Summary
Deze methode beschrijft een chronische voorbereiding die optische toegang tot de hippocampus van levende muizen mogelijk maakt. Deze voorbereiding kan worden gebruikt voor het uitvoeren van longitudinale optische beeldvorming van neuronale structurele plasticiteit en activiteit-opgeroepen cellulaire plasticiteit over een periode van enkele weken.
Abstract
Two-photon microscopie is een fundamenteel hulpmiddel voor Neurowetenschappen, omdat het onderzoek van de hersenen van levende dieren op ruimtelijke schalen mogelijk maakt, variërend van subcellulaire tot netwerk niveaus en op temporele schalen van milliseconden tot weken. Daarnaast kan Two-photon Imaging worden gecombineerd met een verscheidenheid aan gedragstaken om de causale relaties tussen hersenfunctie en gedrag te verkennen. Echter, in zoogdieren, beperkte penetratie en verstrooiing van licht hebben beperkt twee-photon intravital beeldvorming meestal aan oppervlakkige hersengebieden, dus in de richting van longitudinaal onderzoek van diepe hersengebieden zoals de hippocampus. De hippocampus is betrokken bij ruimtelijke navigatie en episodische geheugen en is een lange-staande model gebruikt voor het bestuderen van cellulaire evenals cognitieve processen belangrijk voor het leren en terugroepen, zowel in de gezondheid en de ziekte. Hier is een voorbereiding die chronische optische toegang tot de rughippo campus in levende muizen mogelijk maakt gedetailleerd. Dit preparaat kan worden gecombineerd met twee-photon optische beeldvorming op cellulaire en subcellulaire resolutie in hoofd vaste, verdoofd levende muizen over meerdere weken. Deze technieken maken herhaalde beeldvorming van neuronale structuur of activiteit-Evoked plasticiteit in tientallen tot honderden neuronen in de rughippocampal CA1. Bovendien kan deze chronische voorbereiding worden gebruikt in combinatie met andere technieken zoals micro-endoscopie, hoofd-gemonteerde brede veld microscopie of drie-Fobe microscopie, waardoor de gereedschapskist sterk wordt uitgebreid om cellulaire en netwerkprocessen te bestuderen die betrokken zijn in leren en geheugen.
Introduction
In zoogdieren, de hippocampus is een belangrijke hersenregio voor de codering en terugroepen van episodische herinneringen, alsmede voor ruimtelijke navigatie1,2,3,4. Om deze reden, de hippocampus is geweest-en is nog steeds-een zeer belangrijk model om de basismechanismen die het mogelijk maken de hersenen om te coderen en terugroepen herinneringen5,6,7 of om te navigeren in een omgeving te bestuderen8 ,9 beloningen verzamelen en gevaren vermijden. Daarnaast is de hippocampal formatie is een van de hersengebieden waar nieuwe neuronen worden gegenereerd gedurende het leven van knaagdieren10,11 en, eventueel, van de mens12,13. Tot slot, degeneratie of aantasting van de hippocampal vorming worden geassocieerd met neurologische en psychiatrische stoornissen, met inbegrip van de ziekte van Alzheimer14.
Bij muizen ligt de Hippocampus ongeveer 1 mm onder het hersen oppervlak15. Zijn positie heeft optische toegang voorkomen in het intacte brein en bijgevolg hebben longitudinale studies van hippocampal Dynamics zich voornamelijk gebaseerd op magnetische resonantie (MR) Imaging, elektrofysiologie en ex vivo imaging analyses. De heer Imaging methodes maken het volgen van biologische processen (bijv. genexpressie wijzigingen16) in hetzelfde dier over meerdere dagen mogelijk, maar missen de ruimtelijke resolutie om enkelvoudige neuronen te discrimineren. Klassieke in vivo elektrofysiologische technieken bieden een zeer hoge temporele resolutie en een uitstekende gevoeligheid voor veranderingen in membraanpotentiaal. Ze hebben echter een beperkte ruimtelijke resolutie en ze missen de mogelijkheid om dezelfde cellen betrouwbaar te volgen gedurende langere perioden. Optische beeldvorming maakt het mogelijk om meer diverse processen te studeren op grond van de hoge temporele en ruimtelijke resoluties. Ex vivo imaging biedt echter alleen snapshots van lopende processen, en is dus niet geschikt voor longitudinale studies waarbij de dieren informatie leren en terugroepen.
Optische beeldvorming combineert in vivo een aantal voordelen van de heer Imaging en elektrofysiologie met die van optische beeldvorming. Daarom is het zeer goed geschikt voor longitudinale en correlatieve analyses van muis hersen dynamiek en gedrag. Dit is relevant in studies van biologische processen met zeer snel (milliseconden tot seconden) of zeer traag (dagen tot weken) tijdschema's. Voorbeelden voor dergelijke processen die relevant zijn voor de neurowetenschappen zijn membraanspanning dynamiek, CA2 + transiënten, cellulaire plasticiteit en structurele veranderingen, die worden allemaal verondersteld te zijn zeer belangrijk voor Geheugenvorming en terugroepen. Verschillende methodes zijn uitgebreid in vivo imaging naar de dorsale Hippocampus18,19,20,21,22. Acute preparaten hebben het volgen van de activiteit van piramidale neuron (PN), evenals hun dendritische stekels gedurende enkele uren20,22toegestaan. Deze temporele tijdspanne staat echter niet toe dat structurele veranderingen op de lange termijn, die kunnen leiden tot incrementele leerprocessen, worden bestudeerd. Chronische preparaten-in combinatie met micro-endoscopen23,24 of met lange werkafstand (WD) standaard Microscoop doelstellingen21 -hebben herhaalde beeldvorming van de dorsale Hippocampus over verschillende Weken.
Hier beschrijven we een chronische voorbereiding die terugkerende optische toegang biedt tot het CA1-subveld van de dorsale Hippocampus van levende muizen met behulp van een permanent ingevoegde beeldvormings canule. Dit preparaat maakt herhaalde toegang tot de CA1 zonder functionele verstoring en is geschikt voor intravital Two-photon (2P) of breed-veld epifluorescentie beeldvorming. Twee voorbeelden van 2 p diepe hersenen chronische beeldvorming in de dorsale CA1 van levende muizen zijn gedetailleerd: longitudinale beeldvorming van dendritische structuur en dendritische wervelkolom dynamiek en longitudinale beeldvorming van activiteit-Evoked plasticiteit. De belangrijkste voordelen en beperkingen van de techniek worden besproken.
Protocol
Alle beschreven methoden zijn goedgekeurd door de regering van Opper-Beieren (licentie 2016_ROB-55.2 vet-2532. Vet_02-16-48) en door de Stanford en Max Planck Florida Institute for Neuroscience administratieve panels op laboratorium Animal Care.
1. bereiding van de beeldvormings canule
- Houd een precisie boor op een boorstandaard geleverd met een beweegbare liniaal tafel.
- Klem een roestvrijstalen buis van 3,0 mm diameter op de beweegbare liniaal tafel.
- Snijd de buis naar een 1,6 mm lange metalen ring. Als de randen van de ring niet bot na het snijden, bestand uit de onregelmatigheden.
