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Cancer Research

Analyse cytométrique de flux des espèces réactives d'oxygène mitochondrial dans les cellules hématopoïétiques de tige et de progéniture de Murine et la leucémie entraînée mLL-AF9

Published: September 5, 2019 doi: 10.3791/59593

Summary

Nous décrivons une méthode pour utiliser la cytométrie multiparale de flux pour détecter les espèces réactives d'oxygène mitochondriales (ROS) dans les cellules hématopoïétiques et progénitrices saines murines (HSPc) et les cellules de leucémie d'un modèle de souris de leucémie myéloïde aigue (AML) conduit par MLL-AF9.

Abstract

Nous présentons une approche cytométrique de flux pour analyser le ROS mitochondrial dans diverses populations vivantes de cellules souches et progénitrices dérivées de la moelle osseuse (BM) provenant de souris en bonne santé ainsi que de souris atteintes de LAM entraînées par MLL-AF9. Plus précisément, nous décrivons un processus de coloration cellulaire en deux étapes, par lequel les cellules saines ou la leucémie BM sont d'abord tachées d'un colorant fluorogénique qui détecte les superoxydes mitochondriaux, suivie de coloration avec des anticorps monoclonaux fluorochrome-liés qui sont utilisés pour distinguer diverses populations hématopoïétiques saines et malignes. Nous fournissons également une stratégie pour l'acquisition et l'analyse des échantillons par cytométrie de flux. L'ensemble du protocole peut être réalisé dans un délai aussi court que 3-4 h. Nous soulignons également les variables clés à considérer ainsi que les avantages et les limites de la surveillance de la production de ROS dans le compartiment mitochondrial des sous-populations vivantes de tige sémino-tige et de leucémie et progénitrice utilisant des colorants fluorogènes par cytométrie de flux . En outre, nous présentons des données que l'abondance mitochondriale de ROS varie parmi les sous-populations saines distinctes de HSPC et les progéniteurs de leucémie et discutons des applications possibles de cette technique dans la recherche hématique.

Introduction

Les espèces réactives d'oxygène (ROS) sont des molécules fortement réactives dérivées de l'oxygène moléculaire. L'emplacement cellulaire le plus bien défini de la production de ROS est les mitochondries, où les électrons qui passent par la chaîne de transport d'électrons (ETC) pendant la phosphorylation oxydative (OXPHOS) sont absorbés par l'oxygène moléculaire menant à la formation d'un spécifique type de ROS appelé superoxydes1. Grâce aux actions d'une série d'enzymes, appelées dismutases de superoxyde ou SODs, les superoxydes sont convertis en peroxydes d'hydrogène, qui sont ensuite neutralisés en eau par des enzymes telles que la catalase ou les peroxidases de glutathion (GPX). Les perturbations dans les mécanismes de régulation ROS peuvent conduire à la production excédentaire de ROS, souvent appelé stress oxydatif, qui ont des conséquences cellulaires nocives et potentiellement mortelles telles que les dommages aux macromolécules (c.-à-d. ADN, protéines, lipides). En outre, le stress oxydatif est lié à plusieurs pathologies, telles que le diabète, les maladies inflammatoires, le vieillissement et les tumeurs2,3,4. Pour maintenir l'homéostasie redox et prévenir le stress oxydatif, les cellules possèdent une variété de mécanismes ros-régulateur5.

Les niveaux physiologiques de certains ROS sont nécessaires pour l'hématopoiesis embryonnaire et adulteapproprié 6. Cependant, l'excès de ROS est associé aux dommages d'ADN, à la différenciation cellulaire et à l'épuisement de la tige hématopoïétique et de la piscine d'ancêtre. Il existe également des preuves que les altérations de la biologie du redox peuvent différer entre la leucémie et les cellules saines. Par exemple, les niveaux de ROS ont tendance à être plus élevés dans les cellules de leucémie myéloïde aigue (LAM) par rapport à leurs homologues en bonne santé et d'autres études ont suggéré que les cellules souches de leucémie maintiennent un faible niveau stable de ROS pour la survie7,8. Fait important, les stratégies de capitalisation thérapeutique sur ces différences redox se sont avérées prometteuses dans plusieurs contextes de cancer humain9,10. Par conséquent, les essais qui permettent l'évaluation des niveaux de ROS dans les modèles de souris peuvent améliorer notre compréhension de la façon dont ces espèces contribuent à la physiologie cellulaire et la pathogénie de la maladie ainsi que potentiellement fournir une plate-forme pour évaluer l'efficacité de de nouvelles thérapies anticancéreuses ciblant le redox.

