trituration के बल, दोनों आवृत्ति और व्यापक बोर आग पॉलिश पिपेट से ऊतक स्ट्रिप्स निष्कासित करने के वेग बदलने से हासिल की, व्यक्तिगत अलगाव के अनुरूप किया जाना चाहिए. यदि trituration भी कोमल है, सेल उपज कम हो जाएगा, जबकि trituration कि बहुत कठोर है कई मृत कोशिकाओं उपज होगी. triturating जबकि बुलबुले से बचें।
  6. प्रयोगात्मक उपयोग के लिए कोशिकाओं के वांछित घनत्व के आधार पर 7-10 एमएल के अंतिम मात्रा के लिए KB समाधान के साथ triturated ऊतक स्ट्रिप्स युक्त 14 एमएल दौर नीचे ट्यूब भरें। इस ट्यूब को 1 ज के लिए कमरे के तापमान पर रखें। इस ऊष्मायन अवधि के बाद, कोशिकाओं को 7 ज तक के विभिन्न प्रयोगों के लिए उपयोग किया जा सकता है। कोशिकाओं को भी 4 डिग्री सेल्सियस पर 7 डिग्री सेल्सियस तक के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर अलग एट्रियल मायोसाइट्स पैच-क्लैम्प तकनीक का उपयोग कर इन कोशिकाओं के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। KB समाधान में एट्रियल मायोसाइट्स के Aliquots एक मानक पैच-क्लैम्प उपकरण की रिकॉर्डिंग कक्ष में जोड़ा जा सकता है और प्रयोगवादी प्रदर्शन करने की इच्छा ओंकार की तरह के लिए उपयुक्त समाधान के साथ superfused. इस प्रोटोकॉल का उपयोग अलग एट्रियल मायोसाइट्स सबसे अच्छा अलगाव के 6-7 एच के भीतर electrophysiological अध्ययन के लिए उपयोग किया जाता है। हमारी प्रयोगशाला से प्रतिनिधि पैच-क्लैम्प डेटा नीचे प्रस्तुत किया गया है।

चित्र 4 उपरोक्त प्रोटोकॉल का उपयोग करके तैयार किए गए सामान्य चूहों से पृथक एट्रियल मायोसाइट्स के उदाहरण ों को दर्शाता है। पृथक एट्रियल मायोसाइट्स आमतौर पर लंबाई में 100 डिग्री मी और चौड़ाई में 10 डिग्री मीटर के क्रम पर स्पष्ट striations के साथ कर रहे हैं। पृथक ऐट्रियल मायोसाइट्स की धारिता सामान्यतया 40-70 पीएफ होती है।

चित्र 5क वर्तमान क्लैम्प मोड में छिद्रित पैच-क्लैम्प तकनीक का उपयोग करके दर्ज किए गए एट्रियल मायोसाइट एपी का एक उदाहरण दिखाता है, जैसा कि हमने पहले6,19,20का वर्णन किया है। सारांश आंकड़ा जो विशिष्ट एट्रियल मायोसाइट एपी पैरामीटरों का चित्रण करता है, तालिका 6में प्रदान किए गए हैं। विशेष रूप से, हम आराम झिल्ली क्षमता (आरएमपी), अधिकतम अपस्ट्रोक वेग (वीअधिकतम),overshoot (ओएस) और एपी अवधि पर 50% (APD50), 70% (एपीडी70) और 90% (एपीडी90) पुनर्करण के माप के लिए सारांश डेटा प्रस्तुत समय(तालिका 6) ए पी भी पूरे सेल विन्यास14में दर्ज किया जा सकता है. ए पी एस की रिकॉर्डिंग के लिए सुपरफ्यूजन और पिपेट समाधान तालिका 7 और तालिका 8में उपलब्ध हैं।