- Spoel de metalen ring en een cirkelvormige glazen afdekplaat met 4 mm diameter in 100% aceton en laat voor ≈ 5 min drogen.
- Plaats de metalen ring en de glazen afdekplaat op een gladde, gelijkmatige en schone werkplek, onder een stereoscoop.
- Plaats een druppel UV-uithardende optische lijm op een glad oppervlak, zoals een Petri schaaltje. Gebruik een naald of een spatel om de lijm uit te spreiden om een dunne (< 0,5 mm) laag te vormen.
- Gebruik de tang om de ene kant van de metalen ring in de lijm te dompelen. Let vooral op de binnenkant van de ring niet verzegelen. Als dit gebeurt, gebruik dan een naald om de optische lijm in de ring te breken.
- Gebruik de stereoscoop om de metalen ring in het midden van de glazen afdekplaat te plaatsen met de zijkant van de ring bedekt met lijm die de afdekplaat aanraakt. Een dunne ring van lijm moet worden vorm op de interface tussen de metalen ring en de dekslip. Vermijd het verspreiden van lijm naar het midden van de dekslip.
- Zet de UV-uithardende LED-driver unit en glans licht (365 nm) gedurende 1 minuut aan.
Let op: UV-licht veroorzaakt brandwonden van de huid en is een mutagene stof. Draag UV-beschermende brillen en Bescherm handen en armen met handschoenen en een Labcoat om huid blootstelling te voorkomen. - Om de lijm gelijkmatig te genezen, zorg ervoor dat alle zijden van de ring even verlicht zijn door de richting van de lichtbron te veranderen.
- Laat de lijm ten minste 2 uur verharden, bij voorkeur, 's nachts.
- Houd de canule stevig vast van het open uiteinde van de metalen ring door middel van een hemostat. Gebruik een tandheelkundige boor, uitgerust met een draaiend bestand en werkend onder de stereoscoop, om de overtollige glazen afdekplaat af te spoelen met de zijkanten van de ring (Figuur 1a).
2. implantatie van de beeldvormings canule over de dorsale Hippocampus
- Voorbereiding van apparatuur en installatie
- Zorg ervoor dat alle chirurgische instrumenten schoon en steriel zijn. Bij gebruik van een glazen kraal sterilisator voor sterilisatie, reinig de instrumenten en plaats ze in de sterilisator (ingesteld op 250 °C) gedurende 10 minuten, vóór gebruik. U de instrumenten ook voor gebruik Autoclaveren.
- Bereid alle materialen die nodig zijn voor de operatie, evenals chirurgische instrumenten, zodat ze gemakkelijk kunnen worden bereikt.
- Zorg ervoor dat er genoeg vers bereide medicijnen zoals pijnstillers of ontstekingsremmende geneesmiddelen.
- Zorg ervoor dat er voldoende Isofluraan is voor de hele duur van de operatie (ongeveer 1 uur per operatie).
- Zet het verwarmings tapijt aan en stel het in op 37 °C om de dieren temperatuur stabiel te houden onder anesthesie.
- Zorg ervoor dat het opruimings systeem voor Isofluraan functioneert.
- Open de klep van de zuurstoftoevoer.
- Anesthesie inductie, en dierlijke fixatie
- Plaats de muis in de anesthesie-inductie kamer op 3% Isofluraan in 1 L/min O2 en wacht tot het bewustzijn verliest. Beoordeel anesthesie met behulp van de teen pinch reflex test.
- Weeg het dier af.
- Breng anti-inflammatoire (Meloxicam, 1mg/kg) en pijn Killer (Vetalgin, 200mg/kg) drugs subcutaan.
- Plaats de muis op het verwarmings tapijt. Zorg ervoor dat het dier niet in direct contact is met het verwarmings tapijt om thermische brandwonden te voorkomen.
- Bevestig het hoofd aan het stereotactische apparaat en plaats de neuskegel om de snuit te bedekken. Om anesthesie te handhaven, vermindert Isofluraan tot 1,5-2%. Gedurende de hele operatie, monitor muis toestand door het visueel controleren van de ademhaling en door het testen van Teen pinch reflex. Reguleren Isofluraan percentage indien nodig.
- Breng oftalmische zalf aan op de ogen om uitdroging en mogelijke blindheid te voorkomen.
Opmerking: voor anesthesie en dierlijke medicatie zijn alternatieve methoden en geneesmiddelen mogelijk. Raadpleeg uw dieren licentie en de relatieve literatuur.
- Implantatie van optische canule
- Schakel de glasvezel lichtbron in.
- Verwijder het haar en Desinfecteer de huid over de muis kop.
- Verwijder met een schaar en een tang de hoofdhuid van de muis. Begin met het maken van een kleine snede in de hoofdhuid in een positie dicht bij Lambda. Ga door met het openen van de hoofdhuid aan de twee zijden. Eerst bewegen lateraal in de richting van de oren, dan rostrally, in de richting van de oogbanen, een driehoek op de sagittale as vormen, ongeveer 4 mm rostrale migratoire naar bregma. Let op niet te dicht bij oren en ogen te snijden, maar bloot bregma en lambda, evenals pariëtale botten en de achterste helft van de voorste botten.
- Breng één druppel (≈ 10 mg) lidocaïne (28,9% v/v in alcohol) aan op de schedel.
- Wis het periosteum en droog de schedel met een wattenstaafje.
- Plaats de oorstangen om de muis kop vast te maken.
- Maak een kleine craniotomie, met behulp van een micro-boor met een 0,5 mm breedte Burr. Plaats het gat in het frontale bot tegenover de afbeelding van de hippocampus, ongeveer 1,5 mm van het sagittale hecht en 2 mm ver van de coronale hecht.
- Schroef een 0,86 mm-breedte roestvrijstalen botschroef in het schedel gat.
- Reinig indien nodig het puin en droog de schedel.
- Bereiding van een mengsel van snellijm cement
- Met behulp van een kleine lepel (≈ 4,5 mm diameter), doseren 1-1.5 niveau Scoops van L-poeder in een meng goed.
- Doseer 3-4 druppels snelle basis in de put.
- Doseer 1 druppel universele katalysator in de put.
- Roer de mix voor 5-10 s door een precisie applicator.
Opmerking: er zijn alternatieven beschikbaar. Raadpleeg de instructies van de fabrikant.
- Gebruik precisie applicatoren om snel lijm cement toe te passen op de schedel, de schroef en de omringende huid. Laat het 30 sec. tot 1 min drogen.
- Gebruik een 3,0 mm diameter genoemd boor om een craniotomie in het pariëtale bot te maken. Plaats het gat ongeveer 1,5 mm afstand van de sagittale hecht en 2 mm afstand van de lambdoïde hecht.
- Verwijder voorzichtig de botflap.
- Controleer de grootte van de craniotomie met behulp van de canule om ervoor te zorgen dat deze past. Gebruik een micro-Drill van 0,5 mm of 0,9 mm om de craniotomie zo nodig te vergroten.
- Verwijder de hersenvliezen met de Dumont-Tang.