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Protocol

Toutes les procédures animales décrites dans ce protocole ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) du Fox Chase Cancer Center.

REMARQUE: Le flux de travail du protocole est divisé en 4 parties telles qu'elles sont présentées à la figure 1 et les réactifs requis sont énumérés dans le tableau des matériaux.

1. Isolement de moelle osseuse (BM)

REMARQUE: Des souris de leucémie de MLL-AF9 ont été produites comme décrit précédemment11.

  1. Récupérer les cellules mononucléaires de moelle osseuse, comme décrit précédemment12,13,14,15, de type sauvage C57.Bl6 souris (qui expriment le marqueur congénique CD45.2) ainsi que de C57. Souris Bl6-SJL (qui expriment le marqueur congénique CD45.1) qui ont été transplantées avec des cellules leucémiques exprimant MLL-AF9 (CD45.2).
    REMARQUE: BM peut être récupéré à partir de souris soit en écrasant12,13 ou en rinçant les os14,15. Pour les expériences présentées ici, BM a été récupéré à la fois des souris saines et la leucémie via le rinçage.

2. La coloration fluorogénique mitochondriale de teinture de ROS

  1. Une fois que les cellules mononucléaires de moelle osseuse ont été récupérées de souris saines et/ou de leucémie, tachez un aliquot de cellules avec Le bleu de Trypan et comptez utilisant un hémocytomètre pour déterminer le nombre de départ des cellules totales de BM.
  2. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min. Aspirer le supernatant et resuspendre la pastille en F-PBS (PBS complété par 2% de sérum bovin fœtal et un cocktail pénicilline/streptomycine de 1%) à une concentration de 2 x 106 cellules/mL.
  3. Aliquot 200 L de suspension cellulaire par tube en 9 tubes de commande monocolore étiquetés comme suit :
    Aucune tache, B220-Cy5-PE, cKit-Cy7-APC, Sca1-PacBlue, CD150-APC (pour les HSPC sains seulement), CD45.2-APC (pour les cellules leucémiques seulement), CD34-FITC, colorant mitochondrial ROS et tache de cellules vivantes/mortes.
    REMARQUE: (Facultatif) Un contrôle positif pour l'induction du ROS mitochondrial peut être préparé en traitant 2 x 105 cellules dans 200 L avec 20 M de Bisulfite de sodium de Menadione (MSB) pendant 1 h à 37 oC dans un incubateur de CO2 de 5 %. Un deuxième contrôle pour inverser l'induction MSB-négociée de ROS mitochondrial peut être préparé en traitant 2 x 105 cellules dans 200 L avec 20 M M de MSB plus 100 M N-acetyl-L-cystéine (NAC) pendant 1 h à 37 oC dans un incubateur de CO2 de 5 %.
  4. Aliquot les cellules restantes dans un tube (tube expérimental) et centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min.
  5. Resuspendre les cellules dans F-PBS avec une tache de cellule vivante /morte selon les instructions du fabricant. Incuber sur la glace pendant 30 min. Assurez-vous d'ajouter des taches vivantes/mortes au tube de commande d'une seule couleur.
  6. Ajouter 1,0 ml de F-PBS à température ambiante (RT) aux tubes monocolores et expérimentaux tachés du colorant vivant/mort. Centrifugeuse 5 min à 300 x g à RT.
  7. Resuspendre 50 g du colorant ROS mitochondrial dans 13 L de sulfoxide de diméthyle (DMSO) pour obtenir une solution de stock de 5 mM.
  8. Diluer le colorant ROS mitochondrial jusqu'à une concentration finale de 5 M dans RT F-PBS avec ou sans Verapamil (50 M).
  9. Aspirez le lavage de la tache de cellule vivante/morte. Ajoutez 200 ll de tache mitochondriale de colorant ROS contenant du Verapamil à chaque tube expérimental ainsi que le tube de contrôle monocolore de teinture ROS mitochondrial.
  10. Vortex à mélanger et incuber pendant 10 min à 37 oC dans l'obscurité.
  11. Ajoutez 1,0 ml de RT F-PBS aux tubes mitochondriques de contrôle unicolore et d'expérimentation souillés par ROS. Centrifugeuse 5 min à 300 x g à RT.
  12. Aspirer le supernatant et laver les cellules avec un supplément de 1,0 ml de RT F-PBS. Centrifugeuse 5 min à 300 x g à RT.

