Summary
אנו מתארים שיטה עבור שימוש בזרימה רב פרמטרים cy, לנסות לזהות מיני מיטוכונדריאלי מינים חמצן (ROS) ב מורטין גזע בריא המטבית ובתאי מחולל (HSPCs) ותאי לוקמיה ממודל העכבר של לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) מונע על ידי MLL-AF9.
Abstract
אנו מציגים את הגישה cytometric הזרימה עבור ניתוח מיטוכונדריאלי של רוס החיים שונים מח עצם (BM)-גזע נגזר ואוכלוסיות תאים מחולל שונות עכברים בריאים, כמו גם עכברים עם AML מונע על ידי MLL-AF9. באופן ספציפי, אנו מתארים תהליך מכתים של שני שלבים, לפיו תאים בריאים או לוקמיה מוכתמים הראשון עם צבע פלואורוגנטי המזהה על-ידי מיטוכונדריאלי, ואחריו כתמים עם נוגדנים monoochrome מקושרים המקושרים המשמשים כדי להבחין בין אוכלוסיות שונות בריאות וממאירות של המטפאות. כמו כן, אנו מספקים אסטרטגיה לרכישת וניתוח הדגימות על-ידי הזרמת cy, try. הפרוטוקול כולו יכול להתבצע בתוך פרק זמן קצר כמו 3-4 h. אנו גם להדגיש את המשתנים מפתח לשקול, כמו גם את היתרונות ואת המגבלות של ניטור הייצור של ROS בתוך תא מיטוכונדריאלי של לחיות המטפאות לוקמיה גזע ומתת באמצעות צבעים fluorogenic על ידי הזרמת cy, . יתר על כן, אנו מציגים נתונים כי השפע מיטוכונדריאלי משתנה בין אוכלוסיות משנה בריאה HSPC בריא ו לוקמיה ושלתי ולדון ביישומים האפשריים של טכניקה זו במחקר המטקולוגי.
Introduction
מינים חמצן תגובתי (ROS) הם מולקולות תגובתי מאוד הנגזרות חמצן מולקולרי. המיקום הסלולארי המוגדר ביותר של הייצור של ROS הוא המיטוגיה, שם אלקטרונים העוברים דרך שרשרת התחבורה אלקטרון (וכו ') במהלך זירחון חמצוני (OXPHOS) נספגים על ידי חמצן מולקולרי המוביל היווצרות של מסוים סוג של רוס שנקרא סופרתחמוצות1. באמצעות הפעולות של סדרה של אנזימים, שנקרא סופראוקסיד dismutases או sods, סופראוקסיד מומרים לתוך מימן, אשר מנוטרלים לאחר מכן לתוך מים על ידי אנזימים כגון קטלאז או peroxidases גלוטתיון (gpx). רטבאליות במנגנונים ROS-רגולטוריות יכול להוביל לייצור עודף של ROS, המכונה לעתים קרובות לחץ חמצוני, אשר יש תוצאות מזיקות וקטלניות פוטנציאל הסלולר כגון נזק מקרומולקולה (כלומר, DNA, חלבון, שומנים). יתר על כן, לחץ חמצוני קשורה מספר פתווגיות, כגון סוכרת, מחלות דלקתיות, הזדקנות וגידולים2,3,4. כדי לשמור על הומאוסטזיס מחדש ולמנוע לחץ חמצוני, התאים בעלי מגוון של מנגנונים ROS-ויסות5.
רמות פיסיולוגיים של ROS מסוימים נחוצים עבור המטפיאה המתאימה ומבוגרים6. עם זאת, העודפים ROS קשורה עם נזק DNA, בידול הסלולר ותשישות של גזע המטפאות ובריכת מחולל קדמון. יש גם ראיות כי שינויים בביולוגיה החמצון עשוי להיות שונה בין לוקמיה ותאים בריאים. לדוגמה, רמות ROS נוטים להיות גבוהים יותר בלוקמיה של לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) ביחס לעמיתיהם הבריאים שלהם ומחקרים אחרים הציעו כי תאי גזע לוקמיה לשמור על רמה נמוכה יציבה המדינה של רוס להישרדות7,8. חשוב מכך, אסטרטגיות לקבלת הבדלי מחלות מבחינה רפואית בהבדלים הללו הראו הבטחה במספר הגדרות סרטןהאדם 9,10. לכן, בחני אומר כי לאפשר הערכה של רמות ROS בדגמי העכבר עשוי לשפר את ההבנה שלנו איך מינים אלה תורמים לפיזיולוגיה הסלולר מחלות פתוגנזה, כמו גם פוטנציאל לספק פלטפורמה להערכת האפקטיביות של הרומן נגד חמצון-מיקוד טיפולים נגד סרטן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים בעלי החיים המתוארים בפרוטוקול זה אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) במרכז הסרטן של פוקס צ'ייס.
