Summary
Vi beskriver en metode for bruk multiparameter Flow flowcytometri å oppdage mitokondrie reaktive oksygen arter (ROS) i murine sunn blodkreft stammen og stamceller (HSPCs) og leukemi celler fra en mus modell av akutt myelogen leukemi (AML) drevet av MLL-AF9.
Abstract
Vi presenterer en flyt analytiske tilnærming for å analysere mitokondrie ROS i ulike Live benmarg (BM)-avledet stilk og Stamcelle populasjoner fra friske mus, samt mus med AML drevet av MLL-AF9. Nærmere bestemt beskriver vi en to-trinns cellefarge prosess, hvorved sunne eller leukemi BM celler er først farget med en fluorogenic fargestoff som oppdager mitokondrie superoxides, etterfulgt av farging med fluorokromkonjugert-koblede monoklonale antistoffer som brukes å skille ulike sunn og ondartet blodkreft stamfar populasjoner. Vi tilbyr også en strategi for å anskaffe og analysere prøvene ved å strømme flowcytometri. Hele protokollen kan utføres i en tidsramme så kort som 3-4 h. Vi kan også markere nøkkelen variabler å vurdere samt fordeler og begrensninger av overvåking ROS produksjon i mitokondrie kupé av levende blodkreft og leukemi stilk og stamfar subpopulasjoner bruker fluorogenic fargestoffer ved flyt flowcytometri . Videre presenterer vi data som mitokondrie ROS overflod varierer blant distinkte sunne HSPC Sub-populasjoner og leukemi forfedre og diskutere mulige anvendelser av denne teknikken i Hematologic forskning.
Introduction
Reaktive oksygen arter (ROS) er svært reaktive molekyler avledet fra molekylær oksygen. Den mest veldefinerte cellulære plasseringen av ROS produksjon er mitokondrier, der elektroner som passerer gjennom elektron transport kjeden (ETF) i løpet av oksidativt fosforylering (OXPHOS) absorberes av molekylær oksygen som fører til dannelsen av en bestemt type ROS kalt superoxides1. Gjennom handlingene til en serie av enzymer, kalt superoxide dismutases eller SODs, superoxides omdannes til hydrogen peroksider, som senere nøytralisert i vann av enzymer som catalase eller glutation peroxidases (GPX). Forstyrrelser i ROS-regulatoriske mekanismer kan føre til overflødig produksjon av ROS, ofte referert til som oksidativt stress, som har skadelige og potensielt dødelige cellulære konsekvenser som Makromolekyl Kader (dvs. DNA, protein, lipider). Videre er oksidativt stress knyttet til flere patologi, slik som diabetes, inflammatoriske sykdommer, aldring og svulster2,3,4. For å opprettholde Redox homeostase og forebygge oksidativt stress, celler har en rekke ROS-regulere mekanismer5.
Fysiologiske nivåer av visse ROS er nødvendig for riktig embryonale og voksne hematopoiesen6. Men, overflødig ROS er forbundet med DNA skade, differensiering og utmattelse av blodkreft stammen og stamfar bassenget. Det er også bevis for at endringer i Redox biologi kan variere mellom leukemi og sunne celler. For eksempel, ros nivåer tendens til å være høyere i akutt myelogen leukemi (AML) celler i forhold til deres sunne kolleger og andre studier har antydet at leukemi stamceller opprettholde en lav steady-state nivå av ros for overlevelse7,8. Viktigere, strategier for terapeutisk utnytte disse Redox forskjellene har vist løftet i flere menneskelige kreft innstillinger9,10. Derfor analyser som gjør det mulig for vurdering av ROS nivåer i musemodeller kan forbedre vår forståelse av hvordan disse artene bidra til cellulær fysiologi og sykdom patogenesen samt potensielt gi en plattform for å vurdere effektiviteten av romanen Redox-målretting anti-kreft terapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr prosedyrene beskrevet i denne protokollen har blitt godkjent av institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) ved Fox Chase Cancer Center.
