Summary
急性骨髄性白血病(AML)のマウスモデルから、マウスの健康な造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)におけるミトコンドリア活性酸素種(ROS)を検出するために多パラメータフローサイトメトリーを用いる方法について説明する。MLL-AF9.
Abstract
健康なマウスとMLL-AF9によって駆動されるAMLを有するマウスから、様々な生きた骨髄(BM)由来の幹および前駆細胞集団におけるミトコンドリアROSを分析するためのフローサイトメトリックアプローチを提示する。具体的には、健康または白血病BM細胞がミトコンドリアスーパーオキシドを検出するフルオロゲン性色素で最初に染色され、続いて使用されるフルオロクロム結合モノクローナル抗体による染色を行う2段階の細胞染色プロセスについて説明します。様々な健康で悪性の前駆体集団を区別する。また、フローサイトメトリーによるサンプルの取得と分析に関する戦略も提供しています。プロトコル全体は、3-4時間の短い時間枠で行うことができます。我々はまた、フローサイトメトリーによるフルオロゲン染料を用いた生造血および白血病の幹および前駆体のミトコンドリアコンパートメントにおけるROS産生のモニタリングの利点と限界を考慮すべき重要な変数を強調する。.さらに、ミトコンドリアROSの豊富さが、明確な健康なHSPCサブ集団と白血病前駆体の間で変化するデータを提示し、血液学的研究におけるこの技術の可能な応用について議論する。
Introduction
活性酸素種(ROS)は、分子酸素由来の反応性の高い分子です。ROS産生の最も明確に定義された細胞位置はミトコンドリアであり、酸化リン酸化(OXPHOS)中に電子輸送鎖(ETC)を通過する電子が特定の形成につながる分子酸素によって吸収されるスーパーオキシド1と呼ばれるROSの種類。スーパーオキシドジスムターゼまたはSODと呼ばれる一連の酵素の作用を通じて、スーパーオキシドは過酸化水素に変換され、その後、カタレーゼやグルタチオンペルオキシダーゼ(GPX)などの酵素によって水に中和されます。ROS調節機構の摂動は、多くの場合、高分子損傷(すなわち、DNA、タンパク質、脂質)などの有害で潜在的に致命的な細胞の結果を有する酸化ストレスと呼ばれるROSの過剰産生につながる可能性があります。さらに、酸化ストレスは、糖尿病、炎症性疾患、老化および腫瘍2、3、4などのいくつかの病理に関連している。酸化ホオスタシスを維持し、酸化ストレスを防ぐために、細胞は様々なROS調節機構を有する5.
特定のROSの生理学的レベルは、適切な胚および成人のヘマトポエシス6に必要である。しかし、過剰なROSは、造来茎および前駆体プールのDNA損傷、細胞分化および枯渇に関連している。また、レドックス生物学の変化は、白血病と健康な細胞の間で異なる可能性があるという証拠もあります。例えば、ROSレベルは、彼らの健康な相手に対して急性骨髄性白血病(AML)細胞で高くなる傾向があり、他の研究は、白血病幹細胞が生存7、8のためにROSの低定常状態レベルを維持することを示唆している。重要なことに、これらの酸化還元の違いを治療的に活用するための戦略は、いくつかのヒト癌の設定9、10で約束を示している。したがって、マウスモデルにおけるROSレベルの評価を可能にするアッセイは、これらの種が細胞生理学および疾患病因にどのように寄与するかについての理解を改善し、潜在的に有効性を評価するためのプラットフォームを提供する可能性がある。新しいレドックスターゲティング抗癌療法。
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Protocol
このプロトコルに記載されているすべての動物の手順は、フォックスチェイス癌センターの機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されています。
注:プロトコルワークフローは図1に示すように4つの部分に分かれており、必要な試薬は材料の表に記載されています。
1. 骨髄(BM)分離
注:MLL-AF9白血病マウスは、前述の11として生成された。
- 前述の12、13、14、15、野生型C57.Bl6マウス(CD45.2先天性マーカーを発現する)およびC57から、単核骨髄細胞を回収する。MLL-AF9発現白血病細胞(CD45.2+)で移植したBl6-SJLマウス(CD45.1前生細胞を発現する)。
注:BMは、12、13を粉砕するか、または骨14、15を洗い流すことによってマウスから回収することができる。ここで提示された実験では、BMは、フラッシングを介して健康マウスと白血病マウスの両方から回収された。
2. ミトコンドリアROSフルオロゲン染料染色
- 単核骨髄細胞が健康なマウスおよび/または白血病マウスから回収されたら、トリパンブルーで細胞のアリコートを染色し、血球計を使用してカウントして、総BM細胞の開始数を決定します。
