Summary
우리는 급성 골수성 백혈병 (AML)의 마우스 모델에서 뮤린 건강한 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC) 및 백혈병 세포에서 미토콘드리아 반응성 산소 종 (ROS)을 검출하기 위해 다매개 변수 흐름 세포측정법을 사용하는 방법을 설명합니다. MLL-AF9.
Abstract
우리는 MLL-AF9에 의해 구동되는 AML을 가진 마우스뿐만 아니라 건강한 마우스에서 다양한 살아있는 골수 (BM) 파생된 줄기 및 전구 세포 인구에 있는 미토콘드리아 ROS를 분석하기 위한 교류 세포 측정 접근을 제시합니다. 구체적으로, 우리는 건강한 또는 백혈병 BM 세포가 미토콘드리아 과산화물을 검출하는 형광성 염료로 먼저 염색되고, 그 다음에 사용되는 불소크롬 연결된 단클론 항체로 염색하는 2 단계 세포 염색 과정을 기술합니다. 다양한 건강하고 악성 조혈 선조 집단을 구별합니다. 우리는 또한 유세포분석에 의한 시료를 획득하고 분석하기 위한 전략을 제공합니다. 전체 프로토콜은 3-4 시간만큼 짧은 시간 내에 수행 될 수있다. 우리는 또한 살아있는 조혈 및 백혈병 줄기 및 전구 소집단의 미토콘드리아 구획에서 ROS 생산을 모니터링하는 장점과 한계뿐만 아니라 유세포 측정에 의한 형광 염료를 사용하여 고려해야 할 주요 변수를 강조합니다. . 게다가, 우리는 미토콘드리아 ROS 풍부가 명백한 건강한 HSPC 하위 인구 및 백혈병 전구체 사이에서 변화한다는 것을 데이터를 제출하고 혈액학 연구에서 이 기술의 가능한 응용을 토론합니다.
Introduction
반응성 산소 종 (ROS)은 분자 산소에서 파생 된 반응성이 높은 분자입니다. ROS 생산의 가장 잘 정의 된 세포 위치는 미토 콘 드리 아, 어디 전자 수송 사슬을 통해 통과 하는 전자 (ETC) 산화 인 산화 동안 (OXPHOS) 특정의 형성으로 이어지는 분자 산소에 의해 흡수 수퍼 옥사이드1이라고불리는 ROS의 유형 . 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 또는 SOD라고 하는 일련의 효소의 활동을 통해, 수퍼옥사이드는 과산화수소로 변환되며, 이 수소는 카탈라제 또는 글루타티온 과산화효소(GPX)와 같은 효소에 의해 물로 중화됩니다. ROS 조절 메커니즘의 교란은 종종 산화 스트레스라고도 하는 ROS의 과잉 생산으로 이어질 수 있으며, 이는 거대 분자 손상 (즉, DNA, 단백질, 지질)과 같은 유해하고 잠재적으로 치명적인 세포 결과를 가지고 있습니다. 더욱이, 산화 스트레스는 당뇨병, 염증성 질환, 노화 및 종양2,3,4와같은 여러 병리와 관련이 있다. 항상성을 유지하고 산화 스트레스를 방지하기 위해 세포는 다양한 ROS 조절 메커니즘을 가지고5.
특정 ROS의 생리수준은 적절한 배아 및 성인 조혈에 필요하다6. 그러나, 과잉 ROS는 조혈 줄기 및 전구 풀의 DNA 손상, 세포 분화 및 고갈과 관련이 있다. 또한 레독스 생물학에 있는 변경백혈병과 건강한 세포 사이에서 다를 수 있다는 기록이 있습니다. 예를 들어, ROS 수준은 그들의 건강한 대조물의 대조와 다른 연구에 비해 급성 골수성 백혈병 (AML) 세포에서 더 높은 경향이 백혈병 줄기 세포생존을 위한 ROS의 낮은 정상 상태 수준을 유지한다는 것을건의했습니다 7,8. 중요한 것은, 이러한 산화물의 차이를 치료적으로 활용하기 위한 전략은 몇몇 인간적인 암 조정9,10에서약속을 보여주었습니다. 그러므로, 마우스 모형에 있는 ROS 수준의 평가를 허용하는 분석제는 이 종이 세포 생리학 및 질병 병인에 어떻게 기여하는지의 우리의 이해를 향상할 수 있을 뿐만 아니라 잠재적으로 의 효과를 평가하기 위한 발판을 제공할 수 있습니다 새로운 레독스 표적 항암 치료.