चित्र 5B पैच-क्लैम्प तकनीक के पूरे सेल विन्यास में दर्ज ना+ धाराओं (मैंना) के एक प्रतिनिधि परिवार को दिखाता है। इन धाराओं का उपयोग कर दर्ज किए गए थे 50 एमएस वोल्टेज दबाना कदम के बीच -100 और +10 एमवी की एक होल्डिंग क्षमता से -120 mV. हमने INa पहले6,14,20की रिकॉर्डिंग के लिए दृष्टिकोण और प्रोटोकॉल का वर्णन किया है . एक सारांश Iना IV संबंध भी चित्र 5Bमें प्रस्तुत किया गया है. Iना को अभिलेखित करने के लिए प्रयुक्त समाधान तालिका 7 और तालिका 8में प्रस्तुत किए गए हैं।

चित्र 5C पैच-क्लैम्प तकनीक के पूरे सेल कॉन्फ़िगरेशन में दर्ज Ca2+ धाराओं (ICa,L)के प्रतिनिधि परिवार को दिखाता है। इन धाराओं का उपयोग कर दर्ज किए गए थे 250 एमएस वोल्टेज दबाना कदम के बीच -60 और +80 mV की एक होल्डिंग क्षमता से -70 mV. प्रायोगिक स्थितियों का प्रयोगप्रथम, एल को मापने के लिए किया जा सकता है, जिनका वर्णन पहले17,18,20किया गया है . एक सारांश ICa,L IV संबंध भी चित्र 5Cमें प्रस्तुत किया गया है। ICa,L को रिकॉर्ड करने के लिए उपयोग किए जाने वाले समाधान तालिका 7 और तालिका 8में उपलब्ध हैं।

चित्र 5D पैच-क्लैम्प तकनीक के पूरे सेल विन्यास में दर्ज K+ धाराओं (IK) के एक प्रतिनिधि परिवार को दिखाता है। इन धाराओं -80 एमवी की एक होल्डिंग क्षमता से दर्ज किए गए थे 500 एमएस वोल्टेज दबाना कदम के बीच -120 mV और +80 mV, जैसा कि हम पहले वर्णित किया गया है6,14. कुल IK के लिए सारांश IV संबंध भी चित्र 5Dमें प्रस्तुत किया गया है. IK को रिकॉर्ड करने के लिए प्रयुक्त समाधान तालिका 7 और तालिका 8में उपलब्ध हैं।

ए पी एस और आयनिक धाराओं के प्रमुख परिवारों को रिकॉर्ड करने के लिए इन तरीकों का उपयोग करना, जिसमें ना+, Ca2 + और K+ धाराएं शामिल हैं ( जैसा कि ऊपर सचित्र है), अन्वेषक को एट्रियल मायोसाइट इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी को कड़ाई से पूछताछ करने की अनुमति देता है प्रयोगात्मक स्थितियों की बहुतायत. हमारी प्रयोगशाला नियमित रूप से इन तकनीकों का इस्तेमाल किया है सामान्य चूहों में एट्रियल मायोसाइट इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का अध्ययन करने के लिए, हृदय रोग के माउस मॉडल में, और आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों में6,14,17,18 ,19,20.