3. Staining d'anticorps de lignée

  1. Préparer les cocktails d'anticorps énumérés dans le tableau 1.
    REMARQUE: Ces cocktails d'anticorps ont été optimisés précédemment14,15,16.
  2. Aspirez le supernatant du lavage final de colorant ROS mitochondrial des tubes expérimentaux contenant bM sain et ajoutez 200 l de cocktail d'anticorps #1 à chaque tube. Vortex à mélanger. Préparez également les tubes de commande unicolore. Incuber 60 min sur glace dans l'obscurité.
  3. Aspirez le supernatant du lavage final de colorant ROS mitochondrial des tubes expérimentaux contenant la leucémie BM et ajoutez 200 l de cocktail d'anticorps #2 à chaque tube. Vortex à mélanger. Incuber 60 min sur glace dans l'obscurité.
  4. Laver avec 1,0 ml de F-PBS froid et centrifugeuse 5 min à 300 x g à RT.
  5. Resuspendre les cellules dans 500 L de F-PBS froid et filtrer les cellules dans un tube cytomètre d'écoulement à l'aide d'un filtre de 40 m pour exclure les agrégats.

4. Acquisition et analyse de la cytométrie de flux

REMARQUE: Plusieurs sous-ensembles de tiges et d'ancêtres hématopoïétiques sont rares, comme les cellules souches hématopoïétiques à long terme. Ainsi, idéalement 3-5 millions d'événements devraient être rassemblés pour chaque tube expérimental pendant l'acquisition de cytométrie de flux pour l'analyse suffisante du ROS mitochondrial dans les divers sous-ensembles de HSPC.

  1. Utilisez le tube de commande sans tache pour définir les parcelles de dispersion vers l'avant (FSC-A) et latérales (SSC-A) en fonction de la taille et de la complexité de la population cellulaire analysée.
  2. Utilisez les tubes de contrôle sans taches et monocolores pour compenser le cytomètre d'écoulement.
  3. Portez les débris extérieurs de la parcelle de dispersion vers l'avant et latérale(figure 2A,B, premier panneau à partir de la gauche).
  4. Portez les doublets à l'aide d'un double discriminateur tel que le discriminateur avant (Figure 2A,B, deuxième panneau à partir de la gauche).
  5. Suivez la stratégie de gating proposée dans la figure 2A,B pour sélectionner les cellules vivantes, les cellules basses de lignée et les divers sous-ensembles de HSPC et de leucémie.
  6. Pour chaque population d'intérêt, analyser l'intensité médiane de fluorescence (IMF) du canal TRPE (axe X) dans une parcelle d'histogramme pour évaluer les différences dans le signal ROS mitochondrial(figure 3A-C, panneaux gauches). Les niveaux de ROS mitochondrial peuvent être évalués au niveau unicellulaire en comparant la coloration mitochondriale de ROS par rapport aux marqueurs spécifiques de lignée dans une parcelle de dispersion.