- Ablate corticale materie, om de externe capsule te bereiken. Gebruik een 0,9 mm diameter (19 gauge) botte naald aangesloten op een vacuümpomp. Irrigeren met zoutoplossing om uitdroging van het blootgestelde weefsel te voorkomen en rest bloed weg te spoelen nadat het bloeden is verdwenen. Zuig het corticale weefsel langzaam, ≈ 50-100 μm tegelijk, totdat de cortex loskomt van de capsule, waardoor de vezels van het Cingulum of het corpus callosumworden blootgesteld. Verander de naald regelmatig, om verstopping te voorkomen.
- Vezels strekken zich voornamelijk uit in drie richtingen (Figuur 1b). Schil voorzichtig de rugvezels tot de diepste vezels (alveus van de hippocampus) worden blootgesteld.
- Spoel het weefsel met zoutoplossing. Gebruik dunne tang om de onderste canule in een zoutoplossing te dompelen en plaats deze over het schedel gat. Canule en weefsel moeten met een zoutoplossing worden verzegeld om te voorkomen dat luchtbellen tussen de canule en het weefsel worden overgevuld.
- Duw de canule in de schedel (figuur 1c) totdat de glazen afdekplaat in aanraking komt met de vezels.
- Droog de schedel goed met behulp van absorptie driehoeken, wattenstaafjes en/of de vacuümpomp.
- Bereiding van een mengsel van snellijm cement (zie stap 2.3.10).
- Gebruik precisie applicatoren om snel lijm cement toe te passen op de schedel. Lijm ook aanbrengen op de rand van de canule. Zorg ervoor dat de lijm niet in de canule loopt. Laat het 30 sec. tot 1 min drogen.
- Gebruik een stereotaxic arm om een kophouder plaat over de canule te positioneren, in contact met de schedel.
- Bereiding van een mengsel van tandheelkundige acryl
- Gebruik een lepel (≈ 9 mm diameter), Doseer 1 niveau schep (1 deel) poeder in een meng goed.
- Verdeel 2-3 delen van vloeistof in dezelfde put. Bedek het hele poeder met de vloeistof.
- Roer voor ≈ 1 min met behulp van een spatel.
Opmerking: er zijn alternatieve acryl beschikbaar. Raadpleeg de instructies van de fabrikant.
- Gebruik een spatel of een precisie applicator om acryl over de cranium toe te passen. Bedek de gehele blootgestelde schedel, de schroef en de open huid met tandheelkundige acryl. Dit maakt de voorbereiding stabiel. Laat acryl niet in de nek, oren en ogen lopen.
- Laat het acryl drogen en harden voor ongeveer 15 min.
- Breng een verwijderbare Kleef film aan op de plaat van de hoofd houder, om te voorkomen dat er vuil in de canule terechtkomt. Het wordt aanbevolen dat de film grootte overeenkomt met die van de plaat.
- Schakel Isofluraan flow uit, verwijder het dier uit het stereotactische apparaat en Positioneer het op een verwarmingsplaat om de fysiologische lichaamstemperatuur te behouden terwijl het wakker wordt van de anesthesie.
- Bewaak het dier totdat het voldoende bewustzijn heeft gekregen om borstbeen recumbency te handhaven.
- Terugkeer van het dier dat een operatie heeft ondergaan aan het gezelschap van andere dieren alleen wanneer volledig hersteld.
3. postoperatieve zorg
- Controleer de status van de muis gedurende 2 dagen na de operatie, door het gewicht en het algemene gedrag te bewaken.
- Breng anti-inflammatoire (Meloxicam, 1mg/kg) en pijn Killer (Vetalgin, 200mg/kg) drugs subcutaan gedurende 2 dagen na de operatie
Opmerking: alternatieve bewakingsprocedures, drugs en doseringen zijn mogelijk voor postoperatieve zorg. Raadpleeg uw dieren licentie en de relatieve literatuur.
4. voorbereiding van de beeldvormings sessie
- Schakel de Imaging Setup van tevoren in en laat de laser zo nodig opwarmen en stabiliseren.
- Anesthetiseer de muis (zie stap 2.2.1).
- Gebruik de tang om de zelfklevende folie voorzichtig van de kophouder plaat te verwijderen. Houd de muis in een hand en de hoofd Houderplaat met de vingers. Verwijder de film zachtjes, om beschadiging van het preparaat te voorkomen.
- Plaats de muis onder de Microscoop, over het verwarmings tapijt en bevestig de kopplaat aan de houder (figuur 1d).
- Plaats de neuskegel om de snuit te bedekken en verlaag de Isofluraan tot 1,5-2%.
- Breng oftalmische zalf aan op de ogen van de muis.
- Reinig de Imaging canule door het spoelen met gedeïoniseerd water. Gebruik een spuit en een dunne naald om water in de canule te laten vallen en een vacuümpomp om deze te verwijderen.
5. Imaging sessie
- Gebruik een lage vergroting, lange werkafstand doelstellingen om de canule visueel te controleren op restwater, vuil, integriteit en de aanwezigheid van fluorescentie.
- Lijn de canule op de optische as door de hoeken van de armen van de hoofd houder aan te passen.
- Overschakelen naar de 25X 1,0 NA, 4 mm WD of de 40X 0,8 NA, 3 mm WD, water onderdompeling doelstellingen. Voeg voldoende gedeïoniseerd water toe om de canule te vullen en overtollig water boven op de canule te houden. Vermijd de vorming van luchtbellen.
- Gebruik 2P excitatie en beeld fluorescerende signalen.
Opmerking: het Imaging-protocol is sterk afhankelijk van de tijd en ruimtelijke schalen die moeten worden afgebeeld. Raadpleeg de secties representatieve resultaten en discussie voor meer informatie over de Imaging-instellingen die we hebben gebruikt voor het produceren van de afbeeldingen die in dit artikel worden weergegeven.
Representative Results
Aangezien de canule is geplaatst net rugvin aan Ca1, het rugaspect van de Ca1 is meer proximale aan de Microscoop als in vergelijking met de ventrale één. De alveus is de meest proximale structuur gevolgd in volgorde door stratum Oriens (so), stratum pyramidale (SP), stratum radiatum (SR) en stratum lacunosum moleculare (SLM), de meest distale laag (figuren 1B , C). Longitudinale 2P beeldvorming van neuronale structuur met subcellulaire resolutie en van activiteit-Evoked plasticiteit met cellulaire resolutie worden gepresenteerd als representatieve resultaten. Om de fluor Foren groene fluorescerende eiwitten (GFP), d2Venus en TurboFP635 te prikkelen, wordt een femtosecondelaser gepulseerde TI: saffier laser afgestemd op 920 nm gebruikt en het gemiddelde Laser vermogen wordt aangepast tot 5-25 mW bij het monster. De verschillende emissie golflengten worden gescheiden door middel van emissie filters en verschillende fotomultiplicatorbuizen.
Longitudinale beeldvorming van dendritische structuur en dendritische stekels dynamiek.