- 細胞を300 x gで5分間遠心分離し、F-PBS(PBSは2%の胎児牛血清と1%ペニシリン/ストレプトマイシンカクテルを補充)でペレットを再ステーペンし、2 x 106細胞/mLの濃度にします。
- 次のようにラベル付けされた9つの単色制御チューブにチューブあたりの細胞懸濁液のAliquot 200 μL:
汚れなし、B220-Cy5-PE、cKit-Cy7-APC、Sca1-PacBlue、CD150-APC(健康なHPCのみ)、CD45.2-APC(白血病細胞のみ)、CD34-FITC、ミトコンドリアROS染料および生死細胞染色。
注:(オプション)ミトコンドリアROSの誘導に対する陽性対照は、5%CO2インキュベーターで37°Cで1時間のメナジオンナトリウムビスルボディ(MSB)の20μMで200μLで2x105細胞を処理することによって調製することができる。ミトコンドリアROSのMSB媒介誘導を逆転させる第2の制御は、MSBの20μMに加えて100 μM N-アセチル-L-システイン(NAC)を5%CO2インキュベーターで1時間100μMで200μLで2x105細胞を処理することによって調製することができる。 - チューブ(実験管)の残りの細胞をアリコートし、遠心分離機を300 x gで5分間使用します。
- 製造元の指示に従って、生きている/死んだ細胞の汚れでF-PBSの細胞を再中断する。氷の上で30分間インキュベートし、単色のコントロールチューブに生きた/死んだ汚れを加えるようにしてください。
- 生きた/死んだ色素で染色された単色および実験管の両方に室温(RT)F-PBSの1.0 mLを加える。RTで300 x gで遠心分離機5分。
- ミトコンドリアROS色素の50μgをジメチルスルホキシド(DMSO)の13μLで再中断し、5mMストック溶液を得た。
- ベラパミル(50μM)の有無にかかわらずRT F-PBSで5μMの最終濃度にミトコンドリアROS色素を希釈します。
- 生きている/死んだ細胞の汚れの洗浄を吸引する。各実験チューブにベラパミルを含むミトコンドリアROS染料染料染色剤200μLを加え、ミトコンドリアROS染料単色制御チューブを追加します。
- 渦は、暗闇の中で37°Cで10分間混合し、インキュベートする。
- ミトコンドリアROS染色シングルカラーコントロールおよび実験チューブにRT F-PBSの1.0 mLを追加します。RTで300 x gで遠心分離機5分。
- 上清を吸引し、RT F-PBS の追加の 1.0 mL で細胞を洗浄します。RTで300 x gで遠心分離機5分。
3. リネージ抗体染色
- 表1に記載されている抗体カクテルを準備する。
注:これらの抗体カクテルは、以前に14、15、16に最適化されている。 - 健康なBMを含む実験チューブの最終ミトコンドリアROS色素洗浄から上清を吸引し、各チューブに200μLの抗体カクテル#1を加える。混ぜる渦。また、単色制御チューブを準備します。暗闇の中で氷の上で60分間インキュベートします。
- 白血病BMを含む実験管の最終ミトコンドリアROS色素洗浄から上清を吸引し、各管に200μLの抗体カクテル#2を加える。混ぜる渦。暗闇の中で氷の上で60分間インキュベートします。
- RTで300 x gで1.0 mLの冷たいF-PBSおよび遠心分離機5分で洗う。
- 冷たいF-PBSの500 μLの細胞を再中断し、凝集体を除外するために40 μmフィルターを使用して流れサイトメーターチューブ内の細胞をろ過する。
4. フローサイトメトリーの取得と分析
注:いくつかの造血幹細胞および前駆体のサブセットは、長期造血幹細胞などまれである。したがって、理想的には、様々なHSPCサブセット内のミトコンドリアROSの十分な分析のために、フローサイトメトリー獲得時に各実験管に対して3〜500万のイベントを収集する必要があります。
- 無染色制御チューブを使用して、分析された細胞集団の大きさと複雑さに基づいて前方(FSC-A)と側(SSC-A)散布プロットを設定します。
- 無染色および単色制御管を使用して、フローサイトメーターを補正します。
- 前方および側面散乱プロットから余分な破片をゲートアウトします(図2A,B、左から最初のパネル)。
- 前方識別子などの二重識別子を使用して二重にゲートアウトします(図2A、B、左から2番目のパネル)。
- 図2A、Bで提案されているゲーティング戦略に従って、生細胞、系統低細胞および様々なHSPCおよび白血病サブセットを選択する。
- 対象の各集団について、ヒストグラムプロットにおけるTRPEチャネル(x軸)の中央値蛍光強度(MFI)を分析し、ミトコンドリアROSシグナルの違いを評価します(図3A-C、左パネル)。ミトコンドリアROSのレベルは、散布図中のミトコンドリアROS染色と特定の系統マーカーを比較することによって単一細胞レベルで評価することができる。
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Representative Results
