Summary
We beschrijven een methode voor het gebruik van Multi parameter flow cytometrie te detecteren mitochondriale reactieve zuurstof soorten (ROS) in Murine gezonde hematopoietische stam en voorlopercellen (HSPCs) en leukemie cellen van een muismodel van acute myeloïde leukemie (AML) gedreven door MLL-AF9.
Abstract
We presenteren een flowcytometrische benadering voor het analyseren van mitochondriale ROS in diverse levende beenmerg (BM)-afgeleide stam-en voorlopercellen van gezonde muizen en muizen met AML aangedreven door MLL-AF9. Specifiek beschrijven we een tweestapskleurings proces, waarbij gezonde of leukemie BM-cellen eerst worden gekleurd met een fluorogene kleurstof die mitochondriale Super oxiden detecteert, gevolgd door kleuring met met fluorochrome verbonden monoklonale antilichamen die worden gebruikt verschillende gezonde en kwaadaardige hematopoietische voorlopercellen te onderscheiden. We bieden ook een strategie voor het verwerven en analyseren van de monsters door flow Cytometry. Het gehele protocol kan worden uitgevoerd in een tijdsbestek van slechts 3-4 h. We markeren ook de belangrijkste variabelen om te overwegen, evenals de voordelen en beperkingen van het bewaken van ROS productie in het mitochondriale compartiment van levende hematopoietische en leukemie stam en voorlopercellen subpopulaties met behulp van fluorogenic kleurstoffen doorstroming cytometrie . Bovendien presenteren we gegevens die mitochondriale ROS overvloed varieert tussen verschillende gezonde HSPC subpopulaties en leukemie voor ouders en bespreken de mogelijke toepassingen van deze techniek in hematologisch onderzoek.
Introduction
Reactieve zuurstof soorten (ROS) zijn zeer reactieve moleculen afgeleid van moleculaire zuurstof. De meest goed gedefinieerde cellulaire locatie van ROS productie is de mitochondriën, waar elektronen die passeren de elektronentransport keten (ETC) tijdens oxidatieve fosforylering (OXPHOS) worden geabsorbeerd door moleculaire zuurstof die leidt tot de vorming van een specifieke type ROS genaamd Super oxiden1. Door de acties van een reeks enzymen, genaamd superoxide dismutases of sod's, worden super oxiden omgezet in waterstof peroxiden, die vervolgens worden geneutraliseerd in water door enzymen zoals katalase of glutathion peroxiasen (GPX). Verstoringen in ROS-regelgevende mechanismen kunnen leiden tot de overtollige productie van ROS, vaak aangeduid als oxidatieve stress, die schadelijke en potentieel dodelijke cellulaire gevolgen zoals Macromolecuul schade hebben (dat wil zeggen, DNA, eiwitten, lipiden). Bovendien is oxidatieve stress gerelateerd aan verschillende pathologieën, zoals diabetes, ontstekingsziekten, veroudering en tumoren2,3,4. Te handhaven redox homeostase en oxidatieve stress te voorkomen, cellen bezitten een verscheidenheid van ROS-regulerende mechanismen5.
Fysiologische niveaus van bepaalde ROS zijn noodzakelijk voor goede embryonale en volwassen Hematopoiesis6. Echter, overtollige ROS wordt geassocieerd met DNA-schade, cellulaire differentiatie en uitputting van het hematopoietische stam en voorlopercellen pool. Er is ook bewijs dat veranderingen in redox biologie kunnen verschillen tussen leukemie en gezonde cellen. Bijvoorbeeld, Ros niveaus neigen te zijn hoger in acute myeloïde leukemie (AML) cellen ten opzichte van hun gezonde tegenhangers en andere studies hebben gesuggereerd dat leukemie stamcellen een lage steady-state niveau van Ros voor overleving7,8behouden. Belangrijk, strategieën voor therapeutisch kapitaliseren op deze redox verschillen hebben aangetoond belofte in verschillende menselijke kanker instellingen9,10. Daarom, assays die het mogelijk maken voor de beoordeling van ROS niveaus in muismodellen kunnen verbeteren ons begrip van hoe deze soorten bijdragen aan cellulaire fysiologie en ziekte pathogenese, alsmede mogelijk bieden een platform voor de beoordeling van de effectiviteit van nieuwe redox-gerichte anti-kankertherapieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle in dit protocol beschreven dier procedures zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) bij Fox Chase Cancer Center.
