Summary
这种方法描述了一种慢性制剂,允许光学访问活小鼠的海马区。这种制剂可用于在几周内对神经元结构可塑性和活动诱发细胞可塑性进行纵向光学成像。
Abstract
双光子显微镜是神经科学的基本工具,因为它允许在从亚细胞到网络水平的空间尺度上对活体动物的大脑进行调查,在从毫秒到周的时间尺度上。此外,双光子成像可以结合各种行为任务来探索大脑功能和行为之间的因果关系。然而,在哺乳动物中,有限的穿透力和散射光限制了两光子的在生命内成像,主要局限于浅层大脑区域,从而排除了对深脑区域(如海马区)的纵向调查。海马参与空间导航和偶发性记忆,是一个长期模型,用于研究细胞和认知过程,对学习和回忆都非常重要,无论是在健康和疾病。在这里,详细介绍了一种准备,使活小鼠的背海马的慢性光学访问。这种制备物可以结合双光子光学成像在细胞和亚细胞分辨率在头部固定,麻醉活小鼠在几个星期。这些技术使神经元结构或活动引起的可塑性在背海马CA1的数以十到数百个神经元的重复成像。此外,这种慢性制备可与其他技术结合使用,如显微内窥镜、头装广域显微镜或三光子显微镜,从而大大扩展了工具箱,以研究所涉及的细胞和网络过程在学习和记忆。
Introduction
在哺乳动物中,海马是编码和回忆偶发性记忆以及空间导航1、2、3、4的关键大脑区域。出于这个原因,海马已经-现在仍然是-一个非常重要的模型,研究基本机制,使大脑编码和回忆记忆5,6,7或在一个环境中导航8 ,9收集奖励和避免危险。此外,海马形成是大脑区域之一,在啮齿动物10、11和人类12、13的一生中产生新的神经元。最后,海马形成的退化或损伤与神经和精神疾病有关,包括阿尔茨海默氏病14。
在小鼠中,海马位于大脑表面15以下约1毫米处。它的位置阻止了完整大脑的光学访问,因此,海马动力学的纵向研究主要依靠磁共振成像、电生理学和前体成像分析。MR成像方法允许跟踪生物过程(例如,基因表达变化16)在同一动物多天,但缺乏空间分辨率,以区分单个神经元。经典的体内电生理技术提供非常高的时间分辨率和对膜电位变化的精细敏感性。然而,它们的空间分辨率有限,并且缺乏在较长时间段内可靠地跟踪相同细胞的能力。光学成像允许以其较高的时间和空间分辨率来研究更多样化的过程。然而,前体成像只提供正在进行的过程的快照,因此它不适合在动物学习和回忆信息的纵向研究。
体内光学成像将MR成像和电生理学的一些优点与光学成像的优点相结合。因此,它非常适合对小鼠大脑动力学和行为进行纵向和相关的分析。这与生物过程的研究有关,其速度非常快(毫秒到秒)或非常慢(天到周)的时间尺度。与神经科学相关的这些过程的例子包括膜电压动力学、Ca2+瞬变、细胞可塑性和结构变化,这些都被认为对记忆形成和回忆非常重要。不同的方法已经扩展到体内成像到背海马18,19,20,21,22。急性制剂已经允许跟踪金字塔神经元(PN)活动,以及他们的树突和树突脊柱几个小时20,22。然而,这一时间框架不允许研究长期结构变化,而这种变化可能是渐进式学习的基础。慢性制剂 - 结合微内窥镜23,24或长工作距离 (WD) 标准显微镜目标21 - 已使背海马的重复成像在几个星期。
在这里,我们描述了一种慢性制剂,它使用永久插入的成像导管,提供对活体小鼠背海马的CA1子场的反复光学访问。这种制备允许反复访问CA1,不受功能干扰,适用于生命内双光子(2P)或广域显光成像。详细介绍了活体小鼠背毛CA1中2P深脑慢性成像的两个例子:树突状结构和树突状脊柱动力学的纵向成像和活动可塑性的纵向成像。讨论了该技术的显著优点和局限性。
Protocol
上述所有方法均获得上巴伐利亚州政府(许可 2016_ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-16-48)和斯坦福大学和马克斯·普朗克佛罗里达神经科学管理小组实验室动物护理部的批准。
1. 成像管的制备
- 在配有可移动尺子台的钻台上进行精密钻头。
- 将直径为 3.0 mm 的不锈钢管夹在可移动尺台上。
- 将管子切成 1.6 毫米长的金属环。如果切割后环的边缘没有钝化,则归档不规则情况。
- 在 100% 丙酮中冲洗金属环和圆形 4 mm 直径的玻璃盖玻片,然后晾干 ±5 分钟。
- 将金属环和玻璃盖玻片放在一个光滑、均匀和干净的工作位置,置于立体镜下。
- 在光滑的表面上放置一滴紫外线固化光学粘合剂,如培养皿。使用针头或铲子将胶粘剂铺开,形成薄(<0.5 mm)层。
- 使用钳子将金属环的一侧浸入粘合剂中。特别注意不要密封环的内部。如果发生这种情况,请使用针来打破环中的光学粘合剂。
- 使用立体镜,将金属环置于玻璃盖玻片的中心,用粘合剂盖住环的一侧接触盖玻片。在金属环和盖玻片之间的界面处应形成一层薄薄的胶粘剂。避免任何胶粘剂扩散到盖玻片的中心。
- 打开紫外线固化 LED 驱动器单元,并亮光 (365 nm)1 分钟。
注意:紫外线会引起皮肤灼伤,是一种诱变剂。戴上防紫外线眼镜,用手套和实验室外套遮住手和手臂,避免皮肤暴露。 - 要均匀固化胶粘剂,请确保通过改变光源的方向,确保环的所有侧面均具有照明。
- 让胶粘剂硬化至少2小时,最好是过夜。
- 通过止动将从金属环的打开端牢固地握住管扣。使用装有旋转文件的牙科钻,在立体镜下工作,将多余的玻璃盖玻片归档,直到与环的侧面齐平(图1A)。
2. 在背海马上植入成像管
- 准备设备和设置
- 确保所有手术器械清洁无菌。如果使用玻璃珠灭菌器进行灭菌,请清洁仪器,并在使用前将其放入消毒器(设置为 250°C)10 分钟。或者,在使用前对仪器进行高压灭菌。
- 准备手术所需的所有材料以及手术器械,以便随时到达。
- 确保有足够的新鲜准备的药物,如止痛药或消炎药。
- 确保在整个手术期间有足够的胶质(每次手术约1小时)。
- 打开加热地毯,将其设置为 37°C,以保持动物在麻醉下的温度稳定。
- 确保分路剂的清除系统正常工作。
- 打开氧气流阀。
- 麻醉诱导和动物固定
- 将鼠标置于麻醉诱导室中的 3% 离氟胶,在 1 L/min O2中等待,直到失去知觉。使用脚趾捏反射测试评估麻醉。
- 称量动物。
- 在皮下涂抹抗炎(Meloxicam,1mg/kg)和止痛药(维塔尔金,200mg/kg)药物。
- 将鼠标放在加热地毯上。确保动物不直接接触加热地毯,以避免热灼伤。
- 将头部固定到立体定向装置上,并将鼻锥置于鼻锥上以盖住鼻腔。为了保持麻醉,将单反酶降低至1.5-2%。在整个手术过程中,通过视觉监测呼吸和测试脚趾捏反射来监测小鼠状态。如有必要,调节电子分明百分比。
- 在眼睛上涂上眼膏,防止脱水和潜在的失明。
注:对于麻醉和动物药物,可以采用替代方法和药物。请参考您的动物许可证和相关文献。
- 光学导管植入
- 打开光纤光源。
- 去除头发,对鼠标头进行消毒。
- 使用剪刀和钳子,删除鼠标头皮。首先在靠近 lambda 的位置在头皮上做一个小切口。继续打开两侧的头皮。首先向耳朵方向横向移动,然后以眼轨道的方向旋转,在下垂轴上形成一个三角形,大约4毫米的罗斯特拉到胸腔。注意不要切得太靠近耳朵和眼睛,但要暴露胸骨和羔羊,以及前骨的后半部分。
- 在头骨上涂抹一滴(约10毫克)利多卡因(酒精28.9%v/v)。
- 清除骨皮,用棉签擦干头骨。
- 放置耳杆,固定鼠标头。
- 使用宽度为 0.5 mm 的微钻进行小颅骨切除术。将孔定位到与图像海马相对的前骨上,距离下垂缝合线约 1.5 mm,距离日冕缝合线约 2 毫米。
- 将 0.86 mm 宽的不锈钢骨螺钉拧入头骨孔。
- 如有必要,清洁碎屑并擦干头骨。
- 快速粘合水泥混合物的制备
- 使用小勺子(直径4.5毫米),将1-1.5平的L粉勺放入混合井中。
- 将 3-4 滴快速底座放入井中。
- 将1滴通用催化剂放入井中。
- 使用精密施用器搅拌混合物 5-10 s。
注:提供替代水泥。请参阅制造商的说明。
- 使用精密施用器在头骨、螺钉和周围皮肤上涂抹快速粘合剂水泥。晾干30至1分钟。
- 使用直径为 3.0 mm 的颤音钻在骨骼中进行颅骨切除术。将孔放置在距离下垂缝合线约 1.5 mm 的位置,将孔放置在离羔羊口缝合线 2 毫米远的位置。
- 小心地取出骨皮瓣。
- 使用套管检查颅骨的大小,以确保其适合。如有必要,使用 0.5 mm 或 0.9 mm 宽度的微钻来扩大颅骨切除术。
- 使用杜蒙特钳子去除脑膜炎。
- 甲酸皮质,到达外部胶囊。使用连接到真空泵的直径为 0.9 mm(19 仪表)的钝针。用盐水灌溉,以避免暴露组织的脱水,并在出血解决后冲走残留的血液。慢慢吸皮质组织,每次50-100μm,直到皮层从胶囊分离,露出结节或血肉的纤维。 经常更换针头,防止堵塞。
- 纤维主要向三个方向延伸(图1B)。小心地剥离背纤维,直到最深的纤维(海马的底部分)暴露出来。
- 用盐水冲洗组织。使用细钳将底部管扣浸入盐水中,并将其置于头骨孔上。套管和组织必须用盐水密封,以避免在管状和组织之间捕获气泡。
- 将导管推入头骨(图1C),直到玻璃盖玻片与纤维接触。
- 使用吸收三角形、棉签和/或真空泵将头骨干燥。
- 快速粘合水泥混合物的制备(请参阅步骤 2.3.10)。
- 使用精密施用器在头骨上涂抹快速粘结水泥。在管圈边缘也涂上粘合剂。小心不要让胶粘剂碰到管状。晾干30至1分钟。
- 使用立体手臂将头板放在管板上,与头骨接触。
- 牙科丙烯酸混合物的制备
- 使用勺子(直径约9毫米),将1个水平勺(1部分)粉末放入混合井中。
- 在同一口井中分配2-3份液体。用液体盖住整个粉末。
- 使用铲子搅拌 ±1 分钟。
注:提供替代丙烯酸。请参阅制造商的说明。
- 使用铲子或精密施用器在颅骨上涂施用丙烯酸。用牙科丙烯酸覆盖整个暴露的头骨、螺钉和开放的皮肤。这使得准备稳定。不要让丙烯酸跑下脖子、耳朵和眼睛。
- 让丙烯酸干燥和硬化约15分钟。
- 在头架板上涂抹可拆卸的胶膜,以防止碎屑进入管状。建议薄膜尺寸与板尺寸相匹配。
- 关闭异曲通流,将动物从立体定向装置中取出,并将其放置在加热板上,在麻醉后醒来时保持生理体温。
- 监测动物,直到它恢复足够的意识,以保持胸腔。
- 只有在完全康复后,才将经过手术的动物交还给其他动物。
3. 术后护理
- 通过监测体重和一般行为,检查手术后2天的小鼠状态。
- 在手术后2天内,在皮下涂抹抗炎药(Meloxicam,1mg/kg)和止痛药(维塔尔金,200mg/kg)药物
注:替代监测程序,药物和剂量是可能的术后护理。请参考您的动物许可证和相关文献。
4. 成像会议的准备
- 提前打开成像设置,必要时让激光预热和稳定。
- 麻醉鼠标(请参阅步骤 2.2.1)。
- 使用钳子小心地从头盖板上拆下粘合膜。用手握住鼠标,用手指握住头板。轻轻取下薄膜,以免损坏准备。
- 将鼠标置于显微镜下,放在加热地毯上,并将头板固定到支架上(图 1D)。
- 将鼻锥置于鼻锥中盖住鼻腔,并将单反膜降至 1.5-2%。
- 在小鼠眼睛上涂抹眼膏。
- 用去离子水洗净成像管。使用注射器和薄针将水滴入管和真空泵以将其取出。
5. 成像会话
- 使用低放大率、长工作距离目标直观地检查管路是否存在残留水、污垢、完整性和荧光。
- 通过调整头支架臂的角度,将导管与光学轴对齐。
- 切换到 25X 1.0 NA、4 mm WD 或 40X 0.8 NA、3 mm WD、浸入式目标。加入足够的去离子水,以填充管芯,并保持多余的水在管上。避免形成气泡。
- 使用 2P 激发和图像荧光信号。
注: 成像协议高度依赖于要成像的时间和空间比例。有关我们用于生成本文中显示的图像的成像设置的详细信息,请参阅具有代表性结果和讨论的部分。
Representative Results
由于导管仅放置在 CA1 的背端,因此与腹腔相比,CA1 的背端与显微镜更接近。底极是最近结构,依次为地层或层(SO)、地层金字塔(SP)、地层辐射(SR)和地层乳糖分子(SLM),最远层(图1B) , C。具有亚细胞分辨率的神经元结构的纵向2P成像和细胞分辨率的活性可塑性作为代表性结果呈现。为了激发荧光蛋白绿色荧光蛋白 (GFP)、d2Venus 和 TurboFP635,使用功率为脉冲的 Ti:蓝宝石激光调谐到 920 nm,样品的平均激光功率调整为 5-25 mW。使用发射过滤器和不同的光电倍增管分离不同的发射波长。
树突状结构和树突状脊柱动力学的纵向成像。
为了稀疏地标记海马PN并可视化其结构,使用Thy1-GFP转基因小鼠线(M线)。Thy1-GFP小鼠在Thy1启动子的控制下表达细胞质增强GFP,在稀疏的随机种群25。通常,CA1 PN 的主要轴大致垂直于 XY 成像平面(图 1B、图 2A和辅助影片 1)。基础树突在SO中延伸,从躯体向圆管延伸,而尖顶和尖子则以相反的方向延伸至圆锥形(补充电影1)。由于制备使底状的最深的纤维完好无损,一些荧光纤维穿过视野,就在管状下方,应该是可见的(图2A和电影1)。制备允许用脊柱分辨率成像PN树突(图2 A-C)。为了成像树突和树突状脊柱,使用 25X 1.0 NA、4 mm WD、浸入式商业物镜。
对于纵向跟踪,在第一次成像过程中定义了管状视场内的几个大脑区域。每个区域对应于大约 240 x 240 μm 的区域,并包含 1 到 7 个树突状段(图 2B)。这些区域被手动映射到低放大倍率的三维堆栈,显示成像管锥下方的体积中的 GFP 表达式模式(图 2A)。然后,以不同的时间间隔(从 24 小时到 3 天)采集 1 μm z 级 CA1 PN 基树突图像堆栈,最多约 14 天(图 2C)。成像持续时间和间隔更长,可能26。每个成像会话持续大约 60 到 90 分钟。虽然大多数图像是 SO 中的树突状脊柱,但也可以在 SR 的斜树突中成像树突状脊柱(图 2D-F)。除了脊柱密度,这种方法通过量化脊柱的存活率、得失率26、27、28、29、30,使脊柱动力学得以研究。31,32.为了在一段时间内对树突状脊柱进行评分和跟踪(图2C),使用了一个自定义的MATLAB接口。这允许对齐在不同时间点获取的图像堆栈,并支持手动标记树突和脊柱,同时跟踪树突长度和脊柱位置的时间26。重要的是,这种方法可用于区分(每个时间点,不包括第一个时间点)预先存在的树突状脊柱和新生儿树突状脊柱。这一点很重要,因为不同类别的树突状脊柱被认为在记忆获取和保留中具有不同的角色33。
活动引起的可塑性的纵向成像。
为了在CA1 PN中成像活动引起的可塑性,在电弧内注入背CA1海马区域,通过增强形式的突触活性响应元件(E-SARE)表达绿色荧光破坏d2Venus增强剂/启动器和红色荧光TurboFP635通过ePGK启动子34。这允许成像水平的活动调用可塑性数百CA1PN在每个动物35。由于 PN 的标签非常密集,通常无法解决 CA1 PN (补充电影 2) 的树突。
为了成像 CA1 PN 的 somata,使用 40X 0.8 NA、3 mm WD、水浸式物镜。对于纵向跟踪,在第一次成像过程中,每只小鼠定义 1 到 9 个大脑区域。每个区域对应于大约 300 x 300 μm 的区域,包含 50 到 150 个单元(图 3A)。这些区域手动映射到以较低放大倍率可见的局部组织地标。然后,获取 3 μm z 步长图像堆栈,其中包括 CA1 PN 的 SP(图 3A和辅助影片2),时间间隔从 24 小时到 6 天,最多约 30 天。每个成像会话持续大约 60 到 90 分钟。 E-SARE 激活高峰在暴露于新的或丰富的环境(EE,图 3B)后达到 6 到 8 小时,并在几天内衰减。因此,我们一般图像6至8小时后的经验,并允许5天之间的成像会话35。
为了量化d2Venus和TurboFP635荧光值,绘制了一个直径为4.64 μm的圆形感兴趣区域,该区域比以细胞体为中心的神经细胞体小。然后,我们前进到下一个时间点,以相同的方式对同一个单元格的 soma 进行评分,并迭代纵向数据集中所有时间点和所有可见单元格的此过程。每个神经元(活动相关)d2Venus发射的平均值按其平均值(活动无关)TurboFP635发射归一化。该方法能够研究CA1 PN35(图3C)的一体可塑性的长期动态。
图1:体内深脑光学成像的准备。(A). 示例成像年值的顶部(左)和侧面(右)视图。成像管有一个透明的玻璃底部,允许光学进入海马。( B . (B. 对制备的原理描述,突出成像管管、CA1 PN 和从背到腹的三层纤维的相对位置.(C, D) 。成像过程中成像设置 (C) 和动物固定 (D) 的原理描述.请点击此处查看此图的较大版本。
图 2:树突状结构和树突状脊柱动力学的纵向成像。(A. 2P 图像堆栈 (最大强度投影 (MIP) 59 个图像平面,2 μm z 间距)的神经元和树突标记在活的 Thy1-GFP 鼠标中。(B. 更高的放大倍率(53个图像平面的MIP,1 μm z间距)详细说明位于SO的基底树突。(C. 14 天内拍摄的树突状段的延时图像序列.箭头表示在14天内追踪的树突状脊柱。(D, E) .2P 图像堆栈的神经元和树突标记由GFP在活的Thy1-GFP鼠标;(D) ZY 投影(31 个图像平面,3 μm z 间距)和 (E) XY 投影(17 个图像平面,3 μm z 间距)。(F). 更高的放大倍率(单图像平面) 详细说明位于 SR 中的尖顶树突和树突状脊柱。激励: 920 nm;排放峰值:510 nm。刻度条: A, 50 μm;B, 10 μm;C,2 μm;D 和 E,15 μm;F,4 μm.请点击此处查看此图的较大版本。
图 3:活动引起的可塑性的纵向成像。(A. A . 2P 图像 (单个图像平面) 从活鼠标, 显示相同的单元格在基线日 0 和 EE 后的第 1 天。(B. 2P 图像堆栈(4-6 个图像平面的 MiP,3 μm z 间距),显示特定于环境 A(第 1 天、第 19 天和第 25 天)和环境 B(第 7 天和第 13 天)的 E-SARE 激活模式。绿色:d2维纳斯荧光。红色:TurboFP635 荧光。激励: 920 nm;d2Venus发射峰值:530纳米;TurboFP635 排放峰值:635nm。刻度条: A, 20 μm;B,10 μm。这个数字已被修改从Attardo等人,201835。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4:使用三光子(3P)显微镜对海马DG神经元结构进行成像。(A-H)3P 图像(单图像平面)的神经元和树突标记在活的Thy1-GFP鼠标中详细说明CA1和(F-H)颗粒细胞中的CA1和(F-H)颗粒细胞中的(A-E)PN。激励:1400纳米;排放峰值:510 nm。比例尺:40 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
补充影片 1:实时 Thy1-GFP 鼠标中的成像视场。2P 图像堆栈 (83 图像平面, 7 μm z 间距) 的神经元和树突标记 GFP (白色) 在活的 Thy1-GFP 鼠标从管底延伸到 SLM.为了解释荧光信号在深度增加时衰减的问题,我们使用了光电倍增管增益的非线性梯度。请点击此处下载此文件。
补充电影2:活动可塑性的成像。2P 图像堆栈 (28 图像平面, 3 μm z 间距) 的神经元表示 E-SARE 报告 IEG 表达式在一个实时鼠标包含 SP. Green: d2Venus 荧光。红色:TurboFP635 荧光。请点击此处下载此文件。
Discussion
这里描述了在活小鼠中重复2P成像的手术过程。手术后,小鼠通常在2天内恢复。手术诱导最小的天体化26,43。手术后可能出现的出血和水肿通常在10至14天内重新吸附。一般来说,从植入后14天起,准备足够清晰,可以进行生命内成像。手术的成功并不取决于在无菌环境中工作。然而,保持高水平的卫生,以避免因手术相关感染引起的并发症,这一点至关重要。这是通过精心清洁手术器械之前和之后的手术器械,并通过热消毒他们立即每次使用(步骤2.1.1)获得。在植入前,将光管放入一个清洁的消毒容器中,然后用无菌盐水冲洗。对外科站进行手部消毒和清洁的常见手术实践也非常重要。制剂保持稳定,并允许细胞和亚细胞分辨率成像几个星期26,35。
关键步骤、修改和故障排除。
在最深的纤维暴露之前,剥离外部胶囊非常重要。当使用具有 3 或 4 mm WD 的商业目标时,不暴露白化可能导致无法聚焦于 PN 的体体,或降低分辨率成像树突状脊柱。为此,使用直径为 0.9 mm 的针非常缓慢地将新皮质切除非常有用,然后切换到直径为 0.3-0.5 mm(24-29 度)的针头,在去除最背纤维时,对吸力进行更精细的控制。或者,细钳可用于去除纤维暴露后的剩余皮层36。
手术期间出血可能会有问题,因为血液会阻碍视线。建议等待血块形成,然后用盐水冲洗以洗去残留的血液。根据需要重复。
在套管和颅骨切除术之间贴合有助于提高制备的稳定性,在使用水泥之前保持管紧到位,特别是如果管状的外缘与头骨齐平。由于三甲钻和管状的大小是匹配的,因此由于管状侧面的不规则性(需要稍大颅骨来适应(参见步骤 2.3.14)或不规则颅切除术,可能会出现松动的配合。必须关闭任何管状不规则(步骤 1.3 和 1.12),并且颅骨必须垂直于颅骨,直到颅骨切除术完成(步骤 2.3.12)。在完成颅骨切除术之前,从颅骨中取出颅骨可能导致不规则的颅骨。
限制-制备的侵入性和稳定性。
很难评估皮质消融的影响,因为要精确定义直接和间接受影响的区域是很困难的。一般来说,手术去除了部分皮层和部分视觉和后肢感觉皮层21。腹肌皮层不直接投射到海马,海马组织既没有接触也没有受伤。重要的是,已经表明,植入成像管不会严重改变海马功能,特别是海马依赖学习21,36,37,38, 39.不过,通过评估皮质酮血水平和肾上腺重量与植入物相比,定量到何种程度的管状和植入物的外部部分(头支架板和牙科丙烯酸帽)是慢性压力源,这一点很重要。未植入的小鼠。
准备工作一般保持稳定,从数周到数月26日。从长远来看,皮肤和骨骼生长往往会取代丙烯酸盖,并增加成像制剂的不稳定性。
光学限制。
传统的2P显微镜允许成像约1毫米深到新皮质组织40,41。与此一致,可以对位于 SR(图2D-F) 或 SLM36中的树突和树突状脊柱进行成像。然而,通过导管成像对有效NA有限制。为了实现最大分辨率,成像管的直径和深度应与成像 NA 相匹配,因为直径更小、深度较长会夹住高 NA 物镜的光线。例如,当通过 1.6 mm 长的导管对 1.0 NA 水浸镜进行成像时,需要 3.65 mm 的内径来保持完整的 NA。然而,使用这种直径的导管会增加海马的压缩,并可能影响组织的健康,因此,我们使用直径较小的导管。当通过 1.6 mm 长的管状使用 0.8 NA 水浸物进行成像时,2.5 mm 的内径足以保持完整的 NA。但是,0.8 NA 水浸物目标具有较短的 WD(在我们的案例中为 3 mm),这可以防止对 SP 进行聚焦。
这些计算适用于管底视野的中心。然而,将成像视场侧向移动 - 靠近管状边缘 - 或更深入地聚焦到组织 - 远离管状的玻璃表面 - 会进一步降低焦平面处的有效 NA,从而降低分辨率。这将导致不同体积的图像组织产生非均质分辨率,并可能是亚细胞分辨率定量成像的一个关注点,尤其是在使用超分辨率技术(如2P-STED显微镜42)时。当以蜂窝分辨率成像时,这些问题就不那么重要了。
组织运动。
组织内的运动 - 源自麻醉动物的呼吸和心跳 - 往往变得更加严重,与成像管断的距离增加。这可能是因为成像管状对大脑施加机械压力,从而抵消在导管附近的一些运动(类似于新皮质制剂)。因此,虽然在 SR 和 SLM 中可以成像树突状脊柱,但在我们手中,它是从管状表面到 SO 最坚固的背向高达 200 μm。为了补偿运动,我们使用共振扫描仪和离线平均。以最大可用速度(30 帧/秒)获取 z 堆栈每个图像平面的多个图像(4 到 6 次重复)。然后,每个 z 平面的所有重复都进行去解(使用商业软件 AutoQuant),注册(使用 ImageJ),并平均到单个图像26中。对于索马塔的成像,运动在麻醉35时通常可以忽略不计,两个平均值通常足以补偿运动伪影。
方法的未来应用或方向.
制备可与微内窥镜26、43结合。微内窥镜是刚性光学探头,使用梯度折射率(GRIN)微透镜来引导光线从深组织18。使用微型内窥镜允许直径较小的管状,甚至根本没有管状。然而,商业微内窥镜对光学畸变的校正程度较低,并且比商业目标具有更低的NA。电流探头达到 ±0.6-1 μm、±10-12 μm 的横向和轴向分辨率,分别为17、18、44 。微内窥镜的使用也使这种制备与头戴式集成宽场显微镜45,46,47的组合。
该方法也可用于非麻醉小鼠,并已用于研究细胞活动使用Ca2+传感器在清醒的头固定小鼠21,37,48,49。在这些情况下,由于荧光变化的时间尺度很快,建议实施线路注册50。也可以调整其他海马亚区域的成像准备,如登酸陀螺(DG)39,51,52。结合这种制备与3P激发53,54与1MHz频率脉冲激光调谐到1400nm,我们能够成像更深的海马形成到达分子层,颗粒细胞层和DG 的 hilus (图 4) 而不移除覆盖 CA1。
总之,我们提出了一种方法,提供光学访问背海马,并允许纵向和相关的研究海马结构和活动的动态。该技术扩展了在生理和病理条件下分析海马功能的可能性。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
美国基金会得到施拉姆基金会的支持;C.-W.T.P.和W.G.得到马克斯·普朗克协会的支持;L.Y. 和 R.Y. 由马克斯·普朗克协会和国家卫生研究所 (R01MH080047, 1DP1NS096787) 提供支持;A. C. 得到欧洲研究理事会、欧洲网络网和I-CORE项目、以色列卫生部首席科学家办公室、联邦教育和研究部、罗伯托和雷纳塔·鲁曼、布鲁诺和西蒙娜·利奇的FP7赠款的支持。内拉和莱昂·贝诺齐约神经疾病中心、亨利·查诺克·克伦特生物医学成像和基因组学研究所、以色列科学基金会珀尔曼家族、阿德利斯、马克·贝森、普拉特和欧文·莫斯科维茨基金会;A. A. 得到马克斯·普朗克协会、施拉姆基金会和德意志基金会的支持。3P 图像是在马克斯·普朗克佛罗里达神经科学研究所神经成像技术高级课程期间获得的。神经成像技术高级课程由马克斯·普朗克协会、佛罗里达州马克斯·普朗克科学奖学金计划以及马克斯·普朗克佛罗里达研究所合作计划支持。我们要感谢Thorlabs、相干和光谱物理学在课程期间为2P/3P成像系统提供支持和设备。我们也感谢亨利·海伯勒和梅丽莎·埃伯勒在课程期间为系统提供协助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Professional drill/grinder IBS/E | Proxxon GmbH | 28481 | Pecision drill |
| MICROMOT drill stand MB 200 | Proxxon GmbH | 28600 | Movable ruler table |
| MICRO compound table KT 70 | Proxxon GmbH | 27100 | Movable ruler table |
| Machine vice MS 4 | Proxxon GmbH | 28132 | Movable ruler table |
| Stainless steel tube Ø 3,0 x 0,25 mm (Inner Ø 2,5 mm ) L = 500 mm | Sawade | R00303 | Stainless steel tube for the cannula metal ring |
| Microscope Cover glass (4 mm round) | Engelbrecht Medizin and Labortechnik | Glass coverslips for the cannula glass | |
| Schlusselfeilensatz 6-tgl. Im Blechetui | Hoffmann Group | 713750 160 | Manual files |
| Präzisions-Nadelfeile Gesamtlänge 140 mm 4 | Hoffmann Group | 527230 4 | Manual files |
| UV-Curing Optical Adhesives | Thorlabs | NOA81 | UV-curing adhesive |
| UV Curing LED System, 365 nm | Thorlabs | CS2010 | UV-curing LED driver unit |
| Stemi 305 | Zeiss | Stereoscope | |
| Presto II | NSK-Nakanishi Germany | Z307015 | Dental drill |
| Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 fein | MF Dental | F837.014.FG | Files for the dental drill |
| Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 grob | MF Dental | G837.014.FG | Files for the dental drill |
| Graefe Forceps - Straight / Serrated | Fine Science Tools | 11050-10 | Forceps for the surgery |
| Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19008-05 | 0.5 mm width burr for the micro-drill |
| Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19008-09 | 0.9 mm width burr for the micro-drill |
| MicroMotor mit Handstück | DentaTec | MM11 | Micro-drill for the craniotomy |
| Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Dumont forceps for the surgery |
| Fine Scissors - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | Scissors for the surgery |
| Trephine | MW Dental | 229-020 | Trephine drill - 3.0 mm diameter; for the micro-drill |
| Stainless Steel Self-Tapping Bone Screws | Fine Science Tools | 19010-10 | 0.86 mm width bone screws |
| Stereotaxic apparatus | Kopf | Stereotaxic apparatus | |
| 3-D-Gelenkarm | Hoffmann Group | 442114 | Stereotaxic arm and plate holder |
| Aufnahme 2SM | Hoffmann Group | 442100 2SM | Stereotaxic arm and plate holder |
| Hot Bead Sterilizers | Fine Science Tools | 18000-45 | Glass beads sterilizer |
| Isofluran CP, Flasche 250 ml | Henry Schein VET GmbH | 798932 | Liquid isoflurane for anesthesia |
| Harvard Apparatus Isoflurane Funnel-Fill Vaporizer | Harvard Apparatus GmbH | 34-1040 | Isoflurane vaporizer |
| Lab Active Scavenger | Gropper Medizintechnik | UV17014 | Isoflurane scavenger system |
| Metacam 0,5% Injektionslsg. (Hund / Katze), Flasche 20 ml | Henry Schein VET GmbH | 798566 | Meloxicam, anti-inflammatory |
| Vetalgin 500 mg/ml | MSD Tiergesundheit | Vetalgin, pain killer | |
| CMA 450 Temperature Controller | Hugo Sachs Elektronik - Harvard Apparatus GmbH | 8003770 | Heating blanket |
| Bepanthen Augen- und Nasensalbe | Bayer AG | Ophtalmic ointment | |
| KL 1500 LCD | Schott | Fiber optic light source | |
| Xylocain Pumpspray | AstraZeneca GmbH | Lidocain, local anesthetic | |
| Absorption Triangles - Unmounted | Fine Science Tools | 18105-03 | Absorption triangles for the surgery |
| Parkell C&B Metabond clear powder L | Hofmeester dental | 013622 | Quick adhesive cement |
| Parkell C&B Metabond Quick Base B | Hofmeester dental | 013621 | Quick adhesive cement |
| Parkell C&B Metabond Universal Catalyst C | Hofmeester dental | 013620 | Quick adhesive cement |
| Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | Precision applicators for the surgery |
| Blunt needles 0.9x23 mm | Dentina | 0441324 | Blunt needles |
| Blunt needles 0.5x42 mm | Dentina | 0452155 | Blunt needles |
| Blunt needles 0.3x23 mm | Dentina | 0553532 | Blunt needles |
| Kallocryl A/C | Speiko | 1615 | Acrylic liquid component |
| Kallocryl | Speiko | 1609 | Acrylic powder |
| Hydrofilm transparent roll | Hartmann | Adhesive film | |
| Head plates | Custom made | 30 mm x 10 mm size; 8 mm diameter hole, titanium | |
| Head plate clamp | Custom made | Head plate holder | |
| Pedestal post holders | Thorlabs | PH20E/M | Head plate holder |
| Stainless steel post | Thorlabs | TR30/M | Head plate holder |
| Stainless steel post | Thorlabs | TR75/M | Head plate holder |
| Stainless steel post | Thorlabs | TR150/M | Head plate holder |
| Post connector clamps | Custom made | Head plate holder | |
| Aluminum Breadboard, 300 mm x 450 mm x 12.7 mm, M6 Taps | Thorlabs | MB3045/M | Microscope stage |
| 7" x 4" Lab Jack | Thorlabs | L490/M | Microscope stage |
| Low profile face mask small mice | Emka Technologies | VetFlo-0801 | Anesthesia facemask holder |
| RS4000 Tuned Damped Top Performance Optical Table | Newport | Floating table | |
| S-2000A Top Performance Pneumatic Vibration Isolators with Automatic Re-Leveling | Newport | Floating table | |
| Power Meter Model 1918-R | Newport | Power meter | |
| X-Cite 120Q | Excelitas Technologies | Fluorescence lamp | |
| Two-photon microscope | Bruker | Ultima IV | Two-photon microscopes |
| Two-photon microscope | Thorlabs | Bergamo | Two-photon microscopes |
| Plan N 4x/0.10 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
| Plan N 10x/0.25 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
| LMPlan FLN 20x/0.40 ∞/-/FN26.5 | Olympus | Objectives | |
| XLPlan N 25x/1.00 SVMP ∞/0-0.23/FN18 | Olympus | Objectives | |
| Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | Mai Tai Deep See | Excitaiton lasers |
| Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | InSight DS+ Dual beam | Excitaiton lasers |
| Ultafast tunable laser for 3P excitation | Coherent | Monaco | Excitaiton lasers |
References
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