提示されたのは、複数の健康およびMLL-AF9発現白血病前駆体のミトコンドリアにおけるROSを分析する方法である。図 1は、4 つの主要なステップで構成されるプロトコル ワークフローの概略図を示します: 1) マウスからの BM 分離;2)ミトコンドリアROS、特にスーパーオキシドを認識するフッ素色素でBM細胞を染色する。3)様々な健康および白血病血化集団を線引きする表面マーカー抗体染色;そして4)フローサイトメトリーの獲得と分析。
図 2A,Bは、健康で白血病BMにおける様々な造血幹細胞および前駆体集団を分析するための代表的なゲーティング戦略を示す。破片を除去するために FSC/SSC プロットが適用され、FSC 領域 (FSC-A) 対 FSC 高さ (FSC-H) プロットを使用して、二重子と凝集体を除外します。系統表面マーカー(表1およびステップ3.1)のパネルは、リンパ球、赤血球、顆粒球および単球/マクロファージ(すなわち、リネージが低いまたはリン低)などの様々な成熟した造血集団を除外するために組み合わされる。系統カクテルはまた、CD48抗体を含むので、系統低細胞のすべてのサブセットもCD48 -.Sca-1およびc-Kit細胞表面発現は、骨髄前駆体(リン低、Sca-1-)と呼ばれるHSPCの異種混合物を区別するために使用される( リン低、Sca-1-、cキット+、CD48-)。さらに様々なHSPCサブセットを区別するために、SLAMマーカー、CD150、CD34も17、18、19、20、21を追加する。図 2Bはまた、cKit高発現白血病前駆者(リン低、c-Kit高;高いcKitのための代表的なゲーティング戦略を示しています。Sca-1-)は、cKit(cKitInt-low)の中間低発現を発現する白血病細胞と同様に白血病細胞(LIC)11のために濃縮される。
健康なCD48-LSKおよび骨髄前駆体とのミトコンドリアROS染色の比較は、骨髄前駆体がミトコンドリアROS染色の有意に高いレベルを示すことを示している(図3A)。さらに、cKit高白血病前駆体は、CD48-LSK、骨髄前駆体またはcKitint-低白血病細胞と比較して、ミトコンドリアROS染色の有意に高いレベルを示す(図3A)。cKitInt-low白血病細胞はまた、CD48-LSK細胞と比較して有意に高いミトコンドリアROS染色を示したが、骨髄前駆体には表示されない(図3A)。LSKsをさらにCD150発式でサブ分割すると、ミトコンドリアROS染色はCD48で有意に変化しないことを示した- LSK細胞をCD150高(CD150高)でサブ分割)、中間(CD150Int)またはなし(CD150ネグ)式 (図 3B)しかし、cKit高色またはcKitInt-low白血病細胞の定常状態ミトコンドリアROS染色は、CD48-LSKs-CD150高、-CD150Intまたは-CD150ネグ細胞よりも有意に高いことがわかった(図 3B)。低レベルのCD34を発現するLSK細胞は、造血幹細胞、特にCD34-およびCD150高20、21であるCD48-LSK細胞を長期再構成するために濃縮される。しかしながら、CD48-LSK細胞をCD150およびCD34発現で細分化しても、これら6つのHSPCサブセット間でミトコンドリアROS染色に有意な差は明らかにされなかった(図3C)。
図 1: プロトコルのワークフローのスケマティック表現。ステップ1)健康およびMLL-AF9白血病マウスからのBM分離;ステップ2)ミトコンドリアROS色素(mROS)を用いて細胞染色;ステップ3)健良な白血病マウスにおける造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)集団を判別するために、フルオロクロム結合モノクローナル抗体による細胞染色;ステップ4)いくつかのHSPC集団におけるミトコンドリアROSのフローサイトメトリー獲得および分析この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: 健康でMLL-AF9発現骨髄細胞のためのフローサイトメトリーゲーティング戦略(A)健康なマウスから単離したBM細胞を生きた/死んだ色素(QDot)、ミトコンドリアROS色素(TRPE)で染色した。その後、健良なマウスからのBMを、系統マーカーに加えてCD48(Cy5-PE)、c-Kit(Cy7-APC)、Sca1(パックブルー)、CD34(FITC)、CD150(APC)を認識する抗体で染色した。(B)生きた/死細胞およびミトコンドリアROS染色に加えて、白血病マウスからのBMは、血統マーカーに加えて、CD48(Cy5-PE)、c-Kit(Cy7-APC)、Sca1(PacBlue)およびCD45.2(APC)を認識する抗体で染色された。健康なレシピエントBM細胞からのMLL-AF9白血病細胞間(CD45.1)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: 健康およびMLL-AF9骨髄のミトコンドリアROSレベル。