Opmerking: De protocol-workflow is verdeeld in 4 delen zoals weergegeven in Figuur 1 en de vereiste reagentia worden vermeld in de Inhoudsopgave.
1. scheiding van beenmerg (BM)
Opmerking: MLL-AF9 leukemie muizen werden gegenereerd zoals eerder beschreven11.
- Herstel mono-nucleaire beenmergcellen, zoals eerder beschreven12,13,14,15, van wild type C57. Bl6 muizen (die de cd 45,2 congenic marker uitdrukken) en van C57. Bl6-SJL-muizen (die de CD 45,1 congenic marker uitdrukken) die zijn getransplanteerd met MLL-AF9-uitdrukken van leukemie cellen (CD 45,2+).
Opmerking: BM kan bij muizen worden teruggewonnen door12,13 te breken of door botten te spoelen14,15. Voor de hier gepresenteerde experimenten werd BM hersteld van zowel gezonde als leukemie muizen via Flushing.
2. mitochondriale ROS Fluorogenic kleurstof kleuring
- Zodra mono-nucleaire beenmergcellen zijn teruggewonnen uit gezonde en/of leukemie muizen, vlek een hoeveelheid cellen met Trypan blauw en tellen met behulp van een hemocytometer om te bepalen van het beginaantal van de totale BM-cellen.
- Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 5 min. aspireren de supernatant en respendeer de pellet in F-PBS (PBS aangevuld met 2% foetaal runderserum en een 1% Penicileen/streptomycine cocktail) tot een concentratie van 2 x 106 cellen/ml.
- Aliquot 200 μL celsuspensie per buis in 9 eenkleurige bedienings buizen met het label als volgt:
Geen vlek, B220-Cy5-PE, cKit-Cy7-APC, Sca1-PacBlue, CD150-APC (alleen voor gezonde Hspc's), CD 45,2-APC (alleen voor leukemie cellen), CD34-FITC, mitochondriale ROS kleurstof en levende/dode cel vlek.
Opmerking: Optionele Een positieve controle voor de inductie van mitochondriale ROS kan worden bereid door 2 x 105 cellen in 200 μL te behandelen met 20 ΜM Menadione natrium Bisulfite (MSB) voor 1 uur bij 37 °c in een incubator van 5% Co2 . Een tweede controle om de door MSB gemedieerde inductie van mitochondriale ROS om te keren kan worden bereid door 2 x 105 cellen in 200 μL te behandelen met 20 ΜM MSB plus 100 μM N-acetyl-L-CYSTEÏNE (NAC) voor 1 uur bij 37 °c in een 5% Co2 -incubator. - Aliquot de overblijvende cellen in een buis (experimentele buis) en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min.
- Respendeer de cellen in F-PBS met een levende/dode celvlek volgens de instructies van de fabrikant. Inincuberen op ijs gedurende 30 min. Zorg ervoor dat u Live/Dead Stain aan de eenkleurige controle buis toevoegt.
- Voeg 1,0 mL kamertemperatuur (RT) F-PBS toe aan zowel single-Color als experimentele buizen gekleurd met de Live/Dead kleurstof. Centrifugeer 5 min bij 300 x g bij RT.
- Respendeer 50 μg van de mitochondriale ROS-kleurstof in 13 μL dimethylsulfoxide (DMSO) om een 5 mM stockoplossing te verkrijgen.
- Verdun mitochondriale ROS-kleurstof tot een uiteindelijke concentratie van 5 μM in RT F-PBS met of zonder verapamil (50 μM).
- Aspirate uit de Wash van de levende/dode cel vlek. Voeg 200 μL mitochondriale ROS kleurstof vlek met verapamil toe aan elke experimentele buis en de mitochondriale ROS Dye éénkleurige controle buis.
- Vortex te mengen en inbroed gedurende 10 min bij 37 ° c in het donker.
- Voeg 1,0 mL RT F-PBS toe aan de mitochondriale ROS-gekleurd besturingselement met één kleur en experimentele buizen. Centrifugeer 5 min bij 300 x g bij RT.
- Zuig de supernatant uit en was de cellen met een extra 1,0 mL RT F-PBS. Centrifugeer 5 min bij 300 x g bij RT.
3. kleuring van Lineage-antilichamen
- Bereid de in tabel 1vermelde cocktails met antilichamen voor.