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Representative Results

Présenté est une méthode pour analyser ROS dans les mitochondries de multiples populations saines et MLL-AF9-exprimant l'ancêtre de leucémie. La figure 1 affiche une vue schématique du flux de travail du protocole, qui se compose de 4 étapes principales : 1) l'isolement de BM des souris ; 2) Tacher les cellules BM avec un colorant fluorogénique qui reconnaît le ROS mitochondrial, en particulier les superoxydes; 3) coloration d'anticorps de marqueur de surface pour délimiter diverses populations hématopoïétiques saines et de leucémie ; et 4) Acquisition et analyse de cytométrie de flux.

Figure 2 A,B dépeint une stratégie représentative de gating pour analyser diverses populations hématopoïétiques de tige et d'ancêtre dans la bM saine et de leucémie. Une parcelle FSC/SSC est appliquée pour éliminer les débris et une parcelle de zone FSC (FSC-A) par rapport à fSC-hauteur (FSC-H) est utilisée pour exclure les doublets et les agrégats. Un panneau de marqueurs de surface de lignée(tableau 1 et étape 3.1) sont combinés pour exclure une variété de populations hématopoïétiques matures telles que les lymphocytes, les érythrocytes, les granulocytes et les monocytes/macrophages (c.-à-d. Lineage bas ou Linbas). Le cocktail de lignée comprend également un anticorps CD48 et donc tous les sous-ensembles de cellules basses de lignée sont également CD48-. Sca-1 et c-Kit expression de surface cellulaire est utilisé pour distinguer un mélange hétérogène de HSPC appelés CD48- LSKs (Linbas, Sca-1-, c-Kit-CD48-) des progéniteurs myéloïdes (Linbas, Sca-1- , c-Kit,CD48-). Pour mieux distinguer les différents sous-ensembles HSPC, le marqueur SLAM, CD150 ainsi que CD34 sont également ajoutés17,18,19,20,21. Figure 2 B dépeint également une stratégie de gating représentative pour les progéniteurs de leucémie à forte expression cKit (Linlow, c-Kithigh; Sca-1-), qui sont enrichis pour les cellules d'initiation de la leucémie (LIC)11 ainsi que les cellules leucémiques exprimant l'expression intermédiaire-faible de cKit (cKitInt-low).

Une comparaison de la coloration mitochondriale DE ROS entre CD48 en bonne santé- Les progéniteurs de LSK et de myéloïde montre que les progéniteurs myéloïdes affichent des niveaux sensiblement plus élevés de coloration mitochondriale de ROS (figure 3A). En outre, les progéniteurs de leucémieélevée de cKit affichent des niveaux sensiblement plus élevés de coloration mitochondriale de ROS comparés à CD48- LSK, progéniteurs myéloïdes ou cKitint-low leukemia cells (Figure 3A). cKitInt-low leukemia cells also displayed significantly higher mitochondrial ROS staining compared to CD48- LSK cells but not to myeloid progenitors (Figure 3A). LSKs subdivisé par l'expression CD150 a montré que la coloration mitochondriale ROS n'a pas varié de manière significative dans CD48- cellules LSK subdivisées par CD150 élevé (CD150High), intermédiaire (CD150Int) ou non (CD150Neg) expression (Figure 3B). Cependant, la coloration mitochondriale régulière de ROS des cellules de leucémieélevées ou cKitInt-low s'est avérée significativement plus élevée que CD48- LSKs-CD150High, -CD150Int ou -CD150Neg cells ( Figure 3B). Les cellules LSK exprimant des niveaux faibles à aucun de CD34 sont enrichies pour les cellules souches hématopoïétiques reconstituantes à long terme, en particulier les cellules CD48- LSK qui sont CD34- et CD150haute20,21. Cependant, la subdivision des cellules CD48- LSK par l'expression CD150 et CD34 n'a révélé aucune différence significative dans la coloration mitochondriale de ROS parmi ces six sous-ensembles de HSPC (figure 3C).