הערה: תהליך העבודה של הפרוטוקול מחולק ל -4 חלקים כפי שמוצג באיור 1 והריאגנטים הנדרש מפורטים בטבלת החומרים.
1. מח עצם (BM) בידוד
הערה: MLL-AF9 עכברים לוקמיה נוצרו כמתואר בעבר11.
- שחזור מונו-גרעיני מח עצם בתאי, כפי שמתואר בעבר12,13,14,15, מסוג פראי C57. Bl6 עכברים (אשר לבטא את התקליטור 45.2 congenic) כמו גם מ C57. עכברים Bl6-SJL (אשר מבטאים את סמן CD 45.1 congenic) כי כבר מושתלים עם MLL-AF9-ביטוי תאים לוקמיה (CD 45.2+).
הערה: BM ניתן לשחזר מעכברים או על ידי ריסוק12,13 או על ידישטיפה עצמות 14,15. עבור הניסויים המוצגים כאן, BM התאושש משני עכברים בריאים ולוקמיה דרך השטיפה.
2. מיטוכונדריאלי רוס Fluorogenic צביעת כתמים
- ברגע מונו-גרעיני מוח העצם התאים התגלו מעכברים בריאים ו/או לוקמיה, כתם סדרת מחלקים של תאים עם טריקון כחול ולספור באמצעות הומוציטוטומטר כדי לקבוע את המספר ההתחלתי של התאים BM סך.
- צנטריפוגה את התאים ב 300 x g עבור 5 דקות. ומריף את הסופרנטאנט ולהשעות את הגלולה ב-F-PBS (PBS בתוספת 2% סרום העוברי העובר ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין קוקטייל) לריכוז של 2 x 106 תאים/mL.
- Aliquot 200 μL של השעיית תא לצינור לתוך 9 בודד צינורות בקרת צבע המסומנים כדלקמן:
אין כתם, B220-Cy5-PE, cKit-Cy7-APC, Sca1-PacBlue, CD150-APC (עבור HSPCs בריא בלבד), תקליטור 45.2-APC (עבור תאים לוקמיה בלבד), CD34-FITC, לצבוע מיטוכונדריאלי ולחיות/תא המתים כתם.
הערה: אופציונלי שליטה חיובית אינדוקציה ROS מיטוכונדריאלי יכול להיות מוכן על ידי טיפול 2 x 105 תאים ב 200 μl עם 20 Μm של נתרן ביסולפיט (msb) עבור 1 h ב 37 ° צ' ב 5% CO2 חממה. פקד שני כדי להפוך את האינדוקציה MSB-בתיווך של מיטוכונדריאלי יכול להיות מוכן על ידי בטיפול 2 x 105 תאים ב 200 μl עם 20 ΜM של msb פלוס 100 Μm N-מרחקסיל-L-cysteine (nac) עבור 1 h ב 37 ° c ב 5% שיתוף2 אינקובטור. - מחבר את התאים הנותרים בצינור (צינור ניסיוני) ו צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות.
- השהה מחדש את התאים ב-F-PBS עם כתם חי/מת בהתאם להוראות היצרן. מודקון על הקרח 30 דקות. הקפד להוסיף כתם חי/מת לצינור הבקרה בצבע יחיד.
- הוסף 1.0 mL של טמפרטורת החדר (RT) F-PBS לצינורות בצבע יחיד וניסיוני מוכתם עם צבע חי/מת. צנטריפוגה 5 דקות ב 300 x g ב RT.
- השהה מחדש 50 μg של הצבע המודריאלי של רוס ב -13 μL של diמתיל סולפוקסיד (DMSO) כדי לקבל פתרון מניות של 5 מ"מ.
- לדלל את הצבע מיטוכונדריאלי לריכוז הסופי של 5 μM ב RT F-PBS עם או בלי Verapamil (50 μM).
- מוריד את הכתמים. מכתם התא החי/מת הוסף 200 μL של כתם מיטוכונדריאלי של צבע רוס המכיל Verapamil לכל שפופרת ניסיוני, כמו גם את הצינור מיטוכונדריאלי צבע יחיד בקרת שליטה.
- מערבולת לערבב ו הדגירה עבור 10 דקות ב 37 ° c בחושך.
- הוסף 1.0 מ ל של RT F-PBS כדי מיטוכונדריאלי רוס המוכתמת שליטה בצבע יחיד ושפופרות ניסיוני. צנטריפוגה 5 דקות ב 300 x g ב RT.
- ושטוף את התאים עם 1.0 מ ל של RT F-PBS. צנטריפוגה 5 דקות ב 300 x g ב RT.
3. נוגדן השושלת כתמים
- הכינו את משקאות הנוגדן המפורטים בטבלה 1.
הערה: אלה קוקטיילים נוגדנים כבר אופטימיזציה בעבר14,15,16. - מטפי את supernatant מן האחרון מיטוכונדריאלי לשטוף לצבוע של צינורות ניסיוני המכיל BM בריא ולהוסיף 200 μL של קוקטייל הנוגדן #1 לכל צינור. . מערבולת לערבב גם להכין את צינורות בקרת צבע אחד. דגירה של 60 דקות על קרח בחושך.
- מטפי את supernatant משטיפת מיטוכונדריאלי הסופי של הצינורות הניסיוניים המכילים לוקמיה BM ולהוסיף 200 μL של קוקטייל הנוגדן #2 לכל צינור. . מערבולת לערבב דגירה של 60 דקות על קרח בחושך.
- לשטוף עם 1.0 mL של קר F-PBS ו צנטריפוגה 5 דקות ב 300 x g ב RT.
- להשעות את התאים ב500 μl של קר F-PBS ולסנן את התאים בצינור cytometer זרימה באמצעות מסנן 40 יקרומטר כדי לכלול את האגרגטים.
4. הזרמת הרכש והניתוח
הערה: מספר מערכות המשנה של גזע ומין המטפאות הן נדירות, כגון תאי גזע המטפאות לטווח ארוך. כך, באופן אידיאלי 3-5 מיליון אירועים יש לאסוף עבור כל צינור ניסיוני במהלך הרכישה cy, לנסות ניתוח מספיק של רוס מיטוכונדריאלי בקבוצות משנה HSPC שונים.
- השתמש בצינור הבקרה ללא כתם כדי להגדיר את מחלקות הפיזור הפורוורד (FSC-A) והצד (האס-אס), המבוססות על הגודל והמורכבות של אוכלוסיית התאים שנותחה.
- השתמש בצינורות בקרת הכתמים והצבע היחיד כדי לפצות על הזרימה של cytometer.
- שער החוצה שרידים זרים מתוך החלקה קדימה ופיזור בצד (איור 2A, B, הפאנל הראשון משמאל).
- השער החוצה כפולה באמצעות מבדיל כפול כגון מבדיל קדימה (איור 2א, ב, הפאנל השני משמאל).
- בצע את אסטרטגיית השידור המוצעת באיור 2A,B כדי לבחור תאים חיים, השושלת הנמוכה תאים וערכות המשנה hspc ולוקמיה שונים.
- עבור כל אוכלוסיית עניין, לנתח את עוצמת הקרינה החציוני (MFI) של ערוץ TRPE (x-ציר) בעלילה היסטוגרמה כדי להעריך את ההבדלים באות רוס מיטוכונדריאלי (איור 3a-C, שמאל חלוניות). רמות של מיטוכונדריאני יכול להיות מוערך ברמה תא יחיד על ידי השוואת כתמים ROS מיטוכונדריאלי לעומת סמנים ספציפיים השושלת בעלילה פיזור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הציג הוא שיטה לניתוח ROS ב המיטו, בריאות מרובות ו-MLL-AF9-ביטוי של אוכלוסיות לוקמיה. איור 1 מציג תצוגה סכמטית של זרימת העבודה של הפרוטוקול, המורכבת מ-4 שלבים עיקריים: 1) בידוד מעכברים; 2) צביעת תאי מוניטור עם צבע פלואורוגנטי המזהה ROS מיטוכונדריאלי, במיוחד סופרתחמוצות; 3) לסמן את הנוגדן כתמים כדי להתוות אוכלוסיות שונות בריאות ולוקמיה המטפאות; ו -4) הזרימה הציקיפית לרכישת וניתוח.