Figure 1
चित्र 1: एट्रियल मायोसाइट आइसोलेशन प्रोटोकॉल के लिए फ्लोचार्ट। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके एट्रियल मायोसाइट्स को अलग करने के लिए उपयोग किए गए चरणों का सारांश. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: एट्रियल मायोसाइट आइसोलेशन के लिए प्रायोगिक सेटअप और विच्छेदन उपकरण। (a) एक छोटे बोर आग पॉलिश पिपेट के साथ एक खोलने के साथ 1 मिमी व्यास में (बाएं) विच्छेदन के बाद ऊतक हस्तांतरण के लिए प्रयोग किया जाता है, एक मध्यम बोर आग पॉलिश पिपेट एक खोलने के साथ 3 मिमी व्यास में (मध्य) ऊतक स्ट्रिप्स हस्तांतरण करने के लिए प्रयोग किया जाता है अलगाव, और एक बड़े बोर आग पॉलिश पिपेट एक खोलने के साथ 5 मिमी व्यास में (दाएं) पचा एट्रियल ऊतक के trituration के लिए प्रयोग किया जाता है। (बी) एट्रियल मायोसाइट अलगाव के लिए प्रायोगिक सेटअप। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: एट्रियल उपांग विच्छेदन की छवि. (ए) एक excised atrial उपांग कट के प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र छवि खुला और बाहर टिकी. (ब) लगभग 0ण्7 उउ की चौड़ाई में ऊतक पट्टियों में कटे हुए एट्रियल उपांग के प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र छवि। स्केल बार - 1 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: अलग एट्रियल मायोसाइट्स की छवियाँ. (ए) अलगाव के तुरंत बाद अलग एट्रियल मायोसाइट्स की ब्राइटफील्ड छवि। स्केल बार $ 50 डिग्री मी. (बी) एक अलग एट्रियल मायोसाइट की ब्राइटफील्ड छवि। स्केल बार ] 100 डिग्री मी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: अलग-अलग एट्रियल मायोसाइट्स से प्राप्त प्रतिनिधि पैच-क्लैम्प डेटा। (एक) प्रतिनिधि एक अलग एट्रियल मायोसाइट से एपी रिकॉर्डिंग प्रेरित. एपी पैरामीटरों का सारांश तालिका 6में प्रस्तुत किया गया है। एम्थोएरिकिन बी (200 ग्राम/एमएल) कोल्यूलर झिल्ली को पार करने के लिए पिपेट समाधान में जोड़ा गया था। (बी) प्रतिनिधि मैंना रिकॉर्डिंग (बाएं) और सारांश मैंना चतुर्थ वक्र (दाएं) एक अलग atrial मायोसाइट से. Nifedipine (10 $M) मैंCa, L ब्लॉक करने के लिए संशोधित Tyrod समाधान करने के लिए जोड़ा गया था जब रिकॉर्डिंग मैंना. C. प्रतिनिधि मैंCa,L रिकॉर्डिंग (बाएं) और सारांश मैंCa,L चतुर्थ वक्र (दाएं) एक अलग atrial मायोसाइट से. (डी) प्रतिनिधि मैंK रिकॉर्डिंग (बाएं) और सारांश मैंK IV वक्र (दाएं) एक अलग atrial मायोसाइट से. इनमें से प्रत्येक धारा को अभिलिखित करने के लिए प्रयुक्त समाधान सारणी 7 और सारणी 8में सूचीबद्ध हैं। सारांश IV घटता एक 15 सप्ताह पुराने पुरुष wildtype C57Bl/6 माउस से अलग 10 एट्रियल मायोसाइट्स से औसत माप रहे हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

स्टॉक Tyrode के पीएच 6.9 स्टॉक Tyrode के पीएच 7.4
रासायनिक एम एम में एम एम में
Nacl 140 140
केसीएल 5.4 5.4
KH2पीओ4 १.२ १.२
HEPES 5 5
अंतिम मात्रा 500 एमएल 1 एल
NaOH के साथ अंतिम पीएच 6.9 7.4

तालिका 1: स्टॉक Tyrode पीएच 7.4 और शेयर Tyrode पीएच 6.9 समाधान. स्टॉक Tyrode के समाधान (पीएच 7.4 और पीएच 6.9) की संरचना है कि अग्रिम में बनाया जा सकता है और अप करने के लिए 2 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत.

रासायनिक एम एम में
के-ग्लूटामेट 100
के-एस्पार्टेट 10
केसीएल 25
KH2PO4 10
MgSO4 २
Taurine 20
Creatine 5
ईजीटीए 0.5
ग्लूकोज 20
HEPES 5
Bsa 0.10%
अंतिम मात्रा 1 एल
KOH के साथ अंतिम पीएच 7.2

तालिका 2: संशोधित KB समाधान। संशोधित KB समाधान के लिए नुस्खा है कि अग्रिम में बनाया जा सकता है, alicoated, और 2 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत.