Figure 1
Figure 1 : Représentation schématique du flux de travail du protocole. Étape 1) isolement de BM des souris leucémiques saines et mL-AF9 ; Étape 2) coloration cellulaire à l'aide d'un colorant ROS mitochondrial (mROS); Étape 3) coloration cellulaire avec des anticorps monoclonaux fluorochromes pour discriminer la population de cellules hématopoïétiques et progénitrices (HSPc) chez des souris saines et leucémiques; Étape 4) Acquisition et analyse de Cytométrie de flux de ROS mitochondrial dans plusieurs populations de HSPC. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Stratégies de gating de cytométrie de flux pour les cellules saines et MLL-AF9-exprimant la moelle. (A) Les cellules De MB isolées de souris saines ont été tachées d'un colorant vivant/mort (QDot), colorant ROS mitochondrial (TRPE). BM de souris saines a été plus tard souillé avec des anticorps reconnaissant des marqueurs de lignée plus CD48 (Cy5-PE), c-Kit (Cy7-APC), Sca1 (PacBlue), CD34 (FITC), CD150 (APC). (B) En plus des taches DE ROS à cellules vivantes/mortes et mitochondriales, les bM des souris de leucémie ont également été souillés avec des anticorps reconnaissant des marqueurs de lignée plus CD48 (Cy5-PE), c-Kit (Cy7-APC), Sca1 (PacBlue) et CD45.2 (APC), qui est appliqué à la discrimination entre les cellules leucémiques MLL-AF9 provenant de cellules BM bénéficiaires en bonne santé (CD45.1). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Niveaux de ROS mitochondrial dans la moelle saine et mLL-AF9. Les panneaux de gauche sont des histogrammes représentatifs des niveaux de ROS mitochondriaux des populations indiquées et les panneaux droits respectifs représentent des analyses graphiques à barres de l'IMF du ROS mitochondrial pour les populations indiquées (n - 4). (A) Comparaison des niveaux mitochondriaux de ROS dans les cellulessaines de CD48- LSK, myéloïdes aussi bien que MLL-AF9 Linbas c-KitHigh et MLL-AF9 Lin bas c-KitInt-Low cellules. (B) Comparaison des niveaux mitochondriaux de ROS dans les cellules saines de CD48- de LSK basées sur leur expression de CD150 contre MLL-AF9 Linbas c-Kitélevé et MLL-AF9 Linbas c-KitInt-Low cellules. (C) Comparaison des niveaux mitochondriaux de ROS dans les cellules saines de CD48- de LSK basées sur leur expression de CD150 et de CD34. (p '0,05; 'p 'lt; 0.01 'p 'lt; 0.001; 'p 'lt; 0.0001). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Changements dans les niveaux de ROS mitochondrial utilisant des composés pro et anti-oxydants. Histogrammes de ROS mitochondrial dans des cellules BM saines et exprimant MLL-AF9 traitées avec 20 M de bisulfite de sodium menadione (MSB) pendant 1 h à 37 oC dans un incubateur de CO2 de 5 % (contrôle positif) ou avec 20 M de MSB en combinaison avec 100 M N-acétyl-L-cystéine (NAC) pendant 1 h à 37 oC dans un incubateur de CO2 de 5 %. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Optimisation du ROS mitochondrial et des taches d'anticorps de lignée-reconnaissance. (A) Comparaison des niveaux de ROS mitochondrial (mROS) dans MLL-AF9 exprimant des cellules leucémiques utilisant 1 ou 5 M pour 10 ou 30 min. (Rouge et véhicule; Bleu et MSB 20 m; Vert - CNA 100 M; Orange msb 20 M et NAC 100 M). (B) Comparaison de l'IMF du canal CD34 (FITC) dans des LSK sains tachés pendant 20, 60 ou 90 min avec le cocktail d'anticorps #1 (n 4, p 0,05; p 'lt; 0,01). (C) Comparaison des anticorps tachés avant ou après l'incubation pendant 30 min à 37 oC dans un incubateur de CO2 de 5 %. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Ordre de la coloration mitochondriale de ROS et d'anticorps de marqueur de lignée. (A) Les parcelles ponctuelles des populations indiquées de HSPC ont obtenu en utilisant différents ordres de coloration. (B) Les niveaux de ROS mitochondrial évalués dans les compartiments LSK et Myeloid Progenitors obtenus ont utilisé différents ordres de coloration (rouge et coloration d'anticorps pendant 1 h à 4 oC, suivis de la coloration mitochondriale ROS pendant 10 min à 37 oC; La coloration ros mitochondriale bleu-mitochondrial pendant 10 min à 37 oC, suivie de la coloration des anticorps 1h à 4 oC). (C) Quantification de l'IMF de la coloration mitochondriale ROS (mROS) à l'aide de différents ordres de coloration dans les populations indiquées (n ' 4, p ' 0,05). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7
Figure 7 : Impact du traitement du verapamil sur la coloration mitochondriale de colorant de ROS dans les cellules saines et MLL-AF9-exprimant bM. (A) Les parcelles ponctuelles des populations indiquées de HSPC dans des échantillons traités avec ou sans 50 M Verapamil pendant 10 min à 37 oC dans un incubateur de CO2 de 5 %. (B) Histogrammes de ROS mitochondrial et de colorant vert mitoMASS colorant dans les populations indiquées de HSPC en présence (bleu) ou absence (rouge) de 50 'M Verapamil. (C-E) Quantification des niveaux de ROS mitochondrial dans les populations de cellules saines indiquées (C et D) et de leucémie (E) dans des échantillons de BM traités avec ou sans Verapamil de 50 M au cours de la coloration mitochondriale de ROS (n - 4, p - 0,05). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Table 1
Tableau 1 : Cocktails anticorps. Liste des cocktails d'anticorps préparés à l'étape 3.1. identifier diverses sous-populations hématopoïétiques au sein de la moelle osseuse saine et laleucémie.