Merk: Protokollen arbeidsflyten er delt inn i 4 deler som presenteres i figur 1 og de nødvendige reagensene er oppført i tabellen av materialer.
1. benmarg (BM) isolasjon
Merk: MLL-AF9 leukemi mus ble generert som beskrevet tidligere11.
- Gjenopprette mono-kjernefysiske benmargceller, som beskrevet tidligere12,13,14,15, fra Wild type C57. Bl6 mus (som uttrykker CD 45.2 congenic markør) så vel som fra C57. Bl6-SJL mus (som uttrykker CD 45.1 congenic markør) som har blitt transplantert med MLL-AF9-uttrykker leukemi celler (CD 45.2+).
Merk: BM kan utvinnes fra mus enten ved å knuse12,13 eller ved å skylle bein14,15. For eksperimenter som presenteres her, BM ble utvunnet fra både sunne og leukemi mus via Flushing.
2. mitokondrie ROS Fluorogenic Dye farging
- Når mono-kjernefysiske benmargceller har blitt utvunnet fra friske og/eller leukemi mus, beis en alikvot av celler med Trypan blå og telle ved hjelp av en hemocytometer å bestemme Startantall totalt BM celler.
- Sentrifuger cellene ved 300 x g i 5 min. aspirer supernatanten og resuspend pellet i F-PBS (PBS supplert med 2% fosterets storfe serum og en 1% penicillin/Streptomycin cocktail) til en konsentrasjon av 2 x 106 celler/ml.
- Alikvot 200 μL av celle suspensjon per rør i 9 single-fargekontroll rør merket som følger:
Ingen beis, B220-Cy5-PE, cKit-Cy7-APC, Sca1-PacBlue, CD150-APC (for sunn HSPCs bare), CD 45.2-APC (for leukemi celler bare), CD34-FITC, mitokondrie ROS fargestoff og live/Dead celle flekken.
Merk: Valgfritt En positiv kontroll for induksjon av mitokondrie ROS kan tilberedes ved behandling av 2 x 105 celler i 200 μL med 20 ΜM Menadione natrium BISULFITE (MSB) for 1 time ved 37 ° c i en 5% co2 inkubator. En annen kontroll for å reversere MSB-mediert induksjon av mitokondrie ROS kan tilberedes ved behandling av 2 x 105 celler i 200 μL med 20 ΜM av MSB Plus 100 μM N-acetyl-L-CYSTEIN (NAC) for 1 t ved 37 ° c i en 5% co2 inkubator. - Alikvot de resterende cellene i et rør (eksperimentell tube) og sentrifuger på 300 x g i 5 min.
- Resuspend cellene i F-PBS med en levende/dødt celle flekk i henhold til produsentens anvisninger. Ruge på isen i 30 min. Sørg for å legge til levende/dødt beis til enkelt fargekontroll røret.
- Tilsett 1,0 mL romtemperatur (RT) F-PBS til både single-farge og eksperimentelle rør beiset med live/Dead fargestoff. Sentrifuger 5 min ved 300 x g ved RT.
- Resuspend 50 μg av mitokondrie ROS fargestoff i 13 μL av dimethyl sulfoxide (DMSO) for å oppnå en 5 mM lagerløsning.
- Fortynne mitokondrie ROS fargestoff til en endelig konsentrasjon av 5 μM i RT F-PBS med eller uten Verapamil (50 μM).
- Aspirer av vask av levende/døde celle flekken. Tilsett 200 μL av mitokondrie ROS fargestoff flekk som inneholder Verapamil til hver eksperimentelle rør, samt mitokondrie ROS Dye single-fargekontroll rør.
- Vortex å mikse og ruge i 10 min ved 37 ° c i mørket.
- Legg 1,0 mL RT F-PBS til den mitokondrie ROS-farget enkelt fargekontroll og eksperimentelle rør. Sentrifuger 5 min ved 300 x g ved RT.
- Aspirer av supernatanten og vask cellene med ytterligere 1,0 mL RT F-PBS. Sentrifuger 5 min ved 300 x g ved RT.