Opmerking: Deze antilichamen cocktails zijn eerder14,15,16geoptimaliseerd. - Aspirate de supernatant van de laatste mitochondriale ROS Dye Wash van de experimentele buizen met gezonde BM en voeg 200 μL antilichaam cocktail #1 aan elke buis. Vortex om te mengen. Ook de single-Color besturings buizen voorbereiden. Inincuberen voor 60 min op ijs in het donker.
- Aspirate de supernatant van de laatste mitochondriale ROS Dye Wash van de experimentele buizen met leukemie BM en voeg 200 μL van de antilichaam cocktail #2 aan elke buis. Vortex om te mengen. Inincuberen voor 60 min op ijs in het donker.
- Was met 1,0 mL koude F-PBS en centrifugeer 5 min bij 300 x g bij RT.
- Respendeer cellen in 500 μL koude F-PBS en filtreer de cellen in een flow cytometer-buis met behulp van een 40 μm-filter om aggregaten uit te sluiten.
4. flow Cytometrie acquisitie en analyse
Opmerking: Verschillende hematopoietische stam-en voorlopercellen zijn zeldzaam, zoals op lange termijn hematopoietische stamcel. Zo moeten idealiter 3-5 miljoen gebeurtenissen worden verzameld voor elke experimentele buis tijdens flow cytometrie verwerving voor voldoende analyse van mitochondriale ROS in de verschillende HSPC-subsets.
- Gebruik de No-Stain-bedienings buis om de spreidings plots (FSC-A) en Side (SSC-A) in te stellen op basis van de grootte en complexiteit van de geanalyseerde celpopulatie.
- Gebruik de buizen zonder vlekken en enkele kleuren om de flow cytometer te compenseren.
- Gate uit vreemd puin uit de voorwaartse en zijspreidings plot (Figuur 2A, B, eerste paneel van links).
- Poort uit wambuizen met een dubbele discriminator zoals de voorwaartse discriminator (Figuur 2a, B, tweede paneel van links).
- Volg de gating-strategie voorgesteld in afbeelding 2a,B om te selecteren van levende cellen, lineage lage cellen en de verschillende hspc en leukemie subsets.
- Analyseer voor elke populatie van belang de mediane fluorescentie intensiteit (MFI) van het TRPE-kanaal (x-as) in een histogram plot om de verschillen in het mitochondriale ROS-signaal te evalueren (Figuur 3a-C, linker panelen). Niveaus van mitochondriale ROS kunnen worden geëvalueerd op de single-cell niveau door het vergelijken van mitochondriale ROS kleuring versus specifieke Lineage markers in een Scatter plot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gepresenteerd is een methode voor het analyseren van ROS in de mitochondriën van meerdere gezonde en MLL-AF9-uitdrukken leukemie populaties. Figuur 1 geeft een schematische weergave van de protocol workflow, die bestaat uit 4 belangrijke stappen: 1) BM-isolatie van muizen; 2) kleuring BM-cellen met een fluorogenic kleurstof die mitochondriale ROS herkent, met name Super oxiden; 3) oppervlak marker antilichaam kleuring te afbakenen verschillende gezonde en leukemie hematopoietische populaties; en 4) flow cytometrie acquisitie en analyse.
Figuur 2 A, B toont een representatieve gating strategie voor het analyseren van verschillende hematopoietische stam en voorlopercellen populaties in gezonde en leukemie BM. Er wordt een FSC/SSC-plot toegepast om vuil te elimineren en een FSC-gebied (FSC-A) versus FSC-H-plot (FSC-A) wordt gebruikt om dubbeltjes en aggregaten uit te sluiten. Een panel van Lineage oppervlak markers (tabel 1 en stap 3,1) worden gecombineerd om een verscheidenheid van volwassen hematopoietische populaties zoals lymfocyten, erytrocyten, granulocyten en monocyten/macrofagen (D.w.z. Lineage laag of Linlaag) uit te sluiten. De Lineage cocktail bevat ook een CD48 antilichaam en daarom zijn alle subsets van Lineage lage cellen ook CD48-. SCA-1 en c-Kit celoppervlak uitdrukking wordt gebruikt om een heterogene mix van Hspc's genaamd CD48- lsks (LinLow, SCA-1+, c-Kit+, CD48-) te onderscheiden van myeloïde voorlopercellen (LinLow, SCA-1- , c-Kit+, CD48-). Om verschillende hspc-subsets verder te onderscheiden, worden de Slam marker, CD150 en CD34 ook toegevoegd17,18,19,20,21. Figuur 2 B toont ook een representatieve gating strategie voor ckit High-uitdrukken leukemie voor ouders (Linlaag, c-Kithoog; SCA-1-), die zijn verrijkt voor leukemie initiëren cellen (LICs)11 en leukemie cellen uitdrukken tussen lage expressie van de Ckit (ckitint-laag).