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Discussion

Les colorants fluorogéniques qui ont été développés pour la détection de ROS sont fréquemment évalués dans les cellules fixes par microscopie ou dans les cellules vivantes par cytométrie de flux22. L'évaluation cytométrique de flux du ROS mitochondrial dans les cellules de BM utilisant les colorants fluorogenic mitochondriaux de ROS a deux avantages principaux : 1) C'est une technique rapide et simple qui convient à l'analyse de cellules vivantes et 2) elle permet de distinguer et d'analyser rare populations au niveau unicellulaire dans le BM à l'aide de la coloration des marqueurs de surface. Le protocole étape par étape présenté ici a été développé pour étudier le statut redox ex vivo des populations hématopoïétiques de tige et d'ancêtre des souris saines aussi bien qu'un modèle de souris de AML conduit par MLL-AF9 utilisant la cytométrie de flux. Il y a plusieurs variables techniques clés qui doivent être prises en compte lors de l'exécution de ce protocole.

Tout d'abord, l'utilisation de contrôles pro et anti-oxydants permet à l'utilisateur d'établir une ligne de base pour les augmentations de la coloration ROS mitochondriale ainsi que la spécificité de la tache. Pour le protocole présenté ici, le MSB pro-oxydant a été utilisé comme un contrôle positif pour une induction détectable de la coloration ros mitochondriale dans les deux cellules saines et la leucémie BM (Figure 4). Le CNA anti-oxydant peut être utilisé comme un contrôle supplémentaire, car il inverse en grande partie la coloration ROS mitochondriale induite par MSB (Figure 4).

Deuxièmement, le colorant fluorogène ROS mitochondrial utilisé dans cette étude est recommandé pour être utilisé à une concentration de 5 M pour 10 min. Cependant, le fabricant suggère également que la concentration et le temps de coloration peuvent varier d'un type de cellule à l'autre. Dans cette étude, la coloration mitochondriale de ROS a été comparée à la fois à 1 M et 5 M pour 10 ou 30 min. L'analyse a révélé qu'une concentration de 5 M pour 10 à 30 min est suffisante pour détecter les changements médiés par mSB dans le ROS mitochondrial ainsi que ceux inversés par le traitement du CNA (figure 5A). Comme il n'y avait pas de différence quantitative entre 10 et 30 min, un temps de coloration de 10 min a été choisi pour cette étude afin de minimiser la durée de l'analyse.

