Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Flödescytometrisk analys av mitokondriella reaktiva syreradikaler i murina hematopoietiska Stem och progenitorceller och MLL-AF9 driven leukemi

Published: September 5, 2019 doi: 10.3791/59593

Summary

Vi beskriver en metod för att använda multiparametrar flödescytometri för att detektera mitokondriella reaktiva syreradikaler (ros) i murina friska hematopoietiska stamceller och stamceller (hspcs) och leukemiceller från en musmodell av akut myeloisk leukemi (AML) driven av MLL-AF9.

Abstract

Vi presenterar ett flöde kors metod för att analysera mitokondrie ros i olika levande benmärg (BM)-härledda stamceller och stamcells populationer från friska möss samt möss med AML drivs av MLL-AF9. Specifikt, vi beskriver en två-stegs cell färgning process, där friska eller leukemi BM celler först färgas med ett fluorogent färgämne som detekterar mitokondriella superoxider, följt av färgning med fluorkrom-länkade monoklonala antikroppar som används att särskilja olika friska och maligna hematopoietiska stamceller. Vi erbjuder också en strategi för att förvärva och analysera proverna med flödescytometri. Hela protokollet kan utföras i en tidsram så kort som 3-4 h. Vi belyser också de viktigaste variablerna att överväga samt fördelar och begränsningar av övervakning av ROS produktion i mitokondriella facket av levande hematopoetisk och leukemi stamceller och stamcells subpopulationer med hjälp av fluorogena färgämnen genom flödescytometri . Dessutom presenterar vi data som mitokondriell ROS överflöd varierar mellan olika friska HSPC sub-populationer och leukemi stamceller och diskutera de möjliga tillämpningarna av denna teknik i hematologisk forskning.

Introduction

Reaktiva syreradikaler (ROS) är mycket reaktiva molekyler som härrör från molekyl syre. Den mest väldefinierade cellulära platsen för ROS produktion är mitokonmöen, där elektroner som passerar genom elektrontransportkedjan (ETC) under oxidativ fosforylering (OXFOS) absorberas av molekylärt syre som leder till bildandet av en specifik typ av ROS som kallas superoxider1. Genom åtgärder av en serie enzymer, kallade superoxiddismutaser eller SODs, omvandlas superoxider till väteperoxider, som därefter neutraliseras till vatten av enzymer som katalas eller glutationperoxiaser (GPX). Perturbations i ROS-reglerande mekanismer kan leda till överskottsproduktion av ROS, ofta kallad oxidativ stress, som har skadliga och potentiellt dödliga cellulära konsekvenser såsom makromolekyl skada (dvs., DNA, protein, lipider). Dessutom är oxidativ stress relaterad till flera patologier, såsom diabetes, inflammatoriska sjukdomar, åldrande och tumörer2,3,4. För att bibehålla redox homeostas och förhindra oxidativ stress, celler besitter en mängd olika ROS-reglerande mekanismer5.

Fysiologiska nivåer av vissa ROS är nödvändiga för korrekt embryonala och vuxna hematopoies6. Emellertid, överskott ROS är förknippad med DNA-skador, cellulära differentiering och utmattning av den hematopoietiska stammen och stamcells bassängen. Det finns också belägg för att förändringar i redox biologi kan skilja mellan leukemi och friska celler. Till exempel, ros nivåer tenderar att vara högre i akut myeloisk leukemi (AML) celler i förhållande till deras friska motsvarigheter och andra studier har föreslagit att leukemi stamceller upprätthålla en låg steady-state nivå av ros för överlevnad7,8. Viktigare, strategier för terapeutiskt kapitalisera på dessa redox skillnader har visat löfte i flera mänskliga cancer inställningar9,10. Därför, analyser som gör det möjligt att bedöma ROS nivåer i musmodeller kan förbättra vår förståelse för hur dessa arter bidrar till cellulär fysiologi och sjukdomens patogenes samt potentiellt tillhandahålla en plattform för att bedöma effektiviteten av Roman redox-inriktning mot cancerterapier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla de djur förfaranden som beskrivs i detta protokoll har godkänts av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) på Fox Chase Cancer Center.