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Protocol
이 프로토콜에 설명된 모든 동물 절차는 폭스 체이스 암 센터의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
참고: 프로토콜 워크플로는 그림 1에 나와 있는 대로 4부분으로 나뉘며 필요한 시약은 재료 표에나열되어 있습니다.
1. 골수 (BM) 격리
참고: MLL-AF9 백혈병 마우스는 앞서11일기재한 바와 같이 생성되었다.
- 앞서 설명한 바와 같이,12,13,14,15,야생형 C57.Bl6 마우스(CD45.2 정성 마커를 발현)와 C57로부터 회수한다. MLL-AF9 발현 백혈병 세포로 이식된 Bl6-SJL 마우스(CD45.1 동시 마커)(CD45.2+).
참고: BM은12,13을 분쇄하거나 뼈14,15를플러시하여 마우스에서 회복 할 수 있습니다. 여기에 제시된 실험을 위해, BM은 플러싱을 통해 건강한 및 백혈병 마우스 둘 다에서 회복되었다.
2. 미토콘드리아 ROS 형광염료 염색
- 일단 단핵 골수 세포가 건강한 및/또는 백혈병 마우스에서 회복되면, Trypan Blue로 세포의 별칭을 얼룩지게 하고 총 BM 세포의 시작 수를 결정하기 위해 혈세포계를 사용하여 계산합니다.
- 세포를 300 x g에서 5 분 동안 흡인하고 F-PBS (2 % 태아 소 혈청과 1 % 페니실린 / 스트렙 토마이신 칵테일로 보충 된 PBS)에서 펠릿을 2 x 106 세포 / mL의 농도로 다시 중단시요.
- 다음과 같이 표시된 9개의 단색 제어 튜브로 튜브당 세포 현탁액의 Aliquot 200 μL:
얼룩 없음, B220-Cy5-PE, cKit-Cy7-APC, Sca1-PacBlue, CD150-APC (건강한 HSPC전용), CD45.2-APC (백혈병 세포전용), CD34-FITC, 미토콘드리아 ROS 염료 및 라이브/죽은 세포 얼룩.
참고: (선택 사항) 미토콘드리아 ROS의 유도에 대한 양성 대조군은 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 1시간 동안 20 μL에서 200 μL에서 2 x 105 세포를 메나디온 나트륨 비설핏(MSB)으로 처리함으로써 제조될 수 있다. 미토콘드리아 ROS의 MSB 매개 유도를 역전시키는 제2 대조군은 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 1시간 동안 MSB 플러스 100 μM 플러스 100 μM N-아세틸-L-시스테인(NAC)으로 2x10 5 세포에서 2 x 105 세포를 처리함으로써 제조될 수 있다. - 5 분 동안 300 x g에서 튜브 (실험 튜브) 및 원심 분리기에 남아있는 세포를 알리쿼트.
- 제조업체의 지침에 따라 라이브/데드 셀 얼룩으로 F-PBS의 셀을 다시 일시 중단합니다. 30 분 동안 얼음에 배양. 단색 제어 튜브에 살아있는 / 죽은 얼룩을 추가해야합니다.
- 실온(RT) F-PBS 1.0mL를 살아있는/죽은 염료로 얼룩진 단일 색상 및 실험 용 튜브에 추가합니다. RT에서 300 x g에서 5 분.
- 50 μg의 미토콘드리아 ROS 염료를 13 μL의 디메틸 설폭사이드(DMSO)에서 재중단하여 5 mM 스톡 용액을 얻었다.