Om te dun etiket hippocampal PNs en visualiseren hun structuur, een Thy1-GFP transgene muis lijn (M-lijn) wordt gebruikt. Thy1-GFP muizen Express cytoplasmatische verbeterde GFP onder de controle van de Thy1 promotor in een schaars, willekeurige populatie van PNS25. Over het algemeen is de belangrijkste as van CA1 PNs ruwweg loodrecht op het XY-Imaging vlak (figuren 1B, Fig. 2a en aanvullende film 1). Basale dendrieten strekken zich uit in de SO, van het SOMA naar de canule, terwijl apicale en apicale Tuft dendrites zich in de tegenovergestelde richting uitbreiden naar de canule (aanvullende film 1). Aangezien de voorbereiding de diepste vezels van de alveus intact laat, moeten een paar fluorescerende vezels die het gezichtsveld doorkruisen, net onder de canule, zichtbaar zijn (Figuur 2a en film 1). De voorbereiding maakt het mogelijk om de PN-dendrites te Imaging met rugresolutie (Figuur 2 A-C). Voorbeeld dendrites en dendritische stekels, een 25X 1,0 NA, 4 mm WD, water onderdompeling commerciële objectief objectief wordt gebruikt.
Voor longitudinale tracking worden verschillende hersengebieden binnen het gezichtsveld van de canule gedefinieerd tijdens de eerste beeldvormings sessie. Elke regio komt overeen met een oppervlakte van ongeveer 240 x 240 μm en bevat tussen 1 en 7 dendritische segmenten (Figuur 2b). Deze gebieden worden handmatig toegewezen aan een driedimensionale stapel met een lage vergroting die het patroon van GFP-expressie weergeeft in het volume onder de beeldvormings canule (Figuur 2a). Vervolgens worden 1 μm z-Step beeld stapels van CA1 PN basale dendrites verworven op verschillende tijdstippen (van 24 uur tot 3 dagen) gedurende maximaal 14 dagen (figuur 2c). Langere beeldvormings duur en intervallen zijn mogelijk26. Elke beeldvormings sessie duurt ongeveer 60 tot 90 min. Hoewel de meeste beelden van dendritische stekels zijn, is het ook mogelijk om dendritische stekels te afbeelden in de schuine dendrites van SR (figuren 2D-F). Naast de dichtheid van de wervelkolom, deze methode maakt de studie van de wervelkolom dynamiek door het kwantificeren van hun overleving, winst en verlies tarieven26,27,28,29,30, 31 , 32. om dendritische stekels na verloop van tijd te scoren en te volgen (figuur 2c), wordt een aangepaste MATLAB-interface gebruikt. Hierdoor kan de uitlijning van de beeld stapels verworven op verschillende tijdstippen en ondersteunt handmatige labeling van dendrites en stekels tijdens het volgen van dendritische lengtes en wervelkolom posities na verloop van tijd26. Belangrijk is dat deze methode kan worden gebruikt om onderscheid te maken (per tijdpunt, met uitzondering van de eerste) tussen reeds bestaande en pasgeboren dendritische stekels. Dit is belangrijk omdat de verschillende klassen van dendritische stekels worden verondersteld te hebben verschillende rollen in geheugen verwerving en retentie33.
Longitudinale beeldvorming van activiteit-Evoked plasticiteit.
Om beeld activiteit-Evoked plasticiteit in Ca1 PNS, de rugvin Ca1 hippocampal gebied wordt geïnjecteerd met een virale vector uitdrukken groen fluorescerende gedestabiliseerde d2Venus via een verbeterde vorm van de synaptische activity-responsief element (E-SARE) binnen de Arc Enhancer/promotor en Red fluorescent TurboFP635 via de Epgk Promoter34. Dit zorgt voor Imaging niveaus van activiteit-Evoked plasticiteit van honderden CA1 PNs in elk dier35. Gezien de zeer dichte labeling van PNs, het is over het algemeen niet mogelijk om op te lossen de dendrites van CA1 PNs (aanvullende film 2).
Om het beeld van de somata van CA1 PNs, een 40X 0,8 NA, 3 mm WD, water onderdompeling objectief lens wordt gebruikt. Voor longitudinale tracking worden 1 tot 9 hersengebieden per muis gedefinieerd tijdens de eerste beeldvormings sessie. Elke regio komt overeen met een oppervlakte van ongeveer 300 x 300 μm en bevat tussen 50 en 150 cellen (Figuur 3a). Deze regio's worden handmatig toegewezen aan lokale weefsel monumenten die zichtbaar zijn bij een lagere vergroting. Vervolgens worden 3 μm z-Step beeld stapels verworven, die de SP van CA1 PNs (Figuur 3a en aanvullende film 2) op verschillende tijdstippen (van 24 uur tot 6 dagen) voor maximaal 30 dagen omvatten. Elke Imaging sessie duurt ongeveer 60 tot 90 min. E-SARE activatie pieken 6 tot 8 h na blootstelling aan een nieuwe of verrijkte omgeving (EE, Figuur 3b) en vervalt in de loop van een paar dagen. Dus, we over het algemeen beeld 6 aan 8 h na ervaring en toestaan voor 5 dagen tussen Imaging sessies35.
Om d2Venus-en TurboFP635 fluorescentie waarden te kwantificeren, wordt een cirkelvormig gebied van 4,64 μm in diameter getekend, dat kleiner is dan een neurale cellichaam, gecentreerd op de cel Soma. We gaan dan verder naar het volgende tijdpunt, scoren het SOMA van dezelfde cel op dezelfde manier en herhalen deze procedure voor alle tijdpunten en alle zichtbare cellen in de longitudinale gegevensset. De gemiddelde waarde van elke neuron (activiteitsafhankelijke) d2Venus-emissie wordt genormaliseerd door de gemiddelde (activiteitsonafhankelijke) TurboFP635 emissie. Deze methode maakt het onderzoek van de lange termijn dynamiek van ensemble plasticiteit van CA1 PNs35 (figuur 3c).
Figuur 1: voorbereiding voor in vivo diepe hersenen optische beeldvorming. (A). boven (links) en zijkant (rechts) weergaven van voorbeeld beeldvormings cannuals. Imaging canules hebben een transparante glazen bodem om optische toegang tot de Hippocampus mogelijk te maken. (B). schematische beschrijving van het preparaat dat de relatieve positie van de beeldvormings canule, een Ca1-PN en de drie lagen van vezels van rugvin tot ventrale benadrukt. (C, D). Schematische beschrijving van de installatie van Imaging (C) en van de fixatie van het dier (D) tijdens een beeldvormings sessie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Longitudinale beeldvorming van dendritische structuur en dendritische stekels dynamiek. (A). 2p beeld stapel (maximale intensiteit projectie (MIP) van 59 beeld vlakken, 2 μm z-afstand) van neuronen en dendrites gelabeld door GFP in een live THY1-GFP muis. (B). hogere vergroting (MIP van 53 beeld vlakken, 1 μm z-afstand) met gedetailleerde Details van basale dendrites die zich in so bevinden. (C). de sequentie van een dendritisch segment dat gedurende 14 dagen is afgebeeld. Pijlpunten geven dendritische stekels aan die gedurende 14 dagen worden bijgehouden. (D, E). 2P beeld stapel van neuronen en dendrites gelabeld door GFP in een live Thy1-GFP muis; D) zy projectie (31 beeld vlakken, 3 μm z-Spacing) en (E) XY projecties (17 beeld vlakken, 3 μm z-Spacing). (F). hogere vergrotingsfactor (enkelbeeld vlak) met gedetailleerde apicale dendrites en dendritische stekels die zich in SR. pijlpunten duiden op dendritische stekels. Excitatie: 920 nm; emissie piek: 510 Nm. Schaal stangen: A, 50 μm; B, 10 μm; C, 2 μm; D en E, 15 μm; F, 4 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Longitudinale beeldvorming van activiteit-Evoked plasticiteit. (A). 2p-afbeeldingen (afzonderlijke afbeeldings vlakken) van een live-muis, met dezelfde cellen op baseline dag 0 en na ee op dag 1. (B). 2p-beeld stapels (mip's van 4-6-beeld vlakken, 3 μm z-afstand) met E-SARE-activerings patronen die specifiek zijn voor omgeving a (dagen 1, 19 en 25) en milieu B (dagen 7 en 13). Groen: d2Venus fluorescentie. Rood: TurboFP635 fluorescentie. Excitatie: 920 nm; d2Venus emissie piek: 530 nm; TurboFP635 emissie piek: 635nm. Schaal staven: A, 20 μm; B, 10 μm. Dit cijfer is gewijzigd van Attardo et al., 201835. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Beeldvorming van neuronale structuur in hippocampal DG met behulp van drie-photon (3P) microscopie. (a-H). 3P-beelden (enkele beeld vlakken) van neuronen en dendrites gelabeld door GFP in een live Thy1-GFP muis detaillering (A-E) PNs in de CA1 en (F-H) submodule cellen in het DG. Excitatie: 1400 nm; emissie piek: 510 Nm. Schaalbalk: 40 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende film 1: Imaging Field of View in een live Thy1-GFP-muis. 2P-beeld stapel (83-beeld vlakken, 7 μm z-afstand) van neuronen en dendrites gelabeld door GFP (wit) in een levende Thy1-GFP-muis die zich uitstrekt van de bodem van de canule naar SLM. Om rekening te kunnen maken met het verval van het fluorescentie signaal met toenemende diepte, gebruikten we een niet-lineaire gradiënt van de gain van fotomultiplicator tubes. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende film 2: beeldvorming van activiteit-Evoked plasticiteit. 2P beeld stapel (28 beeld vlakken, 3 μm z-afstand) van neuronen die E-SARE reporter van IEG expressie uitdrukken in een live muis met SP. groen: d2Venus fluorescentie. Rood: TurboFP635 fluorescentie. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Hier wordt een procedure voor herhaalde 2P-beeldvorming van de dorsale CA1 in levende muizen beschreven. Na de operatie herstelt de muis meestal binnen 2 dagen. De procedure induceert minimale Astrogliose26,43. Bloedingen en oedeem die de operatie kunnen volgen, worden meestal binnen 10 tot 14 dagen opnieuw geadsorreven. Over het algemeen is de bereiding vanaf 14 dagen na implantatie voldoende duidelijk om intravital beeldvorming uit te voeren. Het succes van de operatie is niet afhankelijk van het werken in een steriele omgeving. Echter, het is cruciaal om een hoog niveau van hygiëne te handhaven, om complicaties te voorkomen als gevolg van chirurgie-geassocieerde infecties. Dit wordt verkregen door de chirurgische instrumenten voor en na de operatie nauwgezet te reinigen en door ze onmiddellijk voorafgaand aan elk gebruik te verwarmen (stap 2.1.1). De optische canule wordt in een schone, gesteriliseerde verpakking gehouden en vlak voor de implantatie gespoeld met steriele zoutoplossing. Het uitvoeren van gemeenschappelijke chirurgische praktijken van handendesinfectie en reiniging van het chirurgische station is ook erg belangrijk. De bereiding blijft stabiel en maakt cellulaire en subcellulaire resolutie beeldvorming voor enkele weken26,35.
Kritieke stappen, wijzigingen en probleemoplossing.
Het is belangrijk om de uitwendige capsule te schillen tot de diepste vezels worden blootgesteld. Het niet blootleggen van de alveus kan resulteren in het onvermogen om zich te concentreren op het SOMA van PNS, of in gereduceerde resolutie beeldvormende dendritische stekels, bij het gebruik van commerciële doelstellingen met 3-of 4-mm WD. Voor dit doel is het nuttig om de neocortex zeer langzaam te ablaten met een naald van 0,9 mm diameter en vervolgens over te schakelen op een 0,3-0,5 mm diameter (24-29 gauge) naald voor een fijnere controle van de zuigkracht bij het verwijderen van de meest dorsale vezels. Als alternatief kan Fine Tang worden gebruikt om de resterende cortex te verwijderen na blootstelling aan vezels36.
Bloeden tijdens de operatie kan problematisch zijn, als bloed belemmert het uitzicht. Wachten op het stolsel te vormen en vervolgens spoelen met zoutoplossing om rest bloed te wassen wordt aanbevolen. Herhaal deze indien nodig.
Een nauwsluitende pasvorm tussen de canule en de craniotomie helpt de stabiliteit van het preparaat te verhogen door de canule op zijn plaats te houden vóór het aanbrengen van het cement, vooral als de buitenste rand van de canule met de schedel is uitgelijnd. Omdat de maten van de genoemd boor en de canule worden geëvenaard, kan een losse pasvorm ontstaan door onregelmatigheden aan de zijkant van de canule-die iets grotere craniotomieën nodig hebben om te passen (zie stap 2.3.14)-of van een onregelmatige craniotomie. Eventuele onregelmatigheden bij de canule moeten worden afgezet (stappen 1,3 en 1,12) en de trefine moet loodrecht op de schedel worden gehouden totdat de craniotomie is voltooid (stap 2.3.12). Het verwijderen van de trefine uit de schedel voordat de craniotomie is voltooid kan resulteren in onregelmatige craniotomieën.
Beperkingen- Invasiviteit en stabiliteit van het preparaat.
Het is moeilijk om het effect van corticale ablatie te evalueren, omdat het lastig is om de gebieden die direct en indirect worden getroffen nauwkeurig te definiëren. In het algemeen, de operatie verwijdert een deel van de pariëtale cortex en een deel van de visuele en hindledemaat zintuiglijke cortex21. De ablatie cortex niet direct projecteren op de hippocampus en hippocampal weefsel is niet geraakt noch gewond. Belangrijk is dat het is aangetoond dat implantatie van een beeldvormings canule de hippocampal functie en specifiek de hippocampal-afhankelijke leerproces niet sterk wijzigt21,36,37,38, 39. Toch is het belangrijk om te kwantificeren in hoeverre zowel de canule als het uitwendige deel van het implantaat (hoofd Houderplaat en tandheelkundige acryl dop) chronische stressoren zijn door de bloedspiegels van corticosteron en de bijnier gewicht te beoordelen in vergelijking met ongeimplanteerde muizen.
Het preparaat blijft over het algemeen stabiel van weken tot maanden26. Op de lange termijn, huid-en botgroei neiging om het acryl kapje te verplaatsen en de instabiliteit van de Imaging voorbereiding te verhogen.
Optische beperkingen.
Conventionele 2p microscopie maakt beeldvorming tot ongeveer 1 mm diep in neocorticale weefsel40,41. Consistent met deze, het is mogelijk om te beeld dendrites en dendritische stekels gelegen in de SR (figuur 2D-F) of SLM36. Echter, beeldvorming door middel van een canule vormt beperkingen voor de effectieve NA. Om de maximale resolutie te bereiken, moeten de diameter en diepte van de beeldvormings canules worden afgestemd op de Imaging NA, omdat kleinere diameters en langere diepten licht van hoge NA-doelstellingen zullen clippen. Bijvoorbeeld, bij beeldvorming met een 1,0 NA water onderdompeling doel door een 1,6 mm lange canule, is een 3,65 mm binnendiameter nodig om de volledige NA te houden. Echter, met behulp van een canule van deze diameter zal de compressie op de Hippocampus te verhogen en kan invloed hebben op de gezondheid van het weefsel, om deze reden, gebruiken we een canule met een kleinere diameter. Bij beeldvorming met een 0,8 NA water onderdompeling door middel van een 1,6 mm lange canule, zou een inwendige diameter van 2,5 mm voldoende zijn om het volledige NA te houden. Echter, 0,8 NA water onderdompeling doelstellingen hebben een kortere WD (3 mm in ons geval), die kan voorkomen dat zich te concentreren op de SP.
Deze berekeningen zijn van toepassing op het midden van het gezichtsveld aan de onderkant van de canule. Echter, verplaatsen van het beeldveld van de weergave Sidewise-dichter bij de randen van de canule-of dieper in het weefsel te focussen-verder van het glasoppervlak van de canule-vermindert verder de effectieve NA in het brandvlak en dus vermindert de resolutie. Dit zal leiden tot een niet-homogene resolutie over de verschillende volumes van afbeelding gemaakt weefsel en kan een zorg zijn voor kwantitatieve beeldvorming op subcellulaire resolutie, vooral bij het gebruik van super-resolution technieken zoals 2p-STED microscopie42. Deze problemen zijn minder belangrijk bij Imaging op cellulaire resolutie.
Weefsel beweging.
Beweging binnen het weefsel-afkomstig van ademhaling en hartslag bij verdomde dieren-neigt te worden ernstiger met verhoogde afstand van de Imaging canule. Dit is mogelijk omdat de Imaging canule mechanische druk op de hersenen toepast, waardoor een deel van de beweging in de nabijheid van de canule wordt tegengedraaid (vergelijkbaar met neocorticale preparaten). Dus, hoewel beeldvorming van dendritische stekels mogelijk is in SR en SLM, in onze handen, het is de meest robuuste rug tot de zo tot ≈ 200 μm van het oppervlak van de canule. Om de beweging te compenseren, gebruiken we resonante scanners en offline middeling. Verschillende beelden (4 tot 6 herhalingen) worden per beeldvlak van een z-stack verkregen bij de maximaal beschikbare snelheid (30 frames/s). Alle herhalingen voor elk z-vlak worden vervolgens deconvolved (met behulp van de commerciële software, AutoQuant), geregistreerd (met behulp van ImageJ) en gemiddeld in een enkele afbeelding26. Voorbeeld vorming van somata, beweging is vaak verwaarloosbaar op anesthesie35 en twee gemiddelden zijn vaak voldoende om te compenseren voor bewegings artefacten.
Toekomstige toepassingen of richtingen van de methode .
De bereiding kan worden gecombineerd met micro-endoscopen26,43. Micro-endoscopen zijn stijve optische sondes die gebruik maken van gradiënt brekingsindex (GRIN) micro lenzen om licht van en naar diep weefsel18te leiden. Het gebruik van micro-endoscopen maakt canules van kleinere diameters of zelfs geen canules helemaal. Commerciële micro-endoscopen zijn echter minder goed gecorrigeerd voor optische aberraties en hebben lagere NA dan commerciële doelstellingen. Stroom voelers bereiken laterale en axiale resoluties van ≈ 0,6-1 μm, ≈ 10-12 μm, respectievelijk17,18,44. Het gebruik van micro-endoscopen maakt ook de combinatie van dit preparaat mogelijk met Head-Mounted geïntegreerde Widefield microscopen45,46,47.
De methode leent zich ook om te gebruiken in niet-anesthetized muizen, en het is gebruikt voor het onderzoeken van cellulaire activiteit met behulp van CA2 + sensoren in wakker hoofd-vaste muizen21,37,48,49. In deze gevallen, als gevolg van de snelle tijdschalen van de fluorescentie veranderingen, is het raadzaam om te implementeren lijn registratie50. Het is ook mogelijk om de voorbereiding voorbeeld vorming van andere subregio's van hippocampal, zoals de getand gyrus (DG)39,51,52, aan te passen. Het combineren van dit preparaat met 3p excitatie53,54 met 1 MHz frequentie gepulseerde Laser afgestemd op 1400 nm, we konden dieper beeld in de hippocampal formatie bereiken van de moleculaire laag, submodule cellaag en de Hilus van het DG (Figuur 4) zonder het opheffen van de overplaatsing Ca1.