3. Lineage antistoff farging
- Forbered antistoff cocktails oppført i tabell 1.
Merk: Disse antistoffene cocktails har blitt optimalisert tidligere14,15,16. - Aspirer den supernatanten fra den endelige mitokondrie ROS fargestoff vask av eksperimentelle rør som inneholder sunne BM og tilsett 200 μL av antistoff cocktail #1 til hvert rør. Vortex å blande. Også forberede single-fargekontroll rør. Ruge for 60 min på isen i mørket.
- Aspirer den supernatanten fra den endelige mitokondrie ROS fargestoff vask av eksperimentelle rør som inneholder leukemi BM og tilsett 200 μL av antistoff cocktail #2 til hvert rør. Vortex å blande. Ruge for 60 min på isen i mørket.
- Vask med 1,0 mL kald F-PBS og sentrifuger 5 min ved 300 x g ved RT.
- Resuspend celler i 500, μL av kald F-PBS og Filtrer cellene i et strømnings flowcytometer rør med et 40 μm-filter for å utelukke aggregater.
4. Flow flowcytometri oppkjøp og analyse
Merk: Flere blodkreft stammen og stamfar delsett er sjeldne, for eksempel langsiktige blodkreft stamceller. Dermed ideelt 3-5 millioner hendelser skal samles for hver eksperimentell tube under Flow flowcytometri oppkjøpet for tilstrekkelig analyse av mitokondrie ROS i de ulike HSPC delsett.
- Bruk det ikke-flekken kontroll røret for å angi fremover (FSC-A) og side (SSC-A) scatter tomter basert på størrelsen og kompleksiteten i cellen befolkningen analysert.
- Bruk ikke-beis og enkelt fargekontroll rør for å kompensere strømnings flowcytometer.
- Gate ut overflødig rusk fra frem og side scatter tomten (figur 2A, B, første panel fra venstre).
- Gate ut doublets ved hjelp av en dobbel diskriminator som forover diskriminator (figur 2a, B, andre panel fra venstre).
- Følg gating strategien foreslått i figur 2a,B til Velg levende celler, avstamning lave celler og de ulike HSPC og leukemi delsett.
- For hver populasjon av interesse analyserer du median fluorescens intensitet (MFI) av TRPE-kanalen (x-aksen) i et histogram plott for å evaluere forskjellene i mitokondrie ROS signal (Figur 3a-C, venstre panel). Nivåer av mitokondrie ROS kan evalueres på single-cellenivå ved å sammenligne mitokondrie ROS farging versus spesifikke avstamning markører i en scatter plot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Presentert er en metode for å analysere ROS i mitokondrier av flere sunne og MLL-AF9-uttrykker leukemi stamfar populasjoner. Figur 1 viser en skjematisk visning av protokoll arbeidsflyten, som består av 4 viktige trinn: 1) BM isolering fra mus; 2) farging BM celler med en fluorogenic fargestoff som gjenkjenner mitokondrie ROS, spesielt superoxides; 3) overflate markør antistoff flekker å avgrense ulike sunne og leukemi blodkreft populasjoner; og 4) Flow flowcytometri oppkjøp og analyse.
Figur 2 A, B viser en representativ gating strategi for å analysere ulike blodkreft stammen og stamfar populasjoner i sunn og leukemi BM. En FSC/SSC tomten brukes til å eliminere rusk og en FSC-område (FSC-A) versus FSC-høyde (FSC-H) tomten brukes til å utelukke doublets og aggregater. Et panel av avstamning overflate markører (tabell 1 og trinn 3,1) kombineres for å utelukke en rekke modne blodkreft populasjoner som lymfocytter, erytrocytter, granulocytter og monocytter/makrofager (dvs. Lineage lav eller Linlav). The Lineage cocktail inkluderer også et CD48 antistoff og derfor alle delsett av avstamning lave celler er også CD48-. SCA-1 og c-Kit celle overflate uttrykk brukes til å skille en heterogen blanding av HSPCs kalt CD48- LSKs (LinLow, SCA-1+, c-Kit+, CD48-) fra myelogen forfedre (LinLow, SCA-1- , c-Kit+, CD48-). For ytterligere å skille ulike HSPC delsett, er slam markør, CD150 samt CD34 også lagt til17,18,19,20,21. Figur 2 B viser også en representativ gating strategi for cKit høy-uttrykker leukemi forfedre (Linlav, c-Kithøy; SCA-1-), som er beriket for leukemi initiere celler (LICs)11 i tillegg til leukemi celler uttrykker middels-lav uttrykk for cKit (cKitint-Low).