- 미라파밀(50 μM)의 유무에 관계없이 RT F-PBS에서 미토콘드리아 ROS 염료를 5 μM의 최종 농도로 희석한다.
- 살아있는/ 죽은 세포 얼룩의 세척을 흡인합니다. 각 실험 튜브뿐만 아니라 미토콘드리아 ROS 염료 단색 제어 튜브에 베라파밀을 함유하는 미토콘드리아 ROS 염료 얼룩 200 μL을 첨가한다.
- 소용돌이를 혼합하고 어둠 속에서 37°C에서 10분 동안 배양한다.
- 미토콘드리아 ROS 염색 단색 제어 및 실험 튜브에 RT F-PBS 1.0 mL을 추가합니다. RT에서 300 x g에서 5 분.
- 상한체에서 흡인하고 RT F-PBS의 추가 1.0 mL로 세포를 세척합니다. RT에서 300 x g에서 5 분.
3. 계보 항체 염색
- 표 1에열거된 항체 칵테일을 준비한다.
참고: 이러한 항체 칵테일은 이전에14,15,16으로최적화되었습니다. - 건강한 BM을 함유하는 실험튜브의 최종 미토콘드리아 ROS 염료 세척으로부터 상판을 흡인하고 각 튜브에 #1 항체 칵테일의 200 μL을 첨가한다. 혼합 하는 소용돌이. 또한 단색 제어 튜브를 준비합니다. 어둠 속에서 얼음에 60 분 동안 배양.
- 백혈병 BM을 포함하는 실험 튜브의 최종 미토콘드리아 ROS 염료 세척으로부터 상판을 흡인하고 각 튜브에 #2 항체 칵테일의 200 μL을 첨가한다. 혼합 하는 소용돌이. 어둠 속에서 얼음에 60 분 동안 배양.
- 1.0 mL의 차가운 F-PBS와 RT에서 300 x g에서 원심 분리기 5 분으로 씻으소서.
- 차가운 F-PBS의 500 μL에서 세포를 재중단하고 응집체를 배제하기 위해 40 μm 필터를 사용하여 유동 세포계 튜브에서 세포를 필터링합니다.
4. 유세포 분석 수집 및 분석
참고: 몇몇 조혈 줄기 및 전구체 부세트는 장기 조혈 줄기 세포와 같은 희소합니다. 따라서, 이상적으로는 다양한 HSPC 서브세트에서 미토콘드리아 ROS의 충분한 분석을 위해 유세포분석 수집 동안 각 실험관에 대해 3-5백만 개의 이벤트를 수집해야 한다.
- 무얼룩 제어 튜브를 사용하여 분석된 셀 집단의 크기와 복잡성에 따라 전방(FSC-A) 및 측면(SSC-A) 산란플롯을 설정합니다.
- 유세포계를 보정하기 위해 얼룩 없음 및 단색 제어 튜브를 사용합니다.
- 전방 및 측면 산란 플롯에서 외부 파편을 게이트 아웃(그림 2A, B,왼쪽에서 첫 번째 패널).
- 전방 판별기(그림2A, B,왼쪽에서 두 번째 패널)와 같은 이중 판별체를 사용하여 더블을 게이트아웃합니다.
- 도 2A,B에서 제안된 게이팅 전략을 따라 살아있는 세포, 계보 저세포 및 다양한 HSPC 및 백혈병 서브세트를 선택한다.
- 관심 있는 각 집단에 대해, 히스토그램 플롯에서 TRPE 채널(x축)의 중간 형광 강도(MFI)를 분석하여 미토콘드리아 ROS 신호의 차이를 평가하였다(그림3A-C,좌측 패널). 미토콘드리아 ROS의 수준은 산란플롯에서 특정 계보 마커 대 미토콘드리아 ROS 염색을 비교하여 단일 세포 수준에서 평가될 수 있다.