Troisièmement, les temps d'incubation des anticorps CD34 varient dans la littérature de 20 à 90 min23,24. Pour optimiser le protocole présenté ici, les cellules de moelle osseuse murine ont été incubées avec le cocktail d'anticorps #1 (étape 3.1) pendant 20, 60 ou 90 min. Comme le montre la figure 5B, des taches cD34 significativement plus fortes ont été observées sur les cellules tachées pendant 60 ou 90 min par rapport à la tache de 20 min. Cependant, une différence significative dans la coloration CD34 n'a pas été observée entre les temps d'incubation des anticorps de 60 et 90 min (figure 5B) et donc une tache d'anticorps de 60 min est recommandée pour le protocole présenté.

Quatrièmement, dans le protocole présenté, les cellules saines et lelecoles sont d'abord souillées avec le colorant fluorogène mitochondrial de ROS, lavées puis souillées avec des anticorps fluorochrome-liés de lignée. Bien qu'une évaluation directe de la combinaison de la tache mitochondriale DE ROS avec des anticorps de lignée n'ait pas été conduite dans cette étude, une évaluation de la coloration fluorochrome-liée d'anticorps de lignée a été astomise sous des conditions mitochondriales de coloration de ROS pour 10, 20 et 30 min à 37 oC. Cette analyse a révélé que 30 min d'incubation à 37 oC modifie considérablement la coloration des marqueurs de surface de la lignée (figure 5C). En outre, la coloration mitochondriale de ROS a été évaluée par d'abord, taclant les cellules saines de BM avec des anticorps fluorochrome-liés de lignée suivis de coloration avec le colorant fluorogenic mitochondrial de ROS aussi bien que l'ordre d'action d'inverse. Les cellules de coloration d'abord avec des anticorps de lignée suivis de la coloration mitochondriale de ROS ont eu comme conséquence les signaux mitochondriaux inférieurs de ROS comparés au protocole de coloration de l'inverse (figure 6A,B) - y compris les différences significatives pour CD48- LSK CD150high, CD48- LSK CD150Int CD34 et populations d'ancêtres myéloïdes (figure 6C).

Cinquièmement, des études récentes montrent que différentes populations de HSPC saines murines possèdent des capacités distinctes pour effacer plusieurs sondes fluorogéniques de coloration mitochondriale telles que celles utilisées pour évaluer la masse mitochondriale (ci-après appelée mitoMASS vert) ou potentiel25,26. Par conséquent, l'impact du verapamil d'inhibiteur de pompe d'efflux sur la coloration des progéniteurs sains et de leucémie avec le colorant fluorogenic mitochondrial de ROS a été également évalué. La coloration simultanée des HSPC avec le ROS mitochondrial n'a pas modifié la coloration d'anticorps de marqueur de lignée (figure 7A), cependant, le verapamil a amélioré de manière significative les signaux mitochondriaux de coloration de ROS dans une série de saines et de leucémie populations d'ancêtres(figure 7B,C). Notamment, l'ampleur de l'amélioration de la coloration ROS mitochondriale par le verapamil n'était pas aussi grande que celle observée avec le colorant fluorogénique vert mitoMASS (Figure 7B).

Sixièmement, dans le protocole présenté ici, les cellules de BM ont été récupérées en enlevant les bouts d'os (épiphysis) suivis du rinçage des os. Cependant, l'épiphyse contient des cellules hématopoïétiques qui pourraient potentiellement être perdues par le rinçage des os. Comme alternative, les cellules DeM peuvent être extraites en écrasant des os avec un mortier et un pilon comme précédemment décrit12,13.