En sammenligning av mitokondrie ROS farging mellom sunne CD48- LSK og myelogen forfedre viser at myelogen forfedre vise betydelig høyere nivåer av mitokondrie ros farging (Figur 3A). Videre cKithøy leukemi forfedre vise betydelig høyere nivåer av mitokondrie ros farging SAMMENLIGNET med CD48- LSK, myelogen forfedre eller cKitint-lav leukemi celler (Figur 3A). cKitint-lav leukemi celler også vist signifikant høyere mitokondrie ros farging SAMMENLIGNET med CD48- LSK celler, men ikke å myelogen forfedre (Figur 3A). LSKs ytterligere sub-delt av CD150 uttrykk viste at mitokondrie ROS farging ikke signifikant varierer i CD48- LSK celler sub-delt av CD150 høy (CD150høy), Intermediate (CD150int) eller Nei (CD150neg) uttrykket (Figur 3B). Men steady-state mitokondrie ROS farging av cKithøy eller cKitint-Low leukemi celler ble funnet å være betydelig høyere enn CD48-LSKs-CD150høy,-CD150int eller-CD150neg Cells ( Figur 3B). LSK celler uttrykker lav til ingen nivåer av CD34 er beriket for langsiktig rekonstituering av blodkreft stamceller, spesielt CD48-LSK celler som er CD34- og CD150høy20,21. Men subdividing CD48- LSK Cells by CD150 og CD34 uttrykk ikke avsløre noen vesentlige forskjeller i mitokondrie ros farging blant disse seks HSPC delsett (Figur 3C).
Figur 1 : Skjematisk fremstilling av protokoll arbeidsflyten. Trinn 1) BM isolering fra sunne og MLL-AF9 Leukemic mus; Trinn 2) cellulære flekker ved hjelp av en mitokondrie ROS fargestoff (mROS); Trinn 3) mobilnettet farging med fluorokromkonjugert-koblet monoklonale antistoffer for å diskriminere blodkreft stem og stamceller (HSPCs) befolkning på sunne og Leukemic mus; Trinn 4) Flow flowcytometri oppkjøp og analyse av mitokondrie ROS i flere HSPC populasjoner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Flow flowcytometri gating strategier for sunne og MLL-AF9-uttrykker benmargceller. (A) BM celler isolert fra friske mus ble farget med en levende/Dead fargestoff (QDot), mitokondrie ros fargestoff (TRPE). BM fra friske mus ble senere farget med antistoffer erkjenner avstamning markører pluss CD48 (Cy5-PE), c-Kit (Cy7-APC), Sca1 (PacBlue), CD34 (FITC), CD150 (APC). (B) i tillegg til levende/døde celle og mitokondrie ros FLEKKER, BM fra leukemi mus ble også farget med antistoffer erkjenner avstamning MARKØRER pluss CD48 (CY5-PE), c-Kit (CY7-APC), Sca1 (PacBlue) og CD 45.2 (APC), som brukes til å diskriminere mellom MLL-AF9 leukemi celler fra friske mottaker BM celler (CD 45.1). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : MITOKONDRIE ros nivåer i sunn og MLL-AF9 benmarg. Venstre paneler er representative histogrammer av mitokondrie ROS nivåer av indikerte populasjoner og de respektive høyre panelene representerer søylediagram analyser av MFI av mitokondrie ROS for indikerte populasjoner (n = 4). (A) sammenligning av mitokondrie ros nivåer i sunne CD48- LSK, myelogen FORFEDRE samt MLL-AF9 LinLow c-Kithøy og MLL-AF9 LinLow c-Kitint-Low celler. (B) sammenligning av mitokondrie ros nivåer i sunne CD48- LSK celler basert på deres CD150 uttrykk versus MLL-AF9 Linlav c-Kithøy og MLL-AF9 Linlav c-Kitint-lave celler. (C) sammenligning av mitokondrie ros nivåer i sunne CD48- LSK celler basert på deres CD150 og CD34 uttrykk. (* p ≤ 0,05; * * p < 0,01 * * * p < 0,001; * * * * p < 0,0001). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Endringer i MITOKONDRIE ros nivåer ved hjelp av Pro-og antioksidant forbindelser. Histogrammer av mitokondrie ROS nivåer i sunne og MLL-AF9-uttrykker BM celler behandlet med 20 μM av menadione natrium bisulfite (MSB) for 1 t ved 37 ° c i en 5% CO2 inkubator (positiv kontroll) eller med 20 ΜM av MSB i kombinasjon med 100 μM N-acetyl-L-cystein (NAC) for 1 h ved 37 ° c i en 5% CO2 inkubator. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Optimalisering av MITOKONDRIE ros og avstamning-erkjenner antistoff flekker. (A) sammenligning av mitokondrie ros (mROS) nivåer i MLL-AF9 å uttrykke leukemi celler ved hjelp av 1 eller 5 μM for enten 10 eller 30 min. (rød = kjøretøy; Blå = MSB 20 μM; Grønn = NAC 100 μM; Oransje = MSB 20 μM + NAC 100 μM). (B) sammenligning av MFI av CD34 kanalen (FITC) i sunne LSKs beiset for 20, 60 eller 90 min med antistoff cocktail #1 (n = 4, * p ≤ 0,05; * * p < 0,01). (C) sammenligning av antistoffer flekker før eller etter inkubasjons i 30 min ved 37 ° c i en 5% co2 inkubator. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Order of MITOKONDRIE ros og avstamning markør antistoff farging. (A) dot plott av indikerte HSPCs populasjoner innhentet ved hjelp av ulike pålegg av farging. (B) mitokondrie ros nivåer EVALUERT i LSK og myelogen forfedre rom innhentet brukt annen rekkefølge av farging (rød = antistoff farging for 1 t ved 4 ° c etterfulgt av mitokondrie ros farging i 10 min ved 37 ° c; Blå = mitokondrie ROS farging i 10 min ved 37 ° c, etterfulgt av antistoff farging 1h ved 4 ° c). (C) KVANTIFISERING av MFI av mitokondrie ros (mROS) farging ved hjelp av ulike pålegg av farging i indikerte populasjoner (n = 4, * p ≤ 0,05). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 : Virkningen av verapamil behandling på MITOKONDRIE ros fargestoff flekker i sunne og MLL-AF9-uttrykker BM celler. (A) dot plott av indikerte HSPC populasjoner i prøver behandlet med eller uten 50 μM Verapamil i 10 min ved 37 ° c i en 5% co2 inkubator. (B) histogrammer av mitokondrie ros og mitoMASS Green fargestoff flekker i indikerte HSPC populasjoner i nærvær (blå) eller fravær (rød) av 50 μM Verapamil. (C-E) Kvantifisering av mitokondrie ROS nivåer i indikerte sunn (C & D) og leukemi (E) celle populasjoner i BM prøver behandlet med eller uten 50 μM Verapamil under mitokondrie ROS farging (n = 4, * p ≤ 0,05). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1: antistoff cocktails. Liste over antistoff-cocktails som er klargjort i trinn 3,1. å identifisere ulike blodkreft Sub-populasjoner innen sunn og leukemi benmarg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fluorogenic fargestoffer som er utviklet for påvisning av ROS er ofte evaluert i faste celler ved mikroskopi eller i levende celler ved flyt flowcytometri22. Flow analytiske evaluering av mitokondrie ROS i BM celler ved hjelp mitokondrie ROS fluorogenic fargestoffer har to store fordeler: 1) det er en rask og enkel teknikk som er egnet for levende celle analyse og 2) det gir mulighet for å skille og analysere sjeldne populasjoner på ett cellenivå i BM ved hjelp av overflate markør farging. Det steg-av-steg protokollen forevist her over er blitt bebygget å studere det ex vivo Redox rang av blodkreft stilk og stamfar befolkninger fra begge to rask mus likeledes som musen modell av AML drevet av MLL-AF9 benytter flyte flowcytometri. Det er flere viktige tekniske variabler som må vurderes under utførelsen av denne protokollen.