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Representative Results
제시된 것은 다중 건강 및 MLL-AF9 발현 백혈병 전구 집단의 미토콘드리아에서 ROS를 분석하는 방법이다. 그림 1은 4개의 주요 단계로 구성된 프로토콜 워크플로우의 개략적 보기를 표시합니다: 1) 마우스로부터의 BM 격리; 2) 미토콘드리아 ROS, 특히 과산화물을 인식하는 형광성 염료로 BM 세포를 염색하는 단계; 3) 다양한 건강 및 백혈병 조혈 인구를 묘사하기 위해 표면 마커 항체 염색; 및 4) 유세포 분석 수집 및 분석.
그림 2 A, B는 건강하고 백혈병 BM에 있는 각종 조혈 줄기 및 선조 인구를 분석하기 위한 대표적인 게이팅 전략을 묘사합니다. FSC/SSC 플롯은 이물질을 제거하기 위해 적용되며 FSC 영역(FSC-A) 대 FSC 높이(FSC-H) 플롯은 이중 및 집계를 제외하는 데 사용됩니다. 리니지 표면 마커의패널(표 1 및 단계 3.1)은 림프구, 적혈구, 과립구 및 단핵구/대식세포(즉, 리니지 로우 또는 린로우)와같은 다양한 성숙한 조혈 집단을 배제하기 위해 결합된다. 리니지 칵테일은 또한 CD48 항체를 포함하고 따라서 계보 낮은 세포의 모든 하위 세트는 또한 CD48입니다-. Sca-1 및 c-Kit 세포 표면 발현은 CD48 -LSKs (린 로우,Sca-1+, c-Kit+, CD48-) 골수성 전구체 (린로우,Sca-1 )라고 불리는 HSPC의 이기종 혼합물을 구별하는 데사용됩니다. , c-키트+, CD48-). 다양한 HSPC 서브세트를 더욱 구별하기 위해, SLAM 마커, CD150 및 CD34도17,18,19,20,21을추가한다. 그림 2 B는 또한 cKit 고발현 백혈병 선조 (린로우,c-키트높은)에대한 대표적인 게이팅 전략을 묘사한다. Sca-1-)은 백혈병 시동 세포(LICs)(11)뿐만 아니라 cKit의 중간-낮은 발현을 발현하는 백혈병 세포에 대해 농축된다(cKitInt-low).
건강한CD48-LSK 및 골수성 전구체 사이의 미토콘드리아 ROS 염색의 비교는 골수성 전구체가 미토콘드리아 ROS 염색의 상당히 높은 수준을 나타낸다는 것을 보여준다(도3A). 더욱이, cKit고 백혈병 전구체는 CD48-LSK, 골수성 전구체 또는 cKitint-low 백혈병 세포에 비해 미토콘드리아 ROS 염색의 상당히 높은 수준을 표시한다(도3A). cKitInt-저백혈병 세포는 또한CD48-LSK 세포에 비해 미토콘드리아 ROS 염색이 현저히 높게 표시되었으나 골수성 전구체는 그렇지 않다(도3A). CD150 발현에 의해 더 세분화된 LSKs는 미토콘드리아 ROS 염색이 CD48에서 유의하게 변하지 않았다는 것을 보여주었다- LSK 세포는 CD150 높음(CD150High),중간(CD150Int)또는 없음(CD150Neg)으로세분화되었다. 표현식(그림3B). 그러나, cKit높은 또는 cKitInt-낮은 백혈병 세포의 정상 상태 미토콘드리아 ROS 염색은 CD48-LSKs-CD150높음,-CD150Int 또는 -CD150Neg 세포보다 유의하게 높은 것으로 나타났다. 그림 3B). CD34의 수준이 낮지 않은 LSK 세포는 조혈 줄기 세포, 특히 CD34인 CD48-LSK 세포-및 CD150 고20,21을장기간 재구성하기 위해 농축된다. 그러나, CD48-CD150 및 CD34 발현에 의한 LSK 세포를 세분화하는 것은 이들 6개의 HSPC 서브세트 들 사이에서 미토콘드리아 ROS 염색에 있어서 어떠한 유의한 차이도 밝히지 않았다(도3C).