Anmärkning: Protokollet arbetsflöde är uppdelat i 4 delar som presenteras i figur 1 och de nödvändiga reagenser anges i tabellen av material.

1. isolering av benmärg (BM)

Anmärkning: MLL-AF9 leukemi möss genererades som beskrivits tidigare11.

  1. Återvinna mono-nukleära benmärgsceller, som beskrivits tidigare12,13,14,15, från vilda typ C57. Bl6 möss (som uttrycker CD 45,2 kongena markör) samt från C57. Bl6-SJL möss (som uttrycker CD 45,1 congenic markör) som har transplanterats med MLL-AF9-uttrycker leukemiceller (CD 45,2+).
    Anmärkning: BM kan återvinnas från möss antingen genom att krossa12,13 eller genom att spola benen14,15. För de experiment som presenteras här, var BM återvinns från både friska och leukemi möss via spolning.

2. mitokondriell ROS Fluorogena Dye färgning

  1. När mono-nukleära benmärgsceller har återvunnits från friska och/eller leukemi möss, fläcken en alikvot av celler med Trypan blå och räkna med hjälp av en hemocytometern att bestämma start antalet totalt BM celler.
  2. Centrifugera cellerna vid 300 x g i 5 min. aspirera på supernatanten och Omsuspendera pelleten i F-PBS (PBS kompletterad med 2% foster bovint serum och en 1% penicillin/streptomycin cocktail) till en koncentration av 2 x 106 celler/ml.
  3. Aliquot 200 μL cellsuspension per tub till 9 enfärgade kontrollrör märkta enligt följande:
    Ingen fläck, B220-Cy5-PE, cKit-Cy7-APC, Sca1-PacBlue, CD150-APC (endast för friska HSPCs), CD 45,2-APC (endast för leukemiceller), CD34-FITC, mitokondrie ROS Dye och Live/Dead cell Stain.
    Anmärkning: Valfritt En positiv kontroll för induktion av mitokondrie ROS kan förberedas genom att behandla 2 x 105 celler i 200 μl med 20 ΜM Menadionnatriumbisulfit (MSB) för 1 h vid 37 ° c i en 5% Co2 inkubator. En andra kontroll för att vända den MSB-medierade induktion av mitokondrie ROS kan förberedas genom att behandla 2 x 105 celler i 200 μl med 20 ΜM MSB plus 100 μm N-acetyl-L-cystein (NAC) för 1 h vid 37 ° c i en 5% Co2 inkubator.
  4. Aliquot de resterande cellerna i ett rör (experimentell tub) och centrifugera vid 300 x g för 5 min.
  5. Omsuspendera cellerna i F-PBS med en levande/död cell fläck enligt tillverkarens anvisningar. Inkubera på isen i 30 min. var noga med att lägga till levande/död fläck till enfärgade kontroll röret.
  6. Tillsätt 1,0 mL rumstemperatur (RT) F-PBS till både enfärgade och experimentella rör färgade med levande/döda färgämnet. Centrifugera 5 min vid 300 x g vid RT.
  7. Omsuspendera 50 μg av mitokondrie ROS färgen i 13 μL dimetylsulfoxid (DMSO) för att erhålla en 5 mM stamlösning.
  8. Späd mitokondriellt ROS-färg till en slutlig koncentration av 5 μM i RT F-PBS med eller utan verapamil (50 μM).
  9. Aspirera bort tvätten av levande/döda cell fläcken. Tillsätt 200 μL av mitokondriell ROS Dye fläck innehållande verapamil till varje experimentell slang samt mitokondriella ROS Dye enfärgade kontroll röret.
  10. Vortex att blanda och inkubera i 10 min vid 37 ° c i mörker.
  11. Tillsätt 1,0 mL RT F-PBS till de mitokondriella ROS-färgade enfärgade kontroll och experimentella rör. Centrifugera 5 min vid 300 x g vid RT.
  12. Aspirera bort supernatanten och tvätta cellerna med ytterligare 1,0 mL RT F-PBS. Centrifugera 5 min vid 300 x g vid RT.