रासायनिक राशि
ग्लूकोज 5.55 मी.
एमजीसीएल2 1 एम.एम.
CaCl2 1.8 एम.एम.
स्टॉक Tyrode के पीएच 7.4 50 एमएल
हेपरिन 250 $L

तालिका 3: ग्लूकोज, मैग्नीशियम, कैल्शियम, और हेपरिन के साथ संशोधित Tyrode के पीएच 7.4 समाधान। एट्रियल ऊतक विच्छेदन के लिए उपयोग किए जाने वाले संशोधित टायरोड के पीएच 7.4 समाधान की संरचना। इस समाधान को ताजा बनाया जाना चाहिए और उपयोग होने तक 35 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखा जाना चाहिए।

रासायनिक राशि
ग्लूकोज 18.5 एम.एम.
Taurine 49.96 मी.
Bsa 15 मिलीग्राम
CaCl2 0.066 एम.एम.
स्टॉक Tyrode के पीएच 6.9 15 एमएल

तालिका 4: संशोधित Tyrode पीएच 6.9 ग्लूकोज युक्त समाधान, taurine, बीएसए, और कम कैल्शियम. एट्रियल मायोसाइट अलगाव के लिए इस्तेमाल संशोधित Tyrod के पीएच 6.9 समाधान की संरचना। इस समाधान को ताजा बनाया जाना चाहिए और उपयोग होने तक 35 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखा जाना चाहिए।

रासायनिक राशि
कोलाजनेज़ 1,064 यू
इलैस्टेस 9 यू
प्रोटीज़ समाधान 65.2 जेडएल
संशोधित Tyrod के पीएच 6.9 5 एमएल

तालिका 5: एंजाइमी समाधान। एट्रियल ऊतक स्ट्रिप्स को एंजाइमी रूप से पचाने के लिए उपयोग किए जाने वाले एंजाइमी विलयन की संरचना। इस समाधान को ताजा बनाया जाना चाहिए और उपयोग होने तक 35 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखा जाना चाहिए।

पैरामीटर औसत
आरएमपी (एमवी) -74.2 $ 0.7
Vmax (वी/ 144.6 ] 5.8
ओएस (एमवी) 71.9 $ 3.0
APD50 (एमएस) 11.1 $ 1.7
APD70 (एमएस) 23.0 $ 4.6
APD90 (एमएस) 54.7 $ 7.8

तालिका 6: अलग-थलग एट्रियल मायोसाइट्स से एपी पैरामीटर का सारांश। डेटा एक 15 सप्ताह पुरुष wildtype C57Bl/6 माउस से अलग $ 10 एट्रियल मायोसाइट्स के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं।

पोटेशियम धाराओं और ए पीएस सोडियम धाराओं कैल्शियम धाराओं
रासायनिक एम एम में एम एम में एम एम में
Nacl 140 5
केसीएल 5.4
MgCl2 1 1 1
CaCl2 1 1 २
HEPES 10 10 10
ग्लूकोज 5.5 5.5 5.5
सीएससीएल 130
टीईए-सीएल 5.4 145.5
फोन 7.4 NaOH के साथ 7.4 CsOH के साथ 7.4 CsOH के साथ

तालिका 7: पैच-क्लैम्प प्रयोगों के दौरान इस्तेमाल किया Tyrode के समाधान की संरचना। Tyrod के समाधान की संरचना ए पीएस रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया, मैंना, मैंCa, L, और मैंअलग एट्रियल मायोसाइट्स से कश्मीर.