그림 1 : 프로토콜 작업 흐름의 개략적 표현. 단계 1) 건강한 MLL-AF9 백혈병 마우스로부터의 BM 분리; 2) 미토콘드리아 ROS 염료(mROS)를 이용한 세포 염색; 3) 건강한 백혈병 마우스에서 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC) 집단을 구별하기 위해 불소크롬 연결된 단일 클론 항체로 세포 염색; 단계 4) 여러 HSPC 집단에서 미토콘드리아 ROS의 유동 세포 분석 획득 및 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 건강하고 MLL-AF9 발현 골수 세포를 위한 유세포분석 게이팅 전략. (A)건강한 마우스로부터 분리된 BM 세포를 살아있는/죽은 염료(QDot), 미토콘드리아 ROS 염료(TRPE)로 염색하였다. 건강한 마우스로부터의 BM은 이후 계보 마커플러스 CD48(Cy5-PE), c-Kit(Cy7-APC), Sca1(팩블루), CD34(FITC), CD150(APC)을 인식하는 항체로 염색하였다. (B)살아있는/죽은 세포 및 미토콘드리아 ROS 얼룩 이외에, 백혈병 마우스에서 BM은 또한 항체 인식 혈통 마커 플러스 CD48 (Cy5-PE), c-Kit (Cy7-APC), Sca1 (PacBlue) 및 CD45.2 (APC)로 염색되었습니다. 건강한 수용자 BM 세포에서 MLL-AF9 백혈병 세포 사이 (CD45.1). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 미토콘드리아 로스 수치가 건강하고 MLL-AF9 골수입니다. 좌측 패널은 표시된 집단의 미토콘드리아 ROS 수준의 대표적인 히스토그램이고, 각각의 우측 패널은 표시된 집단에 대한 미토콘드리아 ROS의 MFI의 막대 그래프 분석을 나타낸다(n=4). (A)건강한 CD48에서 미토콘드리아 ROS 수준을 비교- LSK, 골수성 전구뿐만 아니라 MLL-AF9 린로우 c-키트하이 및 MLL-AF9 린저c-키트 Int-Low 세포. (B)건강한 CD48에서 미토콘드리아 ROS 수준을비교한 - LSK 세포는 그들의 CD150 발현에 기초하여 MLL-AF9 린로우 c-키트하이 및 MLL-AF9 린로우 c-키트Int-Low 세포. (C)건강한 CD48에서 미토콘드리아 ROS 수준의비교-그들의 CD150 및 CD34 발현을 기초로 한 LSK 세포. (* p≤0.05; ** p < 0.01*** p < 0.001; **** p & 0.0001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 프로-항산화 화합물을 이용한 미토콘드리아 ROS 수치의 변화. 건강하고 MLL-AF9 발현 BM 세포에서 미토콘드리아 ROS 수준의 히스토그램은 5%CO2 인큐베이터(양성 대조군)에서 37°C에서 1시간 동안 메나디온 나트륨 비술피(MSB)의 20 μM으로 처리된 BM 세포또는 100 μM과 조합하여 MSB의 20 μM으로 처리되었습니다. N-아세틸-L-시스테인(NAC)은 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 1시간 동안. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 미토콘드리아 ROS 및 계보 인식 항체 얼룩의 최적화. (a)MLL-AF9에서 미토콘드리아 ROS(mROS) 수준의 비교는 10 또는 30분 동안 1 또는 5 μM을 사용하여 백혈병 세포를 발현한다.