左のパネルは、示された集団のミトコンドリアROSレベルの代表的なヒストグラムであり、それぞれの右側のパネルは、示された集団に対するミトコンドリアROSのMFIの棒グラフ分析を表す(n=4)。(A)健康なCD48-LSK、骨髄前駆体、MLL-AF9リン低c-Kit HighおよびMLL-AF9リン低c-Kit Int-Low細胞におけるミトコンドリアROSレベルの比較。(B)健康なCD48におけるミトコンドリアROSレベルの比較- CD150発現対MLL-AF9リン低c-Kit HighおよびMLL-AF9リン低c-Kit Int-Low細胞に基づくLSK細胞。(C)健良なCD48-CD150およびCD34発現に基づくLSK細胞におけるミトコンドリアROSレベルの比較。(* p≤0.05; ** p < 0.01*** p < 0.001; **** p < 0.0001)この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: プロおよび抗酸化化合物を用いてミトコンドリアROSレベルの変化.健康でMLL-AF9発現BM細胞におけるミトコンドリアROSレベルのヒストグラムは、5%CO2インキュベーター(陽性対照)または100μMと組み合わせて20μMのMSBで37°Cで1時間のメナジオンナトリウム二硫酸ナトリウム(MSB)の20μMで処理した。N-アセチル-L-システイン(NAC)は、5%CO2インキュベーターで37°Cで1時間。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5: ミトコンドリアROSの最適化と系統認識抗体汚れの最適化。(A)10分または30分の1または5μMを用いて白血病細胞を発現するMLL-AF9におけるミトコンドリアROS(mROS)レベルの比較(赤=車両;青 = MSB 20 μM;緑 = NAC 100 μM;オレンジ = Msb 20 μM + NAC 100 μM)。(B)抗体カクテル#1(n = 4, * p ≤ 0.05; ** p < 0.01) 20,60または90分間染色された健康なLSKにおけるCD34チャネル(FITC)のMFIの比較。(C)5%CO2インキュベーターで37°Cで30分間インキュベーション前または後の抗体染色の比較。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6:ミトコンドリアROSおよび系統マーカー抗体染色の順番。(A)染色の異なる順序を用いて得られた示されたHSPC集団のドットプロット。(B)LSKおよび骨髄前駆体で評価されたミトコンドリアROSレベルは、異なる染色順序を用いた(赤=4°Cで1時間の抗体染色、続いてミトコンドリアROS染色を37°Cで10分間染色)青=ミトコンドリアROS染色37°Cで10分間、その後4°Cで抗体染色1h)。(C)示された集団における染色の異なる順序を用いたミトコンドリアROS(mROS)染色のMFIの定量化(n= 4、* p ≤0.05)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 7: 健康でMLL-AF9発現BM細胞におけるミトコンドリアROS染料染色に対するベラパミル治療の影響(A)5%CO2インキュベーターで37°Cで10分間50μMベラパミルの有無にかかわらず処理された試料中の示されたHSPC集団のドットプロット。(B)50μMベラパミルの存在下(青色)または不在(赤色)における示されたHSPC集団におけるミトコンドリアROSおよびミトマスグリーン染料染色のヒストグラム。(C-E)ミトコンドリアROS染色中に50 μMベラパミルの有無にかかわらず処理されたBMサンプル中の示された健康(C&D)および白血病(E)細胞集団におけるミトコンドリアROSレベルの定量化(n= 4、* p ≤ 0.05)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
表1:抗体カクテル.ステップ3.1で調製した抗体カクテルのリスト。健康で白血病の骨髄内の様々な血行性サブ集団を同定する。
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Discussion
ROSの検出のために開発されたフルオロゲン染料は、フローサイトメトリー22により顕微鏡検査または生細胞中の固定細胞において頻繁に評価される。ミトコンドリアROSフルオロゲン染料を用いてBM細胞内のミトコンドリアROSのフローサイトメトリック評価には2つの大きな利点があります:1)生細胞分析に適した高速かつ簡単な技術であり、2)希少な区別と分析を可能にします。表面マーカー染色を使用してBMの単一細胞レベルでの集団。ここで提示されるステップバイステッププロトコルは、正常なマウスとフローサイトメトリーを用いたMLL-AF9によって駆動されるAMLのマウスモデルと同様に、造来性幹および前駆体集団の外生性レドックスステータスを研究するために開発された。このプロトコルの実行中に考慮する必要がある重要な技術的変数がいくつかあります。
