Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Поток Цитометрический анализ митохондриальных реактивных видов кислорода в Мурин гематопоитических стволовых и прародителей клеток и MLL-AF9 Driven лейкемии

Published: September 5, 2019 doi: 10.3791/59593

Summary

Мы описываем метод использования многопараметрического потока цитометрии для обнаружения митохондриальных реактивных видов кислорода (ROS) в мурин здоровых гематопоиетических стволовых и прародителей клеток (HSPCs) и лейкозных клеток из мышиной модели острого миелоидного лейкоза (AML) обусловлен MLL-AF9.

Abstract

Мы представляем циклометрический подход потока для анализа митохондриального ROS в различных живых костных мозгах (БМ) полученных стволовых и прародителей клеток населения от здоровых мышей, а также мышей с AML обусловлен MLL-AF9. В частности, мы описываем двухступенчатый процесс окрашивания клеток, в котором здоровые или лейкозные клетки БМ сначала окрашиваются флюорогенным красителем, который обнаруживает митохондриальные супероксиды, а затем окрашивает с флюрохром-связанных моноклональных антител, которые используются различать различные здоровые и злокачественные популяции гематопоиетических прародителей. Мы также предоставляем стратегию для приобретения и анализа образцов с помощью цитометрии потока. Весь протокол может быть выполнен в срок, как короткие, как 3-4 ч. Мы также подчеркиваем ключевые переменные, которые следует учитывать, а также преимущества и ограничения мониторинга производства ROS в митохондриальном отсеке живой гематопоитической и лейкозной стеблей и субпопуляций гененора с использованием флюорогенных красителей при цитометрии потока . Кроме того, мы представляем данные о том, что митохондриальные ROS изобилие варьируется между различными здоровыми HSPC субпопуляций и лейкемии прародителей и обсудить возможные применения этой техники в гематологических исследований.

Introduction

Реактивные виды кислорода (ROS) являются высокореактивными молекулами, полученными из молекулярного кислорода. Наиболее четко определенным клеточным расположением производства ROS являются митохондрии, где электроны, проходящие через цепочку транспортировки электронов (ETC) во время окислительного фосфорилирования (OXPHOS), поглощаются молекулярным кислородом, ведущим к образованию специфического тип ROS называетсясупероксиды 1. Благодаря действиям ряда ферментов, называемых супероксидными дисмутазами или СОД, супероксиды преобразуются в перекиси водорода, которые впоследствии нейтрализуются в воду такими ферментами, как каталаза или глутатион пероксидаза (GPX). Возмущения в механизмах РОСрегулирования могут привести к избыточному производству ROS, часто называемого окислительным стрессом, которые имеют вредные и потенциально смертельные клеточные последствия, такие как повреждение макромолекулы (т.е. ДНК, белок, липиды). Кроме того, окислительный стресс связан с несколькими патологиями, такими как диабет, воспалительные заболевания, старение и опухоли2,3,4. Для поддержания редокс гомеостаза и предотвращения окислительного стресса, клетки обладают различными механизмами, регулирующими СЕБЯ5.

Физиологические уровни некоторых ROS необходимы для правильного эмбрионального и взрослого гематопоезии6. Однако избыток ROS связан с повреждением ДНК, клеточной дифференциацией и истощением гематопоиетического стебля и бассейна-прародителя. Существует также доказательство того, что изменения в биологии Redox могут отличаться между лейкемией и здоровыми клетками. Например, уровни ROS, как правило, выше в острой миелоидной лейкемии (AML) клетки по сравнению с их здоровыми коллегами и другие исследования показали, что лейкемия стволовые клетки поддерживать низкий устойчивый уровень ROS для выживания7,8. Важно отметить, что стратегии терапевтической капитализации на этих различиях Redox показали обещание в нескольких условиях рака человека9,10. Таким образом, анализы, которые позволяют оценить уровни ROS в моделях мышей, могут улучшить наше понимание того, как эти виды способствуют клеточной физиологии и патогенеза заболеваний, а также потенциально обеспечивают платформу для оценки эффективности новые редокс-таргетинга противораковой терапии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры для животных, описанные в этом протоколе, были одобрены институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) в онкологическом центре Фокс Чейз.

ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий процесс протокола делится на 4 части, представленные на рисунке 1, и необходимые реагенты перечислены в таблице материалов.

1. Изоляция костного мозга (БМ)

ПРИМЕЧАНИЕ: MLL-AF9 лейкемии мышей были созданы, как описано ранее11.

  1. Восстановление моноядерных клеток костного мозга, как описано ранее12,13,14,15, от диких мышей типа C57.Bl6 (которые выражают CD45.2 конгенический маркер), а также от C57. Bl6-SJL мышей (которые выражают CD45.1 конгенический маркер), которые были пересажены с MLL-AF9-выражения лейкозных клеток (CD45.2)).
    ПРИМЕЧАНИЕ: БМ может быть извлечена из мышей либо путем дробления12,13 или промывки костей14,15. Для экспериментов, представленных здесь, БМ был извлечен из здоровых и лейкозных мышей с помощью промывки.

2. Митохондриальный ROS фторгенный краситель окрашивания

  1. После того, как моноядерные клетки костного мозга были извлечены из здоровых и / или лейкемии мышей, пятно аликот клеток с Trypan Blue и рассчитывать с помощью гемоцитометра, чтобы определить начальное число общих клеток БМ.
  2. Центрифуги клетки на 300 х г в течение 5 мин. Аспирировать супернатант и resuspend гранулы в F-PBS (PBS дополнены 2% плода бычьей сыворотки и 1% пенициллина / стрептомицина коктейль) в концентрации 2 х 106 клеток / мл.
  3. Aliquot 200 л клеточной подвески на трубку в 9 одноцветных контрольных трубах с пометкой следующим образом:
    Нет пятна, B220-Cy5-PE, cKit-Cy7-APC, Sca1-PacBlue, CD150-APC (только для здоровых HSPCs), CD45.2-APC (только для клеток лейкемии), CD34-FITC, Митохондриальный ROS dye и Live / мертвые пятна клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: (Необязательно) Положительный контроль для индукции митохондриального ROS может быть подготовлен путем лечения 2 х 105 клеток в 200 ЗЛ с 20 МКм Менадион натрия Бисульфит (MSB) для 1 ч при 37 градусах По Цельсия в 5% CO2 инкубатора. Второй контроль, чтобы обратить вспять MSB-опосредованного индукции митохондриальной ROS может быть подготовлен путем лечения 2 х 105 клеток в 200 QL с 20 МКм МСБ плюс 100 ММ N-ацетил-L-цистеин (NAC) для 1 ч при 37 кв С в 5% CO2 инкубатора.
  4. Aliquot оставшиеся клетки в трубке (экспериментальная трубка) и центрифуги на 300 х г в течение 5 мин.
  5. Resuspend клетки в F-PBS с живым / мертвым пятном клетки в соответствии с инструкциями производителя. Инкубировать на льду в течение 30 мин. Не забудьте добавить живое/ мертвое пятно в одноцветную трубку управления.
  6. Добавьте 1,0 мл комнатной температуры (RT) F-PBS как к одноцветным, так и к экспериментальным трубам, окрашенным живым/мертвым красителями. Центрифуга 5 мин при 300 х г на RT.
  7. Отрежь 50 мкг митохондриального красителя ROS в 13 л диметилсулькоксида (DMSO) для получения раствора запаса 5 мм.
  8. Разбавить митохондриальный краситель ROS до конечной концентрации 5 мкм в РТ F-PBS с верапамилом или без него (50 мкм).
  9. Аспирируй от мытья живого/ мертвого пятна клетки. Добавьте 200 зЛ митохондриального красителя ROS, содержащего верапамил, к каждой экспериментальной трубке, а также митохондриальную трубку управления красителем ROS.
  10. Вихрь смешать и инкубировать в течение 10 минут при 37 градусов по Цельсию в темноте.
  11. Добавьте 1,0 мл RT F-PBS в митохондриальные росцветные одноцветные элементы управления и экспериментальные трубки. Центрифуга 5 мин при 300 х г на RT.
  12. Отпрыгивайте супернатант и промойте клетки дополнительными 1,0 мл RT F-PBS. Центрифуга 5 мин при 300 х г на RT.