(적색=비차량; 파란색 = MSB 20 μM; 녹색 = NAC 100 μM; 주황색 = Msb 20 μM + NAC 100 μM). (B)항체 칵테일 #1 20, 60 또는 90 분 동안 염색 된 건강한 LSK에서 CD34 채널 (FITC)의 MFI를 비교합니다 (n = 4, * p ≤ 0.05; ** p < 0.01). (C)5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 30분 동안 배양 전후에 염색된 항체의 비교. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 미토콘드리아 ROS 및 계보 마커 항체 염색 순서. (A)다른 차종의 염색을 사용하여 얻은 표시된 HSPC 집단의 도트 도표. (b)LSK 및 골수성 전구에서 평가된 미토콘드리아 ROS 수치는 37°C에서 10분 동안 미토콘드리아 ROS 염색을 한 다음 4°C에서 1시간 동안 염색하는 상이한 염색 순서를 사용하였다; 청색 = 미토콘드리아 ROS 염색을 37°C에서 10분 간 염색한 다음 4°C에서 1h 염색하는 항체를 뒤따랐다. (C)표시된 모집단에서 상이한 차종의 염색을 사용하여 염색하는 미토콘드리아 ROS(mROS)의 MFI의 정량화(n=4, * p ≤ 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7 : 비라파밀 트리트먼트가 미토콘드리아 ROS 염색염색에 미치는 영향과 MLL-AF9 발현 BM 세포. (a)5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 10분 동안 50 μM Verapamil의 유무에 관계없이 처리된 샘플에서 표시된 HSPC 집단의 도트 도트. (B)50 μM Verapamil의 존재 (파란색) 또는 부재 (빨간색)에서 표시된 HSPC 집단에서 미토콘드리아 ROS 및 미토매스 그린 염색의 히스토그램. (C-E) 미토콘드리아 ROS 염색 시 50 μM Verapamil 의 유무에 관계없이 처리된 BM 샘플에서 표시된 건강한(C&D) 및 백혈병(E) 세포 집단에서 미토콘드리아 ROS 수준의 정량화(n = 4, * p ≤ 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 항체 칵테일. 3.1단계에서 제조된 항체 칵테일의 목록. 건강하고 백혈병 골수 내의 각종 조혈 하위 인구를 확인하기 위하여.
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Discussion
ROS의 검출을 위해 개발된 형광 염료는 현미경 검사법또는 살아있는 세포에서 유세포분석법22에의해 고정된 세포에서 자주 평가된다. 미토콘드리아 ROS 형광 염료를 사용하여 BM 세포에서 미토콘드리아 ROS의 유세포측정 평가는 두 가지 주요 장점을 가지고 있습니다: 1) 살아있는 세포 분석에 적합한 빠르고 간단한 기술이며 2) 희귀를 구별하고 분석할 수 있습니다. 표면 마커 염색을 사용하여 BM의 단일 세포 수준에서 인구. 여기에 제시된 단계별 프로토콜은 유세포분석기를 사용하여 MLL-AF9에 의해 구동되는 AML의 마우스 모델뿐만 아니라 건강한 마우스모두에서 조혈줄기 및 선조 집단의 생체 내 레독스 상태를 연구하기 위해 개발되었다. 이 프로토콜을 실행하는 동안 고려해야 할 몇 가지 주요 기술 변수가 있습니다.
첫 번째, 프로-산화 컨트롤의 사용은 사용자가 미토콘드리아 ROS 염색뿐만 아니라 얼룩의 특이성에 증가를 위한 기준을 설정할 수 있게 한다. 여기에 제시된 프로토콜에 대해, 프로-산화제 MSB는 건강한 및 백혈병 BM 세포 모두에서 미토콘드리아 ROS 염색의 검출 가능한 유도에 대한 양성 대조군으로서 이용되었다(도 4). 산화성 NAC는 MSB에 의해 유도된 미토콘드리아 ROS 염색을 크게 역전시키기 때문에 추가적인 대조군으로서 사용될 수있다(도 4).