3. infärgning av härstamning

  1. Förbered de antikropps cocktails som listas i tabell 1.
    Anmärkning: Dessa antikroppar cocktails har optimerats tidigare14,15,16.
  2. Aspirera supernatanten från den slutliga mitokondriella ROS färgämne tvätta av experimentella rör som innehåller friska BM och tillsätt 200 μL av antikropp cocktail #1 till varje tub. Virvel för att blanda. Också förbereda enfärgade kontroll rören. Inkubera i 60 min på is i mörkret.
  3. Aspirera supernatanten från den slutliga mitokondriella ROS färgämne tvätta av experimentella rör som innehåller leukemi BM och tillsätt 200 μL av antikropp cocktail #2 till varje tub. Virvel för att blanda. Inkubera i 60 min på is i mörkret.
  4. Tvätta med 1,0 mL kallt F-PBS och centrifugera 5 min vid 300 x g vid RT.
  5. Omsuspendera cellerna i 500 μL kallt F-PBS och filtrera cellerna i ett flödescytometerrör med ett 40 μm-filter för att utesluta aggregat.

4. flöde Cytometry förvärv och analys

Anmärkning: Flera hematopoietiska stamceller och progenitorsubsets är sällsynta, såsom långsiktiga hematopoietiska stamceller. Därför bör helst 3-5 miljoner händelser samlas in för varje experimentell slang under flödescytometri förvärv för tillräcklig analys av mitokondriella ROS i de olika HSPC undergrupper.

  1. Använd No-Stain-styrröret för att ställa in spridningsdiagram för framåt (FSC-A) och Side (SSC-A) baserat på storleken och komplexiteten hos cellpopulationen som analyseras.
  2. För att kompensera flödescytometern ska du använda kontroll rören No-Stain och Single-Color.
  3. Grind ut ovidkommande skräp från framåt och sida scatter Plot (figur 2A, B, första panelen från vänster).
  4. Grind ut dubletter med hjälp av en dubbel diskriminator som framåt diskriminator (figur 2a, B, andra panelen från vänster).
  5. Följ den gating strategi som föreslås i figur 2A,B för att välja levande celler, härstamning låga celler och olika HSPC och leukemi undergrupper.
  6. För varje population av intresse analysera median fluorescensintensiteten (MFI) för TRPE-kanalen (x-axeln) i ett histogramdiagram för att utvärdera skillnader i mitokondriell ROS-signalen (figur 3a-C, vänster paneler). Nivåer av mitokondriella ROS kan utvärderas på Single-cellnivå genom att jämföra mitokondriell ROS färgning kontra specifika härstamning markörer i ett spridningsdiagram.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Presenteras är en metod för att analysera ROS i mitokonan av flera friska och MLL-AF9-uttrycker leukemi progenitorceller populationer. Bild 1 visar en schematisk vy över protokollets arbetsflöde, som består av 4 huvudsteg: 1) BM-isolering från möss. 2) färgning BM celler med ett fluorogent färgämne som erkänner mitokondriella ROS, särskilt superoxider; 3) ytmarkör antikropp färgning för att avgränsa olika friska och leukemi hematopoietiska populationer; och 4) flödescytometri förvärv och analys.

Figur 2 A, B skildrar en representativ gating strategi för att analysera olika hematopoietiska Stem och stamfader populationer i friska och leukemi BM. En FSC/SSC-plan appliceras för att eliminera skräp och ett FSC-område (FSC-A) kontra FSC-höjd (FSC-H) tomt används för att utesluta dubletter och aggregat. En panel av härstamnings yta markörer (tabell 1 och steg 3,1) kombineras för att utesluta en mängd mogna hematopoietiska populationer såsom lymfocyter, erytrocyter, granulocyter och monocyter/makrofager (dvs., härstamning låg eller linlåg). Den Lineage cocktail innehåller också en CD48 antikropp och därför alla undergrupper av härstamning låga celler är också CD48-. SCA-1-och c-kit-cellytans uttryck används för att särskilja en heterogen blandning av HSPCs som kallas CD48- lsks (linLow, SCA-1+, c-kit+, CD48-) från myeloida stamceller (linLow, SCA-1- , c-kit+, CD48-). För att ytterligare särskilja olika HSPC-undergrupper läggs även slam-markören, CD150 och CD34 till17,18,19,20,21. Figur 2 B skildrar också en representativ gating strategi för ckit höguttrycker leukemi progenitorer (linlåg, c-kithög; SCA-1-), som är berikade för leukemi initiera celler (LICs)11 samt leukemiceller uttrycker mellanliggande-låg uttryck för ckit (ckitint-Low).