איור 2 A, B מתאר את התוכנית הנציגה לעבור ניתוח של גזע המטפאות שונים ואוכלוסיות מחולל שונות ב-BM בריא ולוקמיה. העלילה FSC/הג מוחל כדי לחסל את הפסולת ואת FSC-אזור (FSC-A) לעומת FSC-גובה (FSC-H) העלילה משמש כדי להוציא doublets ואגרגטים. פאנל של שושלת היוחסין סמנים (טבלה 1 ו-step 3.1) משולבים כדי לכלול מגוון רחב של אוכלוסיות המטפאות בוגרות כגון לימפוציטים, אריתרופוציטים, גרנולוציטים ו מונוציטים/מקרופאגים (כלומר, השושלת נמוך או ליןנמוך). הקוקטייל שושלת היוחסין כולל גם נוגדן CD48 ולכן כל קבוצות המשנה של תאים נמוכים השושלת הם גם CD48-. ביטוי משטח התא של סקה 1 ו-c-Kit משמש להבחנה בין תערובת הטרוגנית של HSPCs הנקראת CD48- lsks (ליןנמוך, סקה -1+, c-Kit+, CD48-) מ מיאלואיד ושלתי (ליןנמוך, סקה-1- , c-Kit+, CD48-). כדי להבחין עוד יותר קבוצות מערכות מסוימות של hspc, סמן טריקה, CD150 כמו גם CD34 גם הוסיף17,18,19,20,21. איור 2 ב גם מתארת את התוכנית הייצוגית לאחר הושלתי ckit ביטוי גבוה לוקמיה (ליןנמוך, c-Kitגבוה; סקה -1-), אשר מועשר בתאי לוקמיה היוזמים (מומים)11 , כמו גם תאי לוקמיה המבטא בינוני נמוך ביטוי של Ckit (ckitInt-low).
השוואה של כתמים ROS מיטוכונדריאלי בין בריא CD48- lsk ו מיאלואידית ושלתי מראה כי ושלתי מיאלואיד להציג רמות גבוהות יותר באופן משמעותי של הצביעת ROS מיטוכונדריאלי (איור 3א). יתר על כן, cKitגבוהה לוקמיה ושלתי להציג רמות גבוהות באופן משמעותי של כתמים ROS מיטוכונדריאלי לעומת CD48- lsk, מיאלואידית ושלתי או ckit בתאי לוקמיהנמוכה (איור 3א). cKitInt-נמוכה תאים לוקמיה הציג גם מיטוכונדריאלי גבוה באופן משמעותי לעומת CD48- lsk תאים אבל לא מיאלואידית ושלתי (איור 3A). LSKs עוד sub-מחולק על ידי CD150 ביטוי הראה כי כתמים ROS מיטוכונדריאלי לא שונה באופן משמעותי בתאי CD48- lsk מחולקת על-ידי CD150 גבוה (CD150גבוהה), ביניים (CD150INT) או לא (CD150שלילי) ביטוי (איור 3ב). עם זאת, המדינה יציב מיטוכונדריאלי כתמי כתמים שלגבוה ckit או CkitInt- תאים לוקמיה נמוכה נמצא להיות גבוה באופן משמעותי מאשר CD48-Lsks-CD150גבוהה,-CD150Int or-CD150 תאיםשלילי ( איור 3ב). תאי lsk המבטא נמוך ללא רמות של CD34 מועשר לתאי גזע מחדש לטווח ארוך, במיוחד CD48-lsk תאים שהם CD34- ו CD150גבוה20,21. עם זאת, חלוקת תאים CD48- lsk על-ידי CD150 ו CD34 ביטוי לא חשף הבדלים משמעותיים בצביעת רוס מיטוכונדריאלי בקרב אלה שש קבוצות משנה Hspc (איור 3ג).
איור 1 : ייצוג סכמטי של זרימת העבודה בפרוטוקול. שלב 1) מוניטור בידוד מתוך בריא, MLL-AF9 לוקמיה עכברים; שלב 2) מכתים תאי באמצעות מיטוכונדריאלי (רוס); שלב 3) מכתים תאי עם נוגדנים monoochrome מקושרים להפלות גזע ובתאי קדמון (HSPCs) האוכלוסייה של עכברים בריאים לוקמיה; שלב 4) זרימה Cyלנסות לרכוש וניתוח של רוס מיטוכונדריאלי במספר אוכלוסיות HSPC. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : הזרימה cy, לנסות אסטרטגיות עבור בריא ו-MLL-AF9-המבטא תאים מח עצם. (A) התאים BM מבודדים עכברים בריאים היו מוכתמים בצבע חי/מת (qdot), מיטוכונדריאלי צבע ROS (trpe). BM מעכברים בריאים היה מוכתם לאחר מכן עם נוגדנים זיהוי סמנים השושלת בתוספת CD48 (Cy5-PE), c-Kit (Cy7-APC), Sca1 (PacBlue), CD34 (FITC), CD150 (APC). (ב) בנוסף תא חי/מת וכתמי ROS מיטוכונדריאלי, BM מפני עכברים לוקמיה היו גם מוכתמים בנוגדנים הכרה סמנים השושלת בתוספת CD48 (CY5-PE), c-Kit (CY7-APC), Sca1 (pacblue) ו-cd 45.2 (apc), אשר מוחל להפלות בין תאים MLL-AF9 לוקמיה מתאים בריאים BM (CD 45.1). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : רמות מיטוכונדריאלי של רוס בריא ו-MLL-AF9 מח עצם. לוחות שמאל מייצגים היסטגרמות של רמות מיטוכונדריאלי של האוכלוסיות המצוין ואת לוחות זכות בהתאמה לייצג תרשים גרף המייצג של MFI של רוס מיטוכונדריאלי עבור אוכלוסיות שצוינו (n = 4). (א) השוואה של רמות מיטוכונדריאלי של רוס בריא CD48- lsk, מיאלואידית ושלתי, כמו גם Mll-AF9 Linנמוך c-KITגבוה ו mll-AF9 Linנמוכה c-kit תאים-נמוך . (ב) השוואה של רמות מיטוכונדריאלי של רוס CD48- lsk בריא בהתבסס על הביטוי CD150 שלהם לעומת Mll-AF9 Linנמוכה c-KITגבוה ו Mll-AF9 Linנמוכה c-kitInt-נמוך תאים. (ג) השוואה של רמות מיטוכונדריאלי של ROS בריאים CD48- lsk תאים המבוססים על CD150 והביטוי CD34 שלהם. (* p ≤ 0.05; * * p < 0.01 * * * p < 0.001; * * * * p < 0.0001). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4 : שינויים ברמות מיטוכונדריאלי של רוס באמצעות pro-ו נגד חמצון תרכובות. היסטגרמות של רמות מיטוכונדריאלי של ROS בריאים ו-MLL-AF9-ביטוי תאים מוגברים שטופלו 20 μM של מנאדיאחד נתרן ביסולפיט (MSB) עבור 1 h ב 37 ° צ' ב 5% CO2 חממה (בקרה חיובית) או עם 20 μm של msb בשילוב עם 100 μm N-מרחריל-L-cysteine (NAC) עבור 1 h ב 37 ° c בחממה 5% CO2 . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5 : אופטימיזציה של רוס מיטוכונדריאלי ושושלת היוחסין-זיהוי כתמי נוגדנים. (א) השוואה של מיטוכונדריאלי (mros) רמות ב-mros-AF9 המבטא תאים לוקמיה באמצעות 1 או 5 μm עבור 10 או 30 דקות. (אדום = הרכב; כחול = MSB 20 μM; ירוק = NAC 100 μM; כתום = Msb 20 μM + NAC 100 μM). (ב) השוואה של MFI של CD34 ערוץ (fitc) ב lsks בריא ויטראז עבור 20, 60 או 90 דקות עם #1 הנוגדן קוקטייל (n = 4, * p ≤ 0.05; * * p < 0.01). (ג) השוואת נוגדנים לפני או אחרי דגירה של 30 דקות ב 37 ° c בחממה 5% CO2 . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6 : סדר של רוס מיטוכונדריאלי ואת השושלת סימן כתמים מרקר. (א) מגרשים של האוכלוסיות המסומנות ב-HSPCs המתקבלות באמצעות הזמנות שונות של כתמים. (ב) מיטוכונדריאלי רמות מוערך בתאים lsk ו מיאלואיד ושלתי שהתקבלו בשימוש בסדר שונה של כתמים (אדום = נוגדן כתמים עבור 1 h ב 4 ° c ואחריו כתמים ROS מיטוכונדריאלי עבור 10 דקות ב 37 ° c; כחול = מיטוכונדריאלי כתמים רוס עבור 10 דקות ב 37 ° c ואחריו כתמים נוגדן 1h ב 4 ° c. (ג) קוונפיקציה של MFI של ארוס מיטוכונדריאלי (mfi) מכתים באמצעות הזמנות שונות של כתמים באוכלוסיות המצוין (n = 4, * p ≤ 0.05). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7 : ההשפעה של הטיפול verapamil על כתמים מיטוכונדריאלי לצבוע ב בריא ו-MLL-AF9-ביטוי תאים מוניטור. (א) מגרשים של אוכלוסיית hspc המצוין בדגימות שטופלו עם או בלי 50 Μm Verapamil עבור 10 דקות ב 37 ° c בחממה 5% CO2 . (ב) היסטורגרמות מיטוכונדריאלי וצבען ירוק מיטומיה באוכלוסיות hspc שצוינו בנוכחות (כחול) או העדר (אדום) של 50 Μm Verapamil. (C-E) קוונפיקציה של רמות של מיטוכונדריאלי בריא המצוין (C & D) ו לוקמיה (E) אוכלוסיות תאים בדגימות BM מטופלים עם או בלי 50 μM Verapamil במהלך הצביעת ROS מיטוכונדריאלי (n = 4, * p ≤ 0.05). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
שולחן 1: קוקטיילים נוגדן. רשימה של קוקטיילים נוגדנים מוכן בשלב 3.1. כדי לזהות תת המטפאות שונות של אוכלוסיות בתוך מח עצם בריא ולוקמיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
צבעים fluorogenic כי פותחו לאיתור של ROS מוערכים לעתים קרובות בתאים קבועים על ידי מיקרוסקופ או בתאים חיים על ידי הזרימה cy, try22. הערכת הערכה לזרימה של רוס מיטוכונדריאלי בתאי BM באמצעות צבעי fluorogenic מיטוכונדריאלי יש שני יתרונות עיקריים: 1) זוהי טכניקה מהירה ופשוטה המתאימה לניתוח תאים חיים 2) זה מאפשר להבחין וניתוח נדיר אוכלוסיות ברמת התא היחיד ב-BM באמצעות כתמים של סמן פני השטח. הפרוטוקול צעד אחר צעד הציג כאן פותחה כדי ללמוד את הסטטוס vivo חמצון-חיזור לשעבר של גזע המטבית ואוכלוסיות מחולל משני העכברים בריאים, כמו גם מודל העכבר של AML מונע על ידי mll-AF9 באמצעות הזרימה cy, try. קיימים מספר משתנים טכניים מרכזיים שעליהם להיחשב במהלך ביצוע פרוטוקול זה.