둘째, 본 연구에 사용된 미토콘드리아 ROS 형광 염료는 10분 동안 5 μM의 농도로 사용하는 것이 좋습니다. 그러나, 제조 업체는 또한 농도 및 염색의 시간 세포 유형 사이 다를 수 있습니다 제안. 본 연구에서, 미토콘드리아 ROS 염색은 10 또는 30분 동안 1 μM 및 5 μM 모두에서 비교되었다. 분석은 10 내지 30 분 동안 5 μM의 농도가 NAC 처리에 의해 반전된 것 뿐만 아니라 미토콘드리아 ROS에서 MSB 매개 변화를 검출하기에 충분하다는 것을밝혔다(그림 5A). 10 분과 30 분 사이의 정량적 차이가 없었기 때문에, 분석의 길이를 최소화하기 위해 이 연구에 10 분의 염색 시간을 선택했습니다.
셋째, CD34 항체 배양 시간은 20 내지 90 분23,24에서문헌 내에서 다양합니다. 여기에 제시된 프로토콜을 최적화하기 위해, 뮤린 골수 세포는 20, 60 또는 90분 동안 항체 칵테일 #1(Step 3.1)으로 배양하였다. 도 5B에도시된 바와 같이, 20분 얼룩에 비해 60 또는 90분 동안 염색된 세포에서 상당히 강한 CD34 염색이 관찰되었다. 그러나, CD34 염색에서 유의한 차이는 60 내지 90분(도 5B)의항체 배양 시간 사이에서 관찰되지 않았으며 따라서 제시된 프로토콜에 대해 60분 항체 얼룩이 권장된다.
넷째, 제시된 프로토콜에서, 건강한 세포와 백혈병 세포 는 모두 먼저 미토콘드리아 ROS 형광 염료로 염색되고, 세척한 후 형광화 연결 계보 항체로 염색된다. 본 연구에서는 미토콘드리아 ROS 얼룩을 혈통 항체와 결합하는 직접적인 평가가 수행되지 않았지만, 10, 20 및 미토콘드리아 ROS 염색 조건 하에서 불소-연결된 계보 항체 염색에 대한 평가가 분석되었다. 37 °C에서 30 분. 이 분석은 37°C에서 30분 의 배양이 실질적으로 계보 표면 마커 염색을 변화시키는 것으로나타났다(도 5C). 추가적으로, 미토콘드리아 ROS 염색은 먼저, 불소-연결된 혈통 항체로 건강한 BM 세포를 염색하고 미토콘드리아 ROS 형광염료로 염색하고 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 먼저 계보 항체를 가진 계보 항체를 염색하고 미토콘드리아 ROS 염색은 그 반대의 반대염색 프로토콜에 비해 더 낮은 미토콘드리아 ROS 신호를 초래하였다(도 6A, B)- CD48에 대한 유의한 차이를포함- LSK CD150높은,CD48- LSK CD150Int CD34 및 골수성 전구 집단(그림 6C).
다섯째, 최근 연구에 따르면, 다른 뮤린 건강한 HSPC 집단은 미토콘드리아 질량을 평가하는 데 사용되는 것과 같은 여러 미토콘드리아 염색 형광 프로브를 유출하는 뚜렷한 능력을 가지고 있음을 보여준다 (이하 미토매스 녹색이라고함) 또는 잠재적인 25,26. 따라서, 미토콘드리아 ROS 형광염료를 가진 건강및 백혈병 전구체의 염색에 대한 유출 펌프 억제제 verapamil의 영향도 평가되었다. 미토콘드리아 ROS를 가진 HSPC의 동시 염색은 계보 마커 항체 염색을 변경하지 않았습니다(그림 7A),그러나, verapamil는 건강하고 백혈병의 다양한미토콘드리아 ROS 염색 신호를 현저하게 향상했습니다 선조 인구(그림 7B, C). 특히, 베라파밀에 의한 개선된 미토콘드리아 ROS 염색의 크기는 미토매스 녹색 형광성 염료로 볼 수 있는 것만큼 크지않았다(도 7B).
여섯째, 여기에 제시된 프로토콜에서, BM 세포는 뼈 끝을 제거하여 회복되었다 (골단) 다음 뼈의 플러싱. 그러나, 골피는 잠재적으로 뼈 홍조에 의해 손실 될 수있는 조혈 세포를 포함. 대안으로, BM 세포는 앞서 설명한 바와 같이 모르타르와 배봉으로 뼈를 매싱하여 추출 할 수있다12,13.
여기에 제시된 프로토콜은 살아있는 유기체로부터 추출된 살아있는 세포에서 세포내 레독스 생물학을 측정하기 위해 형광 염료를 사용하기 위한 토대를 제공한다. 그러나, 단 하나 형광성 염료는 결정적으로 특정이라고 가정될 수 없다는 것을 주의하는 것이 중요합니다 및 그러므로 어떤 사실 인정든지 확인하기 위하여 대체 방법을 가진 추가 연구 결과가 수행되어야 합니다. 더욱이, 이 연구 결과는 LICs를 위해 농축된 백혈병 세포 집단 (즉, 린낮은 cKit높은)건강한 골수성 전구 또는 그밖 HSPC 인구 보다는 미토콘드리아 ROS의 상부를 표시한다는 것을 건의합니다. 그러나, 여기서 평가된린저 cKit고백혈병 세포 집단은 이질적인 것으로 나타났으며 다른 혈통 마커11,27에의해 더 세분화될 수 있다. 또한, 최근 연구에 따르면 LIC는 뚜렷한 대사 표현형28을가지고 있습니다. 따라서, 신진 대사 검역 또는 프로브뿐만 아니라 추가 계보 마커 항체와 병행하여 미토콘드리아 ROS를 평가하는 미래 연구는 유익할 것입니다.
이 간단한 프로토콜은 살아있는 조혈 세포에서 미토콘드리아 ROS 수준을 측정할 수 있게 해주며, 건강하고 병든 줄기 및 전구 세포의 레독스 생물학을 연구하고 효과를 평가하기 위한 기초를 제공할 수 있습니다. 리독스 표적 치료.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 폭스 체이스 암 센터 이사회 (DDM), 혈액학 학자 상 (SMS), 미국 암 학회 RSG (SMS) 및 국방부 (수상 번호: W81XWH-18-1-0472)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heat inactivated FBS | VWR Seradigm LIFE SCIENCE | 97068-085 | Media |
| Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | Media |
| PBS | Fisher Scientific | BP399-20 | Buffer |
| 15 mL conical tube | BD falcon | 352096 | Tissue Culture Supplies |
| 50 mL conical tube | BD falcon | 352098 | Tissue Culture Supplies |
| 40 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22-363-547 | Tissue Culture Supplies |
| RBC Lysis Buffer | Fisher Scientific | 50-112-9751 | Tissue Culture Supplies |
| Menadione sodium Bisulfite | Sigma aldrich | M5750 | Pro-oxidant |
| NAC | Sigma aldrich | A7250 | Anti-oxidant |
| CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11 | Biolegend | 100310 | Antibody |
| CD4 PE-Cy5 clone RM4-5 | eBioscience | 15-0041-81 | Antibody |
| CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7 | eBioscience | 15-0081-81 | Antibody |
| CD19 PE-Cy5 clone 6D5 | Biolegend | 115510 | Antibody |
| B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2 | Biolegend | 103210 | Antibody |
| Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5 | Biolegend | 108410 | Antibody |
| Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119 | Biolegend | 116210 | Antibody |
| CD48 PE-Cy5 clone HM48-1 | Biolegend | 103420 | Antibody |
| CD117 APC-Cy7 clone 2B8 | Biolegend | 105825 | Antibody |
| Sca1 peacific Blue clone D7 | Biolegend | 108120 | Antibody |
| CD150 APC clone TC15-12F12.2 | Biolegend | 115909 | Antibody |
| CD34 FITC clone RAM34 | BD Bioscience | 553733 | Antibody |
| CD45.2 APC clone 104 | Biolegend | 1098313 | Antibody |
| MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | Dye |
| Mitotracker Green | ThermoFisher Scientific | M7514 | Dye |
| Live/dead Yellow Dye | ThermoFisher Scientific | L34967 | Dye |
References
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