पोटेशियम धाराओं और ए पीएस सोडियम धाराओं कैल्शियम धाराओं
रासायनिक एम एम में एम एम में एम एम में
Nacl 5 5 5
केसीएल 140
MgCl2 1 1 1
CaCl2 0.2 0.2 0.2
HEPES 10 10 10
ईजीटीए 5 5
एमजी-एटीपी 4 5 4
ना-जीटीपी 0.3 0.3 0.3
ना-फॉस्फोक्रेटीन 6.6 6.6
सीएससीएल 130 135
BAPTA 5
फोन 7.2 KOH के साथ 7.2 CsOH के साथ 7.2 CsOH के साथ

तालिका 8: पैच-क्लैम्प प्रयोगों के दौरान इस्तेमाल किया आंतरिक पिपेट समाधान की संरचना। पिपेट भरने समाधान की संरचना ए पीएसरिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया, मैं ना, मैंCa, L, और मैं अलग एट्रियल मायोसाइट्स सेकश्मीर।

Discussion

हमारी प्रयोगशाला नियमित रूप से इस प्रोटोकॉल का उपयोग करता है पैच-क्लैम्प प्रयोगों में उपयोग के लिए माउस एट्रियल मायोसाइट्स को अलग करने के लिए हृदय रोग के विभिन्न रूपों के प्रभाव की जांच करने के लिए, आनुवंशिक उत्परिवर्तन, या एट्रियल मायोसाइट पर औषधीय यौगिकों वैद्युत शरीर विज्ञान। हालांकि अत्यधिक reproduible, अलग एट्रियल मायोसाइट्स से प्राप्त डेटा की गुणवत्ता अलगाव की गुणवत्ता पर निर्भर करता है. इसके अलावा, एट्रियल मायोसाइट अलगाव के बाद कैल्शियम को फिर से शुरू करने से कैल्शियम विरोधाभास16के कारण अलग-अलग मायोसाइट्स की आबादी के लिए कोशिका मृत्यु हो जाएगी। तदनुसार, इस दृष्टिकोण का उपयोग कर व्यवहार्य, उच्च गुणवत्ता वाले एट्रियल मायोसाइट्स को अलग-थलग करने के लिए पूरे अलगाव में कई बिंदुओं पर अभ्यास और अनुकूलन की आवश्यकता होती है। एक बार अनुकूलित, यह अनुमान है कि कुल atrial mycytes के 70-90% के बीच इस दृष्टिकोण का उपयोग कर अलग कैल्शियम सहिष्णु और रॉड के आकार का हो जाएगा. सबसे अधिक अभ्यास और अनुकूलन की आवश्यकता के चरणों के नीचे चर्चा कर रहे हैं.

विच्छेदन की गति और दक्षता अलग कोशिकाओं की गुणवत्ता पर बहाव प्रभाव पड़ेगा. यह सुनिश्चित करने के लिए समय लेने के लिए महत्वपूर्ण है कि सभी रक्त एट्रियल ऊतक से हटा दिया जाता है और ऊतक स्ट्रिप्स एक समान आकार में कटौती कर रहे हैं. यह लगभग 5 मिनट लेने के लिए एट्रियल उपांग को दूर करना चाहिए, स्ट्रिप्स में ऊतक में कटौती, और संशोधित Tyrode पीएच 6.9 समाधान की पहली ट्यूब में ऊतक स्ट्रिप्स हस्तांतरण. हालांकि, अगर यह कदम बहुत लंबा लगता है, ऊतक की गुणवत्ता समझौता किया जा सकता है.

यह भी महत्वपूर्ण है कि ऊतक स्ट्रिप्स एक अलगाव के भीतर और दिल के बीच एक समान आकार में कटौती कर रहे हैं. यदि ऊतक स्ट्रिप्स बहुत बड़े या बहुत छोटे हैं, या यदि वे एक अलगाव के भीतर वर्दी नहीं हैं, यह दोनों एंजाइमी पाचन और trituration के दौरान समस्याओं का कारण बन सकता है. इसका कारण यह है कि छोटे स्ट्रिप्स अधिक अच्छी तरह से पचा जाएगा और बड़ी स्ट्रिप्स पचा के तहत किया जाएगा. यह भी उतना ही जीनोटाइप और रोग सेटिंग पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है के रूप में अध्ययन किया जा रहा है एट्रियल उपांग के आकार जानवरों के बीच भिन्न हो सकते हैं. उदाहरण के लिए, hypertrophic दिल स्वस्थ दिल की तुलना में बड़ा एट्रियल उपांग है, और इसलिए प्रयोगकर्ता सामान्य आकार दिल की तुलना में hypertrophic दिल में अधिक स्ट्रिप्स कटौती कर सकते हैं. तदनुसार, कटौती ऊतक स्ट्रिप्स के आकार का अनुकूलन और प्रत्येक व्यक्ति atrial उपांग के लिए इन आयामों को लागू करने बहुत प्रयोगात्मक स्थितियों के बीच मायोसाइट अलगाव के reproducibility में सुधार होगा.

एंजाइमी पाचन और यांत्रिक वियोजन के बीच नाजुक संतुलन इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर एक सफल एट्रियल मायोसाइट अलगाव के लिए महत्वपूर्ण है। यदि ऊतक एंजाइमी पाचन के दौरान पर्याप्त रूप से घूमता नहीं है, तो व्यक्तिगत ऊतक स्ट्रिप्स झुरमुट करते हैं और एक साथ चिपके रहते हैं, जो एंजाइमी पाचन की प्रभावशीलता को सीमित करेगा। यदि बहुत बार या जोरदार ढंग से उत्तेजित किया जाता है, तो यह एट्रियल ऊतक को नुकसान पहुंचा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप अव्यवहार्य कोशिकाओं का अलगाव होगा। अनुत्यकेश के दौरान ऊतक स्ट्रिप्स से अलग एट्रियल मायोसाइट्स का यांत्रिक वियोजन एट्रियल मायोसाइट्स को अलग करने के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग करने का अभ्यास और अनुकूलन करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम है। यदि trituration बहुत कोमल है, सेल उपज कम हो जाएगा. दूसरी ओर, यदि trituration भी कठोर है, तो गैर-व्यवहार्य मायोसाइट्स की एक बहुतायत अलग हो जाएगा, और पैच-क्लैम्प प्रयोगों के दौरान प्राप्त डेटा की गुणवत्ता ख़तरे में डाल दिया जाएगा। इसके अलावा, atria की संरचना अलगाव को प्रभावित कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, यदि ऊतक फाइब्रोटिक है, एंजाइमी पाचन और trituration कदम संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है. इसलिए यह पैच-क्लैम्प प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि trituration के दौरान उच्च गुणवत्ता कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए आवश्यक कौशल विकसित करने के लिए समय लेने के लिए महत्वपूर्ण है.

सभी प्रयोगात्मक तकनीकों के साथ के रूप में वहाँ सीमाएं हैं. इस तकनीक के क्रम में अभ्यास की आवश्यकता है reproducibly को अलग व्यवहार्य, उच्च गुणवत्ता myocytes, जो बारी में किसी भी प्रयोगों की व्यवहार्यता को प्रभावित करेगा इन myocytes का उपयोग कर प्रदर्शन किया जाएगा. यह दृष्टिकोण भी टर्मिनल है और इस दृष्टिकोण का उपयोग कर अलग atrial mycytes अलगाव के दिन ही इस्तेमाल किया जा सकता है. हमारे प्रयोगशाला अलगाव के 6-7 एच के भीतर कोशिकाओं का उपयोग करता है.

एट्रियल कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करने के इस दृष्टिकोण में कई आवेदन हैं। उदाहरण के लिए, इस दृष्टिकोण मानव एट्रियल ऊतक बायोप्सी सहित अन्य प्रजातियों से एट्रियल मायोसाइट्स (साथ ही कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट्स) को अलग करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। इसके अलावा, एट्रियल मायोसाइट अलगाव के लिए इस खंड विधि का उपयोग करने के लिए एक लाभ (दिल के प्रतिगामी भ्रम के विपरीत) यह है कि इसे दिल के अन्य क्षेत्रों से कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करने के लिए संशोधित किया जा सकता है, जैसे कि साइनोएट्रियल नोड या अन्य विशिष्ट क्षेत्र एट्रियल मायोकार्डियम की, या दिल के पूरे सुप्रावेंट्रिकुलर क्षेत्र को घेरते हैं। हमारी प्रयोगशाला कार्रवाई क्षमता और आयनिक धाराओं को मापने के लिए पैच-क्लैम्प प्रयोगों के लिए एट्रियल कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग करता है, हालांकि इस दृष्टिकोण को इस तकनीक तक सीमित नहीं होना चाहिए। उदाहरण के लिए, अलग मायोसाइट्स का उपयोग विभिन्न प्रयोगात्मक सेटिंग्स में कैल्शियम यात्रियों और संकुचन में परिवर्तन की जांच करने के लिए किया जा सकता है। एट्रियल कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग प्रोटीन या रुचि की संरचनाओं के स्थान का अध्ययन करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस अध्ययन में भी किया जा सकता है। तदनुसार, इस दृष्टिकोण अत्यधिक कई संभव अनुप्रयोगों के साथ बहुमुखी है.

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थानों (एमओपी 93718, 142486) और आर.ए. गुलाब के लिए कनाडा के हार्ट एंड स्ट्रोक फाउंडेशन से अनुदान के संचालन द्वारा समर्थित है.  एच.जे. जेन्सेन एक किलम पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप के प्राप्तकर्ता हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1, 2-Bis(2-Aminophenoxy)ethane-N, N, N', N'-tetraacetic acid 98% Sigma A4926-1G
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra, > 99%, from microbial Sigma A7699-1G
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt > 95%, bacterial Sigma A9187-1G
Amphocetericin B from Streptomyces sp. ~80% (HPLC), powder Sigma A4888-500 MG
Bovine serum albumin Sigma A3059-50G
Calcium chloride dihydrate Sigma 223506-500G
Cesium chloride ReagentPlus, 99.9% Sigma 289329-100G
Cesium hydroxide monohydrate > 99.5% trace metals basis Sigma 562505-1KG
Collagenase Type 2 Worthington Biochemical Corporation LS004176
Creatine anhydrous Sigma C0780
D-(+)-Glucose Sigma G7021-1KG
DL-Aspartic acid potassium salt Sigma A2025-100G
Elastase suspension Worthington Biochemical Corporation LS002279
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid >97.0% Sigma E4378-25G
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate > 95% (HPLC), powder Sigma G8877-250MG
Heparin 10 000 USP U/10 mL SANDOZ 10750
HEPES > 99.5% (titration) Sigma H3375-500G
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate > 99% (HPLC), powder Sigma G1501-500G
Magnesium sulfate Sigma M2643-500G
Nifedipine > 98% (HPLC), powder Sigma N7634-1G
Phosphocreatine disodium salt hydrate enzymatic, approx 98% Sigma P7936-5G
Potassium chloride ACS reagent, 99.0-100.5% Sigma P3911-500G
Potassium hydroxide EM Science PX1480-1
Potassium phosphate monobasic EMD PX1565-1
Protease from Streptomyces griseus, type XIV, >3.5 units/mg solid, powder Sigma P5147-1G
Sodium chloride ACS reagent, > 99.0% Sigma S9888-2.5KG
Sodium hydroxide, pellets, 97+%, A.C.S. reagent Sigma 221465-500G
Sylgard 184 silicone elastomer kit World Precision Instruments Inc SYLG184
Taurine Sigma T0625-100G
Tetraethylammonium chloride > 98% (titration) Sigma T2265-100G

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References

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