En jämförelse av mitokondrie ROS färgning mellan friska CD48- LSK och myeloida stamceller visar att myeloida stamceller uppvisar signifikant högre nivåer av MITOKONDRIELL ros färgning (figur 3A). Dessutom, cKithög leukemi progenitorer visar betydligt högre nivåer av MITOKONDRIELL ros färgning jämfört med CD48- LSK, myeloida stamceller eller ckitint-låg leukemiceller (figur 3A). cKitint-låg leukemiceller visade också signifikant högre mitokondriell ros färgning jämfört med CD48- LSK celler men inte till myeloida stamceller (figur 3a). LSKs ytterligare sub-dividerat med CD150 uttryck visade att mitokondrie ROS färgning inte signifikant varierar i CD48- LSK celler sub-DIVIDERAT med CD150 hög (CD150hög), mellanliggande (CD150int) eller nej (CD150neg) uttryck (figur 3B). Emellertid, steady-state mitokondriella ROS färgning av cKithög eller ckitint-låg leukemiceller konstaterades vara betydligt högre än CD48-lsks-CD150hög,-CD150int eller-CD150neg celler ( Figur 3B). LSK-celler som uttrycker låga till inga nivåer av CD34 är berikade för långtids beredning av hematopoietiska stamceller, särskilt CD48-LSK-celler som ärCD34- och CD150höga20,21. Att dela upp CD48-LSK-celler med CD150 och CD34 uttryck visade dock inte på några signifikanta skillnader i mitokondriell ROS färgning bland dessa sex HSPC- undergrupper (figur 3C).