Concluderend, presenteren we een methode die optische toegang tot de dorsale Hippocampus biedt en toelaat longitudinale en correlatieve studies van de dynamiek van de hippocampal structuur en activiteit. Deze techniek breidt de mogelijkheden van de analyse van de hippocampal functie onder fysiologische en pathologische omstandigheden.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
U. A. F. wordt ondersteund door de Schram Foundation; C.-W. T. P. en W. G. worden ondersteund door de Max Planck Society; L.Y. en R.Y. worden ondersteund door de Max Planck Society en het National Institute of Health (R01MH080047, 1DP1NS096787); A. C. wordt ondersteund door een KP7-subsidie van de Europese Onderzoeksraad, de ERANET-en I-CORE-Programma's, de Chief Scientist Office van het Israëlische ministerie van volksgezondheid, het federale ministerie van onderwijs en onderzoek, Roberto en Renata Ruhman, Bruno en Simone Lich, de Nella en Leon Benoziyo centrum voor neurologische aandoeningen, het Henry Chanoch Krenter Instituut voor biomedische beeldvorming en genomics, de Israel Science Foundation de Perlman familie, Adelis, Marc Besen, Pratt en Irving I. Moskowitz Foundations; A. A. wordt ondersteund door de Max Planck Society, de Schram Foundation en de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). De 3P beelden werden verworven tijdens de Advanced cursus over neuroimaging technieken aan het Max Planck Florida Institute for Neuroscience. De geavanceerde cursus over neuroimaging-technieken wordt ondersteund door de Max Planck Society, het Florida State Max Planck Scientific Fellowship Program en het Max Planck Florida Institute Corporation Partnership Program. We willen Thorlabs, coherente en SpectraPhysics bedanken voor het leveren van ondersteuning en apparatuur voor het 2P/3P Imaging System tijdens de cursus. We zijn Henry Haeberle en Melissa Eberle ook dankbaar voor hulp bij het systeem tijdens de cursus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Professional drill/grinder IBS/E | Proxxon GmbH | 28481 | Pecision drill |
| MICROMOT drill stand MB 200 | Proxxon GmbH | 28600 | Movable ruler table |
| MICRO compound table KT 70 | Proxxon GmbH | 27100 | Movable ruler table |
| Machine vice MS 4 | Proxxon GmbH | 28132 | Movable ruler table |
| Stainless steel tube Ø 3,0 x 0,25 mm (Inner Ø 2,5 mm ) L = 500 mm | Sawade | R00303 | Stainless steel tube for the cannula metal ring |
| Microscope Cover glass (4 mm round) | Engelbrecht Medizin and Labortechnik | Glass coverslips for the cannula glass | |
| Schlusselfeilensatz 6-tgl. Im Blechetui | Hoffmann Group | 713750 160 | Manual files |
| Präzisions-Nadelfeile Gesamtlänge 140 mm 4 | Hoffmann Group | 527230 4 | Manual files |
| UV-Curing Optical Adhesives | Thorlabs | NOA81 | UV-curing adhesive |
| UV Curing LED System, 365 nm | Thorlabs | CS2010 | UV-curing LED driver unit |
| Stemi 305 | Zeiss | Stereoscope | |
| Presto II | NSK-Nakanishi Germany | Z307015 | Dental drill |
| Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 fein | MF Dental | F837.014.FG | Files for the dental drill |
| Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 grob | MF Dental | G837.014.FG | Files for the dental drill |
| Graefe Forceps - Straight / Serrated | Fine Science Tools | 11050-10 | Forceps for the surgery |
| Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19008-05 | 0.5 mm width burr for the micro-drill |
| Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19008-09 | 0.9 mm width burr for the micro-drill |
| MicroMotor mit Handstück | DentaTec | MM11 | Micro-drill for the craniotomy |
| Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Dumont forceps for the surgery |
| Fine Scissors - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | Scissors for the surgery |
| Trephine | MW Dental | 229-020 | Trephine drill - 3.0 mm diameter; for the micro-drill |
| Stainless Steel Self-Tapping Bone Screws | Fine Science Tools | 19010-10 | 0.86 mm width bone screws |
| Stereotaxic apparatus | Kopf | Stereotaxic apparatus | |
| 3-D-Gelenkarm | Hoffmann Group | 442114 | Stereotaxic arm and plate holder |
| Aufnahme 2SM | Hoffmann Group | 442100 2SM | Stereotaxic arm and plate holder |
| Hot Bead Sterilizers | Fine Science Tools | 18000-45 | Glass beads sterilizer |
| Isofluran CP, Flasche 250 ml | Henry Schein VET GmbH | 798932 | Liquid isoflurane for anesthesia |
| Harvard Apparatus Isoflurane Funnel-Fill Vaporizer | Harvard Apparatus GmbH | 34-1040 | Isoflurane vaporizer |
| Lab Active Scavenger | Gropper Medizintechnik | UV17014 | Isoflurane scavenger system |
| Metacam 0,5% Injektionslsg. (Hund / Katze), Flasche 20 ml | Henry Schein VET GmbH | 798566 | Meloxicam, anti-inflammatory |
| Vetalgin 500 mg/ml | MSD Tiergesundheit | Vetalgin, pain killer | |
| CMA 450 Temperature Controller | Hugo Sachs Elektronik - Harvard Apparatus GmbH | 8003770 | Heating blanket |
| Bepanthen Augen- und Nasensalbe | Bayer AG | Ophtalmic ointment | |
| KL 1500 LCD | Schott | Fiber optic light source | |
| Xylocain Pumpspray | AstraZeneca GmbH | Lidocain, local anesthetic | |
| Absorption Triangles - Unmounted | Fine Science Tools | 18105-03 | Absorption triangles for the surgery |
| Parkell C&B Metabond clear powder L | Hofmeester dental | 013622 | Quick adhesive cement |
| Parkell C&B Metabond Quick Base B | Hofmeester dental | 013621 | Quick adhesive cement |
| Parkell C&B Metabond Universal Catalyst C | Hofmeester dental | 013620 | Quick adhesive cement |
| Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | Precision applicators for the surgery |
| Blunt needles 0.9x23 mm | Dentina | 0441324 | Blunt needles |
| Blunt needles 0.5x42 mm | Dentina | 0452155 | Blunt needles |
| Blunt needles 0.3x23 mm | Dentina | 0553532 | Blunt needles |
| Kallocryl A/C | Speiko | 1615 | Acrylic liquid component |
| Kallocryl | Speiko | 1609 | Acrylic powder |
| Hydrofilm transparent roll | Hartmann | Adhesive film | |
| Head plates | Custom made | 30 mm x 10 mm size; 8 mm diameter hole, titanium | |
| Head plate clamp | Custom made | Head plate holder | |
| Pedestal post holders | Thorlabs | PH20E/M | Head plate holder |
| Stainless steel post | Thorlabs | TR30/M | Head plate holder |
| Stainless steel post | Thorlabs | TR75/M | Head plate holder |
| Stainless steel post | Thorlabs | TR150/M | Head plate holder |
| Post connector clamps | Custom made | Head plate holder | |
| Aluminum Breadboard, 300 mm x 450 mm x 12.7 mm, M6 Taps | Thorlabs | MB3045/M | Microscope stage |
| 7" x 4" Lab Jack | Thorlabs | L490/M | Microscope stage |
| Low profile face mask small mice | Emka Technologies | VetFlo-0801 | Anesthesia facemask holder |
| RS4000 Tuned Damped Top Performance Optical Table | Newport | Floating table | |
| S-2000A Top Performance Pneumatic Vibration Isolators with Automatic Re-Leveling | Newport | Floating table | |
| Power Meter Model 1918-R | Newport | Power meter | |
| X-Cite 120Q | Excelitas Technologies | Fluorescence lamp | |
| Two-photon microscope | Bruker | Ultima IV | Two-photon microscopes |
| Two-photon microscope | Thorlabs | Bergamo | Two-photon microscopes |
| Plan N 4x/0.10 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
| Plan N 10x/0.25 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
| LMPlan FLN 20x/0.40 ∞/-/FN26.5 | Olympus | Objectives | |
| XLPlan N 25x/1.00 SVMP ∞/0-0.23/FN18 | Olympus | Objectives | |
| Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | Mai Tai Deep See | Excitaiton lasers |
| Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | InSight DS+ Dual beam | Excitaiton lasers |
| Ultafast tunable laser for 3P excitation | Coherent | Monaco | Excitaiton lasers |
References
- O’Keefe, J., Nadel, L. The hippocampus as a cognitive map. , Clarendon Press; Oxford University Press. (1978).
- Zola-Morgan, S., Squire, L. R. Memory Impairment in Monkeys Following Lesions Limited to the Hippocampus. Behavioral Neuroscience. 100 (2), 155-160 (1986).
- Squire, L., Zola-Morgan, S. The medial temporal lobe memory system. Science. 253 (5026), 1380-1386 (1991).
- Leutgeb, S., Leutgeb, J. K., Barnes, C. A., Moser, E. I., McNaughton, B. L., Moser, M. B. Independent codes for spatial and episodic memory in hippocampal neuronal ensembles. Science. 309 (5734), 619-623 (2005).
- Silva, A. J., Zhou, Y., Rogerson, T., Shobe, J., Balaji, J. Molecular and cellular approaches to memory allocation in neural circuits. Science. 326 (5951), 391-395 (2009).
- Tonegawa, S., Pignatelli, M., Roy, D. S., Ryan, T. J. Memory engram storage and retrieval. Current Opinion in Neurobiology. 35, 101-109 (2015).
- Poo, M., et al. What is memory? The present state of the engram. BMC Biology. 14, (2016).
- O’Keefe, J., Dostrovsky, J. The hippocampus as a spatial map. Preliminary evidence from unit activity in the freely-moving rat. Brain Research. 34 (1), 171-175 (1971).
- Moser, M. B., Moser, E. I. Functional differentiation in the hippocampus. Hippocampus. 8 (6), 608-619 (1998).
- Altman, J. Autoradiographic investigation of cell proliferation in the brains of rats and cats. Anatomical Record. 145, 573-591 (1963).
- Kuhn, H., Dickinson-Anson, H., Gage, F. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. The Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).
- Sorrells, S. F., et al. Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults. Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).
- Boldrini, M., et al. Human hippocampal neurogenesis persists throughout aging. Cell Stem Cell. 22 (4), 589-599 (2018).
- Polanco, J. C., et al. Amyloid-β and tau complexity — towards improved biomarkers and targeted therapies. Nature Reviews Neurology. 14 (1), 22-39 (2017).
- Rosene, D. L., Van Hoesen, G. W., et al. The hippocampal formation of the primate brain. in Cerebral Cortex. Jones, E. G., et al. Chapter 9, Plenum Press. New York. 345-456 (1987).
- Klohs, J., Rudin, M. Unveiling molecular events in the brain by noninvasive imaging. The Neuroscientist. 17 (5), 539-559 (2011).
- Wilt, B. A., et al. Advances in light microscopy for neuroscience. Annual Reviewof Neuroscience. 32, 435-506 (2009).
- Jung, J. C., Schnitzer, M. J. Multiphoton endoscopy. Optics Letters. 28 (11), 902 (2003).
- Levene, M. J., Dombeck, D. A., Kasischke, K. A., Molloy, R. P., Webb, W. W. In vivo multiphoton microscopy of deep brain tissue. Journal of Neurophysiology. 91 (4), 1908-1912 (2004).
- Mizrahi, A., Crowley, J. C., Shtoyerman, E., Katz, L. C. High-Resolution in vivo imaging of hippocampal dendrites and spines. The Journal of Neuroscience. 24 (13), 3147-3151 (2004).
- Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).
- Busche, M. A., et al. Critical role of soluble amyloid- for early hippocampal hyperactivity in a mouse model of Alzheimer’s disease. Proceedings of the National Academy of Science. 109 (22), 8740-8745 (2012).
- Jung, J. C., Mehta, A. D., Aksay, E., Stepnoski, R., Schnitzer, M. J. In vivo mammalian brain imaging using one- and two-photon fluorescence microendoscopy. Journal of Neurophysiology. 92 (5), 3121-3133 (2004).
- Deisseroth, K., et al. Next-generation optical technologies for illuminating genetically targeted brain circuits. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10380-10386 (2006).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Attardo, A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. Impermanence of dendritic spines in live adult CA1 hippocampus. Nature. 523 (7562), 592-596 (2015).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Zuo, Y., Yang, G., Kwon, E., Gan, W. B. Long-term sensory deprivation prevents dendritic spine loss in primary somatosensory cortex. Nature. 436 (7048), 261-265 (2005).
- Holtmaat, A. J. G. D., et al. Transient and persistent dendritic spines in the neocortex in vivo. Neuron. 45 (2), 279-291 (2005).
- Xu, T., et al. Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories. Nature. 462 (7275), 915-919 (2009).
- Yang, G., Pan, F., Gan, W. B. Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories. Nature. 462 (7275), 920-924 (2009).
- Gu, L., et al. Long-term in vivo imaging of dendritic spines in the hippocampus reveals structural plasticity. The Journal of Neuroscience. 34, 13948-13953 (2014).
- Fu, M., Zuo, Y. Experience-dependent structural plasticity in the cortex. Trends in Neurosciences. 34 (42), 177-187 (2011).
- Kawashima, T., et al. Functional labeling of neurons and their projections using the synthetic activity-dependent promoter E-SARE. Nature Methods. 10 (9), 889-895 (2013).
- Attardo, A., et al. Long-term consolidation of ensemble neural plasticity patterns in hippocampal area CA1. Cell Reports. 25 (3), 640-650 (2018).
- Schmid, L. C., et al. Dysfunction of somatostatin-positive interneurons associated with memory deficits in an Alzheimer’s disease model. Neuron. 92 (1), 114-125 (2016).
- Kaifosh, P., Lovett-Barron, M., Turi, G. F., Reardon, T. R., Losonczy, A. Septo-hippocampal GABAergic signaling across multiple modalities in awake mice. Nature Neuroscience. 16 (9), 1182-1184 (2013).
- Lovett-Barron, M., et al. Dendritic inhibition in the hippocampus supports fear learning. Science. 343 (6173), 857-863 (2014).
- Hainmueller, T., Bartos, M. Parallel emergence of stable and dynamic memory engrams in the hippocampus. Nature. 558 (7709), 292-296 (2018).
- Beaurepaire, E., Oheim, M., Mertz, J. Ultra-deep two-photon fluorescence excitation in turbid media. Optics Communications. 188, 25-29 (2001).
- Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 mm in living brains by use of a Ti:Al2O3 regenerative amplifier. Optics Letters. 28 (12), 1022-1024 (2003).
- Pfeiffer, T., et al. Chronic 2P-STED imaging reveals high turnover of dendritic spines in the hippocampus in vivo. eLife. 7, e34700 (2018).
- Barretto, R. P. J., et al. Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy. Nature Medicine. 17 (2), 223-228 (2011).
- Barretto, R. P. J., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses. Nature Methods. 6 (7), 511-512 (2009).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- Ziv, Y., et al. Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes. Nature Neuroscience. 16 (3), 264-266 (2013).
- Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
- Sheffield, M. E. J., Dombeck, D. A. Calcium transient prevalence across the dendritic arbour predicts place field properties. Nature. 517 (7533), 200-204 (2015).
- Basu, J., et al. Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition. Science. 351 (6269), aaa5694 (2016).
- Kaifosh, P., Zaremba, J. D., Danielson, N. B., Losonczy, A. SIMA: Python software for analysis of dynamic fluorescence imaging data. Frontiers in Neuroinformatics. 8, (2014).
- Gonçalves, J. T., et al. In vivo imaging of dendritic pruning in dentate granule cells. Nature Neuroscience. 19 (6), 788-791 (2016).
- Danielson, N. B., et al. Distinct contribution of adult-born hippocampal granule cells to context encoding. Neuron. 90 (1), 101-112 (2016).
- Hell, S. W., et al. Three-photon excitation in fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 1 (1), 71 (1996).
- Horton, N. G., et al. In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain. Nature Photonics. 7 (3), 205-209 (2013).