3. Линия Антитела Запятнание

  1. Подготовка антител коктейли, перечисленные в таблице 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти антитела коктейли были оптимизированы ранее14,15,16.
  2. Аспирировать супернатант из окончательного митохондриального ROS красителя мыть экспериментальных труб, содержащих здоровые БМ и добавить 200 л антитела коктейль #1 к каждой трубке. Вихрь смешать. Также подготовьте одноцветные контрольные трубки. Инкубировать в течение 60 минут на льду в темноте.
  3. Аспирировать супернатант из окончательного митохондриального ROS красителя мыть экспериментальных труб, содержащих лейкемия БМ и добавить 200 л антитела коктейль #2 к каждой трубке. Вихрь смешать. Инкубировать в течение 60 минут на льду в темноте.
  4. Вымойте 1,0 мл холодного F-PBS и центрифугу 5 мин при 300 х г на RT.
  5. Resuspend клетки в 500 л холодных F-PBS и фильтровать клетки в потоке цитометр трубки с помощью фильтра 40 мкм, чтобы исключить агрегаты.

4. Поток Цитометрии Приобретение и анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько гематопоитических стволовых и прародителей подмножества редки, такие как долгосрочные гематопоиэтитические стволовые клетки. Таким образом, в идеале 3-5 миллионов событий должны быть собраны для каждой экспериментальной трубки во время приобретения цитометрии потока для достаточного анализа митохондриального ROS в различных подмножествах HSPC.

  1. Используйте трубку управления без пятен, чтобы установить вперед (FSC-A) и боковые (SSC-A) рассеивания участков в зависимости от размера и сложности проанализированных популяций клеток.
  2. Используйте без пятна и одноцветные трубки управления, чтобы компенсировать поток цитометра.
  3. Выстрывайте посторонний мусор с переднего и бокового рассеяния(рисунок 2A,B, первая панель слева).
  4. Ворота из дублетов с помощью двойного дискриминационного, таких как передний дискриминационный(Рисунок 2A, B, вторая панель слева).
  5. Следуйте стратегии gating, предложенной на рисунке 2A,B, чтобы выбрать живые клетки, линии низких клеток и различных подмножества HSPC и лейкемии.
  6. Для каждой группы, интересуемая, проанализируйте среднюю интенсивность флуоресценции (МФИ) канала TRPE (x-оси) в гистограммном графике для оценки различий в сигнале митохондриального ROS(рисунок 3A-C, левые панели). Уровни митохондриального ROS можно оценить на одноклеточном уровне, сравнив митохондриальные окрашивания ROS с конкретными маркерами линии в участке рассеяния.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Представлен метод анализа ROS в митохондриях нескольких здоровых и MLL-AF9-выражения популяций декариата. Рисунок 1 отображает схематическое представление рабочего процесса протокола, которое состоит из 4 основных шагов: 1) изоляция БМ от мышей; 2) Окрашивание бМ клеток с флуорогенным красителем, который распознает митохондриальный ROS, особенно супероксиды; 3) Поверхностный маркер антитела окрашивания, чтобы разграничить различные здоровые и лейкемии гематопоитических популяций; и 4) Приобретение и анализ цитометрии потока.

Рисунок 2 A,B изображает репрезентативную стратегию gating для анализа различных гематопоиетических стволовых и прародителей популяций в здоровой и лейкемии БМ. Участок FSC/SSC применяется для устранения мусора, а участок FSC-area (FSC-A) против FSC-высоты (FSC-H) используется для исключения дублетов и агрегатов. Панель маркеров поверхности линии(Таблица 1 и шаг 3.1) объединены, чтобы исключить различные зрелые гематопоиетические популяции, такие как лимфоциты, эритроциты, гранулоциты и моноциты/макрофаги (т.е. Линия низкая илиЛин низкая). Линия коктейль также включает в себя CD48 антитела и, следовательно, все подмножества линии низких клеток также CD48-. Sca-1 и c-Kit выражение поверхности клетки используется, чтобы различать неоднородную смесь HSPCs называется CD48- LSKs (Линнизкий, Sca-1,c-Kit, CD48-) от миелоидных прародителей (Linнизкий, Sca-1- ,c-Kit, CD48-). Для дальнейшего различения различных подмножеств HSPC, маркер SLAM, CD150, а также CD34 также добавляются17,18,19,20,21. Рисунок 2 B также изображает репрезентативную стратегию gating для cKit высоко-выражения простаек лейкемии (Linнизкий, c-Kitвысокий; Sca-1- ),которые обогащаются для инициирующих лейкемии клетки (LICs)11, а также лейкозных клеток, выражающих промежуточно-низкое выражение cKit (cKitInt-low).