Le protocole présenté ici fournit une base pour l'utilisation de colorants fluorogènes pour mesurer la biologie du redox intracellulaire dans les cellules vivantes extraites d'organismes vivants. Cependant, il est important de noter qu'aucun colorant fluorogénique unique ne peut être supposé être définitivement spécifique et donc des études supplémentaires avec des méthodes alternatives devraient être menées pour vérifier les résultats. En outre, les résultats de cette étude suggèrent que les populations de cellules leucémiques enrichies pour les LICs (c.-à-d., Linfaible cKitélevé) montrent des niveaux plus élevés de ROS mitochondrial que les progéniteurs myéloïdes sains ou d'autres populations de HSPC. Cependant, la population élevée de cellules deleucémie deCKit basse de Lin évaluée ici s'est avérée hétérogène et peut être subdivisée par d'autres marqueurs de lignée11,27. En outre, des études récentes montrent que les SIF possèdent un phénotype métabolique distinct28. Par conséquent, les études futures évaluant le ROS mitochondrial en parallèle avec des essais métaboliques ou des sondes aussi bien que des anticorps additionnels de marqueur de lignée seront instructives.

Ce protocole simple permet la mesure des niveaux mitochondriaux de ROS dans les cellules hématopoïétiques vivantes et peut fournir une base pour étudier la biologie de redox des cellules de tige et d'progénitrice saines et malades aussi bien que pour évaluer l'efficacité des cellules de tige et d'progéniture saines et malades aussi bien que pour évaluer l'efficacité de thérapies redox-ciblage.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le Fox Chase Cancer Center Board of Directors (DDM), l'American Society of Hematology Scholar Award (SMS), l'American Cancer Society RSG (SMS) et le Department of Defense (Award: W81XWH-18-1-0472).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Heat inactivated FBS VWR Seradigm LIFE SCIENCE 97068-085 Media
Penicillin Streptomycin Corning 30-002-CI Media
PBS Fisher Scientific BP399-20 Buffer
15 mL conical tube BD falcon 352096 Tissue Culture Supplies
50 mL conical tube BD falcon 352098 Tissue Culture Supplies
40 μm cell strainers Fisher Scientific 22-363-547 Tissue Culture Supplies
RBC Lysis Buffer Fisher Scientific 50-112-9751 Tissue Culture Supplies
Menadione sodium Bisulfite Sigma aldrich M5750 Pro-oxidant
NAC Sigma aldrich A7250 Anti-oxidant
CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11 Biolegend 100310 Antibody
CD4 PE-Cy5 clone RM4-5 eBioscience 15-0041-81 Antibody
CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7 eBioscience 15-0081-81 Antibody
CD19 PE-Cy5 clone 6D5 Biolegend 115510 Antibody
B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2 Biolegend 103210 Antibody
Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5 Biolegend 108410 Antibody
Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119 Biolegend 116210 Antibody
CD48 PE-Cy5 clone HM48-1 Biolegend 103420 Antibody
CD117  APC-Cy7 clone 2B8 Biolegend 105825 Antibody
Sca1 peacific Blue clone D7 Biolegend 108120 Antibody
CD150 APC clone TC15-12F12.2 Biolegend 115909 Antibody
CD34 FITC clone RAM34 BD Bioscience 553733 Antibody
CD45.2 APC clone 104 Biolegend 1098313 Antibody
MitoSOX Red ThermoFisher Scientific M36008 Dye
Mitotracker Green ThermoFisher Scientific M7514 Dye
Live/dead Yellow Dye ThermoFisher Scientific L34967 Dye

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References

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Recherche sur le cancer Numéro 151 LAM HSCs ROS superoxydes mitochondries cytomètre de flux
Analyse cytométrique de flux des espèces réactives d'oxygène mitochondrial dans les cellules hématopoïétiques de tige et de progéniture de Murine et la leucémie entraînée mLL-AF9
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Di Marcantonio, D., Sykes, S. M.More

Di Marcantonio, D., Sykes, S. M. Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia. J. Vis. Exp. (151), e59593, doi:10.3791/59593 (2019).

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