Een vergelijking van mitochondriale ROS kleuring tussen gezonde CD48- LSK en myeloïde voorlopercellen blijkt dat myeloïde voorlopercellen vertonen significant hogere niveaus van MITOCHONDRIALE Ros kleuring (Figuur 3A). Bovendien, cKithoge leukemie voor ouders vertonen significant hogere niveaus van MITOCHONDRIALE Ros kleuring in vergelijking met CD48- LSK, myeloïde voorlopercellen of ckitint-lage leukemie (Figuur 3A). cKitint-lage leukemie cellen ook weergegeven significant hogere MITOCHONDRIALE Ros kleuring in vergelijking met CD48- LSK cellen, maar niet aan myeloïde voor ouders (Figuur 3A). LSKs verder sub-gedeeld door CD150 uitdrukking toonde aan dat mitochondriale ROS kleuring niet significant Variete in CD48- LSK cellen sub-gedeeld door CD150 hoog (CD150hoog), Intermediate (CD150int) of No (CD150NEG) uitdrukking (Figuur 3B). Echter, Steady-State mitochondriale ROS kleuring van cKithoge of Ckitint-lage leukemie cellen bleek aanzienlijk hoger dan CD48-Lsks-CD150hoge,-CD150int of-CD150NEG cellen ( Figuur 3B). LSK-cellen die laag tot geen niveaus van CD34 uitdrukken, zijn verrijkt voor langdurig reconstitueren van hematopoëtische stamcellen, met name CD48-LSK-cellen die CD34- en CD150hoge20,21zijn. Echter, onderverdelen CD48- LSK cellen door CD150 en CD34 uitdrukking geen significante verschillen in de MITOCHONDRIALE Ros kleuring tussen deze zes hspc subsets (Figuur 3C).
Figuur 1 : Schematische weergave van de protocol-work-flow. Stap 1) BM isolatie van gezonde en MLL-AF9 leukemische muizen; Stap 2) cellulaire kleuring met behulp van een mitochondriale ROS kleurstof (mROS); Stap 3) cellulaire kleuring met fluor chroom-gebonden monoklonale antilichamen om te discrimineren hematopoietische stam en voorlopercellen (HSPCs) populatie in gezonde en leukemische muizen; Stap 4) flow Cytometrie acquisitie en analyse van mitochondriale ROS in verschillende HSPC populaties. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Flowcytometrie strategieën voor gezonde en MLL-AF9-uitdrukken beenmergcellen. (A) BM-cellen geïsoleerd van gezonde muizen werden gekleurd met een levende/dode kleurstof (qdot), MITOCHONDRIALE Ros-kleurstof (trpe). BM van gezonde muizen werd vervolgens bevlekt met antilichamen die Lineage markers herkennen plus CD48 (Cy5-PE), c-Kit (Cy7-APC), Sca1 (PacBlue), CD34 (FITC), CD150 (APC). (B) naast levende/dode cel-en MITOCHONDRIALE Ros-vlekken waren BM van leukemie muizen ook bevlekt met antilichamen die Lineage markers herkennen plus CD48 (CY5-PE), c-Kit (CY7-APC), Sca1 (pacblue) en cd 45,2 (APC), die wordt toegepast op discrimineren tussen MLL-AF9 leukemie cellen van gezonde ontvanger BM cellen (CD 45,1). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Mitochondriale Ros niveaus in gezonde en MLL-AF9 beenmerg. Linker panelen zijn representatieve histogrammen van mitochondriale ROS niveaus van de aangegeven populaties en de respectieve rechter panelen vertegenwoordigen staafdiagram analyses van de MFI van mitochondriale ROS voor de aangegeven populaties (n = 4). (A) vergelijking van MITOCHONDRIALE Ros niveaus in gezonde CD48- LSK, myeloïde VOORLOPERCELLEN, evenals mll-AF9 Linlage c-Kithoog en mll-AF9 Linlage c-Kitint-low Cells. (B) vergelijking van MITOCHONDRIALE Ros niveaus in gezonde CD48- LSK cellen op basis van hun CD150 expressie versus mll-AF9 Linlage c-Kithoog en mll-AF9 Linlage c-Kitint-lage cellen. C) vergelijking van MITOCHONDRIALE Ros-niveaus in gezonde CD48- LSK-cellen op basis van hun CD150 en CD34 expressie. (* p ≤ 0,05; * * p < 0,01 * * * p < 0,001; * * * * p < 0,0001). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Veranderingen in mitochondriale Ros niveaus met behulp van Pro-en anti-oxydant verbindingen. Histogrammen van mitochondriale Ros niveaus in gezonde en mll-AF9-uitdrukken BM cellen behandeld met 20 μM menadion natrium natriumbisulfiet (MSB) voor 1 h bij 37 ° c in een 5% Co2 incubator (positieve controle) of met 20 μm van MSB in combinatie met 100 μM N-acetyl-L-cysteïne (NAC) voor 1 h bij 37 ° c in een 5% CO2 incubator. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5 : Optimalisatie van de mitochondriale Ros en Lineage-herkennen van antilichaam vlekken. A) vergelijking van de MITOCHONDRIALE Ros (mros) spiegels in mll-AF9 die leukemie cellen met 1 of 5 μM voor 10 of 30 min. (rood = voertuig; Blauw = MSB 20 μM; Groen = NAC 100 μM; Oranje = MSB 20 μM + NAC 100 μM). B) vergelijking van de MFI van het CD34 Channel (FITC) in gezonde lsks gekleurd voor 20, 60 of 90 min met de antilichaam cocktail #1 (n = 4, * p ≤ 0,05; * * p < 0,01). C) de vergelijking van antilichamen vlekken vóór of na incubatie gedurende 30 minuten bij 37 °c in een incubator van 5% Co2 . Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6 : Orde van mitochondriale Ros en Lineage marker antilichaam kleuring. A) punt grafieken van de aangegeven HSPCs-populaties, verkregen door gebruik te maken van verschillende kleurings bevelen. B) de MITOCHONDRIALE Ros-niveaus geëvalueerd in de LSK-en myeloïde voorloper compartimenten die zijn verkregen, gebruikten verschillende volgorde van kleuring (rood = antilichaam kleuring gedurende 1 uur bij 4 °c gevolgd door MITOCHONDRIALE Ros-kleuring gedurende 10 minuten bij 37 °c; Blauw = mitochondriale ROS kleuring gedurende 10 minuten bij 37 °C gevolgd door antilichaam kleuring 1h bij 4 °C). C) kwantificering van de MFI-kleuring van MITOCHONDRIALE Ros (mros) met verschillende kleurings bevelen in de aangegeven populaties (n = 4, * p ≤ 0,05). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7 : Effect van verapamil behandeling op mitochondriale Ros kleurstof kleuring in gezonde en MLL-AF9-uitdrukken van BM-cellen. A) punt grafieken van de aangegeven hspc-populaties in monsters die met of zonder 50 ΜM verapamil gedurende 10 minuten bij 37 °c zijn behandeld in een incubator van 5% Co2 . B) histogrammen van MITOCHONDRIALE Ros en mitoMASS groene kleurstof kleuring in de aangegeven hspc-populaties in aanwezigheid (blauw) of afwezigheid (rood) van 50 ΜM verapamil. (C-E) Kwantificering van mitochondriale ROS niveaus in de aangegeven gezonde (C & D) en leukemie (E) celpopulaties in BM monsters behandeld met of zonder 50 μM verapamil tijdens de mitochondriale ROS kleuring (n = 4, * p ≤ 0,05). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Tabel 1: cocktails met antilichamen. Lijst van antilichamen cocktails bereid in stap 3,1. om verschillende hematopoëtische subpopulaties binnen gezond en leukemie beenmerg te identificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fluorogene kleurstoffen die zijn ontwikkeld voor de detectie van Ros worden vaak geëvalueerd in vaste cellen door microscopie of in levende cellen door flow flowcytometrieonderzoeken22. Flow cytometrische evaluatie van mitochondriale ROS in BM-cellen met behulp van mitochondriale ROS fluorogenic kleurstoffen heeft twee belangrijke voordelen: 1) het is een snelle en eenvoudige techniek die geschikt is voor Live-celanalyse en 2) het maakt het mogelijk om te onderscheiden en te analyseren zeldzame populaties op het eencellige niveau in de BM met behulp van oppervlak marker kleuring. Het stapsgewijze protocol dat hier wordt gepresenteerd, is ontwikkeld om de ex vivo redox-status van hematopoietische stam-en voorlopercellen van zowel gezonde muizen als een muismodel van AML, aangedreven door mll-AF9, te bestuderen met behulp van Flowcytometrie. Er zijn verschillende belangrijke technische variabelen die tijdens de uitvoering van dit protocol moeten worden overwogen.
Ten eerste, het gebruik van Pro-en anti-oxydant controles stelt de gebruiker in staat om een basislijn voor stijgingen van de mitochondriale ROS kleuring en de specificiteit van de vlek vast te stellen. Voor het protocol hier gepresenteerd, de Pro-oxidant MSB werd gebruikt als een positieve controle voor een detecteerbare inductie van mitochondriale ROS kleuring in zowel gezonde en leukemie BM cellen (figuur 4). De anti-oxidant NAC kan worden gebruikt als een extra controle, als het grotendeels keert de mitochondriale ROS kleuring geïnduceerd door MSB (figuur 4).
Ten tweede wordt de mitochondriale ROS fluorogene kleurstof die in deze studie wordt gebruikt, aanbevolen om 10 minuten te gebruiken bij een concentratie van 5 μM. De fabrikant suggereert echter ook dat de concentratie en de tijd van kleuring kunnen variëren tussen celtypen. In deze studie, mitochondriale ROS kleuring werd vergeleken bij zowel 1 μM en 5 μM voor 10 of 30 min. Uit de analyse bleek dat een concentratie van 5 μM voor ofwel 10 tot 30 minuten voldoende is om MSB-gemedieerde veranderingen in mitochondriale ROS te detecteren, evenals die omgekeerd door NAC-behandeling (figuur 5a). Aangezien er geen kwantitatief verschil was tussen 10 en 30 minuten, werd voor deze studie een kleurings tijd van 10 minuten geselecteerd om de lengte van de assay te minimaliseren.
Ten derde varieert de incubatietijd van CD34 antilichamen in de literatuur van 20 tot 90 min23,24. Om het protocol dat hier wordt gepresenteerd te optimaliseren, werden de cellen van het beenmerg van Murine geïnincubeerd met de antilichaam cocktail #1 (stap 3,1) voor 20, 60 of 90 min. Zoals weergegeven in figuur 5b, significant sterker CD34 kleuring werd waargenomen op cellen gekleurd voor 60 of 90 min in vergelijking met de 20 min vlek. Er werd echter geen significant verschil in CD34 kleuring waargenomen tussen antilichaamincubatie tijden van 60 en 90 min (figuur 5b) en daarom wordt een antilichaam vlek van 60 min aanbevolen voor het gepresenteerde protocol.
Ten vierde, in het gepresenteerde protocol, zowel gezonde en leukemie cellen worden eerst gekleurd met de mitochondriale ROS fluorogenic kleurstof, gewassen en vervolgens gekleurd met fluorochrome-gebonden Lineage antilichamen. Hoewel een directe beoordeling van het combineren van de mitochondriale ROS vlek met Lineage antilichamen niet werd uitgevoerd in deze studie, werd een evaluatie van de kleuring van fluorchrome-gebonden Lineage-antilichamen getest onder mitochondriale ROS-kleurings omstandigheden voor 10, 20 en 30 min bij 37 °C. Deze analyse toonde aan dat 30 minuten incubatie bij 37 °C de Lineage Surface marker kleuring aanzienlijk verandert (figuur 5c). Bovendien werd de mitochondriale ROS-kleuring geëvalueerd door de eerste, kleurengezonde BM-cellen met fluorochrome-gebonden Lineage antilichamen gevolgd door kleuring met de mitochondriale ROS fluorogenic kleurstof en vice versa volgorde van operaties. Kleuring cellen eerst met Lineage antilichamen gevolgd door mitochondriale ROS kleuring resulteerde in lagere mitochondriale ROS signalen in vergelijking met de vice versa kleuring Protocol (Figuur 6a, B)-met inbegrip van significante verschillen voor CD48- LSK CD150hoog, CD48- LSK CD150int CD34 en myeloïde voorlopercellen (figuur 6c).
Ten vijfde, recente studies tonen aan dat verschillende muriene gezonde HSPC-populaties beschikken over verschillende capaciteiten om verschillende mitochondriale kleuring fluorogene sondes zoals die gebruikt om de mitochondriale massa te beoordelen (hierna aangeduid als mitoMASS Green) of potentiaal25,26. Daarom werd ook de impact van de effluxpomp remmer verapamil op de kleuring van gezonde en leukemie voorlopercellen met de mitochondriale ROS fluorogenic kleurstof beoordeeld. Gelijktijdige kleuring van Hspc's met mitochondriale ROS niet veranderen Lineage marker antilichaam kleuring (figuur 7A), echter, verapamil aanzienlijk verbeteren mitochondriale Ros kleurings signalen in een verscheidenheid van gezonde en leukemie populatie van voorlopercellen (figuur 7b, C). Met name, de omvang van de verbeterde mitochondriale ROS kleuring door verapamil was niet zo groot als die gezien met de mitoMASS groene fluorogenic kleurstof (figuur 7b).
Ten zesde, in het hier gepresenteerde protocol werden BM-cellen teruggevonden door de botuiteinden (Epifyse) te verwijderen, gevolgd door het afspoelen van de botten. De Epifyse bevat echter hematopoietische cellen die mogelijk verloren gaan door het afspoelen van het bot. Als alternatief kunnen BM-cellen worden geëxtraheerd door het Maischen van botten met een mortier en een stamper zoals eerder beschreven12,13.
Het protocol dat hier wordt gepresenteerd, biedt een basis voor het gebruik van fluorogene kleurstoffen om intracellulaire redox-biologie te meten in levende cellen die worden geëxtraheerd uit levende organismen. Echter, het is belangrijk op te merken dat geen enkele fluorogene kleurstof kan worden verondersteld te zijn definitief specifiek en daarom aanvullende studies met alternatieve methoden moeten worden uitgevoerd om te controleren of eventuele bevindingen. Bovendien, de resultaten van deze studie suggereren dat leukemie celpopulaties verrijkt voor LICs (dat wil zeggen, Linlaag ckithoog) hogere niveaus van mitochondriale Ros weergeven dan gezonde myeloïde voor ouders of andere hspc populaties. Echter, de Linlage ckithoge leukemie celpopulatie geëvalueerd hier is aangetoond dat heterogeen en verder kan worden onderverdeeld door andere Lineage markers11,27. Bovendien, recente studies tonen aan dat de LICs bezitten een duidelijke metabole fenotype28. Daarom zullen toekomstige studies waarin de mitochondriale ROS parallel met metabole assays of sondes en aanvullende Lineage marker antilichamen worden geëvalueerd, informatief zijn.
Dit eenvoudige protocol maakt de meting van mitochondriale ROS niveaus in levende hematopoietische cellen mogelijk en kan een basis bieden voor het bestuderen van de redox biologie van gezonde en zieke stam-en voorlopercellen, alsmede voor het beoordelen van de effectiviteit van redox-gerichte therapieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de Fox Chase Cancer Center Raad van bestuur (DDM), de American Society of Hematology Scholar Award (SMS), American Cancer Society RSG (SMS) en het Department of Defense (Award #: W81XWH-18-1-0472).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heat inactivated FBS | VWR Seradigm LIFE SCIENCE | 97068-085 | Media |
| Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | Media |
| PBS | Fisher Scientific | BP399-20 | Buffer |
| 15 mL conical tube | BD falcon | 352096 | Tissue Culture Supplies |
| 50 mL conical tube | BD falcon | 352098 | Tissue Culture Supplies |
| 40 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22-363-547 | Tissue Culture Supplies |
| RBC Lysis Buffer | Fisher Scientific | 50-112-9751 | Tissue Culture Supplies |
| Menadione sodium Bisulfite | Sigma aldrich | M5750 | Pro-oxidant |
| NAC | Sigma aldrich | A7250 | Anti-oxidant |
| CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11 | Biolegend | 100310 | Antibody |
| CD4 PE-Cy5 clone RM4-5 | eBioscience | 15-0041-81 | Antibody |
| CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7 | eBioscience | 15-0081-81 | Antibody |
| CD19 PE-Cy5 clone 6D5 | Biolegend | 115510 | Antibody |
| B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2 | Biolegend | 103210 | Antibody |
| Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5 | Biolegend | 108410 | Antibody |
| Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119 | Biolegend | 116210 | Antibody |
| CD48 PE-Cy5 clone HM48-1 | Biolegend | 103420 | Antibody |
| CD117 APC-Cy7 clone 2B8 | Biolegend | 105825 | Antibody |
| Sca1 peacific Blue clone D7 | Biolegend | 108120 | Antibody |
| CD150 APC clone TC15-12F12.2 | Biolegend | 115909 | Antibody |
| CD34 FITC clone RAM34 | BD Bioscience | 553733 | Antibody |
| CD45.2 APC clone 104 | Biolegend | 1098313 | Antibody |
| MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | Dye |
| Mitotracker Green | ThermoFisher Scientific | M7514 | Dye |
| Live/dead Yellow Dye | ThermoFisher Scientific | L34967 | Dye |
References
- Dröse, S., Brandt, U. Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain. Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).
- Gerber, P. A., Rutter, G. A. The Role of Oxidative Stress and Hypoxia in Pancreatic Beta-Cell Dysfunction in Diabetes Mellitus. Antioxidant & Redox Signaling. 26 (10), 501-518 (2017).
- Höhn, A., et al. Happily (n)ever after: Aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence. Redox Biology. 11, 482-501 (2017).
- Reuter, S., Gupta, S. C., Chaturvedi, M. M., Aggarwal, B. B. Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked. Free Radical Biology & Medicine. 49 (11), 1603-1616 (2010).
- Lee, B. W. L., Ghode, P., Ong, D. S. T. Redox regulation of cell state and fate. Redox Biology. 2213-2317 (18), 30899 (2018).
- Harris, J. M., et al. Glucose metabolism impacts the spatiotemporal onset and magnitude of HSC induction in vivo. Blood. 121, 2483-2493 (2013).
- Hole, P. S., Darley, R. L., Tonks, A. Do reactive oxygen species play a role in myeloid leukemias. Blood. 117, 5816-5826 (2011).
- Lagadinou, E. D., et al. BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).
- Di Marcantonio, D., et al. Protein Kinase C Epsilon Is a Key Regulator of Mitochondrial Redox Homeostasis in Acute Myeloid Leukemia. Clinical Cancer Research. 24 (3), 608-618 (2018).
- Glasauer, A., Chandel, N. S. Targeting antioxidants for cancer therapy. Biochemical Pharmacology. 92 (1), 90-101 (2014).
- Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
- Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Lo Celso, C., Scadden, D. T. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiments. (157), (2007).
- Kalaitzidis, D., et al. mTOR complex 1 plays critical roles in hematopoiesis and Pten-loss-evoked leukemogenesis. Cell Stem Cell. 11 (3), 429-439 (2012).
- Sykes, S. M., et al. AKT/FOXO signaling enforces reversible differentiation blockade in myeloid leukemias. Cell. 146 (5), 697-708 (2011).
- Kalaitzidis, D., Neel, B. G. Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells. PLoS One. 3 (11), 3776 (2008).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Mooney, C. J., Cunningham, A., Tsapogas, P., Toellner, K. M., Brown, G. Selective expression of flt3 within the mouse hematopoietic stem cell compartment. International Journal Molecular Sciences. 18 (5), (2017).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. I. SLAM family markers resolve functional distinct sub-populations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment. Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1178 (2010).
- Mukhopadhyay, P., Rajesh, M., Haskó, G., Hawkins, B. J., Madesh, M., Pacher, P. Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy. Nature Protocols. 2 (9), 2295-2301 (2007).
- Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies. Blood. 107 (2), 501-507 (2006).
- Morita, Y., Ema, H., Yamazaki, S., Nakauchi, H. Non-side-population hematopoietic stem cells in mouse bone marrow. Blood. 108 (8), 2850-2856 (2006).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment. Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).
- Somervaille, T. C., Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).
- Hao, X., et al. Metabolic Imaging Reveals a Unique Preference of Symmetric Cell Division and Homing of Leukemia-Initiating Cells in an Endosteal Niche. Cell Metabolism. 29 (4), 950-965 (2019).