Figure 1
Figur 1 : Schematisk representation av protokollets arbetsflöde. Steg 1) BM isolering från friska och MLL-AF9 leukemi möss; Steg 2) cellulär färgning med hjälp av en mitokondriell ROS Dye (mROS); Steg 3) cellulär färgning med fluorkromkopplade monoklonala antikroppar för att diskriminera hematopoietiska stamceller och stamcells celler (HSPCs) hos friska och leukemiska möss. Steg 4) flödescytometri förvärv och analys av mitokondriella ROS i flera HSPC populationer. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Flow flödescytometrianalys gating strategier för friska och MLL-AF9-uttrycker benmärgsceller. (A) BM-celler som isolerats från friska möss färgas med ett levande/dött färgämne (qdot), MITOKONDRIELL ros Dye (trpe). BM från friska möss färgas därefter med antikroppar som erkänner Lineage markörer plus CD48 (Cy5-PE), c-kit (Cy7-APC), Sca1 (PacBlue), CD34 (FITC), CD150 (APC). (B) förutom levande/död cell och MITOKONDRIE ros fläckar, BM från leukemi möss var också färgas med antikroppar erkänna Lineage MARKÖRER plus CD48 (CY5-PE), c-kit (CY7-APC), Sca1 (pacblue) och CD 45,2 (APC), som tillämpas för att diskriminera mellan MLL-AF9 leukemiceller från friska mottagare BM celler (CD 45,1). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Mitokondriella ros nivåer i friska och MLL-AF9 benmärg. Lämnade paneler är representativa histogram av mitokondrial ros jämnar av de indikerade befolkningarna och de respektive högra panelerna föreställer bommar för diagram analyser av MFI av mitokondrial ros för de indikerade befolkningarna (n = 4). Ajämförelse av MITOKONDRIELLA ros nivåer hos friska CD48- LSK, MYELOIDA stamceller samt MLL-AF9 linLow c-kithög och MLL-AF9 linLow c-kitint-Low Cells. (B) jämförelse av MITOKONDRIELLA ros nivåer i friska CD48- LSK celler baserat på deras CD150 uttryck kontra MLL-AF9lin Low c-kithög och MLL-AF9 linLow c-kitint-Low Cells. Cjämförelse av MITOKONDRIELLA ros nivåer i friska CD48-LSK- celler baserat på deras CD150 och CD34 uttryck. (* p ≤ 0,05; * * p < 0,01 * * * p < 0,001; * * * * p < 0,0001). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Förändringar i mitokondriella ros nivåer med hjälp av Pro-och antioxidant föreningar. Histogram av mitokondriella ROS-nivåer i friska och MLL-AF9-uttrycker BM-celler behandlade med 20 μM menadionnatriumbisulfit (MSB) för 1 h vid 37 ° c i en 5% CO2 inkubator (positiv kontroll) eller med 20 ΜM MSB i kombination med 100 μm N-acetyl-L-cystein (NAC) för 1 h vid 37 ° c i en 5% CO2 inkubator. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Optimering av mitokondriella ros och härstamning-erkänna antikropp fläckar. (A) jämförelse av mitokondrie ros (Mros) nivåer i MLL-AF9 uttrycker leukemiceller med 1 eller 5 μm för antingen 10 eller 30 min. (röd = fordon; Blå = MSB 20 μM; Grön = NAC 100 μM; Orange = MSB 20 μM + NAC 100 μM). (B) jämförelse av MFI i CD34 Channel (FITC) i friska lsks färgas i 20, 60 eller 90 min med antikropp cocktail #1 (n = 4, * p ≤ 0,05; * * p < 0,01). C) jämförelse av antikroppar som färglägger före eller efter inkubering i 30 minuter vid 37 ° c i en 5% Co2 -inkubator. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : Order av mitokondriell ros och Lineage markör antikropp färgning. A) punktdiagram över de angivna HSPCs-populationerna som erhållits genom användning av olika färgningsordningar. (B) mitokondriella ros nivåer som utvärderats i LSK och myeloida stamceller erhållna används olika ordning av färgning (röd = antikropps färgning för 1 h vid 4 ° c följt av mitokondrie ros färgning i 10 min vid 37 ° c; Blå = mitokondriell ROS färgning i 10 min vid 37 ° c följt av antikropps färgning 1H vid 4 ° c). C) kvantifiering av MFI i MITOKONDRIELL ros (Mros) färgning med hjälp av olika färg fläckar i de angivna populationerna (n = 4, * p ≤ 0,05). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7 : Effekten av verapamil behandling på mitokondriella ros färgämne färgning i friska och MLL-AF9-uttrycker BM celler. A) punktdiagram över de angivna HSPC-populationerna i prover som behandlats med eller utan 50 ΜM verapamil i 10 minuter vid 37 ° c i en 5% Co2 -inkubator. (B) histogram av MITOKONDRIE ros och mitoMASS grön färgämne färgning i de angivna HSPC populationer i närvaro (blå) eller frånvaro (röd) av 50 ΜM verapamil. (C-E) Kvantifiering av mitokondriella ROS-nivåer i de indikerade friska (C & D) och leukemi (E) cellpopulationer i BM-prover som behandlats med eller utan 50 μM verapamil under mitokondriell ROS-färgning (n = 4, * p ≤ 0,05). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Table 1
Tabell 1: cocktails med antikroppar. Lista över antikropps cocktails som förberetts i steg 3,1. att identifiera olika hematopoietiska sub-populationer inom friska och leukemi benmärg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fluorogena färgämnen som har utvecklats för detektion av ROS är ofta utvärderas i fasta celler av mikroskopi eller i levande celler med flödescytometri22. Flödescytometrisk utvärdering av mitokondriella ROS i BM-celler med mitokondriella ROS-fluorogena färgämnen har två stora fördelar: 1) det är en snabb och enkel teknik som är lämplig för levande cell analys och 2) det gör det möjligt för att skilja och analysera sällsynta populationer på Single-cellnivå i BM med hjälp av yta markör färgning. Det steg-för-steg-protokoll som presenteras här har utvecklats för att studera ex vivo redox status för hematopoietisk Stem och stamfader populationer från både friska möss samt en musmodell av AML drivs av MLL-AF9 med hjälp av flödescytometri. Det finns flera viktiga tekniska variabler som måste beaktas vid utförandet av detta protokoll.