ראשון, השימוש pro-ונגד חמצון בקרות מאפשר למשתמש להקים בסיס עבור עליות מיטוכונדריאלי האלה מוסיף, כמו גם את הספציפיות של הכתם. עבור הפרוטוקול המוצג כאן, הפרו-חמצון MSB היה מנוצל כפקד חיובי לזיהוי אינדוקציה של מיטוכונדרילי רוס כתמים בריאים ולוקמיה בתאי BM (איור 4). האנטי חמצון NAC יכול לשמש כפקד נוסף, כפי שהוא מבטל במידה רבה את הצביעת ROS מיטוכונדריאלי הנגרמת על ידי MSB (איור 4).
שנית, לצבוע מיטוכונדריאני fluorogenic המועסקים במחקר זה מומלץ לשמש בריכוז של 5 μM עבור 10 דקות. עם זאת, היצרן גם מציע כי הריכוז והזמן של הצביעת עשויים להשתנות בין סוגי תאים. במחקר זה, כתמים ROS מיטוכונדריאלי הושווה בשניהם 1 μM ו 5 μM עבור 10 או 30 דקות. הניתוח חשף כי ריכוז של 5 μM עבור 10 כדי 30 דקות מספיק כדי לזהות שינויים MSB בתיווך ב-ROS מיטוכונדריאלי, כמו גם אלה הפוכים על ידי טיפול NAC (איור 5a). מאז לא היה הבדל כמותי בין 10 ו 30 דקות, זמן מכתים של 10 דקות נבחר עבור מחקר זה כדי למזער את אורך השיטת.
שלישית, CD34 נוגדנים הדגירה הזמן להשתנות בתוך הספרות מ 20 עד 90 מינימום23,24. כדי לייעל את הפרוטוקול המוצג כאן, תאים מח עצם murine היו מודבטים עם #1 הנוגדן הנוגדנים (שלב 3.1) עבור 20, 60 או 90 דקות. כפי שמוצג באיור 5b, חזקה באופן משמעותי CD34 כתמים נצפתה על תאים ויטראז עבור 60 או 90 min לעומת הכתם 20 דקות. עם זאת, הבדל משמעותי ב CD34 כתמים לא נצפתה בין הדגירה הנוגדן פעמים של 60 ו 90 דקות (איור 5b) ולכן הכתם מינימום 60 הנוגדן מומלץ עבור הפרוטוקול המוצג.
הרביעי, בפרוטוקול המוצג, תאים בריאים ולוקמיה הם הוכתם הראשון עם הצבע המודריאלי fluorogenic של רוס, שטף ולאחר מכן מוכתם עם נוגדנים fluorochrome מקושרים השושלת. למרות הערכה ישירה של שילוב הכתם ROS מיטוכונדריאלי עם נוגדנים השושלת לא נערך במחקר זה, הערכה של כתמים fluorochrome מקושר השושלת כתמי היה הרוס תחת מיטוכונדריאלי כתמי התנאים עבור 10, 20 ו 30 דקות ב 37 ° c. ניתוח זה חשף כי 30 דקות של דגירה ב 37 ° c באופן משמעותי משנה את פני השושלת כתמים סמן (איור 5c). בנוסף, כתמים ROS מיטוכונדריאלי הוערך על ידי הראשון, כתמים תאים BM בריאים עם שושלת היוחסין fluorochrome מקושרים ואחריו על ידי צביעת עם לצבוע מיטוכונדריאני של רוס fluorגנטית, כמו גם להיפך סדר הפעולות. צביעת תאים הראשון עם נוגדנים השושלת ואחריו כתמים ROS מיטוכונדריאלי הביא אותות מיטוכונדריאלי נמוך יותר לעומת הפרוטוקול להיפך כתמים (איור 6A, ב)-כולל הבדלים משמעותיים עבור CD48- LSK CD150גבוהה, CD48- lsk CD150Int CD34 ואוכלוסיות מיאלואידים (איור 6c).
החמישית, מחקרים שנעשו לאחרונה מראים כי שונה בריאות murine בריאים אוכלוסיות בעלי יכולות שונות כדי למחוק מספר בדים מיטוכונדריסטי מכתים כגון אלה המשמשים להערכת מסה מיטוכונדריאלי (להלן מכונה ירוק mitoMASS) או . פוטנציאל25,26 לכן, ההשפעה של המשאבה מעכב משאבת verapamil על כתמים של בריא ולוקמיה ושלתי עם הצבע מיטוכונדריאני של רוס fluorogenic העריכו גם. כתמים בו של HSPCs עם ROS מיטוכונדריאלי לא לשנות את סימן השושלת מכתים כתמים (איור 7a), עם זאת, verapamil עשה באופן משמעותי מאוד לשפר את האותות הללו ROS כתמים במגוון של בריא ולוקמיה אוכלוסיותמחולל קדמון (איור 7B, ג). בעיקר, את הסדר הגודל של המוודות מיטוכונדריאלי השתפר על ידי verapamil לא היה גדול כמו זה ראה עם צבען fluoromass ירוק מיטוגנטי (איור 7b).
שישית, בפרוטוקול המוצג כאן, התאים BM התאושש על ידי הסרת קצות העצם (אפיזיס) ואחריו שטיפה של העצמות. עם זאת, האפיזיס מכיל תאים המטבטיים שעלולים לאבד על ידי הריקון העצם. כחלופה, ניתן לחלץ תאי מוניטור באמצעות מרגמות ומלט באמצעות מרגמה ומכתש כמתואר לעיל12,13.
הפרוטוקול המוצג כאן מספק בסיס לשימוש בצבעי פלואורוגנטיים כדי למדוד ביולוגיה מחדש תאיים בתאים חיים שחולצו מאורגניזמים חיים. עם זאת, חשוב לציין כי אין להניח צבע fluorogenic יחיד להיות ספציפי לגמרי ולכן מחקרים נוספים עם שיטות חלופיות יש להתנהל כדי לאמת כל ממצאים. יתר על כן, התוצאות של מחקר זה מראים כי אוכלוסיות תאים לוקמיה מועשר עבור מומים (כלומר, ליןנמוך ckitגבוהה) להציג רמות גבוהות יותר של ROS מיטוכונדריאלי בריא ושלתי OID או אוכלוסיות hspc אחרים. עם זאת, ליןנמוך ckit האוכלוסייההגבוהה לוקמיה מוערך כאן הוכח להיות הטרוגנית והוא יכול להיות נוסף מחולק על ידי סמנים אחריםהשושלת 11,27. יתרה מזאת, מחקרים שנעשו לאחרונה מראים כי הבדלים בעלי פנוטיפ ברורים מטבולית28. לכן, מחקרים עתידיים הערכת ROS מיטוכונדריאלי במקביל עם בחני מטבולית או רגשים, כמו גם נוגדנים נוספים סמן השושלת יהיה אינפורמטיבי.
פרוטוקול זה פשוט מאפשר את המדידה של רמות מיטוכונדריאלי בתאי המטפאות החיים והוא עשוי לספק בסיס ללימוד הביולוגיה החוזרת של הגזע הבריא והחולני של תאים מחולל קדמון, כמו גם להערכת האפקטיביות של . טיפולים נגד חמצון
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו היתה נתמכת על ידי הדירקטוריון פוקס מרדף מרכז מנהלים (DDM), האגודה האמריקנית להמטולוגיה פרס המלומד (SMS), האגודה האמריקנית לסרטן RSG (SMS) ומשרד ההגנה (הפרס: W81XWH-18-1-0472).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heat inactivated FBS | VWR Seradigm LIFE SCIENCE | 97068-085 | Media |
| Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | Media |
| PBS | Fisher Scientific | BP399-20 | Buffer |
| 15 mL conical tube | BD falcon | 352096 | Tissue Culture Supplies |
| 50 mL conical tube | BD falcon | 352098 | Tissue Culture Supplies |
| 40 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22-363-547 | Tissue Culture Supplies |
| RBC Lysis Buffer | Fisher Scientific | 50-112-9751 | Tissue Culture Supplies |
| Menadione sodium Bisulfite | Sigma aldrich | M5750 | Pro-oxidant |
| NAC | Sigma aldrich | A7250 | Anti-oxidant |
| CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11 | Biolegend | 100310 | Antibody |
| CD4 PE-Cy5 clone RM4-5 | eBioscience | 15-0041-81 | Antibody |
| CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7 | eBioscience | 15-0081-81 | Antibody |
| CD19 PE-Cy5 clone 6D5 | Biolegend | 115510 | Antibody |
| B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2 | Biolegend | 103210 | Antibody |
| Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5 | Biolegend | 108410 | Antibody |
| Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119 | Biolegend | 116210 | Antibody |
| CD48 PE-Cy5 clone HM48-1 | Biolegend | 103420 | Antibody |
| CD117 APC-Cy7 clone 2B8 | Biolegend | 105825 | Antibody |
| Sca1 peacific Blue clone D7 | Biolegend | 108120 | Antibody |
| CD150 APC clone TC15-12F12.2 | Biolegend | 115909 | Antibody |
| CD34 FITC clone RAM34 | BD Bioscience | 553733 | Antibody |
| CD45.2 APC clone 104 | Biolegend | 1098313 | Antibody |
| MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | Dye |
| Mitotracker Green | ThermoFisher Scientific | M7514 | Dye |
| Live/dead Yellow Dye | ThermoFisher Scientific | L34967 | Dye |
References
- Dröse, S., Brandt, U. Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain. Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).
- Gerber, P. A., Rutter, G. A. The Role of Oxidative Stress and Hypoxia in Pancreatic Beta-Cell Dysfunction in Diabetes Mellitus. Antioxidant & Redox Signaling. 26 (10), 501-518 (2017).
- Höhn, A., et al. Happily (n)ever after: Aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence. Redox Biology. 11, 482-501 (2017).
- Reuter, S., Gupta, S. C., Chaturvedi, M. M., Aggarwal, B. B. Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked. Free Radical Biology & Medicine. 49 (11), 1603-1616 (2010).
- Lee, B. W. L., Ghode, P., Ong, D. S. T. Redox regulation of cell state and fate. Redox Biology. 2213-2317 (18), 30899 (2018).
- Harris, J. M., et al. Glucose metabolism impacts the spatiotemporal onset and magnitude of HSC induction in vivo. Blood. 121, 2483-2493 (2013).
- Hole, P. S., Darley, R. L., Tonks, A. Do reactive oxygen species play a role in myeloid leukemias. Blood. 117, 5816-5826 (2011).
- Lagadinou, E. D., et al. BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).
- Di Marcantonio, D., et al. Protein Kinase C Epsilon Is a Key Regulator of Mitochondrial Redox Homeostasis in Acute Myeloid Leukemia. Clinical Cancer Research. 24 (3), 608-618 (2018).
- Glasauer, A., Chandel, N. S. Targeting antioxidants for cancer therapy. Biochemical Pharmacology. 92 (1), 90-101 (2014).
- Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
- Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Lo Celso, C., Scadden, D. T. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiments. (157), (2007).
- Kalaitzidis, D., et al. mTOR complex 1 plays critical roles in hematopoiesis and Pten-loss-evoked leukemogenesis. Cell Stem Cell. 11 (3), 429-439 (2012).
- Sykes, S. M., et al. AKT/FOXO signaling enforces reversible differentiation blockade in myeloid leukemias. Cell. 146 (5), 697-708 (2011).
- Kalaitzidis, D., Neel, B. G. Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells. PLoS One. 3 (11), 3776 (2008).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Mooney, C. J., Cunningham, A., Tsapogas, P., Toellner, K. M., Brown, G. Selective expression of flt3 within the mouse hematopoietic stem cell compartment. International Journal Molecular Sciences. 18 (5), (2017).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. I. SLAM family markers resolve functional distinct sub-populations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment. Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1178 (2010).
- Mukhopadhyay, P., Rajesh, M., Haskó, G., Hawkins, B. J., Madesh, M., Pacher, P. Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy. Nature Protocols. 2 (9), 2295-2301 (2007).
- Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies. Blood. 107 (2), 501-507 (2006).
- Morita, Y., Ema, H., Yamazaki, S., Nakauchi, H. Non-side-population hematopoietic stem cells in mouse bone marrow. Blood. 108 (8), 2850-2856 (2006).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment. Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).
- Somervaille, T. C., Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).
- Hao, X., et al. Metabolic Imaging Reveals a Unique Preference of Symmetric Cell Division and Homing of Leukemia-Initiating Cells in an Endosteal Niche. Cell Metabolism. 29 (4), 950-965 (2019).