Først, bruk av Pro-og antioksidant kontroller tillater brukeren å etablere en Baseline for økninger i mitokondrie ROS farging samt spesifisitet av flekken. For protokollen som presenteres her, den Pro-oksiderende MSB ble benyttet som en positiv kontroll for en synlig induksjon av mitokondrie ROS farging i både sunne og leukemi BM celler (figur 4). Den Anti-oksiderende NAC kan brukes som en ekstra kontroll, som det i stor grad reverserer mitokondrie ROS farging indusert av MSB (figur 4).
For det andre er mitokondrie ROS fluorogenic fargestoff ansatt i denne studien anbefales å bli brukt ved en konsentrasjon på 5 μM i 10 min. Men produsenten antyder også at konsentrasjonen og tiden av farging kan variere mellom celletyper. I denne studien ble mitokondrie ROS farging sammenlignet med både 1 μM og 5 μM for enten 10 eller 30 min. Analysen viste at en konsentrasjon på 5 μM for enten 10 til 30 min er tilstrekkelig til å oppdage MSB-mediert endringer i mitokondrie ROS så vel som de reversert av NAC behandling (figur 5a). Siden det ikke var noen kvantitativ forskjell mellom 10 og 30 min, en farge tid på 10 min ble valgt for denne studien for å minimere lengden på analysen.
Tredje, CD34 antistoff inkubasjons ganger varierer innenfor litteraturen 20 til 90 min23,24. For å optimalisere protokollen som presenteres her, ble murine benmargceller inkubert med antistoff cocktail #1 (trinn 3,1) for 20, 60 eller 90 min. Som vist i figur 5B, betydelig sterkere CD34 farging ble observert på celler beiset for 60 eller 90 min sammenlignet med 20 min flekken. En signifikant forskjell i CD34 farging ble imidlertid ikke observert mellom antistoff inkubasjons tider på 60 og 90 min (figur 5B) og således en 60 min antistoff flekk anbefales for den presenterte protokollen.
Fjerde, i den presenterte protokollen, både sunne og leukemi celler er først farget med mitokondrie ROS fluorogenic fargestoff, vasket og deretter farget med fluorokromkonjugert avstamning antistoffer. Selv om en direkte vurdering av å kombinere den mitokondrie ROS flekken med slekts antistoffer ikke ble gjennomført i denne studien, ble en evaluering av fluorokromkonjugert slekts antistoff farging analyseres under mitokondrie ROS farge forhold for 10, 20 og 30 min ved 37 ° c. Denne analysen viste at 30 min av inkubasjons ved 37 ° c vesentlig endrer linjens overflate markør farging (figur 5c). I tillegg ble mitokondrie ROS farging evaluert av første, flekker sunne BM celler med fluorokromkonjugert avstamning antistoffer etterfulgt av farging med mitokondrie ROS fluorogenic fargestoff samt vice versa rekkefølge av operasjoner. Farging celler først med avstamning antistoffer etterfulgt av mitokondrie ROS farging resulterte i lavere mitokondrie ROS signaler i forhold til vice versa farging protokollen (figur 6a, B)-inkludert betydelige forskjeller for CD48- LSK CD150høy, CD48- LSK CD150int CD34 og myelogen Stam populasjoner (figur 6C).