Första, användning av Pro-och antioxidant kontroller tillåter användaren att etablera en baslinje för ökningar i mitokondriella ROS färgning samt specificiteten av fläcken. För det protokoll som presenteras här, den Pro-oxidant MSB utnyttjades som en positiv kontroll för en detekterbar induktion av mitokondrie ROS färgning i både friska och leukemi BM celler (figur 4). Den antioxidant NAC kan användas som en extra kontroll, eftersom det till stor del vänder mitokondrie ROS färgning induceras av MSB (figur 4).

För det andra, den mitokondriella ROS fluorogena färgämne som används i denna studie rekommenderas att användas vid en koncentration av 5 μM för 10 min. Tillverkaren föreslår dock också att koncentrationen och tiden för färgning kan variera mellan olika celltyper. I denna studie jämfördes mitokondriell ROS färgning på både 1 μM och 5 μM för antingen 10 eller 30 min. Analysen visade att en koncentration av 5 μM för antingen 10 till 30 min är tillräcklig för att upptäcka MSB-medierade förändringar i mitokondrie ROS samt de som vändas av NAC behandling (figur 5a). Eftersom det inte fanns någon kvantitativ skillnad mellan 10 och 30 min valdes en infärgnings tid på 10 min för denna studie för att minimera analysens längd.

Tredje, CD34 antikropp inkubationstider varierar inom litteraturen från 20 till 90 min23,24. För att optimera det protokoll som presenteras här, murina benmärgsceller inkuberades med antikropp cocktail #1 (steg 3,1) för 20, 60 eller 90 min. Som visas i figur 5b, observerades signifikant starkare CD34 färgning på celler som färgas för 60 eller 90 min jämfört med 20 min fläcken. En signifikant skillnad i CD34 färgning observerades dock inte mellan antikropps inkubationstider på 60 och 90 min (figur 5b) och därför rekommenderas en 60 min antikropps fläck för det presenterade protokollet.

För det fjärde, i det presenterade protokollet, både friska och leukemiceller först färgas med mitokondriella ROS fluorogena färgämne, tvättas och sedan färgas med fluorokrom-länkade härstamning antikroppar. Även om en direktbedömning av kombinationen av mitokondriet ROS fläcken med härstamning antikroppar inte genomfördes i denna studie, en utvärdering av fluorokrom-länkade Lineage antikropp färgning var analyseras under mitokondriella ROS färgning villkor för 10, 20 och 30 min vid 37 ° c. Denna analys visade att 30 min av inkubation vid 37 ° c väsentligen förändrar Lineage yta markör färgning (figur 5c). Dessutom utvärderades mitokondriell ROS färgning av först, färgning friska BM celler med fluorokrom-länkade härstamning antikroppar följt av färgning med mitokondriella ROS fluorogena färgämne samt vice versa ordning operationer. Infärgnings celler först med härstamning antikroppar följt av mitokondriell ROS färgning resulterade i lägre mitokondrie ROS signaler jämfört med vice versa färgning protokoll (figur 6a, B)-inklusive betydande skillnader för CD48- LSK CD150hög, CD48- LSK CD150int CD34 och myeloida stamfader populationer (figur 6c).