Сравнение митохондриальных ROS окрашивания между здоровыми CD48- LSK и миелоидных прародителей показывает, что миелоидные прародители отображают значительно более высокие уровни митохондриального окрашивания ROS(рисунок 3A). Кроме того, cKitвысокий лейкоз прародителей дисплей значительно более высокие уровни митохондриального ROS окрашивания по сравнению с CD48- LSK, миелоидных прародителей или cKitint-низкие лейкозные клетки (Рисунок 3A). cKitInt-низкие клетки лейкемии также отображаются значительно выше митохондриальных ROS окрашивания по сравнению с CD48- LSK клеток, но не миелоидных прародителей (Рисунок 3A). LSKs далее суб-разделены CD150 выражение показало, что митохондриальные ROS окрашивания значительно не меняются в CD48- LSK клетки суб-разделены CD150 высокой (CD150High), промежуточный (CD150Int) или нет (CD150Neg) выражение(рисунок 3B). Тем не менее, устойчивое состояние митохондриальных ROS окрашивания cKitвысокой или cKitInt-низкий лейкоз клетки было установлено, что значительно выше, чем CD48- LSKs-CD150Высокий, -CD150Int или -CD150Neg клеток ( Рисунок 3B). LSK клетки, выражающие низкий до отсутствия уровней CD34 обогащаются для долгосрочного восстановления гематопоиетических стволовых клеток, в частности, CD48- LSK клеток, которые CD34- и CD150высокой20,21. Тем не менее, разделение CD48- LSK-клеток по CD150 и CD34 выражение не выявило каких-либо существенных различий в митохондриальных ROS окрашивания среди этих шести подмножестваHPC (Рисунок 3C).

Figure 1
Рисунок 1 : Схематическое представление рабочего потока протокола. Шаг 1) БМ изоляции от здоровых и MLL-AF9 лейкемических мышей; Шаг 2) клеточное окрашивание с помощью митохондриального красителя ROS (mROS); Шаг 3) клеточное окрашивание с флюорохром-связанных моноклональных антител для дискриминации гематопоитических стволовых и клеток-прародителей (HSPCs) населения у здоровых и лейкемических мышей; Шаг 4) Распределение цитометрии потока приобретение и анализ митохондриальной ROS в нескольких популяциях HSPC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2 : Поток цитометрии gating стратегии для здоровых и MLL-AF9-выражения клеток костного мозга. (A) БМ клетки, изолированные от здоровых мышей были окрашены живым / мертвым красителем (здешной), митохондриальной краситель ROS (TRPE). BM от здоровых мышей был впоследствии окрашены антителами, распознающими маркеры линии плюс CD48 (Cy5-PE), c-Kit (Cy7-APC), Sca1 (PacBlue), CD34 (FITC), CD150 (APC). (B) В дополнение к живой / мертвой клетки и митохондриальные пятна ROS, БМ от лейкемии мышей были также окрашены антителами распознавающих маркеры линии плюс CD48 (Cy5-PE), c-Kit (Cy7-APC), Sca1 (PacBlue) и CD45.2 (APC), который применяется для дискриминации между клетками лейкемии MLL-AF9 из здоровых клеток БМ-реципиента (CD45.1). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3 : Уровень митохондриальной РОЗ в здоровом и MLL-AF9 Костном мозге. Левые панели являются репрезентативными гистограммами митохондриальных уровней ROS указанных популяций, а соответствующие правые панели представляют собой барный график анализа МФО митохондриальных ROS для указанных популяций (n No 4). ()Сравнение уровней митохондриальной ROS в здоровых CD48- LSK, миелоидных прародителей, а также MLL-AF9 Linнизкий c-KitHigh и MLL-AF9 Linнизкий c-KitInt-Low клеток. (B) Сравнение уровней митохондриальных ROS в здоровых CD48- LSK-клетки на основе их экспрессии CD150 по сравнению с MLL-AF9 Linнизким c-KitHigh и MLL-AF9 Linнизким c-KitInt-Low клеток. (C) Сравнение уровней митохондриальных ROS в здоровых КЛЕТКах CD48- LSK на основе их экспрессии CD150 и CD34. (п. 0,05; п.л.; 0,01 евро) p .lt; 0.001; p slt; 0.001; p slt; 0.0001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4 : Изменения в уровнях митохондриального ROS с использованием про- и антиоксидантных соединений. Гистограммы митохондриальных уровней ROS в здоровых и MLL-AF9-выражения БМ-клеток, обработанных с 20 МКм бисульфита натрия (MSB) для 1 ч при 37 градусах По Цельсия в 5% CO2 инкубатора (положительный контроль) или с 20 мКм МСВ в сочетании с 100 ММ N-ацетил-L-цистеин (НАК) для 1 ч при 37 градусах По Цельсия в 5% CO2 инкубатора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5 : Оптимизация митохондриальных ROS и линии признания антител пятна. (A) Сравнение уровней митохондриальной РОЗ (mROS) в MLL-AF9, выражающих клетки лейкемии с использованием 1 или 5 мкм для 10 или 30 мин. (Красный автомобиль; Синий й MSB 20 мкм; Зеленый й NAC 100 мкм; Оранжевый й Msb 20 мкм и НАК 100 мкм). (B) Сравнение МФО канала CD34 (FITC) в здоровых LSKs окрашенных в течение 20, 60 или 90 минут с антитела коктейль #1 (n No 4, р 0,05; р.л.; 0,01). (C) Сравнение антител окрашивания до или после инкубации в течение 30 мин при 37 градусов по Цельсию в 5% CO2 инкубатора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6 : Порядок митохондриального ROS и линии маркера антитела окрашивания. (A) Точечные участки указанных популяций HSPCs, полученные с помощью различных порядков окрашивания. (B) Митохондриальные уровни ROS, оцененные в отсеках LSK и Myeloid Progenitors, полученных, использовали разный порядок окрашивания (красный и антитела окрашивание для 1 ч при 4 кв с, а затем митохондриальной ROS окрашивания в течение 10 мин при 37 градусах Цельсия; Синий й митохондриальный ROS окрашивание в течение 10 мин при 37 градусах По Цельсию, а затем антитела окрашивания 1h при 4 C). (C) Количественная оценка МФО митохондриального ROS (mROS) окрашивания с использованием различных порядков окрашивания в указанных популяциях (n No 4, р- 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 7
Рисунок 7 : Влияние лечения верапамилна на митохондриальный КРАСитель ROS окрашивания в здоровых и MLL-AF9-выражения БМ клеток. (A) Точечные участки указанных популяций HSPC в образцах, обработанных с или без 50 мкм Верапамил в течение 10 минут при 37 градусах По Цельсию в 5% CO2 инкубатора. (B) Гистограммы митохондриального ROS и митоMASS Зеленый краситель окрашивания в указанных популяциях HSPC в присутствии (синий) или отсутствие (красный) 50 мкм Верапамил. (C-E) Количественная оценка уровней митохондриальной РОС в указанных здоровых (C и D) и лейкемии (E) популяций клеток в образцах БМ, обработанных с или без 50 ММ Верапамил во время митохондриального окрашивания ROS (n No 4, p 0.05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Table 1
Таблица 1: Антитела коктейли. Список коктейлей антитела, приготовленных в шаге 3.1. для выявления различных гематопоитических подпопуляций в здоровом и лейкозном костном мозге.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Флюорогенные красители, которые были разработаны для обнаружения ROS часто оцениваются в фиксированных клетках с помощью микроскопии или в живых клетках цитометрии потока22. Поток цитометрической оценки митохондриального ROS в клетках БМ с использованием митохондриальных рвов ROS фторгенных имеет два основных преимущества: 1) Это быстрый и простой метод, который подходит для анализа живых клеток и 2) он позволяет различать и анализировать редкие населения на одноклеточном уровне в БМ с использованием окрашивания поверхностного маркера. Пошаговой протокол, представленный здесь, был разработан для изучения статуса ex vivo redox гематопоиетического стебля и популяций прародителей как от здоровых мышей, так и мышиной модели AML, управляемой MLL-AF9 с использованием цитометрии потока. Есть несколько ключевых технических переменных, которые необходимо учитывать при исполнении этого протокола.

Во-первых, использование про- и антиоксидантных средств управления позволяет пользователю установить базовый упор для увеличения митохондриальных ROS окрашивания, а также специфика пятна. Для протокола, представленного здесь, про-окислитель MSB был использован в качестве положительного контроля для обнаруживаемой индукции митохондриального ROS окрашивания в здоровых и лейкозных клеток BM (Рисунок 4). Антиоксидант НАК может быть использован в качестве дополнительного контроля, так как он в значительной степени обращает митохондриальные ROS окрашивания индуцированных MSB (Рисунок 4).

Во-вторых, митохондриальный фторгенный краситель ROS, используемый в данном исследовании, рекомендуется использовать в концентрации 5 мкм в течение 10 мин. Тем не менее, производитель также предполагает, что концентрация и время окрашивания может варьироваться между типами клеток. В этом исследовании, митохондриальные ROS окрашивания был сопоставлен на обоих 1 ММ и 5 ММ либо 10 или 30 мин. Анализ показал, что концентрация 5 мкм для 10 до 30 минут достаточно для обнаружения MSB-опосредованных изменений в митохондриальной ROS, а также тех, вспять нацлечения(рисунок 5A). Так как не было количественной разницы между 10 и 30 мин, время окрашивания 10 мин был выбран для этого исследования, чтобы свести к минимуму продолжительность асссе.

В-третьих, CD34 антитела инкубации раз различаются в литературе от 20 до 90 мин23,24. Для оптимизации протокола, представленного здесь, клетки костного мозга были инкубированы антител #1 (шаг 3.1) за 20, 60 или 90 мин. Как показано на рисунке 5B, значительно сильнее CD34 окрашивание наблюдалось на клетках окрашенных в течение 60 или 90 минут по сравнению с 20 мин пятно. Тем не менее, существенная разница в CD34 окрашивания не наблюдается между антитела инкубации раз 60 и 90 мин (Рисунок 5B) и, таким образом, 60 мин пятно антитела рекомендуется для представленного протокола.

В-четвертых, в представленном протоколе, как здоровые, так и лейкозные клетки сначала окрашиваются митохондриальным фторгенным красителем ROS, промывают, а затем окрашивают флюорохромно-связанными с ним линейными антителами. Хотя прямая оценка объединения митохондриальных ros пятно с линией антител не было проведено в этом исследовании, оценка фторхром-связанных линии антитела окрашивания был пробы в митохондриальных ros окрашивания условиях для 10, 20 и 30 мин при 37 градусах по Цельсию. Этот анализ показал, что 30 мин инкубации при 37 градусах По Цельсию существенно изменяет окрашивание поверхности линии(рисунок 5C). Кроме того, митохондриальные ROS окрашивания была оценена в первую очередь, окрашивание здоровых клеток БМ с флюорохром-связанных линии антител следуют окрашивания с митохондриальной ROS фторгенный краситель, а также наоборот порядок операций. Окрашивание клеток сначала с линией антител следуют митохондриальные ROS окрашивания привело к более низким митохондриальных сигналов ROS по сравнению с наоборот окрашивания протокола(Рисунок 6A,B) - в том числе значительные различия для CD48- LSK CD150высокий, CD48- LSK CD150Int CD34 и миелоидные популяции прародителей(рисунок 6C).

В-пятых, последние исследования показывают, что различные мурин здоровые популяции HSPC обладают различными способностями к efflux несколько митохондриальных окрашивания фторгенных зондов, таких как те, которые используются для оценки митохондриальной массы (далее называют mitoMASS зеленый) или потенциальные25,26. Таким образом, влияние ингибитора насоса efflux verapamil на окрашивание здоровых и лейкемии прародителей с митохондриальной ROS фторгенный краситель. Одновременное окрашивание HSPCs с митохондриальной ROS не изменить линии маркера антитела окрашивания(Рисунок 7A), однако, верапамил сделал значительно улучшить митохондриальные ROS окрашивания сигналов в различных здоровых и лейкемии популяции прародителей(рисунок 7B, C). Примечательно, что величина улучшенной митохондриальной ROS окрашивания путем верапамил был не так велик, как видели с mitoMASS зеленый фторгенный краситель(Рисунок 7B).

В-шестых, в протоколе, представленном здесь, бМ клетки были восстановлены путем удаления костных наконечников (эпифиза), а затем промывки костей. Тем не менее, эпифиза содержит гематопоитические клетки, которые потенциально могут быть потеряны в результате промывки костей. В качестве альтернативы, БМ клетки могут быть извлечены путем затирания костей с раствором и пестиком, как ранее описано12,13.

Представленный здесь протокол закладывает основу для использования флюорогенных красителей для измерения внутриклеточной биологии редокса в живых клетках, извлеченных из живых организмов. Однако важно отметить, что ни один фторгенный краситель нельзя считать окончательно конкретным, и поэтому для проверки любых выводов следует проводить дополнительные исследования с альтернативными методами. Кроме того, результаты этого исследования показывают, что популяции клеток лейкемии, обогащенные для LICs (т.е. Linlow cKithigh) показывают более высокие уровни митохондриального ROS, чем здоровые миелоидные прародители или другие популяции HSPC. Тем не менее, Linнизкий cKitвысокой популяции клеток лейкемии оценивается здесь было показано, что неоднородныи и могут быть дополнительно подразделены другими маркерами линии11,27. Кроме того, последние исследования показывают, что LICs обладают различными метаболических фенотип28. Поэтому будущие исследования, оценивающие митохондриальные ROS параллельно с метаболическими анализами или зондами, а также дополнительные линейные маркерные антитела будут информативными.

Этот простой протокол позволяет измерять уровни митохондриального ROS в живых гематопоиетических клетках и может служить основой для изучения глубинной биологии здоровых и больных стволовых и клеток-прародителей, а также для оценки эффективности редокс-таргетинг терапии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Фокс Чейз онкологический центр совета директоров (DDM), Американское общество гематологии Стипендиат премии (SMS), Американское онкологическое общество RSG (SMS) и Министерство обороны (Награда: W81XWH-18-1-0472).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Heat inactivated FBS VWR Seradigm LIFE SCIENCE 97068-085 Media
Penicillin Streptomycin Corning 30-002-CI Media
PBS Fisher Scientific BP399-20 Buffer
15 mL conical tube BD falcon 352096 Tissue Culture Supplies
50 mL conical tube BD falcon 352098 Tissue Culture Supplies
40 μm cell strainers Fisher Scientific 22-363-547 Tissue Culture Supplies
RBC Lysis Buffer Fisher Scientific 50-112-9751 Tissue Culture Supplies
Menadione sodium Bisulfite Sigma aldrich M5750 Pro-oxidant
NAC Sigma aldrich A7250 Anti-oxidant
CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11 Biolegend 100310 Antibody
CD4 PE-Cy5 clone RM4-5 eBioscience 15-0041-81 Antibody
CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7 eBioscience 15-0081-81 Antibody
CD19 PE-Cy5 clone 6D5 Biolegend 115510 Antibody
B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2 Biolegend 103210 Antibody
Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5 Biolegend 108410 Antibody
Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119 Biolegend 116210 Antibody
CD48 PE-Cy5 clone HM48-1 Biolegend 103420 Antibody
CD117  APC-Cy7 clone 2B8 Biolegend 105825 Antibody
Sca1 peacific Blue clone D7 Biolegend 108120 Antibody
CD150 APC clone TC15-12F12.2 Biolegend 115909 Antibody
CD34 FITC clone RAM34 BD Bioscience 553733 Antibody
CD45.2 APC clone 104 Biolegend 1098313 Antibody
MitoSOX Red ThermoFisher Scientific M36008 Dye
Mitotracker Green ThermoFisher Scientific M7514 Dye
Live/dead Yellow Dye ThermoFisher Scientific L34967 Dye

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dröse, S., Brandt, U. Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain. Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).
  2. Gerber, P. A., Rutter, G. A. The Role of Oxidative Stress and Hypoxia in Pancreatic Beta-Cell Dysfunction in Diabetes Mellitus. Antioxidant & Redox Signaling. 26 (10), 501-518 (2017).
  3. Höhn, A., et al. Happily (n)ever after: Aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence. Redox Biology. 11, 482-501 (2017).
  4. Reuter, S., Gupta, S. C., Chaturvedi, M. M., Aggarwal, B. B. Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked. Free Radical Biology & Medicine. 49 (11), 1603-1616 (2010).
  5. Lee, B. W. L., Ghode, P., Ong, D. S. T. Redox regulation of cell state and fate. Redox Biology. 2213-2317 (18), 30899 (2018).
  6. Harris, J. M., et al. Glucose metabolism impacts the spatiotemporal onset and magnitude of HSC induction in vivo. Blood. 121, 2483-2493 (2013).
  7. Hole, P. S., Darley, R. L., Tonks, A. Do reactive oxygen species play a role in myeloid leukemias. Blood. 117, 5816-5826 (2011).
  8. Lagadinou, E. D., et al. BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).
  9. Di Marcantonio, D., et al. Protein Kinase C Epsilon Is a Key Regulator of Mitochondrial Redox Homeostasis in Acute Myeloid Leukemia. Clinical Cancer Research. 24 (3), 608-618 (2018).
  10. Glasauer, A., Chandel, N. S. Targeting antioxidants for cancer therapy. Biochemical Pharmacology. 92 (1), 90-101 (2014).
  11. Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
  12. Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  13. Lo Celso, C., Scadden, D. T. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiments. (157), (2007).
  14. Kalaitzidis, D., et al. mTOR complex 1 plays critical roles in hematopoiesis and Pten-loss-evoked leukemogenesis. Cell Stem Cell. 11 (3), 429-439 (2012).
  15. Sykes, S. M., et al. AKT/FOXO signaling enforces reversible differentiation blockade in myeloid leukemias. Cell. 146 (5), 697-708 (2011).
  16. Kalaitzidis, D., Neel, B. G. Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells. PLoS One. 3 (11), 3776 (2008).
  17. Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
  18. Mooney, C. J., Cunningham, A., Tsapogas, P., Toellner, K. M., Brown, G. Selective expression of flt3 within the mouse hematopoietic stem cell compartment. International Journal Molecular Sciences. 18 (5), (2017).
  19. Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. I. SLAM family markers resolve functional distinct sub-populations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
  20. Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
  21. Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment. Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1178 (2010).
  22. Mukhopadhyay, P., Rajesh, M., Haskó, G., Hawkins, B. J., Madesh, M., Pacher, P. Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy. Nature Protocols. 2 (9), 2295-2301 (2007).
  23. Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies. Blood. 107 (2), 501-507 (2006).
  24. Morita, Y., Ema, H., Yamazaki, S., Nakauchi, H. Non-side-population hematopoietic stem cells in mouse bone marrow. Blood. 108 (8), 2850-2856 (2006).
  25. de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
  26. Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment. Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).
  27. Somervaille, T. C., Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).
  28. Hao, X., et al. Metabolic Imaging Reveals a Unique Preference of Symmetric Cell Division and Homing of Leukemia-Initiating Cells in an Endosteal Niche. Cell Metabolism. 29 (4), 950-965 (2019).

Tags

Исследования рака выпуск 151 AML HSCs ROS супероксиды митохондрии цитометр потока
Поток Цитометрический анализ митохондриальных реактивных видов кислорода в Мурин гематопоитических стволовых и прародителей клеток и MLL-AF9 Driven лейкемии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Di Marcantonio, D., Sykes, S. M.More

Di Marcantonio, D., Sykes, S. M. Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia. J. Vis. Exp. (151), e59593, doi:10.3791/59593 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter