Summary
我们描述了一种使用多参数流细胞测定法来检测小鼠健康造血干细胞和祖细胞（HSPCs）中的线粒体活性氧物种（ROS）和白血病细胞的方法，这些细胞来自急性骨髓性白血病（AML）的小鼠模型。MLL-AF9。
Abstract
我们提出了一种流式细胞学方法，用于分析健康小鼠以及MLL-AF9驱动的AML小鼠的各种活骨髓（BM）衍生干细胞和祖细胞群中的线粒体ROS。具体来说，我们描述了一个两步细胞染色过程，其中健康或白血病BM细胞首先用荧光染料染色，检测线粒体超氧化物，然后染色与氟铬链接单克隆抗体使用区分各种健康和恶性造血祖群。我们还提供了一个通过流式细胞测定采集和分析样品的策略。整个协议可以在3-4小时的时间内执行。我们还强调了要考虑的关键变量，以及监测活造血干细胞和白血病茎线粒体中ROS生产的优点和局限性，并使用流式细胞测定的氟原染料进行祖生子种群.此外，我们提供的数据，线粒体ROS丰度在不同的健康HSPC亚群体和白血病祖细胞之间变化，并讨论了该技术在血液学研究的可能应用。
Introduction
活性氧物种（ROS）是从分子氧中提取的高度活性分子。ROS生产最明确的细胞位置是线粒体，在氧化磷酸化（OXPHOS）期间通过电子传输链（ETC）的电子被分子氧吸收，从而形成特定的ROS类型称为超氧化物1。通过一系列酶（称为超氧化物歧化酶或SOD）的作用，超氧化物转化为过氧化氢，随后通过催化酶或谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）等酶中和成水。ROS 调节机制中的扰动可导致 ROS 的过量生产，通常称为氧化应激，具有有害且潜在的致命细胞后果，如大分子损伤（即 DNA、蛋白质、脂质）。此外，氧化应激与多种疾病有关，如糖尿病、炎症性疾病、衰老和肿瘤2、3、4。为了保持氧化平衡和防止氧化应激，细胞拥有各种ROS调节机制5。
某些ROS的生理水平是必要的适当的胚胎和成人造核6。然而，过量的ROS与DNA损伤、细胞分化和造血干细胞和祖细胞池的衰竭有关。也有证据显示，在白血病和健康细胞之间，氧化还原生物学的改变可能有所不同。例如，在急性骨髓性白血病（AML）细胞中，ROS水平往往高于其健康细胞，其他研究表明，白血病干细胞维持低稳态的ROS水平，以生存7，8。重要的是，利用这些氧化还原差异的治疗策略在几个人类癌症环境中显示出了希望9，10。因此，允许评估小鼠模型中ROS水平的检测可以增进我们对这些物种如何促进细胞生理学和疾病发病机制的理解，并可能为评估新型氧化还原靶向抗癌疗法。
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Protocol
本议定书中描述的所有动物程序均已获得福克斯大通癌症中心机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
注：协议工作流程分为4个部分，如图1所示，所需试剂列在材料表中。
1. 骨髓 （BM） 隔离
注：MLL-AF9白血病小鼠的产生，如前11所述。
- 如前文所述，从野生型C57.Bl6小鼠（表示CD45.2共基因标记）和C57中恢复单核骨髓细胞，如前所述12、13、14、15。Bl6-SJL小鼠（表示CD45.1致基因标记）已移植与MLL-AF9表达白血病细胞（CD45.2+）。
注：BM可以通过粉碎12，13或冲洗骨头14，15从小鼠中恢复。在这里提出的实验，BM通过冲洗从健康和白血病小鼠中恢复。
2. 线粒体 ROS 荧光染料染色
- 一旦从健康和/或白血病小鼠中恢复单核骨髓细胞，用Trypan Blue染色一个等分位细胞，并使用血细胞计计数，以确定总BM细胞的起始数量。
- 在300 x g下将细胞离心5分钟。在F-PBS中吸收上清液并重新悬浮颗粒（PBS补充2%胎儿牛血清和1%青霉素/链霉素鸡尾酒），浓度为2 x 106细胞/mL。
- 每管的电池悬浮液200μL，分为9个单色控制管，标签如下：
无污渍，B220-Cy5-PE，cKit-Cy7-APC，Sca1-PacBlue，CD150-APC（仅适用于健康的HPC），CD45.2-APC（仅适用于白血病细胞），CD34-FITC，线粒体ROS染料和活/死细胞染色。
注：（可选）通过在 5% CO2培养箱中用 20 μM 的 Menadione 双硫酸钠 （MSB） 在 37°C 下处理 2 x 105细胞，可以制备线粒体 ROS 诱导的阳性控制。通过用20μM MSB加100μM N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）在5%CO2培养箱中处理200μL中的2 x 105细胞，可以制备第二种控制，以逆转线粒体ROS的MSB介导诱导。 - 将剩余的细胞与300 x g的离心机（实验管）中的细胞等同分5分钟。
- 根据制造商的说明，用活/死细胞染色重新悬浮F-PBS中的细胞。在冰上孵育30分钟，一定要在单色控制管中添加活/死污渍。
- 在单色和实验管中加入1.0 mL的室温（RT）F-PBS，并涂上活/死染料。在 RT 时，在 300 x g下离心 5 分钟。
- 在13μL二甲基硫酸盐（DMSO）中重新悬浮50μg线粒体ROS染料，以获得5 mM库存溶液。
- 在RT F-PBS中稀释线粒体ROS染料，最终浓度为5μM，无论是否不含Verapamil（50μM）。
- 吸出活/死细胞污渍的洗涤。在每个实验管以及线粒体ROS染料单色控制管中加入含有Verapamil的线粒体ROS染料染色剂200μL。
- 在黑暗中37°C下混合和孵育10分钟。
- 将 1.0 mL 的 RT F-PBS 添加到线粒体 ROS 染色单色控制和实验管中。在 RT 时，在 300 x g下离心 5 分钟。
- 吸出上清液，用额外的1.0 mL的RT F-PBS清洗细胞。在 RT 时，在 300 x g下离心 5 分钟。
3. 系界线抗体染色
- 准备表1所列抗体鸡尾酒。
注：这些抗体鸡尾酒已经优化之前14，15，16。 - 从含有健康BM的实验管的最终线粒体ROS染料洗涤中吸出上液，并在每个管中加入200μL的抗体鸡尾酒#1。漩涡混合。还准备单色控制管。在黑暗中在冰上孵育60分钟。
- 从含有白血病BM的实验管的末线粒体ROS染料洗涤中吸出上液，并在每个管中加入200μL的抗体鸡尾酒#2。漩涡混合。在黑暗中在冰上孵育60分钟。
- 用 1.0 mL 的冷 F-PBS 清洗，在 RT 时以 300 x g的速度清洗离心机 5 分钟。
- 在 500 μL 的冷 F-PBS 中重新悬浮细胞，并使用 40 μm 过滤器过滤流式细胞计管中的细胞以排除聚合。
4. 流式细胞采集与分析
注：几个造血干细胞和祖细胞子集是罕见的，如长期造血干细胞。因此，理想情况下，在流式细胞学采集期间，每个实验管应收集300万到500万个事件，以便充分分析各种HSPC子集中的线粒体ROS。
- 使用无染色控制管根据所分析的细胞群的大小和复杂性设置正向 （FSC-A） 和侧 （SSC-A） 散射图。
- 使用无污渍和单色控制管补偿流量细胞仪。
- 从正向和侧面散射图中挖出无关碎片（图2A，B，左侧第一面板）。
- 使用双鉴控器（如前锋鉴别器）的双打门（图2A，B，左侧第二面板）。
- 按照图2A、B中提出的门控策略，选择活细胞、系系低细胞以及各种HSPC和白血病子集。
- 对于每个感兴趣的群体，分析直方图图中 TRPE 通道 （x 轴） 的荧光强度 （MFI）， 以评估线粒体 ROS 信号的差异（图 3A-C，左侧面板）。线粒体ROS的水平可以通过比较线粒体ROS染色与散射图中特定系划的标记在单细胞水平上进行评估。
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Representative Results
提出了一种分析多个健康型和MLL-AF9表达性白血病祖体群线粒体ROS的方法。图 1显示了协议工作流的原理图视图，该视图由 4 个主要步骤组成：1） BM 与小鼠分离;2） 用能识别线粒体ROS的荧光染料染色BM细胞，特别是超氧化物;3） 表面标记抗体染色，以划定各种健康和白血病造血人群;4） 流式细胞学采集和分析。
图 2A，B描绘了一种具有代表性的浇注策略，用于分析健康和白血病 BM 中的各种造血干细胞和祖体群体。应用 FSC/SSC 图来消除碎屑，并使用 FSC 区域 （FSC-A） 与 FSC 高度 （FSC-H） 图来排除双精度值和聚合。将谱系表面标记（表1和步骤3.1）组合起来，以排除各种成熟的造血人群，如淋巴细胞、红细胞、粒细胞和单核细胞/巨噬细胞（即，低系或林低）。血统鸡尾酒还包括CD48抗体，因此所有系系低细胞的子集也是CD48-。Sca-1和c-Kit细胞表面表达用于区分称为CD48-LSKs的HSPCs异构混合物（林低，斯卡-1=，c-Kit+，CD48-）与骨髓祖体（林低，斯卡-1-， c-Kit=， CD48-）。为了进一步区分各种HSPC子集，SLAM标记，CD150以及CD34也添加了17，18，19，20，21。图 2B还描绘了 cKit 高表达白血病祖（林低，c-Kit高;Sca-1-），它丰富于白血病启动细胞（LICs）11以及表达cKit（cKitInt-低）中低表达的白血病细胞。
健康CD48-LSK和骨髓祖体之间的线粒体ROS染色比较表明，骨髓祖体显示线粒体ROS染色水平显著较高（图3A）。此外，与CD48- LSK、骨髓祖细胞或cKitint-低白血病细胞相比，cKit高白血病祖细胞显示的线粒体ROS染色水平明显较高（图3A）。cKitInt-低白血病细胞也表现出明显高于CD48- LSK细胞的线粒体ROS染色（图3A）。LSK进一步细分CD150表达表明，线粒体ROS染色在CD48- LSK细胞中没有显著变化，分除CD150高（CD150高），中间体（CD150Int）或无（CD150Neg）表达式 （图 3B）。然而，发现cKit高或cKitInt低白血病细胞的稳态线粒体ROS染色明显高于CD48-LSKs-CD150高，-CD150Int或-CD150内格细胞（图 3B.表达低到无CD34水平的LSK细胞被浓缩用于长期重组造血干细胞，特别是CD48-LSK细胞为CD34-和CD150高20，21。然而，将CD48-LSK细胞细分为CD150和CD34表达，并没有发现这六个HSPC子集在线粒体ROS染色方面有任何显著差异（图3C）。
图 1：协议工作流的架构表示。步骤 1） BM 从健康小鼠和 MLL-AF9 白血病小鼠分离;步骤 2） 使用线粒体 ROS 染料 （mROS） 细胞染色;步骤3）细胞染色与氟铬链接单克隆抗体，以区分健康小鼠和白血病小鼠的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）种群;步骤 4） 流细胞学采集和分析线粒体ROS在几个HSPC种群。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2：用于健康和MLL-AF9表达骨髓细胞的流式细胞测量门控策略。（A） 从健康小鼠中分离的BM细胞被染色的活/死染料（QDot），线粒体ROS染料（TRPE）。健康小鼠的BM随后被染色抗体识别系系标记加上CD48（Cy5-PE）、c-Kit（Cy7-APC）、Sca1（PacBlue）、CD34（FITC）、CD150（APC）。（B） 除了活/死细胞和线粒体 ROS 污渍外，白血病小鼠的 BM 还沾染了识别系系标记的抗体加上 CD48 （Cy5-PE）、c-Kit （Cy7-APC）、Sca1 （PacBlue） 和 CD45.2 （APC），用于识别在MLL-AF9白血病细胞之间，来自健康受体BM细胞（CD45.1）。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3：健康骨髓学ROS水平和MLL-AF9骨髓。左面板是指示种群的线粒体 ROS 水平的代表性直方图，相应的右侧面板表示对指示种群的线粒体 ROS MFI 的条形图分析（n = 4）。（A） 比较健康 CD48- LSK、骨髓祖体以及 MLL-AF9 林低c-Kit高和 MLL-AF9 林低C-KitInt-低细胞中的线粒体 ROS 水平。（B） 基于CD150表达的健康CD48-LSK细胞中的线粒体ROS水平与MLL-AF9林低c-Kit高和MLL-AF9林低C-Kit Int-低细胞的线粒体ROS水平进行比较。（C） 基于CD150和CD34表达的健康CD48-LSK细胞中的线粒体ROS水平比较。（= p = 0.05; = p < 0.01= p < 0.001; = p < 0.0001）。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4：使用亲氧化和抗氧化化合物改变线粒体ROS水平。健康细胞和MLL-AF9表达BM细胞中的线粒体ROS水平的直方图，在5%CO2培养箱（正对照）或20μM MSB与100μM结合使用100μM中，在37°C下处理1小时。N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）在37°C下在5%CO2培养箱中1小时。请点击此处查看此图的较大版本。
图 5：优化线粒体ROS和系界线识别抗体污渍。（A） MLL-AF9中线粒体ROS（mROS）水平的比较，在10或30分钟内使用1或5μM表达白血病细胞（红色=车辆;蓝色 = MSB 20 μM;绿色 = NAC 100 μM;橙色 = Msb 20 μM = NAC 100 μM）。（B） 将CD34通道（FITC）在健康LSK中染色20、60或90分钟与抗体鸡尾酒#1（n = 4，± p = 0.05;= p < 0.01）中的 MFI 进行比较。（C） 在5%CO2培养箱中，在37°C孵育前或孵化后30分钟，对抗体染色进行比较。请点击此处查看此图的较大版本。
图 6：线粒体ROS和系体标记抗体染色的顺序。（A） 使用不同染色顺序获得的指示 HSPC 种群的点图。（B） 在 LSK 和 Myeloid Progenitor 隔间中评估的线粒体 ROS 水平使用不同的染色顺序（红色 = 抗体在 4 °C 下染色 1 小时，随后在 37°C 下进行线粒体 ROS 染色 10 分钟;蓝色 = 线粒体 ROS 在 37°C 下染色 10 分钟，随后在 4°C 下使抗体染色 1h。（C） 在指定种群（n = 4， = p = 0.05）中使用不同顺序的线粒体 ROS （mROS） 染色的 MFI 进行定量化。请点击此处查看此图的较大版本。
图 7：在健康和MLL-AF9表达BM细胞中，血管粒体ROS染料染色对线粒体ROS染色的影响。（A） 在5%CO2培养箱中，在37°C下，在50μM Verapamil处理的样品中，指示的HSPC种群的点图为10分钟。（B） 在指示的 HSPC 种群中线粒体 ROS 和线粒体绿色染料染色的直方图，在 50 μM Verapamil 存在（蓝色）或不存在（红色）的情况下。（C-E）在线粒体 ROS 染色期间，无论是否进行 50 μM Verapamil 的 BM 样本中，在指示的健康 （C & D） 和白血病 （E） 细胞群中对线粒体 ROS 水平进行定量化（n = 4，= p = 0.05）。请点击此处查看此图的较大版本。
表1：抗体鸡尾酒。步骤 3.1 中制备的抗体鸡尾酒列表。以识别健康骨髓和白血病骨髓内的各种造血亚群。
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Discussion
为检测ROS而开发的荧光染料，经常通过显微镜或流式细胞22在固定细胞中进行评估。使用线粒体ROS氟致染料对BM细胞中线粒体ROS进行流式细胞测量具有两个主要优点：1）它是一种快速简便的技术，适合活细胞分析;2）它允许区分和分析罕见使用表面标记染色在BM的单细胞水平上。此处介绍的分步协议旨在研究两只健康小鼠的造血干细胞和祖体种群的活体氧化还原状态，以及使用流式细胞测定法由 MLL-AF9 驱动的 AML 小鼠模型。在执行此协议期间需要考虑几个关键技术变量。
首先，使用亲和抗氧化控制允许用户建立增加线粒体ROS染色的基线以及染色的特异性。对于这里介绍的协议，亲氧化剂MSB被用作在健康和白血病BM细胞中线粒体ROS染色的可检测诱导的阳性对照（图4）。抗氧化剂NAC可用作额外的控制，因为它在很大程度上逆转了MSB引起的线粒体ROS染色（图4）。
其次，本研究中使用的线粒体ROS荧光染料建议在5μM浓度下使用10分钟。然而，制造商也建议，染色的浓度和时间可能因细胞类型而异。在这项研究中，线粒体ROS染色在1μM和5μM下被比较了10或30分钟。分析表明，浓度为5μM10至30分钟，足以检测线粒体ROS中MSB介导的变化以及NAC治疗逆转的变化（图5A）。由于10到30分钟的定量差异，为本研究选择了10分钟的染色时间，以尽量减少测定的长度。
第三，CD34抗体的孵育时间在文献中变化的时间从20到90分钟23，24。为了优化此处提出的方案，用抗体鸡尾酒#1（步骤3.1）孵育了20、60或90分钟。如图5B所示，与20分钟的染色相比，在染色的细胞上观察到明显更强的CD34染色。然而，在60分钟至90分钟的抗体孵育时间（图5B）之间未观察到CD34染色的显著差异，因此建议在提出的方案中存在60分钟的抗体染色。
第四，在提出的协议中，健康细胞和白血病细胞首先被线粒体ROS荧光染料染色，洗涤后沾染与氟铬相关的系骨抗体。虽然本研究中没有对线粒体ROS染色与系系抗体进行直接评估，但在线粒体ROS染色条件下对含氟铬相关系骨抗体染色的评估进行了10、20和30 分钟，在 37°C 下。该分析表明，在37°C下孵育30分钟会显著改变血统表面标记染色（图5C）。此外，线粒体ROS染色首先进行评估，用含氟铬相关的沿袭抗体染色健康的BM细胞，然后用线粒体ROS荧光染料染色，反之亦然。 与对照染色方案（图6A，B）相比，先用系骨抗体染色细胞，然后是线粒体ROS染色，导致线粒体ROS信号降低（图6A，B），包括CD48的显著差异-LSK CD150高，CD48- LSK CD150Int CD34 和骨髓祖体种群 （图 6C）
第五，最近的研究表明，不同的鼠健康HSPC种群具有独特的能力，以排泄几个线粒体染色荧光源探针，如那些用于评估线粒体质量（以下简称线粒体绿色）或潜在25，26.因此，还评估了排泄泵抑制剂Verapamil对使用线粒体ROS氟原性染料染色的健康和白血病后代的影响。与线粒体ROS同步染色的HSPCs并没有改变系系标记抗体染色（图7A），然而，verapamil确实显著改善了各种健康和白血病中的线粒体ROS染色信号祖祖居群体（图7B，C）。值得注意的是，通过verapamil改善线粒体ROS染色的程度没有线粒体绿色荧光染料（图7B）那么大。
第六，在这里介绍的协议，BM细胞通过去除骨尖（表皮）和冲洗骨头来恢复。然而，表皮包含造血细胞，可能因骨冲洗而丢失。作为替代方案，BM细胞可以通过用迫击炮和虫子捣碎骨头来提取，如前所述12，13。
这里提出的协议为使用含氟染料测量从活生物体中提取的活细胞细胞内氧化还原生物学奠定了基础。然而，必须指出，不能假定任何单一的荧光染料是明确具体的，因此，应进行额外的研究，用替代方法来验证任何发现。此外，这项研究的结果表明，为LIC（即林低cKit高）而富集的白血病细胞群比健康的骨髓原代或其他HSPC种群表现出更高的线粒体ROS水平。然而，这里评估的Lin低cKit高白血病细胞群已被证明是异质的，可以进一步细分其他谱系标记11，27。此外，最近的研究表明，LIC具有独特的代谢表型28。因此，未来评估线粒体ROS与代谢测定或探针以及附加系系标记抗体的研究将具有信息性。
这种简单的协议允许测量活造血细胞中的线粒体ROS水平，并可能为研究健康和病变干细胞和祖细胞的氧化还原生物学以及评估氧化还原靶向疗法。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了福克斯大通癌症中心董事会（DDM）、美国血液学学会学者奖（SMS）、美国癌症协会RSG（SMS）和国防部的支持（奖状：W81XWH-18-1-0472）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heat inactivated FBS | VWR Seradigm LIFE SCIENCE | 97068-085 | Media |
| Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | Media |
| PBS | Fisher Scientific | BP399-20 | Buffer |
| 15 mL conical tube | BD falcon | 352096 | Tissue Culture Supplies |
| 50 mL conical tube | BD falcon | 352098 | Tissue Culture Supplies |
| 40 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22-363-547 | Tissue Culture Supplies |
| RBC Lysis Buffer | Fisher Scientific | 50-112-9751 | Tissue Culture Supplies |
| Menadione sodium Bisulfite | Sigma aldrich | M5750 | Pro-oxidant |
| NAC | Sigma aldrich | A7250 | Anti-oxidant |
| CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11 | Biolegend | 100310 | Antibody |
| CD4 PE-Cy5 clone RM4-5 | eBioscience | 15-0041-81 | Antibody |
| CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7 | eBioscience | 15-0081-81 | Antibody |
| CD19 PE-Cy5 clone 6D5 | Biolegend | 115510 | Antibody |
| B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2 | Biolegend | 103210 | Antibody |
| Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5 | Biolegend | 108410 | Antibody |
| Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119 | Biolegend | 116210 | Antibody |
| CD48 PE-Cy5 clone HM48-1 | Biolegend | 103420 | Antibody |
| CD117 APC-Cy7 clone 2B8 | Biolegend | 105825 | Antibody |
| Sca1 peacific Blue clone D7 | Biolegend | 108120 | Antibody |
| CD150 APC clone TC15-12F12.2 | Biolegend | 115909 | Antibody |
| CD34 FITC clone RAM34 | BD Bioscience | 553733 | Antibody |
| CD45.2 APC clone 104 | Biolegend | 1098313 | Antibody |
| MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | Dye |
| Mitotracker Green | ThermoFisher Scientific | M7514 | Dye |
| Live/dead Yellow Dye | ThermoFisher Scientific | L34967 | Dye |
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