Femte, nyare studier visar att olika murina friska HSPC populationer besitter distinkta förmågor att efflux flera mitokondriell färgning fluorogena sonder såsom de som används för att bedöma mitokondriell massa (hädanefter kallad mitoMASS Green) eller potentiell25,26. Därför bedömdes effekten av effluxpumphämmaren verapamil på färgning av friska och leukemi stamceller med mitokondrierna ROS fluorogena färgämnet också. Samtidig färgning av HSPCs med mitokondrie ROS förändrade inte Lineage markör antikropp färgning (figur 7a), men verapamil avsevärt förbättra mitokondrie ros färgning signaler i en mängd olika friska och leukemi stamceller (figur 7b, C). I synnerhet var omfattningen av förbättrade mitokondriella ROS färgning av verapamil inte lika stor som den som sågs med mitoMASS gröna fluorogena färgämne (figur 7b).

För det sjätte, i det protokoll som presenteras här, var BM celler återvinnas genom att ta bort benet tips (Epifys) följt av spolning av benen. Emellertid, epifysen innehåller hematopoietiska celler som potentiellt kan förloras genom ben spolning. Som ett alternativ, BM celler kan extraheras genom mosa ben med en murbruk och mortelstöt som tidigare beskrivits12,13.

Det protokoll som presenteras här ger en grund för användning av fluorogena färgämnen för att mäta intracellulär redoxbiologi i levande celler som utvinns ur levande organismer. Det är dock viktigt att notera att ingen enskild fluorogen färgämne kan antas vara slutgiltigt specifik och därför bör ytterligare studier med alternativa metoder utföras för att kontrollera eventuella fynd. Dessutom, resultaten av denna studie tyder på att leukemi cellpopulationer berikas för LICs (dvs, linlåg ckithög) Visa högre nivåer av mitokondrie ros än friska myeloida STAMCELLER eller andra HSPC populationer. Emellertid, linlåg ckithög leukemi cellpopulation utvärderas här har visat sig vara heterogena och kan ytterligare sub-dividerat med andra Lineage markörer11,27. Dessutom, nyare studier visar att LICs besitter en distinkt metabolisk fenotyp28. Därför, framtida studier som bedömer mitokondriella ROS parallellt med metaboliska analyser eller sonder samt ytterligare härstamning markörer antikroppar kommer att vara informativ.

Detta enkla protokoll möjliggör mätning av mitokondriella ROS nivåer i levande hematopoietiska celler och kan ge en grund för att studera redox biologi av friska och sjuka stamceller och progenitorceller samt för att bedöma effektiviteten av Redox-riktade terapier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Fox Chase Cancer Center styrelse (DDM), American Society of hematologi Scholar Award (SMS), American Cancer Society RSG (SMS) och Department of Defense (Award #: W81XWH-18-1-0472).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Heat inactivated FBS VWR Seradigm LIFE SCIENCE 97068-085 Media
Penicillin Streptomycin Corning 30-002-CI Media
PBS Fisher Scientific BP399-20 Buffer
15 mL conical tube BD falcon 352096 Tissue Culture Supplies
50 mL conical tube BD falcon 352098 Tissue Culture Supplies
40 μm cell strainers Fisher Scientific 22-363-547 Tissue Culture Supplies
RBC Lysis Buffer Fisher Scientific 50-112-9751 Tissue Culture Supplies
Menadione sodium Bisulfite Sigma aldrich M5750 Pro-oxidant
NAC Sigma aldrich A7250 Anti-oxidant
CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11 Biolegend 100310 Antibody
CD4 PE-Cy5 clone RM4-5 eBioscience 15-0041-81 Antibody
CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7 eBioscience 15-0081-81 Antibody
CD19 PE-Cy5 clone 6D5 Biolegend 115510 Antibody
B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2 Biolegend 103210 Antibody
Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5 Biolegend 108410 Antibody
Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119 Biolegend 116210 Antibody
CD48 PE-Cy5 clone HM48-1 Biolegend 103420 Antibody
CD117  APC-Cy7 clone 2B8 Biolegend 105825 Antibody
Sca1 peacific Blue clone D7 Biolegend 108120 Antibody
CD150 APC clone TC15-12F12.2 Biolegend 115909 Antibody
CD34 FITC clone RAM34 BD Bioscience 553733 Antibody
CD45.2 APC clone 104 Biolegend 1098313 Antibody
MitoSOX Red ThermoFisher Scientific M36008 Dye
Mitotracker Green ThermoFisher Scientific M7514 Dye
Live/dead Yellow Dye ThermoFisher Scientific L34967 Dye