第一に、プロおよび抗酸化コントロールの使用は、ユーザーがミトコンドリアROS染色の増加のためのベースラインを確立するだけでなく、染色の特異性を可能にする。ここで提示されたプロトコルについては、プロオキシダントMSBは、健康なBM細胞と白血病BM細胞の両方におけるミトコンドリアROS染色の検出可能な誘導のための陽性対照として利用された(図4)。抗酸化NACは、MSBによって誘導されるミトコンドリアROS染色を大きく反転させるため、追加の制御として使用することができる(図4)。
第二に、本研究で用いられるミトコンドリアROSフルオロゲン染料を10分間5μMの濃度で使用することが推奨される。しかし、製造業者はまた、染色の濃度および時間が細胞タイプによって異なる可能性があることを示唆している。本研究では、ミトコンドリアROS染色を1μMと5μMの両方で10分または30分間比較した。分析の結果、ミトコンドリアROSのMSB媒介性変化とNAC処理によって逆転したMSB媒介性変化を検出するのに十分な濃度が5μMであることを明らかにした(図5A)。10分から30分の間に定量的な差はなかったので、アッセイの長さを最小限に抑えるために、本研究では10分の染色時間を選択した。
第3に、CD34抗体のインキュベーション時間は、文献内で20~90分23、24分まで変化する。ここで提示されるプロトコルを最適化するために、マウス骨髄細胞を抗体カクテル#1(ステップ3.1)で20、60または90分間インキュベートした。図5Bに示すように、20分間の染色と比較して60または90分間染色した細胞に有意に強いCD34染色が認められた。しかし、CD34染色の有意な差は60分と90分の抗体インキュベーション時間(図5B)の間で観察されず、したがって、提示されたプロトコルには60分の抗体染色が推奨される。
第4に、提示されたプロトコルにおいて、健康な細胞と白血病細胞の両方が、まずミトコンドリアROSフルオロゲン色素で染色され、洗浄され、次いでフルオロクロム結合系統抗体で染色される。本研究では、ミトコンドリアROS染色と系統抗体との組み合わせに関する直接的な評価は行われなかったが、ミトコンドリアROS染色条件下で10、20及び及びその後、フルオロクロム結合系統抗体染色の評価を行った。37 °Cで30分。この分析により、37°Cでのインキュベーションの30分が系統表面マーカー染色を実質的に変化することを明らかにした(図5C)。さらに、ミトコンドリアROS染色を最初に評価し、フルオロクロム結合系統抗体で健康なBM細胞を染色し、続いてミトコンドリアROSフルオロゲン染料で染色し、その逆の操作順を行った。まず血統抗体を用いた染色細胞、続いてミトコンドリアROS染色により、その逆染色プロトコル(図6A、B)と比較してミトコンドリアROSシグナルが低く、CD48に対する有意な差異を含む-LSK CD150高,CD48- LSK CD150Int CD34 および骨髄前駆体集団 (図 6C)
第5に、最近の研究は、異なるマウスの健康なHSPC集団が、ミトコンドリア質量(以下、mitoMASS greenと呼ばれる)を評価するために使用されるようないくつかのミトコンドリア染色フッ素性プローブを流出させる明確な能力を有することを示している。ポテンシャル25,26.そこで、ミトコンドリアROSフルオロゲン染料を用いた健康な白血病前駆体の染色に対する流出ポンプ阻害剤ベラパミルの影響も評価した。ミトコンドリアROSとのHSPCの同時染色は系統マーカー抗体染色を変えなかった(図7A)が、ベラパミルは様々な健康および白血病におけるミトコンドリアROS染色シグナルを有意に改善した。前駆体集団(図7B、C)。特に、ベラパミルによる改善されたミトコンドリアROS染色の大きさは、mitoMASS緑蛍石染料で見られるほど大きくない(図7B)。
第6に、ここで提示されるプロトコルにおいて、BM細胞は骨の先端(エピフィシス)を除去し、続いて骨のフラッシュを除去することによって回収された。しかし、エピフィシスには、骨の紅潮によって失われる可能性のある血化細胞が含まれています。代替として、BM細胞は、前述の12、13と同様に、モルタルおよび害虫で骨をマッシュすることによって抽出することができる。
ここで提示されるプロトコルは、生物から抽出された生細胞中の細胞内酸化還元生物学を測定するためのフッ素色素の使用のための基礎を提供する。しかし、単一の蛍色染料は決定的に特異的であると仮定できないため、代替方法を用いた追加の研究を行い、所見を検証する必要があることに注意することが重要です。さらに、本研究の結果は、LICに富んだ白血病細胞集団(すなわち、リン低cKit高)が健康な骨髄前駆体または他のHSPC集団よりも高いレベルのミトコンドリアROSを示すことを示唆している。しかしながら、ここで評価されたLinlow cKit高白血病細胞集団は、不均一であることが示されており、さらに他の系統マーカー11,27によってさらに細分化することができる。さらに、最近の研究は、LICが明確な代謝表現型28を有することを示している。したがって、代謝アッセイまたはプローブおよび追加の系統マーカー抗体と並行してミトコンドリアROSを評価する将来の研究は有益である。
この簡単なプロトコルは、生きている造血細胞におけるミトコンドリアROSレベルの測定を可能にし、健康で病気の幹細胞および前駆細胞の酸化還元生物学を研究するための基礎を提供し、また、酸化還元標的療法。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
この研究は、フォックスチェイス癌センター理事会(DDM)、米国血液学会学術賞(SMS)、米国癌学会RSG(SMS)および国防総省(賞#:W81XWH-18-1-0472)によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heat inactivated FBS | VWR Seradigm LIFE SCIENCE | 97068-085 | Media |
| Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | Media |
| PBS | Fisher Scientific | BP399-20 | Buffer |
| 15 mL conical tube | BD falcon | 352096 | Tissue Culture Supplies |
| 50 mL conical tube | BD falcon | 352098 | Tissue Culture Supplies |
| 40 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22-363-547 | Tissue Culture Supplies |
| RBC Lysis Buffer | Fisher Scientific | 50-112-9751 | Tissue Culture Supplies |
| Menadione sodium Bisulfite | Sigma aldrich | M5750 | Pro-oxidant |
| NAC | Sigma aldrich | A7250 | Anti-oxidant |
| CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11 | Biolegend | 100310 | Antibody |
| CD4 PE-Cy5 clone RM4-5 | eBioscience | 15-0041-81 | Antibody |
| CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7 | eBioscience | 15-0081-81 | Antibody |
| CD19 PE-Cy5 clone 6D5 | Biolegend | 115510 | Antibody |
| B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2 | Biolegend | 103210 | Antibody |
| Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5 | Biolegend | 108410 | Antibody |
| Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119 | Biolegend | 116210 | Antibody |
| CD48 PE-Cy5 clone HM48-1 | Biolegend | 103420 | Antibody |
| CD117 APC-Cy7 clone 2B8 | Biolegend | 105825 | Antibody |
| Sca1 peacific Blue clone D7 | Biolegend | 108120 | Antibody |
| CD150 APC clone TC15-12F12.2 | Biolegend | 115909 | Antibody |
| CD34 FITC clone RAM34 | BD Bioscience | 553733 | Antibody |
| CD45.2 APC clone 104 | Biolegend | 1098313 | Antibody |
| MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | Dye |
| Mitotracker Green | ThermoFisher Scientific | M7514 | Dye |
| Live/dead Yellow Dye | ThermoFisher Scientific | L34967 | Dye |
References
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