Femte, nyere studier viser at ulike murine sunne HSPC populasjoner har distinkte evner til å utstrømming flere mitokondrie farging fluorogenic sonder som brukes til å vurdere mitokondrie masse (heretter referert til som mitoMASS grønn) eller potensiell25,26. Derfor, virkningen av utstrømming pumpen inhibitor verapamil på farging av sunne og leukemi forfedre med mitokondrie ROS fluorogenic fargestoff ble også vurdert. Samtidige farging av HSPCs med mitokondrie ROS ikke endre avstamning markør antistoff farging (figur 7a), men verapamil gjorde betydelig bedre mitokondrie ros flekker signaler i en rekke sunne og leukemi befolkningsgrupper (figur 7b, C). Spesielt omfanget av forbedrede mitokondrie ROS farging av verapamil var ikke så stor som den sett med mitoMASS grønne fluorogenic fargestoff (figur 7b).
Sjette, i protokollen som presenteres her, BM celler ble gjenopprettet ved å fjerne benet tips (epiphysis) etterfulgt av Flushing av bein. Men epiphysis inneholder blodkreft celler som potensielt kan gå tapt ved bein Flushing. Som et alternativ, BM celler kan trekkes ut av mose bein med en mørtel og morter som tidligere beskrevet12,13.
Protokollen som presenteres her gir et grunnlag for bruk av fluorogenic fargestoffer for å måle intracellulære Redox biologi i levende celler Hentet fra levende organismer. Det er imidlertid viktig å merke seg at ingen enkelt fluorogenic fargestoff kan antas å være definitivt spesifikk og derfor ytterligere studier med alternative metoder bør gjennomføres for å verifisere eventuelle funn. Videre resultatene av denne studien tyder på at leukemi celle populasjoner beriket for LICs (dvs. Linlav cKithøy) vise høyere nivåer av mitokondrie ros enn sunn MYELOGEN forfedre eller andre HSPC populasjoner. Men, LinLow cKithøy leukemi celle befolkning evaluert her har vist å være heterogen og kan videre sub-delt av andre avstamning markører11,27. Videre viser nyere studier at LICs besitter en distinkt metabolsk fenotype28. Derfor fremtidige studier vurdere mitokondrie ROS parallelt med metabolske analyser eller sonder, samt ytterligere avstamning markør antistoffer vil være informativ.
Denne enkle protokollen tillater måling av mitokondrie ROS nivåer i levende blodkreft celler og kan gi grunnlag for å studere Redox biologi av sunne og syke stilk og stamceller, samt for å vurdere effektiviteten av Redox-målretting behandlinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av The Fox Chase Cancer Center styret (DDM), American Society of hematologi Scholar Award (SMS), American Cancer Society RSG (SMS) og Department of Defense (Award #: W81XWH-18-1-0472).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heat inactivated FBS | VWR Seradigm LIFE SCIENCE | 97068-085 | Media |
| Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | Media |
| PBS | Fisher Scientific | BP399-20 | Buffer |
| 15 mL conical tube | BD falcon | 352096 | Tissue Culture Supplies |
| 50 mL conical tube | BD falcon | 352098 | Tissue Culture Supplies |
| 40 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22-363-547 | Tissue Culture Supplies |
| RBC Lysis Buffer | Fisher Scientific | 50-112-9751 | Tissue Culture Supplies |
| Menadione sodium Bisulfite | Sigma aldrich | M5750 | Pro-oxidant |
| NAC | Sigma aldrich | A7250 | Anti-oxidant |
| CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11 | Biolegend | 100310 | Antibody |
| CD4 PE-Cy5 clone RM4-5 | eBioscience | 15-0041-81 | Antibody |
| CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7 | eBioscience | 15-0081-81 | Antibody |
| CD19 PE-Cy5 clone 6D5 | Biolegend | 115510 | Antibody |
| B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2 | Biolegend | 103210 | Antibody |
| Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5 | Biolegend | 108410 | Antibody |
| Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119 | Biolegend | 116210 | Antibody |
| CD48 PE-Cy5 clone HM48-1 | Biolegend | 103420 | Antibody |
| CD117 APC-Cy7 clone 2B8 | Biolegend | 105825 | Antibody |
| Sca1 peacific Blue clone D7 | Biolegend | 108120 | Antibody |
| CD150 APC clone TC15-12F12.2 | Biolegend | 115909 | Antibody |
| CD34 FITC clone RAM34 | BD Bioscience | 553733 | Antibody |
| CD45.2 APC clone 104 | Biolegend | 1098313 | Antibody |
| MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | Dye |
| Mitotracker Green | ThermoFisher Scientific | M7514 | Dye |
| Live/dead Yellow Dye | ThermoFisher Scientific | L34967 | Dye |
References
- Dröse, S., Brandt, U. Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain. Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).
- Gerber, P. A., Rutter, G. A. The Role of Oxidative Stress and Hypoxia in Pancreatic Beta-Cell Dysfunction in Diabetes Mellitus. Antioxidant & Redox Signaling. 26 (10), 501-518 (2017).
- Höhn, A., et al. Happily (n)ever after: Aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence. Redox Biology. 11, 482-501 (2017).
- Reuter, S., Gupta, S. C., Chaturvedi, M. M., Aggarwal, B. B. Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked. Free Radical Biology & Medicine. 49 (11), 1603-1616 (2010).
- Lee, B. W. L., Ghode, P., Ong, D. S. T. Redox regulation of cell state and fate. Redox Biology. 2213-2317 (18), 30899 (2018).
- Harris, J. M., et al. Glucose metabolism impacts the spatiotemporal onset and magnitude of HSC induction in vivo. Blood. 121, 2483-2493 (2013).
- Hole, P. S., Darley, R. L., Tonks, A. Do reactive oxygen species play a role in myeloid leukemias. Blood. 117, 5816-5826 (2011).
- Lagadinou, E. D., et al. BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).
- Di Marcantonio, D., et al. Protein Kinase C Epsilon Is a Key Regulator of Mitochondrial Redox Homeostasis in Acute Myeloid Leukemia. Clinical Cancer Research. 24 (3), 608-618 (2018).
- Glasauer, A., Chandel, N. S. Targeting antioxidants for cancer therapy. Biochemical Pharmacology. 92 (1), 90-101 (2014).
- Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
- Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Lo Celso, C., Scadden, D. T. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiments. (157), (2007).
- Kalaitzidis, D., et al. mTOR complex 1 plays critical roles in hematopoiesis and Pten-loss-evoked leukemogenesis. Cell Stem Cell. 11 (3), 429-439 (2012).
- Sykes, S. M., et al. AKT/FOXO signaling enforces reversible differentiation blockade in myeloid leukemias. Cell. 146 (5), 697-708 (2011).
- Kalaitzidis, D., Neel, B. G. Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells. PLoS One. 3 (11), 3776 (2008).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Mooney, C. J., Cunningham, A., Tsapogas, P., Toellner, K. M., Brown, G. Selective expression of flt3 within the mouse hematopoietic stem cell compartment. International Journal Molecular Sciences. 18 (5), (2017).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. I. SLAM family markers resolve functional distinct sub-populations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment. Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1178 (2010).
- Mukhopadhyay, P., Rajesh, M., Haskó, G., Hawkins, B. J., Madesh, M., Pacher, P. Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy. Nature Protocols. 2 (9), 2295-2301 (2007).
- Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies. Blood. 107 (2), 501-507 (2006).
- Morita, Y., Ema, H., Yamazaki, S., Nakauchi, H. Non-side-population hematopoietic stem cells in mouse bone marrow. Blood. 108 (8), 2850-2856 (2006).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment. Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).
- Somervaille, T. C., Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).
- Hao, X., et al. Metabolic Imaging Reveals a Unique Preference of Symmetric Cell Division and Homing of Leukemia-Initiating Cells in an Endosteal Niche. Cell Metabolism. 29 (4), 950-965 (2019).