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dröse, S., Brandt, U. Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain. Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).
  2. Gerber, P. A., Rutter, G. A. The Role of Oxidative Stress and Hypoxia in Pancreatic Beta-Cell Dysfunction in Diabetes Mellitus. Antioxidant & Redox Signaling. 26 (10), 501-518 (2017).
  3. Höhn, A., et al. Happily (n)ever after: Aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence. Redox Biology. 11, 482-501 (2017).
  4. Reuter, S., Gupta, S. C., Chaturvedi, M. M., Aggarwal, B. B. Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked. Free Radical Biology & Medicine. 49 (11), 1603-1616 (2010).
  5. Lee, B. W. L., Ghode, P., Ong, D. S. T. Redox regulation of cell state and fate. Redox Biology. 2213-2317 (18), 30899 (2018).
  6. Harris, J. M., et al. Glucose metabolism impacts the spatiotemporal onset and magnitude of HSC induction in vivo. Blood. 121, 2483-2493 (2013).
  7. Hole, P. S., Darley, R. L., Tonks, A. Do reactive oxygen species play a role in myeloid leukemias. Blood. 117, 5816-5826 (2011).
  8. Lagadinou, E. D., et al. BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).
  9. Di Marcantonio, D., et al. Protein Kinase C Epsilon Is a Key Regulator of Mitochondrial Redox Homeostasis in Acute Myeloid Leukemia. Clinical Cancer Research. 24 (3), 608-618 (2018).
  10. Glasauer, A., Chandel, N. S. Targeting antioxidants for cancer therapy. Biochemical Pharmacology. 92 (1), 90-101 (2014).
  11. Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
  12. Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  13. Lo Celso, C., Scadden, D. T. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiments. (157), (2007).
  14. Kalaitzidis, D., et al. mTOR complex 1 plays critical roles in hematopoiesis and Pten-loss-evoked leukemogenesis. Cell Stem Cell. 11 (3), 429-439 (2012).
  15. Sykes, S. M., et al. AKT/FOXO signaling enforces reversible differentiation blockade in myeloid leukemias. Cell. 146 (5), 697-708 (2011).
  16. Kalaitzidis, D., Neel, B. G. Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells. PLoS One. 3 (11), 3776 (2008).
  17. Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
  18. Mooney, C. J., Cunningham, A., Tsapogas, P., Toellner, K. M., Brown, G. Selective expression of flt3 within the mouse hematopoietic stem cell compartment. International Journal Molecular Sciences. 18 (5), (2017).
  19. Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. I. SLAM family markers resolve functional distinct sub-populations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
  20. Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
  21. Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment. Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1178 (2010).
  22. Mukhopadhyay, P., Rajesh, M., Haskó, G., Hawkins, B. J., Madesh, M., Pacher, P. Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy. Nature Protocols. 2 (9), 2295-2301 (2007).
  23. Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies. Blood. 107 (2), 501-507 (2006).
  24. Morita, Y., Ema, H., Yamazaki, S., Nakauchi, H. Non-side-population hematopoietic stem cells in mouse bone marrow. Blood. 108 (8), 2850-2856 (2006).
  25. de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
  26. Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment. Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).
  27. Somervaille, T. C., Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).
  28. Hao, X., et al. Metabolic Imaging Reveals a Unique Preference of Symmetric Cell Division and Homing of Leukemia-Initiating Cells in an Endosteal Niche. Cell Metabolism. 29 (4), 950-965 (2019).

Tags

Cancer forskning AML HSCs ROS superoxider mitokona flödescytometer
Flödescytometrisk analys av mitokondriella reaktiva syreradikaler i murina hematopoietiska Stem och progenitorceller och MLL-AF9 driven leukemi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Di Marcantonio, D., Sykes, S. M.More

Di Marcantonio, D., Sykes, S. M. Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia. J. Vis. Exp. (151), e59593, doi:10.3791/59593 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter